UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO UROŠ STANIČ RAZGRADNJA NEKATERIH ZDRAVILNIH UČINKOVIN IN NJIHOVIH METABOLITOV V SIMULIRANIH POGOJIH ČIŠČENJA ODPADNIH VODA DEGRADATION OF SELECTED PHARMACEUTICALS AND THEIR METABOLITES IN SIMULATED WASTE WATER TREATMENT CONDITIONS DIPLOMSKA NALOGA Ljubljana, 2010
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
UROŠ STANIČ
RAZGRADNJA NEKATERIH ZDRAVILNIH U ČINKOVIN IN NJIHOVIH METABOLITOV V SIMULIRANIH POGOJIH
ČIŠČENJA ODPADNIH VODA
DEGRADATION OF SELECTED PHARMACEUTICALS AND THEIR METABOLITES IN SIMULATED WASTE
WATER TREATMENT CONDITIONS
DIPLOMSKA NALOGA
Ljubljana, 2010
Diplomsko delo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo in na Odseku za znanosti o okolju
Instituta Jožef Stefan pod mentorstvom prof.dr. Marije Sollner Dolenc in somentorstvom
doc.dr. Ester Heath.
Mentorici prof.dr. Mariji Sollner Dolenc se zahvaljujem za pomoč in usmerjanje v času
diplomskega dela. Somentorici doc.dr. Ester Heath in dr. Tini Kosjek se iskreno
zahvaljujem za pomoč, svetovanje, potrpljenje in podporo tekom celotnega dela. Za pomoč
pri laboratorijskem delu se zahvaljujem Silvi Perko. Za dodatno pomoč pa se zahvaljujem
še Mihi Avberšku in Renatu Babiču.
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelal pod mentorstvom prof.dr. Marije
Sollner Dolenc in somentorstvom doc.dr. Ester Heath.
3.2.3 MEJNE VREDNOSTI PARAMETROV ODPADNE VODE ........................................ 29
4 NAMEN DELA........................................................................................................................ 30 5 MATERIALI IN METODE ..................................................................................................... 31
5.2.2 IZKORISTEK EKSTRAKCIJE IN KALIBRACIJA ...................................................... 34
5.2.3 PILOTNA ČISTILNA NAPRAVA IN VZORČENJE ................................................... 35
5.2.4 DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE ............................... 38
5.2.5 ANALIZNI POSTOPEK DOLOČANJA ANALITOV V VZORCIH............................ 40
6 REZULTATI IN RAZPRAVA ................................................................................................ 45 6.1 IZKORISTKI EKSTRAKCIJE IN LINEARNOST ANALIZNE METODE ........................ 45
6.2 MEJA ZAZNAVNOSTI ANALIZNE METODE ................................................................. 48
6.3 DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE ...................................... 49
6.7 PRIMERJAVA ODSTRANJEVANJA V SKLOPLJENIH IN AEROBNIH REAKTORJIH ...................................................................................................................................................... 71
7 SKLEP ...................................................................................................................................... 72 8 LITERATURA ......................................................................................................................... 74
2
1 POVZETEK
Zdravilne učinkovine in mnogi njihovi presnovki so biološko aktivne spojine, ki po
uporabi v humani ali veterinarski medicini po različnih poteh preidejo v okolje. Številne
raziskave so potrdile njihovo prisotnost v odpadnih, površinskih in podtalnih vodah, zato
smo lahko njihovemu vplivu posredno izpostavljeni z uživanjem pitne vode. Naraščajoča
poraba zdravilnih učinkovin je v začetku devetdesetih let prejšnjega stoletja pripeljala do
začetka obsežnejšega preučevanja njihovega vpliva na okolje.
V diplomskem delu smo preučevali odstranjevanje izbranih zdravilnih učinkovin in
njihovih presnovkov v pilotni čistilni napravi pod aerobnimi in anoksičnimi pogoji ter v
sklopljenem sistemu anoksični-aerobni reaktor. Z merjenjem vrednosti različnih kemijskih
parametrov (amonij, nitrat, nitrit, ortofosfat, kemijska in biokemijska potreba po kisiku)
smo potrdili procesa nitrifikacije v aerobnih ter denitrifikacije v anoksičnih pogojih. Kot
modelne spojine smo izbrali nesteroidne protivnetne učinkovine ibuprofen, naproksen,
ketoprofen in diklofenak, antiepileptik karbamazepin, klofibrinsko kislino, humani
presnovek lipidnega regulatorja klofibrata, presnovka karbamazepina akridin in akridon ter
1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on, presnovek diklofenaka. Visoka letna poraba učinkovin je
potrdila smiselnost njihovega izbora. Spojine smo iz vodnih vzorcev izolirali z ekstrakcijo
na trdnem nosilcu, pri tem smo raztopinam dodali interna standarda devteriran ibuprofen
za zdravilne učinkovine ter 9-kloroakridin za presnovke. Sledila je derivatizacija z N-
metil-N-(tercbutildimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamidom. Ločbo in analizo smo izvedli s
plinskim kromatografom z masno spektrometričnim detektorjem.
