INGINERIA CROMOZOMIAL I UTILIZAREA EI N AMELIORAREA
PLANTELORVariabilitatea genetic la plante , poate fi cauzat i de
mutaii genomice , care provoac variatii ale numrului de cromozomi
din celule. n funcie de cromozomii afectai , mutaiile de genom pot
fi: reprezentate de multiplicri ale ntregului set de cromozomi(
EUPLOIDIE) sau modificarea unuia sau mai multor cromozomi din genom
( ANEUPLOIDIE). POLIPLOIDIE AUTOPOLIPLOIDIE EUPLOIDIE
ALOPOLIPLOIDIEHAPLOIDIE MONOHAPLOIDIE POLIHAPLOIDIEOLIGOSOMIE
MONOSOMIEANEUPLOIDIE NULISOMIEPOLISOMIE TRISOMIE
TETRASOMIEVariaiile numrului de cromozomi apar natural , sub
influena condiiilor de mediu , pe perioade mari de timp i su
frecven relativ redus.Ingineria cromozomial se ocup cu manipularea
cromozomilor ntregi sau a unor segmente a acestora n vederea
folosirii genotipurilor astfel obinute n lucrri de genetic i
ameliorare.POLIPLOIDIA I UTILIZAREA EI N AMELIORAREPoliploizii
reprezint euploizi care au un multiplu al numrului de baz de
cromozomi (x) seturi cromozomiale care provin de la formele
parentale sau obinute n urma unor tratamente de multiplicare.
Diversele variaii ale numrului de cromozomi determin lrgirea
diversitii genetice i a bazei de selecie pentru activitatea de
ameliorare. n funcie de originea i modul lor de obinere ,
poliploizii pot fi:AUTOPOLIPLOIZII : se obin prin multiplicarea
numrului de baz al cromozomilor , astfel acetia vor avea trei sau
mai multe garnituri de cromozomi. n funcie de gradul de ploidie ,
seturile de cromozomi sunt perfect omoloage . Pe cale natural s-au
format diferite specii de cultur autotetraploide: lucerna ,
arahidele , cartoful , batatul (cartoful dulce) , arborele de cafea
, unele forme de vi-de-vie.ALOPOLIPLOIZII : au seturi cromozomiale
strine , obinute n urma unor hibridri interspecifice sau
intergenice , urmate de dublarea numrului de cromozomi , caz n care
seturile de cromozomi manifest ntre ele o omologie parial sau
uneori sunt total diferite.ABAxBAABB
2n=4 2n=62n=5 2n=10Cele dou tipuri de poliploidie nu pot fi
complet separate , existnd situaii n care formele poliploide au i
seturi cromozomiale strine alturi de o multiplicare a seturilor
proprii ale cromozomilor. Pe cale natural , se consider c
aproximativ 30% din speciile vegetale sunt de natur
poliploid.Poliploidia este , n general , asociat cu o cretere a
dimensiunii celulelor i a organelor vegetative , caractere ce
prezint interes pentru anumite specii de cultur.
AUTOPOLIPLOIDIA I UTILIZAREA EI N AMELIORAREA PLANTELORPrin
multiplicarea seturilor de cromozomi , au loc modificri la nivelul
morfo-fiziologic i biochimic , care se exteriorizeaz la nivelul
fenotipic la majoritatea oragnelor plantei. Frunzele plantelor
poliploide sunt mai mari , mai groase , prezentnd modificri ale
culorii i formei sau a poziiei plantelor (culoare mai intens , limb
grofat-ncreit ceea ce face ca absoria luminii s fie mai eficient).
Tulpina poliploizilor este mai viguroas , iar sistemul radicular
mai puternic dezvoltat. Florile , fructele i seminele poliploizilor
sunt mai mari dar mai puine.Ritmul de cretere al poliploizilor este
mai lent , plantele nfloresc mai trziu i au o perioad de vegetaie
mai lung. n unele cazuri , poliploizii sunt superiori ca vigoare fa
de formele din care provin , aprnd fenomenul numit gigantism , cu
excepia poliploizilor care provin de la formele diploide cu numr
mare de cromozomi , a cror vigoare este mai redus.Genotipurile
prezint deosebiri evidente ntre ele n ceea ce privete reacia la
poliploidizare , astfel este necesar testarea unui numr mare de
genotipuri pentru a gsi forme poliploide viguroase. Comparativ cu
formele diploide , poliploizii prezint fertilitate mai redus ,
datorit unor deranjamente ce apar n timpul fecundrii i formrii
polenului. n ceea ce privete eficiena utilizrii poliploizilor n
ameliorare , se iau n considerare urmtoarele principii:
Autopoliploizii manifest o cretere superioar , asociat cu o
fertilitate mai redus , astfel producia de semine a acestora este
mai limitat , aceste forme prezint importan n ameliorarea speciilor
furajere i a celor leguminoase sau ornamentale. Pretabilitatea la
autopoliploidizare este mai mare la speciile cu numr mai mic de
cromozomi , care permit obinerea unor forme valoroase fertile , n
schimb la speciile cu numr mare de cromozomi , autopoliploidizarea
determin o depire a numrului optim de cromozomi compatibili cu
fertilitatea i productivitatea Speciile alogame ofer rezultate
superioare prin aceast metod , fa de autogame n vederea
identificrii unor genotipuri poliploide superioare , este necesar o
populaie ct mai larg , care se obine mult mai uor la alogame
comparativ cu autogamele.
