Utilizzo di metodi biologici alternativi Utilizzo di metodi biologici alternativi alla sperimentazione animale alla sperimentazione animale Antonella Ciarelli/Mirella Luciani Antonella Ciarelli/Mirella Luciani Istituto Zooprofilattico Sperimentale Abruzzo e Molise “G. Capor Istituto Zooprofilattico Sperimentale Abruzzo e Molise “G. Capor ale” ale” 9 marzo 2009 9 marzo 2009 Alternative alla sperimentazione animale nello studio e Alternative alla sperimentazione animale nello studio e rilevazione delle biotossine marine rilevazione delle biotossine marine
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Utilizzo di metodi biologici alternativi Utilizzo di metodi biologici alternativi alla sperimentazione animalealla sperimentazione animale
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Abruzzo e Molise “G. CaporIstituto Zooprofilattico Sperimentale Abruzzo e Molise “G. Caporale” ale”
9 marzo 20099 marzo 2009
Alternative alla sperimentazione animale nello studio e Alternative alla sperimentazione animale nello studio e rilevazione delle biotossine marinerilevazione delle biotossine marine
The Priciples of Human Experimental TechniqueThe Priciples of Human Experimental Technique(Russel e Burch, 1959) Russel e Burch, 1959)
Strategia per ottenere il maggior beneficio possibile Strategia per ottenere il maggior beneficio possibile dalla sperimentazione, minimizzando la perdita di vite dalla sperimentazione, minimizzando la perdita di vite animalianimali
Direttiva del Consiglio 86/609/CEEDirettiva del Consiglio 86/609/CEE
Art. 7.2: “Si eviterà di eseguire un esperimento qualora per otArt. 7.2: “Si eviterà di eseguire un esperimento qualora per ottenere tenere il risultato ricercato sia ragionevolmente e praticamente applicil risultato ricercato sia ragionevolmente e praticamente applicabile abile un altro metodo, scientificamente valido, che non implichi l’impun altro metodo, scientificamente valido, che non implichi l’impiego di iego di animali”animali”
Art. 23.1: “La Commissione e gli Stati Membri dovrebbero Art. 23.1: “La Commissione e gli Stati Membri dovrebbero incoraggiare la ricerca intesa a sviluppare e rendere più efficaincoraggiare la ricerca intesa a sviluppare e rendere più efficaci ci tecniche alternative atte a fornire lo steso livello d’informazitecniche alternative atte a fornire lo steso livello d’informazione one degli esperimenti su animali […]”degli esperimenti su animali […]”
Decreto Legislativo 27 gennaio 1992, n. 116Decreto Legislativo 27 gennaio 1992, n. 116
Attuazione della CEE 609/86Attuazione della CEE 609/86
Art. 4.1: “Gli esperimenti […] possono essere eseguiti soltanto Art. 4.1: “Gli esperimenti […] possono essere eseguiti soltanto quando, per ottenere il risultato cercato, non sia possibile impquando, per ottenere il risultato cercato, non sia possibile impiegare iegare un altro metodo scientificamente valido, ragionevolmente e un altro metodo scientificamente valido, ragionevolmente e praticamente applicabile, che non implichi l’uso degli animali”praticamente applicabile, che non implichi l’uso degli animali”
Art. 17.1: “Nella programmazione dei piani di ricerca scientificArt. 17.1: “Nella programmazione dei piani di ricerca scientifica a applicata alla sanità umana e animale ed alla salubrità dell’ambapplicata alla sanità umana e animale ed alla salubrità dell’ambiente, iente, saranno preferiti, ove possibile:saranno preferiti, ove possibile:
a) quelli che non si avvalgono di sperimentazione animale […]”a) quelli che non si avvalgono di sperimentazione animale […]”
Normativa italiana di riferimentoNormativa italiana di riferimento
Applicazioni DL n.116Applicazioni DL n.116Circ. n.32 (26 agosto 1992) Circ. n.32 (26 agosto 1992) Circ. n.17 (5 maggio 1993) Circ. n.17 (5 maggio 1993) Circ. n.18 ( 5 maggio 1993) Circ. n.18 ( 5 maggio 1993) Circ. n.8 (22 aprile 1994) Circ. n.8 (22 aprile 1994) Circ. n.6 (14 maggio 2001)Circ. n.6 (14 maggio 2001)