Izkoristki ekstrakcije so bili za vse spojine višji od 76 %. Odstranjevanje ibuprofena,
naproksena, ketoprofena in akridina v aerobnih pogojih je bilo več kot 90-odstotno,
medtem ko so se ostale spojine odstranjevale v manjši meri. V anoksičnih pogojih sta se
najbolje odstranjevala naproksen (87 %) in akridin (64 %), ostale spojine so se
odstranjevale manj kot 13-odstotno. V sklopljenih sistemih so se ibuprofen, naproksen in
ketoprofen statistično značilno bolje odstranjevali kot v posameznih reaktorjih, medtem ko
za druge spojine tega ne moremo trditi.
3
ABSTRACT
Pharmaceuticals and many of their metabolites are biologically active substances that
are used in human and veterinary medicine and subsequently reach the environment
through different pathways. Numerous studies have confirmed their presence in
wastewater, surface and subterranean water, thus we can be subject to their influence
indirectly through consuming drinking water. In the beginning of the 1990s, the increase in
consumption of pharmaceutical products led to the widespread study of their influence on
the environment.
In our work, we have studied the elimination of selected pharmaceuticals and their
metabolites in a pilot wastewater treatment plant under aerobic and anoxic conditions and
in the coupled anoxic-aerobic reactor system. By measuring various chemical parameters
(ammonia, nitrate, nitrite, orthophosphate, chemical and biochemical oxygen demand) we
have confirmed the processes of nitrification in aerobic conditions and denitrification in
anoxic conditions. The model substances used were the non-steroidal anti-inflammatory
drugs ibuprofen, naproxen, ketoprofen and diclofenac, the antiepileptic carbamazepine,
clofibric acid, the human metabolite of the lipid regulator clofibrate, the metabolites of
carbamazepine acridine and acridone, and 1-(2,6-dichlorophenyl)indolin-2-one, a
metabolite of diclofenac. The substantial yearly consumption of the pharmaceuticals
justified our selection. We have used solid phase extraction to isolate the compounds from
the water samples, adding the internal standards deuterated ibuprofen and 9-chloroacridine
(for pharmaceuticals and metabolites respectively) in the process. This was followed by
derivatization with N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)-2,2,2-trifluoroacetamide. We
have used gas chromatography coupled with a mass spectrometry detector to perform the
separation and analysis.
The extraction efficiency was above 76% for all studied compounds. The elimination
of ibuprofen, naproxen, ketoprofen and acridine in aerobic conditions was over 90%, while
other compounds were eliminated in a lesser degree. In anoxic conditions, only naproxen
(87%) and acridine (64%) were eliminated substantially, the elimination of all other
compounds was below 13%. The elimination of ibuprofen, naproxen and ketoprofen was
greater in the coupled system than in individual reactors to a statistically significant degree,
while we could not confirm the same for other compounds.
4
2 SEZNAM OKRAJŠAV
OKRAJŠAVA POMEN BPK5 biokemijska potreba po kisiku v petih dneh COX ciklooksigenaza (cyclooxygenase) DKFI 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on DMS dimetilsilil GC plinska kromatografija (gas chromatography)
GC-MS plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo (gas chromatography- mass spectrometry)
KPK kemijska potreba po kisiku LC tekočinska kromatografija (liquid chromatography) LLE ekstrakcija tekoče-tekoče (liquid-liquid extraction) LOD meja zaznavnosti (limit of detection) MS masna spektrometrija (mass spectrometry) MTBSTFA N-metil-N-(tercbutildimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamid RSD relativna standardna deviacija SCAN snemanje čez celotno masno območje SD standardna deviacija SIM snemanje izbranih ionov (selected ion monitoring) SPE ekstrakcija na trdnem nosilcu (solid phase extraction)
SPME mikroekstrakcija na trdnem nosilcu (solid phase microextraction)
učinkovine, ki se uporabljajo v humani in veterinarski medicini,
pridejo v površinske oz. podtalne vode in so posledi
kar je prikazano na Sliki 8.
Slika 8: Poti vnosa zdravil za humano medicino v vodno okolje
Zdravilne učinkovine, ki
prek urina in fecesa izločajo v kanalizacijo in pridejo do
spojinah pride do razgradnje
so odpornejše na razgradnjo in
ostajajo v blatu, odvisno od njihovih fizikalno
uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne u
podtalnico. Vir zdravilnih u
neuporabljenih zdravil (8).
Večina zdravilnih učinkovin, ki se uporablj
prehaja v prst. Del se jih tudi prek urina in fecesa pašnih živali direktno izlo
koder lahko ogrožajo podtalnico. V ribogojstvu se zdravilne u
hrani, uvajajo neposredno v vodo
teh uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne u
(npr. streptomicini) se uporabljajo v sadjarstvu in
12
ČINKOVINE V OKOLJU
ja poraba zdravilnih učinkovin je v začetku devetdesetih let 20. stoletja
preučevanja njihovega vpliva na okolje (Environmental Risk
, podobno kot se je to že izvajalo za toksične snovi.