ETAPELE AMELIORRII PRIN AUTOPOLIPLOIDIE
1. Inducerea ploidiei se realizeaz cu colchicin , extras din
Colchicum autumnale sau Brndua de toamn (C22H25O6N) , care blocheaz
activitatea fusului de diviziune , astfel nct cromozomii nu mai pot
migra la poli. Colchicina se aplic pe regiuni meristematice prin
pulverizare sau frecare cu past de lanolin. Aplicarea se realizeaz
la semine germinate , plantule , rdcini sau muguri iar pentru a
spori eficiena tratamentului i pentru a mpiedica evaporarea ,
soluiei i se adaug i agar sau glicerin. Tratamentul se aplic
dimineaa , cnd frecvena diviziunii este maxim. La monocotiledonate
(gru) se aplic o concentraie de 0,25% Colchicin , timp de 50-60 de
minute , iar la dicotiledonate 1-2% timp de cteva ore. Protocolul
tratamentului difer n funcie de specie i de stadiul de dezvoltare
al organelor tratate. Seminele se imerseaz n soluie de Colchicin
12-24h n funcie de specie.2. Identificarea autopoliploizilor se
poate realiza: Indirect : n funcie de anumite corelaii stabilite
ntre gradul de ploidie i unele caractere ale plantei: dimensiunea i
densitatea stomatelor , numrul i mrimea cloroplastelor ,etc. Direct
: prin determinarea numrului de cromozomi cu ajutorul unor analize
citologice3. Selecia i utilizarea autopoliploizilor : folosirea
eficient a autoploizilor depinde de dimensiunea i variabilitatea
materialului iniial , avnd n vedere c numai o mic parte din formele
obinute sunt valoroase. Selecia aplicat este identic cu cea
utilizat la formele mutanta, n F1 poliploizii fiind inferiori
formelor diploide i avnd cerine aparte fa de condiiile de mediu. n
F2 raporturile de segregare sunt mult mai complexe comparativ cu
diploizii. Selecia la aceste forme necesit analizarea unui numr
mare de indivizi , de unde pot fi reinute forme valoroase ce urmeaz
a fi testate n vederea introducerii lor n producie , sau pot fi
utilizate ca genitori n hibridare. La alogame , prin hibridarea
autopoliploizilor , se pot obine forme superioare genitorilor ,
care manifest o vigoare asemntoare cu cea obinut prin heterozis ,
deoarece la autopoliploizi nivelul fertilitii este redus , selecia
avnd ca scop i identificarea unor forme cu vitalitate superioar
care s asigure fertilitate.La secar , formele tetraploide prezint
boabe mai mari ns cu o producie de semine egal sau uor superioar
formelor diploide , prezint un pai mai gros i mai rezistent la
cdere iar nsuirile de panificaie ale boabelor sunt mai bune
comparativ cu formele diploide.La orz , soiurile tetraploide au
tulpina mai groas , frunze mai mari , spice mai lungi i boabe mai
grele.Introducerea acestora n cultur este condiionat de
sterilitatea spicului , fiind ns recomandate pentru cultura de
furaj pentru mas verde.La trifoi , formele tetraploide prezint o
mas vegetativ superioar , ns datoritmai multor factori , producerea
de smn este foarte redus , astfel , numrul de flori este redus ,
corola are tub foarte lung , apare avortarea embrionilor i
pierderea de cromozomi. Triploizii se obin prin fecundarea ovulului
cu un numr redus de cromozomi (2x) de ctre un gamet mascul cu numr
normal de cromozomi , astfel de forme se pot obine la specii unde
exist diploizi i tetraploizi.
2n=2xx*2n=4x
n=x n=x n=2x n=2x
2n=3x sterilFormele triploide sterile pot fi utilizate n
producie la speciile unde partea vegetativ prezint interes.La sfecl
, triploizii prezint o suprafa foliar mai mare care determin o
cretere a produciei de rdcini de 20-30% i o rezisten mai mare la
secet i boli. Datorit sterilitii acestor forme , producerea de smn
triploid se realizeaz n loturi de hibridare , prin cultivarea
alternativ a formelor diploide i tetraploide , urmnd ca smna obinut
s fie majoritar diploid. Obinerea unor forme triploide 100%
presupune folosirea unor forme androsterile.La pepeni , formele
triploide produc fructe fr semine , superioare ca valoare comercial
formelor diploide.La via-de-vie se obin forme triploide i
tetraploide prin colchinizare. Formele tetraploide au un numr redus
de semine , numr redus de ciorchini pe butuc ns boabele sunt mai
mari. Formele triploide nu prezint semine , fiind foarte valoroase
pentru producerea de stafide sau consum.
ALOPOLIPLOIDIA I UTILIZAREA EI N AMELIORAREA
PLANTELORAlopoliploizii se obin prin hibridare ndeprtat ,
interspecific sau intergenic , urmat apoi de dublarea numrului de
cromozomi. Prin alopoliploidie se reface fertilitatea hibrizilor
ndeprtai , asigurndu-se i o barier ntre noua form i formele
parentale , eliminndu-se posibilitatea ncrucirii acestora.ntre
genomurile unui aloploid poate exista o complet lips de omologie ,
sau poate exista o omologie parial , n cazul n care genomurile sunt
diferite , n meioz , prin mperecherea genomurilor omoloage se
formeaz cromozomi bivaleni i aloploidul se numete
genomial-amfiploid.n cazul n care genomurile sunt parial omoloage ,
n meioz , pe lng bivaleni rezult i trivaleni , tretravaleni , care
afecteaz fertilitatea.Alopoliploizii de segmentaie reprezint o mare
parte din formele speciilor cultivate , care au aprut pe cale
natural prin hibridare ndeprtat i prin restaurarea numrului de
cromozomi: Triticale 2n=6x=42(hexaploid), 2n=8x=56(octaploid)
Triticum durum AABB 2n=4x=28 Avena sativa AABBCC2n=6x=42 Solanum
tuberosum2n=4x=48
UTILIZAREA ALOPOLIPLOIZILOR N AMELIORAEA PLANTELOR
Inducerea alopoliploizilor presupune o alegere atent a formelor
parentale avndu-se n vedere relaiile dintre genomurile acestora.
