UP 3: Isomerisierung in cyanobakteriellem Phytochrom 400 500 600 700 0 100 200 300 400 statische Absorptionsspektren von Cph1-PCB Pr Pr und Pfr Pfr Absorption / mOD λ / nm 500 550 600 650 700 0 100 200 300 statisches Absorptionsspektrum von Cph1-PEB PEB Absorption / mOD λ / nm 0 100 200 300 400 500 -1,0 0,0 0,0 1,0 -10 0 770 nm Zeit / ps 555 nm 670 nm Absorptionsdifferenz / mOD Pflanzliches Phytochrom • einer der wichtigsten Photorezeptoren der Pflanze • Ausbildung des Photosyntheseapparates • Steuerung des Blühverhaltens, der Samenkeimung etc. • Bestandteil der „inneren Uhr“ der Pflanze Bakterielles Phytochrom aus Cyanobakterium Synechocystis Cph1-PCB: • phosphoryliert Rcp1 aus seiner Pr-Form Photoanregung keine Isomerisierung durch Fehlen der C15-C16 Doppelbindung Cph1-PEB Cph1-PCB P r -Form Isomerisierung: Wellenpaketdynamik Cph1-PCB P fr -Form P r P fr Isomerisierung um die C15-C16 Doppelbindung Photoreaktion Analyse der Photoreaktionen: 0 10 20 30 40 0 1 2 -9 -6 -3 0 -6 -4 -2 0 760 nm Zeit / ps 710 nm 690 nm Absorptionsdifferenz / mOD Transienten λ exc. = 727 nm Reaktionskoordinate E Z lumi-F Energie S 0 S 1 540 fs 3,2 ps kinetisches Modell Transienten λ exc. = 650 nm Differenzspektren -6 -4 -2 0 2 0 50 100 150 200 250 300 -6 -4 -2 0 2 0 3 6 9 565 nm Fit Absorptionsdifferenz / mOD 640 nm Fit Zeit / ps 470 nm Fit Transienten λ exc. = 580 nm 450 500 550 600 650 700 0,0 4,0 -20 -10 0 10 Absorptionsdifferenz / mOD Residuum λ / nm Differenzspektrum 60 ps elektronisch angeregter Zustand stat. Fluoreszenz stat. Absorption stat. Abs. + Fluor. Differenzspektren Reaktionskoordinate E Z lumi-R Energie S 0 S 1 kinetisches Modell 150 fs 16 ps Reaktionskoordinate Z Energie S 0 S 1 1,1 ns ≤ 150 fs kinetisches Modell Transienten λ exc. = 580 nm Transienten λ exc. = 650 nm Cph1-PEB Cph1-PCB P r -Form Vorhaben zur Reaktionssteuerung durch die Proteinumgebung: Ø Diskrete Ratenkonstanten oder Verteilung von Ratenkonstanten? Ø Ursache für die langsame Isomerisierung in der Pr-Form? Ø Abhängigkeit der Dynamik von der Temperatur Ø Anisotropiemessungen zur Erweiterung der Datenbasis Ø Modifizierung der Chromophor-Protein-Wechselwirkung durch Mutanten Ø Welche dynamischen Prozesse werden durch den Ring D und die Möglichkeit der Isomerisierung verursacht (Cph1-PEB und weitere Chromophore)? Ø Zeitaufgelöste Strukturuntersuchungen durch Infrarotmessungen Vorhaben: Ø genauere Charakterisierung der ultrakurzen Zeitkonstanten in Cph1-PEB sowie in Cph1-PCB in der Pr- und der Pfr-Form Ø Abgrenzung der dissipativen von der kohärenten Dynamik Ø Untersuchung der oszillatorischen Signale in Cph1-PEB und Cph1-PCB in der Pr-Form Ø Charakterisierung der Wellenpaketdynamik Ø Sind ähnliche Signale auch in der Pfr-Form zu sehen? Ø