inkovine, ki se uporabljajo v humani in veterinarski medicini, lahko
v površinske oz. podtalne vode in so posledično lahko prisotne tudi v pitni vodi
: Poti vnosa zdravil za humano medicino v vodno okolje
inkovine, ki se uporabljajo v humani medicini, in njihovi
čajo v kanalizacijo in pridejo do čistilnih naprav
gradnje v čistilnih napravah, druge spojine (oz. njihovi
na razgradnjo in bodisi neovirano prehajajo v površinske vode bodisi
odvisno od njihovih fizikalno-kemijskih lastnosti. Č
uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne učinkovine preidejo v prst in od tod tudi v
Vir zdravilnih učinkovin v okolju je lahko tudi neprimerno
činkovin, ki se uporabljajo v veterini, konča
v prst. Del se jih tudi prek urina in fecesa pašnih živali direktno izlo
koder lahko ogrožajo podtalnico. V ribogojstvu se zdravilne učinkovine, ki se dodajajo
neposredno v vodo. Ta prehaja v lokalne čistilne naprave in
teh uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne učinkovine preidejo v prst. Nekateri antibiotiki
(npr. streptomicini) se uporabljajo v sadjarstvu in čebelarstvu (8).
etku devetdesetih let 20. stoletja
Environmental Risk
čne snovi. Zdravilne
lahko po različnih poteh
hko prisotne tudi v pitni vodi (8),
in njihovi presnovki se
istilnih naprav. Pri nekaterih
njihovi presnovki) pa
bodisi neovirano prehajajo v površinske vode bodisi
. Če se blato nato
inkovine preidejo v prst in od tod tudi v
neprimerno odlaganje
a v gnojnici in tako
v prst. Del se jih tudi prek urina in fecesa pašnih živali direktno izloča v zemljo, od
inkovine, ki se dodajajo
istilne naprave in če se blato iz le-
Nekateri antibiotiki
13
Čistilne naprave so verjetno edina možnost za odstranjevanje zdravilnih učinkovin,
zato je pomembno preučevanje kroženja in razgradnje spojin med samim procesom
čiščenja. Pri biotransformaciji zdravilnih učinkovin imajo največjo vlogo encimske
reakcije. Te so običajno zelo kompleksne, obsegajo različne poti (vzporedne,
kompetitivne), lahko prihaja tudi do indukcije ali inhibicije procesov. Pogosto nastane več
razgradnih produktov, ki lahko:
- ohranijo lastnosti matične spojine,
- izkazujejo večjo toksičnost od matične spojine,
- vodijo v sinergistične ali aditivne farmakološke efekte z drugimi prisotnimi
spojinami,
- izgubijo farmakološko aktivnost (9).
Nekatere spojine so težko razgradljive in se lahko kopičijo v okolju, npr.
sulfametoksazol, klofibrinska kislina, eritromicin ipd. Mnoge lahko tudi povzročijo akutne
ali kronične negativne reakcije tako na ekosistemih kot na ljudeh. Hormoni, npr. estrogen,
lahko v koncentracijskem območju zgolj ng L-1 vplivajo na razmnoževanje ali spolni
razvoj, npr. feminizacijo samcev rib (10).
Preglednica III predstavlja izmerjene koncentracije preučevanih spojin v odpadnih,
površinskih in pitnih vodah v različnih državah. Vidimo lahko, da so vsebnosti v odpadni
vodi približno 5–10-krat višje kot v površinskih vodah. V pitni vodi so navadno prisotne v
1000-krat nižjih koncentracijah, izstopata pa predvsem ZDA in Nemčija, ki imata med
omenjenimi državami največ prebivalcev in posledično tudi največjo porabo ter
obremenitev okolja. Opazimo lahko visoke koncentracije karbamazepina in klofibrinske
kisline, obe spojini se namreč slabo razgrajujeta in se kopičita v okolju.
Preglednica IV predstavlja uspešnost odstranitve izbranih zdravilnih učinkovin v
pilotnih čistilnih napravah pod različnimi pogoji čiščenja. Najbolje se odstranjujejo
ibuprofen, naproksen in ketoprofen, medtem ko se diklofenak, karbamazepin in
klofibrinska kislina odstranjujejo v manjši meri. Naproksen se kot edina spojina dobro
odstranjuje tudi v anaerobnih pogojih.
14
Preglednica III: Vsebnost preučevanih spojin v odpadni (Codp), površinski (Cpov) ter najvišja izmerjena vsebnost v pitni (Cpitmax) vodi v nekaterih državah, a koncentracije na iztoku, b koncentracije na vtoku (3, 10, 11, 12, 13)
Izkoristke ekstrakcije smo določili po postopku, ki je opisan v poglavju 5.2.2,
predstavljeni pa so v Preglednici XI:
Preglednica XI: Povprečni izkoristki ekstrakcije (IE), relativne standardne deviacije (RSD), št. meritev z dodatkom analitov pred (npred) in po (npo) ekstrakciji
Iz Preglednice XI je razvidno, da so izračunani izkoristki ekstrakcije preučevanih
spojin med 76 in 102 %, najvišji je pri klofibrinski kislini, najnižji pa pri karbamazepinu in
diklofenaku. Ocenili smo, da so dovolj visoki, da ekstrakcija ne botruje prevelikim
izgubam in ni potrebna nadaljnja optimizacija.
Pri karbamazepinu smo opazili, da se pri vzorcih, derivatiziranih 12 ur, med čakanjem
na analizo pri sobni temperaturi površina pod krivuljo za karbamazepin povečuje s časom,
ki ga vzorec preživi na sobni temperaturi. Sklepamo lahko torej, da derivatizacija še ni bila
popolna in je deloma še potekala, česar nismo opazili pri drugih spojinah. Tudi s tem lahko
razložimo nižji izkoristek ekstrakcije ter tudi večjo relativno standardno deviacijo (6,5 %)
kot pri drugih spojinah (1,0–4,6 %).