Speciile parentale trebuie s fie suficient de nrudite pentru a se
putea realiza hibridarea , dar suficient de ndeprtate pentru ca
genomurile s fie neomoloage i s formeze cromozomi univaleni , care
prin colchinizare vor deveni bivaleni. De la fiecare printe se aleg
genotipurile cele mai valoroase.Eliminarea caracterelor nedorite la
aloploizi este foarte dificil , pentru c dublarea numrului de
cromozomi inhib segregarea. Importana alopoliploidiei n ameliorare
const n faptul c permite identificarea originii genetice a unei
specii i stabilirea relaiilor dintre acestea. Este posibil crearea
de noi genotipuri i specii de cultur care s mbine avantajele a dou
specii parentale. Prin utilizarea acestor forme este posibil
transferarea unor gene de la o specie la alta (gene de rezisten ,
adaptare).
UTILIZAREA HAPLOIZILOR N AMELIORAREA PLANTELORHaploizii posed n
celulele somatice acelai numr de cromozomi ca n gamei , astfel ei
au un singur cromozom din fiecare pereche , iar genele plasate pe
acetia se manifest n totalitate(stare de homozigoie). Datorit
acestei stri de homozigoie , haploizii au vigoare redus i sunt
sterili , astfel c ei se folosesc pentru dublarea numrului de
cromozomi i obinerea de organisme 100% homozigote.Haploidia n
ameliorare permite scurtarea considerabil a duratei necesare
formrii homozigoilor , care , n cazul plantelor alogame necesit 7-8
generaii de autopolenizare pentru a fi obinui. La speciile alogame
incompatibile (secar,trifoi) , pe cale clasic , homozigoii se obin
n numr foarte redus , au vitalitate redus , iar haploidia rezolv
foarte eficient problema formelor homozigote.La autogame ,
haploidia permite scurtarea procesului de ameliorare , prin
reducerea timpului necesar analizei generaiilor segregante. Liniile
dublu haploide obinute se pot utiliza direct n ameliorare , se pot
testa , n vederea obinerii de soiuri noi sau pot fi utilizate ca
material iniial.n mod natural , obinerea haploidiei este o urmare a
unor procese apomictice (partenogenez,apogamie) dar frecvena
acestui fenomen este redus (1 la 10000) i astfel , artificial s-au
elaborat diferite procedee care permit obinerea de randamente
corespunztoare a haploizilor ( se formeaz natural i prin
poliembrionie)La orz , se folosete cu succes metoda bulbosum, care
presupune ncruciarea orzului cultivat cu Hordeum bulbosum , specie
peren slbatic. Zigotul hibrid obinut pierde n primele stadii de
dezvoltare cromozomii de la Hordeum bulbosum , iar embrionul devine
haploid ,rmnnd doar cromozomii de la orz cultivat. Embrionul nu
poate supravieui dect pe mediu de cultur , obinndu-se o plant
haploid ce se poate trata cu colchicin. Se pot obine haploizi i
prin hibridri interspecifice ca: gru x porumb , orz x secar
,etc.Androgeneza presupune obinerea de haploizi prin cultur in
vitro de antere sau polen , printr-o mitoz ce formeaz un nucleu
vegetativ i unul generativ care ulterior degenereaz = plantele
haploide sau uneori prin mitoz anormal , formndu-se 2 nuclei
identici iar unul dintre acetia degenereaz , cel rmas caluseaz i
apoi determin apariia haploizilor. Eficiena depinde de: genotip ,
stadiul de dezvoltare al polenului , compoziia mediului de cultur i
starea fiziologic a plantelor donor.Ginogeneza utilizeaz ovule ,
ovare sau flori nepolenizate pentru obinerea plantelor haploide in
vitro. Reuita depinde de originea plantelor formate care uneori pot
deriva din sacul embrionar i nu din gamei. Selecia haploizilor se
face la nivel fenotipic pe baza unor observaii legate de vigoarea i
vitalitatea acestora , iar la nivel citologic , se face analiznd
numrul de cromozomi cu markeri moleculari de selecie.
UTILIZAREA GENELOR HAP N AMELIORAREA PLANTELORGenele hap au fost
identificate la o linie mutant de orz , obinut n urma tratrii cu
EMS (etil-metil-sulfonat) , ele sunt gene majore (oligogene) ce
controleaz avortarea sau supravieuirea embrionilor i endospermelor
anormale , favoriznd formarea i supravieuirea haploizilor. Genele
hap se transmit doar pe linie matern ( citoplasmatice) i acioneaz
fie mpiedicnd fecundarea nucleului , fie stimulnd nucleul respectiv
s se divid prematur , rezultnd astfel embrioni haploizi. Linia
mutant produce n descenden o frecven de 11-14% plante haploide
(prin autopolenizare). Prin ncruciarea unei plante homozigote ,
pentru gena hap , utilizat ca genitor matern , cu un soi oarecare ,
se obine n descenden o frecven de 8% haploizi. ncruciarea reciproc
a celor 2 forme nu produce haploizi. Prin diferite ncruciri ntre
forme cu gene hap s-a observat c vigoarea si vitalitatea
haploizilor obinui este diferit , fiind influenat de genotipul
formei paterne. Avantajul acesti metode de obinere a haploizilor
const n faptul c nu sunt necesare tehnici i echipamente speciale ,
iar plantele haploide pot fi obinute n orice generaie segregant a
plantelor haploide.Eficiena haploidiei n ameliorarea plantelor
depinde de msura asigurrii urmtoarelor condiii: Producerea unui
numr mare de linii dublu haploide cu uurin i cu diferite genotipuri
Populaia de linii dublu haploide s conin o prob randomizat a
gameilor parentali Formele dublu haploide s fie normale din punct
de vedere genetic i s fie stabile Frecvena haploizilor este
influenat de genotip i de condiiile de mediu(fitohormoni ,
temperatur , lumin) astfel c exist situaii n care acelai genotip
furnizeaz haploizi cu frecvene diferite sau nu produce haploizi n
anumite condiii. Mediul de cultur i tratamentul cu colchicin
determin adesea apariia unor variaii somaclonale , deviaii de la
genotipurile originale , proces care complic uneori activitatea de
ameliorare.