DM 29 settembre 1995:DM 29 settembre 1995: Riconoscimento titoli di laurea Riconoscimento titoli di laurea idonei ai fini della sperimentazione animale idonei ai fini della sperimentazione animale
Legge n.413/1993: Legge n.413/1993: Norme sull’obiezione di coscienza alla Norme sull’obiezione di coscienza alla sperimentazione animalesperimentazione animale
Raccomandazione CEE 18 giugno 2007Raccomandazione CEE 18 giugno 2007
Linee guida per la sistemazione e tutela degli animali da Linee guida per la sistemazione e tutela degli animali da esperimentoesperimento
Parte generale: sistemazione, alloggio e tutela degli animaliParte generale: sistemazione, alloggio e tutela degli animali
Parti specifiche: informazioni sulle specie più comunemente usatParti specifiche: informazioni sulle specie più comunemente usatee
Proposta di Direttiva CE (Novembre 2008)Proposta di Direttiva CE (Novembre 2008)
Sostiene la strategia globale della Commissione sulla Sostiene la strategia globale della Commissione sulla sperimentazione animalesperimentazione animale
Finalizzata ad assicurare maggiore promozione dello sviluppo Finalizzata ad assicurare maggiore promozione dello sviluppo di metodi alternatividi metodi alternativi
Quali sono i metodi alternativi?Quali sono i metodi alternativi?
Qualunque procedura che sostituisca l’uso degli animali, Qualunque procedura che sostituisca l’uso degli animali, ne riduca il numero e/o ne ottimizzi il benesserene riduca il numero e/o ne ottimizzi il benessere
Metodi biologiciMetodi biologici
Colture di procarioti, cellule, tessuti e organi isolatiColture di procarioti, cellule, tessuti e organi isolati
Vantaggi:Vantaggi: studio di funzioni altamente differenziatestudio di funzioni altamente differenziate,,meccanismi cellulari e molecolarimeccanismi cellulari e molecolari
Svantaggi: Svantaggi: uutilizzo ditilizzo di un un sistema semplificatosistema semplificato, , estrapolazione dei datiestrapolazione dei dati ex vitroex vitro in vivoin vivo
Metodi biologiciMetodi biologici
MTT test: MTT test: valuta la diminuzione di valuta la diminuzione di vitalità cellulare
Microtox: Microtox: valuta il decremento valuta il decremento di luminescenza vitalità cellularedi luminescenza
Metodi chimiciMetodi chimici
Corrositex:Corrositex: valuta l’effetto irritante o corrosivo valuta l’effetto irritante o corrosivo su un modello artificiale di pelle umanasu un modello artificiale di pelle umana
QSAR (Quantitative Structure Activity RelationshipQSAR (Quantitative Structure Activity Relationship): ): collega la tossicità con la struttura molecolarecollega la tossicità con la struttura molecolare
Ricerca corrente 2006 IZS AM 09/06 Ricerca corrente 2006 IZS AM 09/06
OBIETTIVO: OBIETTIVO:
applicazione di un modello tossicologico applicazione di un modello tossicologico in vitroin vitro che studi gli effetti che studi gli effetti delle delle yessotossineyessotossine ((YTXsYTXs) su linee cellulari confrontando ) su linee cellulari confrontando l’efficienza della nuova metodica diagnostica con il MBAl’efficienza della nuova metodica diagnostica con il MBA
Progetto presentato da: IZS AMProgetto presentato da: IZS AM
Area tematica: Benessere animaleArea tematica: Benessere animale
Resonsabile Scientifico: Prof. G.P. RossiniResonsabile Scientifico: Prof. G.P. Rossini
Procedura di Dosaggio funzionale delle YTXsProcedura di Dosaggio funzionale delle YTXs
Principio del metodo: capacità delle YTXs di indurre una Principio del metodo: capacità delle YTXs di indurre una risposta doserisposta dose--dipendente su colture cellularidipendente su colture cellulari
Procedura Operativa Standard 27 Giugno 2007 Procedura Operativa Standard 27 Giugno 2007 (Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Modena e Regg(Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Modena e Reggio Emilia)io Emilia)
Patent application No PCT/EP01/07487Patent application No PCT/EP01/07487
YESSOTOSSINE (YTXs)YESSOTOSSINE (YTXs)
Polieteri solforati, capaci di causare la morte Polieteri solforati, capaci di causare la morte dei topi da esperimento se iniettate i.p.dei topi da esperimento se iniettate i.p.