Ravno zaradi tega pojava smo v nadaljevanju podaljšali čas derivatizacije na 15 ur. Da
bi preverili utemeljenost spremembe, smo pripravili 2 vzorca, enega smo derivatizirali 12
ur, enega pa 15 ur ter vsak vzorec izmerili trikrat zapored. Glede na trajanje
temperaturnega programa (poglavje 5.2.6) to pomeni, da je vzorec do tretjega injiciranja
46
bil na sobni temperaturi približno 90 minut. Dobljene relativne standardne deviacije
(19,3 % in 4,0 %) so nas prepričale v pravilnost odločitve, da čas derivatizacije
podaljšamo. Kljub temu pa smo se skušali v največji meri izogibati daljšemu izpostavljanju
vzorcev sobni temperaturi.
Preverili smo tudi druge mogoče vire izgub, npr. adsorpcija na stene čaš, zato smo po
SPE stene čaše, iz katere smo črpali vzorec, sprali z metanolom in dobljeno raztopino
analizirali. Poskusili smo tudi z lovljenjem prečrpane vode v posebno čašo namesto odpada
in to ponovno ekstrahirali (če smo morda presegli kapaciteto sorbenta v koloni). Izvedli
smo tudi elucijo z dvakratno količino etilacetata, osemkrat po 0,5 mL, ter analizirali druga
2 mL. V nobenem od naštetih poskusov nismo zaznali analitov, torej lahko trdimo, da ni
prišlo do dodatnih izgub. Nazadnje smo poskusili tudi z elucijo z metanolom namesto z
etilacetatom. Dobili smo višje odzive kot pri eluciji z etilacetatom, vendar ker smo izvedli
le en poskus, ne moremo z gotovostjo trditi, da je elucija z metanolom optimalnejša.
V Preglednici XII so navedeni izračunani Pearsonovi koeficienti korelacije (r) ter
koeficienti determinacije (R2) za posamezne spojine, ki smo jih določali po postopku,
opisanem v poglavju 5.2.2. S tem smo preverjali linearnost analizne metode.
Preglednica XII: Koeficienti korelacije (r), koeficienti determinacije (R2) ter koncentracijsko območje, znotraj katerega smo ju določali za posamezne spojine
Pri vseh spojinah smo opravili meritve v koncentracijskem območju 0,5–60 µg L-1,
vendar pri nekaterih spojinah pri najnižjih koncentracijah nismo dobili odziva, zato teh
koncentracij nismo upoštevali. Tako pri koncentraciji 0,5 µg L-1 nismo dobili odziva pri
klofibrinski kislini, karbamazepinu, akridinu in akridonu. Na Sliki 24 je primer umeritvene
krivulje za ketoprofen.
Slika 24: Umeritvena krivulja za ketoprofen, razmerje med površino pod krivuljo sililnih estrov ketoprofena in internega standarda – devteriranega ibuprofena (Aket/A is) v odvisnosti od razmerja koncentracij sililnih estrov ketoprofena in internega standarda (cket/cis)
y = 0,4726x + 0,6564R² = 0,9986
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25
Aket/A is
cket/cis
48
6.2 MEJA ZAZNAVNOSTI ANALIZNE METODE
Mejo zaznavnosti analizne metode (LOD), ki je definirana kot najmanjša koncentracija
analita, ki ga še lahko kvantitativno določimo z uporabljeno analizno metodo, smo določili
tako, da smo tri slepe paralelke (iztokov R0 brez dodanih analitov) ekstrahirali in
analizirali po postopku iz poglavja 5.2.5. Izračunali smo jo kot koncentracijo analita, pri
kateri je kromatografski vrh enak trikratni vrednosti standardne deviacije sipanja signala.
Za izračun smo uporabili enačbe umeritvenih premic za posamezne spojine, predpostavili
pa smo 100-odstotni izkoristek ekstrakcije. V Preglednici XIII so podane izračunane
vrednosti mej zaznavnosti za posamezne spojine.
Preglednica XIII: Izračunane meje zaznavnosti za posamezne spojine
Spojina Meja zaznavnosti v ng L-1 ibuprofen 43,0 klofibrinska kislina 432,9 naproksen 81,3 ketoprofen 84,8 diklofenak 46,5 karbamazepin 72,1 akridin 289,5 akridon 93,2 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on 73,9
Opazimo lahko predvsem izstopajoči vrednosti za klofibrinsko kislino in akridin. Pri
akridinu smo tekom analiz že opazili, da je imel med metaboliti najnižji odziv, temu je
lahko vzrok dejstvo, da se kot edina spojina ne derivatizira. Klofibrinska kislina je bila
med zdravilnimi učinkovinami tudi med slabše odzivnimi (pri vtokih, saj so vse spojine
takrat bile prisotne v približno enakih koncentracijah).
Za naše potrebe (visoke koncentracije v reaktorjih) dobljene vrednosti zadostujejo,
vendar bi jih bilo za okoljske vzorce potrebno znižati, npr. z izbiro primernejšega topila za
elucijo (metanol namesto etilacetata, poglavje 6.1), večjim volumnom vzorca ali manjšim
dodatkom derivatizacijskega sredstva.
49
6.3 DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE
V Preglednici XIV so prikazani rezultati meritev kemijskih parametrov. Določali smo
jih po postopku iz poglavja 5.2.4.