ANEUPLOIDIA I IMPORTANA EI N AMELIORAREA PLANTELOR
Aneuploidia este fenomenul prin care are loc o variaie a
numrului de cromozomi din genom , nefiin afectate garniturile
complete de cromozomi , ci doar anumii cromozomi care pot lipsi sau
pot fi n exces. n funcie de abaterile numrului de cromozomi
aneuploizii pot fi: nulisomi 2n-2:lipsete o pereche de cromozomi
monosomi 2n-1: lipsete un cromozom dintr-o pereche trisomi 2n+1:
prezint un cromozom n plus ntr-o pereche tetrasomi 2n+2: prezint o
pereche n plusExist i aneuploizi care prezint abateri difereniate
ale numrului de cromozomi, precum monosomii pentru o pereche de
cromozomi i trisomi pentru alta 2n-1+1.Pe baza formelor aneuploide
s-au stabilit poziiile unor gene pe cromozom , respectiv rolul
cromozomilor n exprimarea fenotipic a caracterelor. Cele mai
utilizate sunt seriile de monosomi. Formele aneuploide pot fi
utilizate pentru adiia , substituia de cromozomi sau substituirea
de gene , procedee ce completeaz hibridarea , n urma creia , alturi
de genele utile se transmit i gene nevaloroase ameliorrii.Metoda
adiiei de cromozomi const n adugarea unui cromozom nou sau a unei
perechi de cromozomi de la o specie donor la o alta receptoare.
Liniile de adiie se obin prin ncruciarea a dou specii din acelai
gen sau din genuri diferite cu cromozomi neomologi. Hibridul iniial
se colchinizeaz pentru a deveni fertil , obinndu-se un amfiploid
(aloploid) care se back-croseaz de 3-4 ori cu forma receptoare. n
generaiile de back-cross , pe lng plantele aloploide apar i cteva
plante aneuploide care conin suplimentar unul sau mai muli
cromozomi la specia donor. Valoarea acestor aneuploizi este dat de
caracterele pe care le controleaz genele de pe cromozomii
suplimentari. Aceste linii de adiie prezint stabilitate redus ,
astfel acestea trebuiesc periodic analizate citologic. S-au
transferat prin aceast metod gene de rezisten la boli diferitelor
specii de cultur.Metoda substituiei de cromozomi const n transferul
unei gene valoroase de la o specie la alta , prin nlocuirea unei
perechi de cromozomi de la specia receptoare , cu o pereche omoloag
de cromozomi de la o specie donor , obinndu-se astfel linii de
substituie. Substituia este mai important ca adiia n ameliorare ,
fiind pretabil la speciile la care absena unui cromozom sau a unei
perechi de cromozomi este compatibil cu supravieuirea plantei.
Realizarea substituiei presupune existena unei serii monosomice la
forma receptoare i identificarea cromozomilor cu genele de interes
la forma donor. Pentru obinerea unei linii de substituie, plantele
din forma deficient cromozomal (receptorul) se polenizeaz cu forma
valoroas, plantele din F1 se analizeaz citologic i se rein
monosomii care ulterior sunt back-crosai cu forma receptoare pn cnd
se reface genotipul acesteia , cu cromozomii transferai. Plantele
monosomice se autopolenizeaz i 25% devin disomice (diploide-stare
normal) i posed cromozomi cu genele valoroase.
METODELE NECONVENIONALE FOLOSITE N AMELIORAREA PLANTELOR
Ameliorarea neconvenional se bazeaz pe valorificarea prin
selecie a variabilitii genetice naturale i artificiale la speciile
de cultur. Aceast ramur a ameliorrii cuprinde tehnici pentru
producerea variabilitii la toate categoriile de specii , urmate de
identificarea i izolarea genotipurilor valoroase , ct i nmulirea
controlat a descendenilor. Noile genotipuri obinute posed gene
valoroase fie de la alte forme cultivate ale aceleiai specii , fie
de la forme slbatice nrudite. Rezultatele ameliorrii clasice
necesit un timp ndelungat , costuri ridicate i necesitatea
selectrii unui volum mare de material n cmp i
laborator.Biotehnologiile cuprind diferite tehnici care presupun
utilizarea unor organisme sau componente al acestora pentru a
mbuntii performanele genotipurilor cultivate. Implicarea
biotehnologiilor n ameliorare se numete ameliorare
neconvenional.Comparativ cu ameliorarea clasic , care se bazeaz pe
manipularea ntregului genom , biotehnologiile manipuleaz materialul
genetic la nivel molecular , completnd rezultatele ameliorrii
clasice sau realiznd obiective pe care aceasta nu le poate
ndeplini. Aportul biotehnologiilor n ameliorare a fost condiionat
de capacitatea celulelor vegetale de a reconstitui pe mediu
artificial , organismul din care provine.Biotehnologiile sunt
superioare metodelor clasice de ameliorare din punct de vedere a
sursei de gene , al gradului de modificare a genotipului i a
posibilitii de evaluare a rezultatelor obinute. Dac metodele
clasice folosesc surse de gene doar de la specii nrudite ,
compatibile sexual , prin biotehnologii , sursele de gene pot fi
foarte variate , fiind astfel reprezentate prin orice organism pro
sau eucariot. De asemenea metodele neconvenionale permit transferul
doar a unei singure gene , reducndu-se astfel considerabil timpul
necesar eliminrii genelor nedorite.Metodele biotehnologice permit
evaluarea extrem de precis a rezultatelor , identificndu-se ntr-o
perioad scurt de timp , genotipurile ce posed gene i caractere
utile.