Untersuchung des freien PCB- und PEB- Chromophors auf oszillatorische Signale Ø Vergleich der ermittelten Schwingungsfrequenzen mit Infrarotmessungen P fr Chromophor: N H R N O Cys H N H R N H O + A B C D P r 5 10 15 PCB : PEB : 15 10 5 D C B A + N H R N O Cys H N H R O H N N H R N O Cys H N H R N H O + A B C D 5 10 15 Photoreaktion: Ø Verteilung von Ratenkonstanten in der Primärdynamik um (16 ps) -1 Ø Bei höherenergetischer Anregung wird die Verteilung breiter Ø Spektren der Grundzustandsabsorption, des angeregten Zustandes und des Photoproduktes überlagern stärker als in pflanzlichem Phytochrom (Andel et al., Rentsch et al., Bischoff, Holzwarth et al.) dissipative Prozesse im angeregten Zustand: Ø Schnelle Umverteilung der Anregungsenergie innerhalb 150 fs Photoreaktion: Ø 2 Ratenkonstanten beschreiben die Primärreaktion Ø Die Relaxation auf der S1-Oberfläche ist barrierelos Ø Die Dynamik ähnelt der bR-Dynamik Ø Deutlicher Unterschied der Reaktionssteuerung durch das Protein in der Pfr-Form im Gegensatz zur Pr-Form Ø Ratenkonstanten analog zu Haferphytochrom (Bischoff) Kooperationen: • Prof. J. Hughes (Gießen), Dr. T. Lamparter (FU Berlin) • Priv. Doz. G. Hermann (Jena) Photoreaktion: Ø strahlende Lebensdauer 1,1 ns Ø dissipative Prozesse sind nach etwa 200 fs im elektronisch angeregten Zustand abgeschlossen Ø Spektrum des elektronisch angeregten Zustandes ist deutlich blauverschoben im Gegensatz zur Pr-Form in Cph1-PCB Ø Chromophor-Protein Wechselwirkung am Ring D beeinflußt die spektrale Lage des elektronisch angeregten Zustandes stark 0 400 800 1200 1600 0,0 0,4 0,8 1,2 Fourierkoeffizienten a.u. Wellenzahl / cm -1 Summe der Fouriertransformierten aus den Residuen der Transienten Summe der Fouriertransformierten aus den Residuen der Transienten Ø Oszillatorischer Signalanteil in den Transienten Ø komplexe mehrexponentielle Dynamik im Zeitbereich unter 200 fs F. Andel, K.C. Hasson, F. Gai, P.A. Anfinrud und R.A. Mathies; Biospectroscopy 3, 421 (1997) Mark Bischoff, Dissertation, Friedrich-Schiller-Universität Jena, (1999) A.R. Holzwarth, E. Venuti, S.E. Braslavsky und K. Schaffner; Bioch. Biophys. Acta 1140, 59 (1992) S. Rentsch, M. Bischoff, G. Hermann und D. Strehlow; Appl. Phys. B 66, 259 (1998) 600 620 640 660 680 700 720 740 760 -15 -10 -5 0 -15 -10 -5 0 λ anr. = 615 nm Absorptionsdifferenz / mOD λ / nm 300 fs 600 fs 1,2 ps 2,4 ps 5 ps 10 ps 20 ps 40 ps 80 ps 150 ps 300 ps Grundzustands- absorption stimulierte Emission λ anr. = 650 nm 300 fs 600 fs 1,2 ps 2,4 ps 5 ps 10 ps 20 ps 40 ps 80 ps 150 ps 300 ps 0 400 800 1200 1600 0 1 2 Fourierkoeffizienten a.u. Wellenzahl / cm -1 -30 -20 -10 0 -6 -3 0 0 200 400 600 800 1000 -4 -2 0 Absorptionsdifferenz / mOD 580 nm 565 nm Zeit / fs 640 nm