Preglednica XIV: Rezultati meritev kemijskih parametrov za sklopljen sistem reaktorjev za zdravilne učinkovine (ZU) in metabolite (M); vm. = vmesni vsebnik
NH4+
(mg L-1) NO3
- (mg L-1)
NO2-
(mg L-1) PO4
3-
( mg L-1) KPK
(mg L-1) ZU vtok 64,40 24,0 0,440 38,80 1043 ZU vm. 77,80 18,0 0,100 43,60 327 ZU iztok 10,00 110,0 0,180 46,40 213 MET vtok 54,80 22,0 0,380 37,80 1015 MET vm. 73,20 18,0 0,120 34,00 248 MET iztok 5,60 116,0 0,560 41,60 204
Rezultati za amonijev, nitratni in nitritni dušik so v okviru pričakovanj, saj kot smo
opisali v poglavju 3.2.1, amonij med anoksično presnovo nastaja in se med aerobno
presnovo porablja, medtem ko se nitrat in nitrit med anoksično presnovo porabljata
(denitrifikacija) in nastajata med aerobno presnovo (nitrifikacija).
Pri ortofosfatu ne moremo opaziti enotnega trenda, saj se njegova koncentracija v
reaktorjih z zdravilnimi učinkovinami vseskozi povečuje, medtem ko se pri reaktorjih z
metaboliti med anoksično presnovo najprej zmanjša in nato poveča med aerobno presnovo.
To lahko pripišemo dejstvu, da ortofosfati niso edina oblika fosfata v odpadnih vodah in je
mogoče nihanje koncentracij razložiti tudi z različnim razpadom polifosfatov. Tako bi
morali za popolnejšo sliko izmeriti tudi celoten fosfat, potrebno pa bi bilo opraviti še več
meritev.
Kemijska potreba po kisiku (KPK) pada tako med anoksično kot med aerobno
presnovo, vendar smo pričakovali večji padec med aerobno presnovo in ne med anoksično.
Vzrok temu bi lahko bila prisotnost mikroorganizmov v vmesnem vsebniku, kar poveča
razgradnjo. Glede na to, da v vmesnem vsebniku nismo menjavali raztopine, saj smo želeli
vzpostaviti konstantno koncentracijo zdravilnih učinkovin, je verjetno, da je prišlo do rasti
mikroorganizmov, posebej zato, ker je medij ugoden za njihov razvoj.
Določili smo tudi biokemijsko potrebo po kisiku v petih dneh (BPK5). V Preglednici
XV so predstavljeni rezultati meritev po posameznih dnevih kot povprečje paralelk
je enak rezultatom po 5. dnevu meritev. Pri vtokih je rezultat že po 2. dnevu
čje in je tako višji od 500 mg L-1, le ena paralelka
za metabolite je ostala znotraj merilnega območja. Za izboljšanje teh rezultatov bi torej
jega števila meritev vzorce razredčiti.
Sicer pa je viden padec BPK med vtokom, vmesnim vsebnikom in iztokom, vendar bi
o sliko potrebovali večje število opravljenih meritev skozi daljši
primerjamo rezultate meritev KPK in BPK5, vidimo, da je padec obeh vrednosti ve
nim in vmesnim kot med vmesnim in aerobnim reaktorjem. Ker se vrednosti BPK
med vmesnim reaktorjem in iztokom (še posebej pri zdravilnih učinkovinah) le malo
razlikujeta, lahko sklepamo, da bi bilo smiselno dodajanje hranilnih snovi tudi v vmesne
je prikazan potek BPK za iztok reaktorjev z metaboliti.
: Potek BPK po dnevih za iztok reaktorjev z metaboliti
2 3 4 5
Čas (dni)
je enak rezultatom po 5. dnevu meritev. Pri vtokih je rezultat že po 2. dnevu
le ena paralelka vtoka reaktorjev
Za izboljšanje teh rezultatov bi torej
Sicer pa je viden padec BPK med vtokom, vmesnim vsebnikom in iztokom, vendar bi
je število opravljenih meritev skozi daljši čas. Če
vidimo, da je padec obeh vrednosti večji med
nim in vmesnim kot med vmesnim in aerobnim reaktorjem. Ker se vrednosti BPK5
činkovinah) le malo
razlikujeta, lahko sklepamo, da bi bilo smiselno dodajanje hranilnih snovi tudi v vmesne
je prikazan potek BPK za iztok reaktorjev z metaboliti.
6
Čas (dni)
51
6.4 MASNI SPEKTRI PREUČEVANIH SPOJIN
V Preglednici XVI so navedene preučevane spojine, njihovi retencijski časi in značilni
fragmentni ioni, s pomočjo katerih smo lahko identificirali spojine.
Preglednica XVI: Preučevane spojine, njihova relativna molekulska masa (Mr), retencijski čas (tr), najznačilnejši fragmentni ioni in referenčni ion, po katerem smo spojino kvantificirali (Mq)
Fragmentacija je bila najbolj izrazita pri klofibrinski kislini, kjer je število dobro
izraženih vrhov (kar je razvidno tudi iz samega spektra, Slika 29) precej višje kot pri
ostalih spojinah. Pri večini spojin smo za opazovani ion (Mq) izbrali dimetilsililni (DMS)
derivat osnovne spojine, ki nastane po odcepitvi butilne skupine in čigar vrh je bil povečini
tudi najvišji. Pri akridinu in 9-kloroakridinu smo opazovali osnovno spojino, saj se ta ne
derivatizira, pri karbamazepinu pa smo opazovali tričlenski obročni sistem z m/z = 193, ki
je najbolj stabilen fragmentni ion. Za siliranje značilna fragmenta z m/z = 73 in m/z = 75
nastaneta po odcepu sililne skupine, ponekod se pojavi tudi fragment z m/z = 57, ki
predstavlja terc-butilno skupino (Slika 26).