UTILIZAREA CULTURILOR IN VITRO N AMELIORAREA PLANTELORTehnicile
de culturi in vitro au la baz totipotena celulelor vegetale ,
cumulate cu nsuiri de dedifereniere , astfel , n condiii de cultur
in vitro , celulele i pierd specializarea i regreseaz spre o stare
simpl , embrionar , recptndu-i capacitatea de diviziune i de a
forma mai multe celule care pot fi organizate sau nu.Dediferenierea
reprezint procesul prin care o colonie de celule nceteaz creterea
nedefinit i se organizeaz n vederea formrii unor organe
specializate ale unor plantule sau plante ntregi.Plantele
regenerate din culturi in vitro implic dou procese: organogeneza i
embriogeneza somatic.Organogeneza somatic presupune un proces de
dedifereniere a calusului , n urma cruia , n masa celular apar
primordii de muguri i rdcini.Prin dirijarea balanei hormonale , din
muguri se obin lstari (caulogenez) , care n partea bazal formeaz
rdcini (rizogenez).Embriogeneza somatic presupune iniierea formrii
de embrioni din calus sau celule izolate , embrionii somatici ,
asemenea celor obinui pe cale sexuat , au aceleiai componente i pot
genera plante ntregi. Aceste dou procese pot fi directe , dac se
trece de la celulele explantelor la plantul i indirecte , cnd apare
starea de calus sau suspensie celular. Tehnicile de culturi in
vitro pot fi utilizate pentru completarea i accelerarea metodelor
de ameliorare i pentru multiplicarea genotipurilor valoroase.
Micropropagarea permite obinerea unui numr mare de indivizi ,
identici din punct de vedere genetic , mai ales n cazul n care
cantitatea de material biologic este redus sau la speciile la care
coeficientul de nmulire este redus. Pe lng multiplicarea rapid ,
micropropagarea este foarte eficient n cazuri speciale ale
ameliorrii , precum nmulirea plantelor heterozigote sau
autoincompatibile , androsterile, etc.Micropropagarea se poate
realiza pe diferite ci : formarea de lstari adventivi , lstrirea
axilar multipl i embriogenez somatic.Lstarii adventivi se pot obine
prin organogenez direct i indirect. Lstarii axilari multiplii apar
la nivelul vrfului tulpinii i a mugurilor laterali , cea mai
eficient surs fiind din esut meristematic deoarece se reduc
variaiile genetice aprute ulterior.Embriogeneza somatic reprezint
calea cea mai eficient de accelerare a micropropagrii. Embrionii
somatici astfel obinui pot fi utilizai pentru regenerarea de plante
in vitro sau pentru obinerea seminelor artificiale.Producerea
seminelor artificiale are la baz ideea ncapsulrii embrionilor
somatici ntr-un mediu nutriional i ntr-o membran permeabil i
biodegradabil care va permite seminei artificiale s germineze n sol
i s dea natere la o plant identic cu cea de la care a fost prelevat
explantul original.Aplicarea n practic a acestei metodologii
necesit depirea unor impedimente practice i economice. O prim
problem const n nesincronizarea proceselor de formare a embrionilor
somatici ntr-o cultur i simultaneitatea redus a maturrii acestora.
Trebuie avut n vedere ca mediul de cultur conine embrioni de
diferite vrste i dimensiuni ( 1 ml suspensie celular -1x10la 6
celule -5000 embrioni)Alte probleme pot consta n stabilizarea
embrionilor n vederea stocrii acestora , astfel , n interiorul
seminei artificiale , embrionii s nu i continue dezvoltarea dar s
rmn viabili. n vederea izolrii embrionilor s-au realizat sisteme de
filtrare care permit trecerea doar a embrionilor cu un anumit grad
de dezvoltare.Embrionii izolai au fost ncapsuli n polimeri
biodegradabili care conin substane ce permit germinarea , creterea
i dezvoltarea plantulelor n primele faze ( nutrieni , fungicid ,
pesticid).Smna artificial poate fi realizat ntr-o perioad scurt de
timp (1-2 luni de la prelevarea explantului) , avnd i alte avantaje
teoretice i practice. Din punct de vedere genetic , ofer
posibilitatea obinerii de semine i de a spori variabilitatea la
specii la care , n mod natural , nu se produc semine.Se permite
meninerea formelor hibride valoroase fr a fi necesar meninerea
formelor parentale i ncruciarea acestora. La speciile autogame , se
permite obinerea de semine hibride la scar comercial. Sub aspect
fitosanitar , multiplicarea in vitro , respectiv includerea
embrionilor ntr-un nveli steril ar permite obinerea unor semine
sntoase ( libere de viroze). Din punct de vedere nutriional , n
capsulele protectoare se vor introduce diferii hormoni de cretere
sau ngrminte , respectiv , bacterii simbiotice la leguminoase
(Rhizobium).Producerea seminelor artificiale trebuie analizate
foarte detaliat i sub aspect economic , n funcie de raportul dintre
sporurile de producie obinute i cheltuielile necesare obinerii
acestor semine.