EE--caderina: glicoproteina transcaderina: glicoproteina trans--membrana che media membrana che media l’adesione cellulare in presenza di Cal’adesione cellulare in presenza di Ca2+2+
AR = IR ECRAAR = IR ECRA100 100 / IR ECRA/ IR ECRA100100MAXMAX
Dosaggio funzionale YTXsDosaggio funzionale YTXs
Elaborazione dati con SigmaPlot 11 e creazione di una curva staElaborazione dati con SigmaPlot 11 e creazione di una curva standardndardCurva Standard CRM-YTX (Teramo)
Concentrazione nM
0 1 2 3
Attiv
ità R
elat
iva
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
[nM] vs AR
Sigmoide a 5 parametriSigmoide a 5 parametri
Dall’interpolazione dei valori di AR dei campioni incogniti si Dall’interpolazione dei valori di AR dei campioni incogniti si ottiene il valore di ottiene il valore di mgmgeqeqYTX/kg p.e.YTX/kg p.e.
esp# diluizione AU E-cad AU E100 AU S IR E100 IR E100 medi IR E100 max AR AR medi nME ngeq YTX pz.1A 1793,75323 0 1793,75 0,00 0,70 41,57 0,00 0,021B 1960,52743 27,7417 1988,27 1,40 41,57 0,03
I differenti test forniscono risultati confrontabiliI differenti test forniscono risultati confrontabili
BibliografiaBibliografia
Callegari F., Rossini G.P. Yessotoxin inhibit the complete degraCallegari F., Rossini G.P. Yessotoxin inhibit the complete degradation of Edation of E--cadherin. 2008. cadherin. 2008. ToxicologyToxicology, , 244244:133:133--144.144.
Hess P., Grune B., Anderson D. B., Aune T., Botana L. M., CaricaHess P., Grune B., Anderson D. B., Aune T., Botana L. M., Caricato P., van Egmond H.P., to P., van Egmond H.P., Halder M., Hall S., Lawrence J.F., Moffat C., Poletti R., RichmoHalder M., Hall S., Lawrence J.F., Moffat C., Poletti R., Richmond J., Rossini G.P., Seamer nd J., Rossini G.P., Seamer C., Vilageliu J.S. Three Rs Approaches in Marine Biotoxin TestinC., Vilageliu J.S. Three Rs Approaches in Marine Biotoxin Testing. The Report and g. The Report and Recommendation of a joint ECVAM/DG SANCO Workshop (ECVAM WorkshoRecommendation of a joint ECVAM/DG SANCO Workshop (ECVAM Workshop 55). 2006. p 55). 2006. ATLAATLA,, 3434:193:193--224.224.
Panzini G., Lorenzini R.N. Animali experimentation in Italy. LegPanzini G., Lorenzini R.N. Animali experimentation in Italy. Legislation and the islation and the authorization of research protocols. 2004. authorization of research protocols. 2004. Ann Ist Super SanitàAnn Ist Super Sanità, , 4040:205:205--210.210.
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Ronzitti G., Rossini G.P. Yessotoxin induces the accumulation ofRonzitti G., Rossini G.P. Yessotoxin induces the accumulation of altered Ealtered E--cadherin dimers cadherin dimers that are not part of adhesive structures in intact cells. 2008. that are not part of adhesive structures in intact cells. 2008. Toxicology,Toxicology, 244244:145:145--156.156.
Se qualcuno sostenesse che, non diversamente che i frutti della Se qualcuno sostenesse che, non diversamente che i frutti della terra, il dio ci ha dato anche gli animali per terra, il dio ci ha dato anche gli animali per il nostro uso, è comunque vero che, sacrificando esseri viventi,il nostro uso, è comunque vero che, sacrificando esseri viventi, si commette contro di loro un’ingiustizia, si commette contro di loro un’ingiustizia,
perché si fa rapina della loro vita....perché si fa rapina della loro vita....
Teofrasto, Metafisica
Io speriamo che me la Io speriamo che me la cavo!!!cavo!!!