Slika 26: fragmenti z m/z = 57 (levo), m/z = 73 in m/z = 75 (desno)
52
Na Slikah 27 in 28 sta prikazana kromatograma za enega od vzorcev odpadne vode z
zdravilnimi učinkovinami in metaboliti.
Slika 27: Kromatogram vseh ionov vzorca zdravilnih učinkovin v SCAN načinu (x-os predstavlja čas v minutah, y-os pa odziv)
Slika 28: Kromatogram vseh ionov vzorca metabolitov v SCAN načinu (x-os predstavlja čas v minutah, y-os pa odziv)
53
Iz masnega spektra ibuprofena (Slika 29) lahko vidimo, da je najvišji odziv pri DMS
ionskem fragmentu ibuprofena (m/z = 263), ki nastane po odcepu dobro izstopajoče terc-
butilne skupine iz terc-butildimetilsililnega (TBDMS) derivata (m/z = 320). Pri m/z = 247
lahko vidimo sicer nizek odziv za fragment, ki nastane po dodatni odcepitvi metilne
skupine. Dobljeni odziv pri m/z = 205 predstavlja molekulo ibuprofena z odcepljenim
vodikovim atomom, ta nastane po odcepu DMS skupine iz fragmenta m/z = 263. Značilen
je še fragment pri m/z = 161, ki nastane po odcepu fragmenta –COOSiR3, lahko pa vidimo
tudi tipična fragmenta pri m/z = 57 in m/z=75 (Slika 26).
Slika 29: Masni spekter ibuprofena v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
54
Na Sliki 30 je prikazan masni spekter klofibrinske kisline. Vidimo lahko, da je
fragmentacija zelo raznolika, najvišji odziv je v tem primeru pri fragmentu 1-kloro-4-
metoksibenzenu (m/z = 143). Izbrani fragment, ki smo ga opazovali pri analizi, je DMS
ester (m/z = 271), ki nastane po odcepu terc-butilne skupine (iz molekule z m/z=328) in
ima drugi najvišji odziv. Običajno sicer spremljamo najvišji odziv, vendar ima fragment
m/z = 143 premajhno maso in bi dal prevelik šum. Preostali fragmentni ioni, ki so imeli še
visok odziv, so ion pri m/z = 243 in 1-terc-butoksi-4-klorobenzil (m/z = 185). Visok odziv
imata tudi fragmenta pri m/z = 75 in m/z = 57.
Slika 30: Masni spekter klofibrinske kisline v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
55
Slika 31 predstavlja masni spekter naproksena. Najvišji odziv ima DMS derivat (m/z =
287), ki smo ga tudi uporabljali pri analizi. Pri m/z = 344 lahko opazimo molekulski ion
TBDMS derivata naproksena. Včasih je viden tudi fragment pri m/z = 272, ki nastane z
odcepom metilne skupine. Visok odziv imata še fragmentna iona 2-metilnaftil pri m/z =
141 in 2-etil-6-metoksinaftil pri m/z = 185. Fragment m/z = 185 nastane z odcepitvijo
COOSiR3 skupine, po nadaljnji odcepitvi metilne in metoksi skupine pa dobimo fragment
m/z = 141. Opazimo pa lahko tudi tipičen odziv pri m/z = 75.
Slika 31: Masni spekter naproksena v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
56
Iz masnega spektra ketoprofena na Sliki 32 lahko opazimo, da je najvišji odziv pri
fragmentu z m/z = 311, DMS estru ketoprofena. Fragmenta pri m/z = 294 in m/z = 282
nastaneta z odcepom ene oz. dveh metilnih skupin iz DMS fragmentnega iona. Tipičen je
še odziv pri m/z=75.
Slika 32: Masni spekter ketoprofena v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
57
Slika 33 predstavlja masni spekter diklofenaka. Tako kot pri klofibrinski kislini, lahko
tudi pri diklofenaku opazimo, da ion, ki smo ga uporabljali pri analizi (DMS ester, m/z =
352) ni imel najvišjega odziva, v tem primeru je to ion pri m/z = 214. Visok odziv imajo še
fragmenti pri m/z = 179, m/z = 242 ter molekulski ion pri m/z = 409 (TBDMS ester
diklofenaka). Z odcepom terc-butilne skupine iz molekulskega iona m/z = 409 dobimo
fragment z m/z = 352. Z nadaljnjim odcepom Cl atoma in OSiMe2 skupine dobimo
fragment z m/z = 242. Z odcepom karbonilne skupine iz m/z = 242 dobimo fragment z
m/z = 214 in od tod z odcepom še drugega klorovega atoma fragment z m/z = 179.
Opazimo lahko še odziva pri m/z = 57 ter pri m/z = 75.
Slika 33: Masni spekter diklofenaka v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
58
Na Sliki 34 je masni spekter karbamazepina. Pri analizi smo opazovali fragment z
m/z = 193, tričlenski obročni sistem 5H-dibenzo[b,f]azepin, ki nastane po odcepu
karboksamidne stranske skupine iz molekule karbamazepina. Ta ima tudi najvišji odziv.