OBINEREA SETURILOR GENETICE LIBERE DE AGENI PATOGENI
Producerea de plante prin micromultiplicare ofer posibilitatea
eliminrii surselor de infectare i infestare cu ageni patogeni. n
acest sens , clonarea din explante prelevate din vrfuri
meristematice ofer plante libere de viroze. Practic , anumite
viroze nu sunt eliminate total nici prin acest procedeu , motiv
pentru care , la plantele obinute , trebuie efectuate teste pentru
identificarea prezenei virusurilor. Micropropagarea din vrfuri
meristematice se folosete pe scar larg pentru obinerea de plante
sntoase la speciile ornamentale , pomi i arbuti fructiferi ,
vi-de-vie , deasemenea poate fi utilizat i pentru obinerea i
multiplicarea unor linii ameliorate la specii unde infecia viral se
transmite prin semine. Dup testarea plantelor n vederea
identificrii nivelului de infestare , se iau msuri pentru evitarea
reinfectrii , respectiv , protecia plantelor sntoase fa de vectori
care transmit viroze (insecte fitofage).
UTILIZAREA CULTURILOR IN VITRO PENTRU PSTRAREA
GERMOPLASMEIEficiena acestei tehnici este foarte mare n cazurile n
care este nevoie de o multiplicare rapid a materialului valoros ,
ea permind pstrarea unui volum mare de material ntr-un spaiu redus
, ns necesit o dotare tehnic i echipamente
corespunztoare.Prelungirea duratei de pstrare se poate face pe o
perioad ndelungat , necesitnd realizarea unor subculturi.
Prelungirea longevitii materialului stocat necesit asigurarea unei
rate minime cretere care se realizeaz prin folosirea unui inhibitor
(acid abscisic) sau prin asigurarea unor condiii de ncetinire a
metabolismului , pn la un prag minim , compatibil cu
variabilitatea. Pe termen lung aceast metod de pstrare poate fi
asociat cu o instabilitate genetic i o reducere a potenialului
morfo-genetic al materialului. Instabilitatea genetic apare mai
ales n cazul culturilor de calus motiv pentru care acestea nu sunt
recomandate.Culturile de meristeme sunt suficiente pentru
conservarea germoplasmei , necesitnd subculturi dup maxim 3 ani.
Materialul obinut in vitro poate fi pstrat pe perioad ndelungat i
prin crioconservare n azot lichid (-196 grade) . Materialul supus
crioconservrii trebuie s aib un coninut redus de ap , n cazul
esuturilor meristematice n prealabil , se trateaz cu glicerol sau
dimetil-sulfoxid (crioprotectori). Utilizarea materialului obinut
in vitro pentru extragerea de ADN permite stocarea la nivel
genomial ( n bnci de gene).
VARIABILITATEA SOMACLONAL I UTILIZAREA EI N AMELIORAREA
PLANTELOR
n mod obinuit , plantele obinute in vitro sunt identice
fenotipic cu cele din care provin ,ns la unele caractere pot aprea
modificri datorate variabilitii somaclonale. Aceast variaie poate
fi att dominant ct i recesiv ,de natur genetic , meninndu-se n
descenden. Variaia poate fi i epigenetic , instabil , care se
pierde n generaiile viitoare.Intensitatea i frecvena variabilitii
somaclonale depinde de mai muli factori: Vrsta celulelor din cultur
Genotip Condiiile de microclimat Durata ciclului de cultur Natura
explantului Tipul de culturAmplitudinea variabilitii este influenat
pozitiv de folosirea unor culturi de calus nedifereniat i a
suspensiilor de celule , manifestndu-se la un nivel redus , n cazul
folosirii meristemelor sau vrfurilor de lstari.Varitiile
somaclonale reprezentate prin modificri ale structurii i a numrului
de cromozomi sunt cele mai frecvente , fiind instabile genetic i se
elimin pe parcursul generaiilor de nmulire sexuat. ntr-o frecven
considerabil , variaiile somaclonale produc i deficiene
clorofiliene , care la majoritatea speciilor sunt nefavorabile , cu
excepia unor plante ornamentale. Aceste variaii afecteaz att
caractere calitative ct i cantitative. n ceea ce privete efectul
asupra caracterelor cantitative s-a observat reducerea taliei ,
prelungirea perioadei de vegetaie , creterea numrului de tulpini ,
modificarea spicelor , rezisten la boli , erbicide sau factori de
stres abiotici.
Inducerea i selecia variaiilor genetice utile prin culturi in
vitro se poate face pe dou ci:1. Selecia la nivel de genotip :
presupune ca soiurile sau clonele deficiente pentru un anummit
caracter s fie cultivate in vitro , ulterior printe somaclonele
obinute se urmrete identificarea unora la care respectivul caracter
deficitat este corectat. Eficiena acestui tip de selecie se
stabilete n funcie de msura n care specia respectiv rspunde pozitiv
la regenerarea in vitro , existena unor tehnici adecvate de alegere
a plantelor regenerate pentru deficiena ce trebuie corectat i de
stabilitatea genetic a plantelor regenerate.2. Selecia la nivel
celular presupune obinerea unor culturi de celule din genotipul
valoros al unei specii care este deficient pentru o anumit nsuire
de rezisten i pentru care exist o tehnic bine cunoscut de selecie n
cultura de celule. Ulterior se aplic stresul respectiv tuturor
celulelor cu scopul de a inhiba creterea i dezvoltarea lor , cu
excepia celor rezistente la stres. Pe baza celulelor rezistente se
vor regenera plante ce vor manifesta acest caracter de rezisten.