Opazimo lahko prisotnost fragmenta akridinila (m/z = 179). Pri m/z = 293 in m/z = 335
lahko opazimo odziva za DMS oz. TBMS derivat karbamazepina. Fragment m/z = 293
nastane z odcepom terc-butilne skupine, fragment m/z = 335 pa z odcepom metilne
skupine iz TBDMS derivata. Pri m/z = 250 pa opazimo metilni derivat karbamazepina.
Reakcije nastanka fragmentov m/z = 250, m/z = 293 in m/z = 335 so možne zaradi keto-
enol tavtomerije. Opazimo tudi fragmenta pri m/z = 57 ter pri m/z = 73.
Slika 34: Masni spekter karbamazepina v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
59
Na masnem spektru devteriranega ibuprofena (Slika 35), internega standarda pri
določanju zdravilnih učinkovin, dobimo najvišji odziv pri m/z = 266, DMS estru osnovne
spojine. Opazimo lahko tudi sicer nizek odziv za ibuprofen (m/z = 205), ki najverjetneje
nastane z zamenjavo devterijevih atomov z vodikovimi po odcepu DMS skupine. Vidimo
lahko tudi odziva pri m/z = 73 ter pri m/z = 57.
Slika 35: Masni spekter devteriranega ibuprofena v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
60
Na masnem spektru akridina na Sliki 36 je najvišji odziv pri m/z = 179, ki predstavlja
samo molekulo akridina. Ta se ne derivatizira, zato lahko ostale odzive smatramo bodisi za
preostale spojine, prisotne v matriksu, bodisi za ostanke derivatizacijskega sredstva
(m/z = 75).
Slika 36: Masni spekter akridina v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
61
Na Sliki 37 je masni spekter akridona. Najvišji odziv dobimo pri DMS derivatu
akridona (m/z = 252), ki nastane po značilnem odcepu terc-butilne skupine iz
molekulskega iona pri m/z = 309 (TBDMS derivat). Derivatizacija na OH skupini je
mogoča zaradi keto-enol tavtomerije. Opazimo tudi značilni odziv pri m/z = 73.
Slika 37: Masni spekter akridona v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
62
Slika 38 predstavlja masni spekter 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-ona. Med analizo smo
opazovali fragment pri m/z = 300, ki ima tudi najvišji odziv. Gre za DMS fragmentni ion
osnovne spojine, iz katere se je odcepil klorov atom. Visoke odzive smo dobili še pri
m/z = 391 (TBDMS eter osnovne spojine), pri m/z = 276 (osnovna spojina), m/z = 241
(odcep klorovega atoma iz osnovne spojine) in m/z = 213 (razpad indolnega obroča pri
m/z = 241 z odcepom karbonilne skupine). Tudi pri DKFI je derivatizacija mogoča zaradi
keto-enol tavtomerije. Opazimo lahko še odziv pri m/z = 73.
Slika 38: Masni spekter 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-ona v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
63
Slika 39 predstavlja masni spekter 9-kloroakridina, ki smo ga uporabljali kot interni
standard pri določanju metabolitov. Molekula se ni derivatizirala, odziv za osnovno
molekulo lahko vidimo pri m/z = 213. Opazimo lahko tudi odziv za fragmentni ion
akridinil, ki nastane po odcepu klorovega atoma in se prav tako ne derivatizira.
Slika 39: Masni spekter 9-kloroakridina v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv
64
6.5 ODSTRANJEVANJE ZDRAVILNIH U ČINKOVIN
Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v posameznih reaktorjih
V Preglednici XVII so predstavljene eliminacije preiskovanih zdravilnih učinkovin v
posameznih reaktorjih. V nadaljnji diskusiji bomo predvsem skušali interpretirati dobljene
rezultate in hkrati razložiti anomalije, do katerih je prišlo, in sicer smo ponekod dobili na
videz negativne eliminacije, tj. izmerjene koncentracije spojin na iztokih so bile višje kot
na vtokih.
Preglednica XVII: Rezultati meritev odstranjevanja zdravilnih učinkovin v % v posameznih reaktorjih; nR1, nR2 in nA1 predstavljajo število meritev v posameznem reaktorju, SD pa standardno deviacijo
Preglednica XVIII: Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v sklopljenem sistemu anoksičen-aeroben reaktor (R20-A1); SD predstavlja standardno deviacijo, %teor. predstavlja teoretično izračunano eliminacijo, n pa število meritev
Vidimo lahko, da so dobljeni izkoristki v glavnem blizu teoretično izračunanih
vrednosti. Pri večini spojin so sicer nekoliko višji (izjemi sta le klofibrinska kislina in
diklofenak), kar lahko razložimo s tem, da bi izkoristki v posameznih reaktorjih morali biti
višji, kar smo skušali utemeljiti v podpoglavju Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v
posameznih reaktorjih. Pri računanju smo ponekod uporabili negativne izkoristke, kar je
rezultate še dodatno znižalo, saj je sicer logično sklepati, da bi morala biti eliminacija po
sklopitvi višja ali kvečjemu enaka eliminaciji v enem od reaktorjev (saj le-ta teoretično ne
bi smela biti manjša od 0).