Avantajul seleciei la nivel celular const n faptul c permite
creterea unui numr foarte mare de celule ntr-un spaiu limitat ,
care pot fi expuse factorului de stres n conditii uniforme de
microclimat , eliminndu-se n mare parte influena factorilor
externi.Printscreeningul celulelor n cultur poate identifica doar
caractere ce se exprim la nivel celular : rezisten la erbicide ,
antibiotice , metale grele , toxine patogene , temperaturi sczute
,etc. Genotipurile izolate se pot utiliza n ameliorare direct sau
indirect , ca material iniial sau surs de gene.Variabilitatea
somaclonal are ca principale dezavantaje: Caracterul ntmpltor ,
total nefavorabil Frecvena ridicat a formelor nevaloroase Nu
influeneaz caracterele de interes agricol
Variabilitatea somaclonal poate fi folosit ca o surs potenial de
mutante valoroasela speciile care au o baz genetic restrns (
vegetativ sau apomictice din pereii ovarului).Eficiena varaibilitii
depinde de posibilitatea reducerii frecvenei formelor nevaloroase i
sporirea randamentului seleciei formelor utile , care s se menin n
generaiile viitoare (sexuat).
HIBRIDAREA SEXUAT I PARASEXUAT IN VITRO
Metodele sexuate i parasexuate in vitro permit obinerea de
genotipuri recombinate , atunci cnd genitorii nu se pot hibrida
sexuat.1. Metoda de hibridare sexuat in vitro se folosete atunci
cnd exist barierele de incompatibilitate sau post zigotice.a)
Polenizarea i fecundarea in vitro const n recoltarea ovarelor sau
ovulelor nefecundate , cultivarea lor pe mediu nutritiv i pudrarea
lor cu polen proaspt. Prin plasarea pe mediu de cultur a organelor
sexuale de reproducere de la specii sau genuri diferite , n lipsa
unor substane inhibitoare produse de sporofitul matern este posibil
germinarea polenului i ulterior fecundarea i formarea unui embrion
hibrid ce are structuri seminale normale. Prin aceiai metod poate
fi depit autoincompatibilitatea plantelor alogame: hermafrodite i
monoice ,obinndu-se forme consanvinizate.b) Cultura de embrioni
imaturi se aplic n hibridri ndeprtate , unde exist bariere
postzigotice care determin o stopare a dezvoltrii embrionale
datorit incompatibilitii acestuia , cu endospermul , urmnd ca
embrionul hibrid s fie avortat. Embrionul imatur este prelevat i
cultivat pe un mediu adecvat dezvoltrii optime a acestuia. n unele
cazuri , pentru a permite obinerea unor embrioni viabili , se adaug
polen n cultura de embrioni. Tehnica de embriocultur poate elimina
neajunsurile repaosului germinal (dormans) i implicit se scurteaz
procesul de ameliorare.c) Cultura de ovule fecundate se folosete
pentru a salva embrionii interspecifici , fr ca acetia s fie s fie
scoi din ovul , permind cultura timpurie a ovulelor i embrionilor.
Embrionii din ovul beneficiaz de un mediu de cretere mai favorabil
dect cei prelevai din ovul.
Protoplatii se obin din celule somatice la care se ndeprteaz
peretele celular , fie prin centrifugare , fie cu ajutorul unor
enzime (celulaza , pectinaza). Numrul de protoplati ce pot fi
obinui este foarte mare ( 10-15x10la a 6 per gram) , dup obinerea
lor , protoplatii sunt cultivai pe medii ce le permit supravieuirea
i dezvoltarea. n vedera fuzionrii este necesar parcurgerea mai
multor etape :1. Obinerea de protoplati viabili de la speciile ce
urmeaz a fi hibridate2. Cultivarea n amestec i centrifugarea
protoplatilor de la cele dou specii , n prezena unui agent care s
favorizeze fuziunea protoplatilor (PEG-polietilenglicol)3. Plasarea
suspensiei de protoplati pe un mediu , n condiii optime de asepsie
, lumin i temperatur. n suspensia respectiv se gsesc protoplati
parentali , protoplati parentali fuzionai (de la acelai genitor) i
protoplati hibrizi fuzionai. Ulterior , este necesar folosirea unor
medii selective de cultur pe care protoplatii hibrizi supravieuiesc
i ceilali sunt eliminai.Protoplatii hibrizi selecionai trebuie s i
refac peretele celular , s se divid i s formeze o plantul. Asupra
plantelor obinute trebuie s se efectueze analize citologice n
vederea confirmrii originii hibride a acestora.Metoda obinerii i
fuziunii protoplatilor permite hibridarea ntre specii foarte
diferite , chiar dac hibrizii astfel obinui au utilitate redus
pentru ameliorarea plantelor.
CIBRIDIZAREA SOMATIC I ROLUL EI N AMELIORAREA PLANTELOR
Cibridizarea const n folosirea protoplatilor pentru transferul
organitelor celulare de la o specie la alta i obinerea unei
populaii hibride de organite , care nu se poate obine prin
hibridare sexuat. Organismele care posed citoplasm i organite
celulare de la o alt specie i nucleul de la alta se numesc cibrizi.
Prin aceast metod este posibil o sporire a variabilitii genetice ,
valorificndu-se materialul genetic extranuclear.
UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI N AMELIORAREA
PLANTELORRezultatele i eficiena ameliorrii convenionale depind
printre altele de posibilitatea de a identifica i cumula variaiile
genetice utile , avnd n vedere c majoritatea caracterelor de
interes sunt de natur poligenic fiind puternic influenate de
mediu.Pentru a spori eficiena programelor de ameliorare , au fost
folosite gene marcatoare sau markeri genetici. Markeri respectivi
prezint gene care controleaz caractere fenotipice cu determinism
genetic simplu i puin influenate de mediu , care sunt asociate cu
unele caractere de interes urmrite de ameliorator.Markerii
moleculari reprezint secvene scurte de ADN , strns nlnuite cu
caracterul de interes , astfel nct selecia pentru acest marker
asigur i selecia genelor implicate n determinismul caracterului de
dorit.Strategia utilizrii markerilor moleculari se bazeaz pe
evidenierea polimorfismului molecular , care la nivelul genomului
este datorat variiei cantitii de ADN repetitiv.Unitile repetitive
mici sub 10 bp se numesc minisatelii.Polimorfismul este considerat
ca o diferen (la nivelul de ADN ) care apare frecvent , n timp ce o
diferen care apare rar este considerat o mutaie.Markerii moleculari
pot fi folosii pentru: Clonarea genelor Cartarea genomului Selecia
asistat de markeri Determinarea amprentelor genetice n vederea
identificrii soiurilor i hibrizilor
TIPURI DE MARKERI MOLECULARI
Acetia se mpart n 2 categorii: Markeri RFLP Markeri pe baz de
PCR Markerii RFLP ( polimorfismul lungimii fragmentelor de
restricie) au cea mai larg utilizare la alctuirea hrilor genomice a
speciilor cultivate.Analizele respective utilizeaz diferenele ntre
scevene de nucleotide la nivelul crora endonucleazele de restricie
taie ADN-ul genomic.Aceast tehnic include: Extracia ADN-ului
genomic Digestia acestuia cu enzime de restricie slecionate
Testarea probei cu secvene de ADN cunoscuten cazul hrilor genetice
, aceast tehnic permite exprimarea numrului de loci implicai n
determinismul unui caracter cantitativ (QTL) i poziia acestora ,
deasemenea este posibil i detectarea QTL-urilor cu efecte
pleiotropice.Utilizarea acestor markeri este limitat de necesitatea
de a folosi pentru analiz o cantitate mare de ADN genomic , care
implic cheltuieli mari i o perioad mai lung de timp.
Tehnica pe baz de PCR ( reacia n lan a polimerazei) se folosete
pentru studiul variaiei secvenelor de ADN prin amplificarea
enzimatic pe baz de transcripie invers a unui segment specific de
ADN din ADN-ul genomic sau ARN. Ea nu necesit construcii genomice i
biblioteci de ADN complementar , fiind mai simplu de utilizat n
cazul existenei a unui numr mare de probe. Markeri RAPD
(polimorfismul ADN-ului amplificat randomizat) sunt utilizai pentru
construirea hrilor i analiza linkage-ului , bazndu-se pe diferena
dintre secvenele de ADN genomic , amplificat prin PCR , folosind
primeri scuri de oligonucleotide , dominani. Aceast tehnic nu
necesit primeri specifici ( primerii se pot folosi la diferite
specii)Odat ce au fost identificate benzile de ADN pot fi
secvenializate i clonate , generndu-se un marker cu o utilizare
larg. Comparativ cu RFLP-ul aceast tehnic necesit o cantitae mic de
ADN genomic , este mai simpl , mai ieftin , asigur un nivel ridicat
de polimorfism , att la nivel intra ct i inter
specific.Dezavantajul major al acestor markeri const n faptul c nu
face distincie ntre homozigoi i heterozigoi. Markerii AFLP
(polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate) sunt un produs
rezultat prin amplificarea selectiv a fragmentelor de ADN digerate
cu enzime de restricie.Dup fiecare reacie se produc benzi multiple.
Este o tehnic de natur cantitativ , care pe baza intensitii de
amplificare permite separarea homozigoilor i heterozigoilor.
Folosete primeri dominani , fiind o tehnic mai costisitoare
necesitnd echipamente care s asigure automatizarea operaiunilor.
Markerii SSR (secvene scurte repetate) reprezint o surs eficient de
polimorfism , utile pentru construirea hrilor genetice.
Microsateliii sunt alctuii din secvene simple de nucleotide ,
fiecare cu lungime de 1-6 bp.Necesit probe reduse de ADN , fiind
utilizai att n cartarea fenotipic ct i la identificarea speciilor
sau n studii de genetcia populaiilor.
Alegerea markerilor moleculari depinde de obiectivul urmrit i
anume: Construirea hrilor genetice Cartarea locilor pentru
caractere cantitative (QTL) Selecia asistat de markeri Determinarea
structurii populaiei Stabilirea diversitii genomului Preul de cost
Echipamente necesareMarkeri RFLP cartai ntr-o populaie pot fi
utilizai ca probe i pentru caracterizarea altei populaii din aceeai
specie , n tmp ce markerii RAPD pot fi folosii pentru
caracterizarea unor populaii i din specii diferite.n studiul de
sistematic i evoluionism markerii RFLP prezint avantaje comparativ
cu cei pe baz de PCR , deoarece ofer informaii pe baza unor
fragmente lungi de ADN , n timp ce markerii pe baz de PCR evalueaz
doar variaia unor fragmente de 20-40bp.n funcie de preul de cost
pentru alegerea sistemului de markeri , trebuie avut n vedere:
Timpul necesar pentru extragerea ADN-ului Cantitatea de ADN necesar
pentru analize Necesitatea clonrii i secvenializrii ADN-ului Tipul
i cantitatea de informaie genetic solicitat Tipul de markeri
(dominant , recesiv) Echipamentele existente i necesare Alegerea
sistemului de markeri pentru cartarea genelor i selecia asistat are
n vedere n primul rnd costuri reduse i un timp scurt de analiz ,
avnd n vedere c trebuie evaluai muli indivizi din fiecare
populaie.Oricare dintre sistemele de markeri folosite , trebuie s
asigure o eficien sporit comparativ cu metodele convenionale de
ameliorare , pentru a justifica cheltuielile necesare. 13