Izkoristki za ibuprofen, ketoprofen in naproksen so pričakovano visoki, diklofenak,
karbamazepin in klofibrinska kislina pa se odstranjujejo v manjši meri, kar smo opazili že
v posameznih reaktorjih.
69
6.6 ODSTRANJEVANJE METABOLITOV
Odstranjevanje metabolitov v posameznih reaktorjih
V Preglednici XIX so predstavljene eliminacije metabolitov v posameznih reaktorjih, v
nadaljevanju pa smo dobljene rezultate skušali tudi interpretirati.
Preglednica XIX: Rezultati meritev odstranjevanja metabolitov v % v posameznih reaktorjih; nR3, nR4 in nA2 predstavljajo število meritev v posameznem reaktorju, SD pa standardno deviacijo
Preglednica XX: Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v sklopljenem sistemu anoksičen-aeroben reaktor (R3-A2); SD predstavlja standardno deviacijo, %teor. predstavlja teoretično izračunano eliminacijo, n pa število meritev
Teoretične izkoristke smo izračunali po Enačbi 17. Akridina tako kot pri posameznih
aerobnih reaktorjih na iztoku sklopljenih reaktorjev nismo zaznali, tako da smo tudi tukaj
od 100 % odšteli ½ LOD. Pri akridonu opazimo, da je odstranjevanje bistveno višje kot
teoretično izračunana vrednost, kar lahko pripišemo nižjima izkoristkoma v obeh
posameznih reaktorjih, ki sta v veliki meri bila posledica prve serije in povečevanja
odstranjevanja s časom (opisano v podpoglavju Odstranjevanje metabolitov v posameznih
reaktorjih). Pri DKFI pa je dobljen izkoristek nižji od teoretično izračunanega, čeprav smo
pričakovali, da bo ta, podobno kot pri akridonu, višji. Spremenljivost rezultatov pri DKFI
je moč razložiti s tem, da smo spojino prvič poskusno preučevali, in verjetno je, da analizni
postopek, ki je primernejši za karbamazepin in njegove metabolite (akridin, akridon), za
določanje DKFI, ki je podoben diklofenaku in se strukturno bistveno razlikuje od internega
standarda 9-kloroakridina, ni optimalen.
71
6.7 PRIMERJAVA ODSTRANJEVANJA V SKLOPLJENIH IN
AEROBNIH REAKTORJIH
S pomočjo enostranskega t-testa smo primerjali odstranjevanje preučevanih spojin v
sklopljenih sistemih anoksičen-aeroben reaktor z odstranjevanjem spojin v uporabljenem
aerobnem reaktorju, kjer so bili rezultati za večino spojin višji kot v anoksičnem. V
Preglednici XXI so navedeni rezultati za aerobni reaktor in sklopljen sistem:
Preglednica XXI: Primerjani rezultati odstranjevanja preučevanih spojin v sklopljenih sistemih in posameznih reaktorjih (za zdravilne učinkovine R2, za metabolite R3) ter ali je razlika statistično značilna
Spojina aerobni reaktor (%)
SD sklopljen sistem (%)
SD statistično značilna razlika
ibuprofen 94,8 3,3 98,6 0,6 da klofibrinska kislina –14,1 5,1 –21,4 2,2 da naproksen 92,3 4,8 99,8 0,1 da ketoprofen 94,6 3,2 98,2 0,8 da diklofenak 50,4 7,2 45,0 18,9 ne karbamazepin 8,0 5,8 10,0 3,5 ne akridin 99,7 0 99,7 0 ne akridon 68,6 18,8 87,1 1,5 ne DKFI 45,2 12,8 40,0 5,7 ne
Na osnovi rezultatov smo poskusili ugotoviti, ali se za posamezne spojine dobljeni
eliminaciji statistično značilno razlikujeta pri stopnji zaupanja α = 0,05. Za ibuprofen,
naproksen in ketoprofen smo ugotovili, da je eliminacija v sklopljenem sistemu statistično
značilno višja kot v aerobnem reaktorju. Za navedene spojine iz podatkov torej lahko
trdimo, da se bolje odstranjujejo v sklopljenih sistemih aerobni-anoksični reaktor. Pri
klofibrinski kislini pa je eliminacija statistično značilno manjša (bolj negativna).
Pri vseh ostalih spojinah, večinoma gre za slabo razgradljive snovi, razlike nismo
ugotovili, kar lahko pripišemo majhnemu številu vzorcev ter naraščanju odstranjevanja s
časom (adaptacijo biomase na vnesene snovi), kar je povečalo standardne deviacije. Pri
nekaterih spojinah sama metoda analize ni bila optimalna.
Opazili smo tudi, da so standardne deviacije pri vseh spojinah, razen pri diklofenaku,
nižje v sklopljenih sistemih, kar je lahko dokaz v prid adaptaciji biomase na spojine, saj
smo sklopitev izvedli šele po nekajtedenskem vnašanju spojin v posamezne reaktorje.
72
7 SKLEP
V diplomskem delu smo opazovali odstranjevanje zdravilnih učinkovin in nekaterih
njihovih presnovkov v pilotni čistilni napravi v aerobnih in anoksičnih pogojih ter v
sklopljenem sistemu anoksični-aerobni reaktor. Kot modelne spojine smo izbrali
predstavnike nesteroidnih protirevmatičnih učinkovin ibuprofen, naproksen, ketoprofen in