Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover ___________________________________________________________________________ Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Sophie Koppe (geb. Richers) aus Berlin Hannover 2007
170
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Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine ... · Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
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12 = Transferkonstante für den Transport von 1 nach 2 21 = Transferkonstante für den Transport von 2 nach 1 K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
KK
37
LITERATURÜBERSICHT
Bei halblogarithmischer Darstellung der Plasmakonzentrationen fallen diese zunächst rasch
bfallenden Geraden zu liegen. Es zeigt sich ein
n n.
ie Gleichung für die Plasmakonzentrationskurve lautet wie folgt:
C =
C = Plasmakonzentration
C1 und Cz = Ordinatenabschnitte C und C = C0
ab, um später auf einer weniger stark a
biexpo entieller Phasenverlauf der Gerade
D
tzt eCeC ⋅−⋅− ⋅+⋅ λλ2
11
1 2
λ 1 und λ z = Hybridkonstanten
ohl Verteilungs- als auch
Hybridkonstanten sind Geschwindigkeitskonstanten, in die sow
Eliminationsvorgänge einfließen.
λ 1 charakterisiert vorwieg λ zend die Verteilungsgeschwindigkeit, vorwiegend die
inetik bei einmaliger oraler Gabe:
ei oraler Verabreichung laufen Resorption, Verteilung und Elimination parallel zueinander
Eliminationsgeschwindigkeit,.
K
B
ab. Bei einem diese Situation beschreibenden Modell muss ein Eingangskompartiment
hinzugefügt werden, welches das Substanzdepot enthält (MUTSCHLER, 1996).
Abb. 8: Zwei-Kompartiment-Modell nach einmaliger oraler Applikation
0 = Eingangskompartiment
K 01 Resorptionsgeschwindigkeitskonstante K 10 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
1 = zentrales Kompartiment
==
38
LITERATURÜBERSICHT
Abb. 9: Drei-Kompartiment-Modell nach einmaliger oraler Applikation
Funktion gibt die Gleichung für die Kurvenverläufe für Resorption,
limination und gleichzeitige Resorption und Elimination linear und halblogarithmisch
r 10):
=
0 = Eingangskompartiment 1 = zentrales Kompartiment 2 = peripheres Kompartiment K 01 = Resorptionsgeschwindigkeitskonstante K 10 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante K 12 = Transferkonstante für den Transport von 1 nach 2 K 21 = Transferkonstante für den Transport von 2 nach 1
Die sogenannte Bateman-
E
wiede (BATEMAN, 19
( )tktkel
el
eekkkC ⋅−⋅− −⋅
−⋅ 1
1
10 C
.
2.5. Pharmakokinetische Parameter
):
ls Bioverfügbarkeit (F) wird das Ausmaß und die Geschwindigkeit bezeichnet, mit der ein
m freigesetzt, resorbiert und am Wirkort verfügbar ist. Somit
erabreichten Arzneimittels nahezu 100%. Nach
xtravasaler Verabreichung beträgt die Bioverfügbarkeit weniger als 100% (FICHTL et al.,
Bioverfügbarkeit (F
A
Wirkstoff aus einer Arzneifor
beträgt die Bioverfügbarkeit eines intravenös v
e
1996).
Stellvertretend für die nicht messbare Konzentration am Wirkort, wird die Bioverfügbarkeit
durch Konzentrationsmessung im Plasma oder Urin ermittelt. Diese Methode ist nicht für
39
LITERATURÜBERSICHT
topisch angewendete Stoffe zulässig, da diese nicht über den Blutweg zu ihrem Zielorgan
elangen.
it ermittelt, indem zunächst der Wirkstoff intravasal
erabreicht wird, um so die volle Bioverfügbarkeit zu erhalten. Anschließend wird die gleiche
achdem die Flächen unter den beiden Plasma-Konzentratrions-
rve / AUC), die das Maß für die Konzentration im Organismus
l den, kann die Bioverfügbarkeit wie folgt berechnet werden (KOCH
nd RITSCHEL, 1986):
g
Praktisch wird die Bioverfügbarke
v
Dosis extravasal verabreicht. N
Kurven (Area under the cu
darstel en, berechnet wur
u
F = 100..viAUC⋅xAUC [%]
zentration- Zeit- Kurve bei extravasaler Applikation AUC . = Fläche unter der Konzentration- Zeit- Kurve bei intravenöser Applikation
aß für die Ausscheidungsgeschwindigkeit eines Stoffes. Sie
asmavolumen, welches pro Zeiteinheit von dem Stoff gereinigt
wird wie folgt berechnet:
F = Bioverfügbarkeit AUCx = Fläche unter der Kon
i.v.
Clearance (CL):
Die Clearence ist ein M
bezeichnet das virtuelle Pl
wird. Die Gesamtkörper-Clearance
CL = AUC
D [ml/min]
CL = Gesamtkörper-Clearance D = Dosis AUC = Fläche unter der Konzentration- Zeit- Kurve
Wird ein Stoff ausschließlich durch ein Organ eliminiert, entspricht die Gesamtkörper-
learance der Organ-Clearance. Ist jedoch, wie in den meisten Fällen, mehr als ein Organ an
Clearances zusammen (SAMS, 1992):
C
der Eliminierung des Arzneimittels beteiligt, setzt sich die Gesamtkörper-Clearance aus den
Tab.30: Stabilitätsdaten von Theophyllin, T min, Paraxanthin und Coffein im Urin
Diese Ergebnisse verdeutlichen unter Berücksi ng des U-Tests, dass sowohl Coffein und
Theobromin, als auch Theophyllin und Par in in einem Zeitraum von 28 Tagen
geringgradige Konzentrationsveränderungen aufweisen. Diese Abweichungen liegen jedoch
innerhalb der Messungenauigkeit, so dass tabilität dieser Substanzen für diesen
Zeitraum angenommen werden kann.
heo
cht
ax
ein
bro
igu
anth
e S
86
ERGEBNISSE
4.2.8. Wiederfindung
Plasma:
Die Ergebnisse der Berechnung der Wiederfindung der Substanzen Theophyllin, Theobromin,
Paraxanthin und Coffein im Plasma sind in Tabelle 31 beschrieben.
Mittlere Substanzen Wiederfindungsrate [%]
Theophyllin 90,2
Theobromin 84,9
Paraxanthin 90,2
Coffein 100,0 T Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin unab.31: d Coffein im
Plasma
rin:
Mittlere
U
Die Wiederfindungsergebnisse der Analyten im Urin sind der Tabelle 32 zu entnehmen.
Substanzen Wiederfindungsrate [%]
Theophyllin 96,1
Theobromin 93,4
Paraxanthin 95,9
Coffein 92,4
Tab.32: Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma
87
ERGEBNISSE
4.3. Ergebnisse des Hauptversuches
4.3.1.
In Anlehnung an den Hauptversuch gliedert sich die Untersuchung der Plasmaproben in drei
ischen der applizierten
Substanz sowie den entstandenen Metaboliten unterschieden wird.
8.834 ng pro ml Plasma gemessen werden. Wie
allen Pferden
ml Plasma nicht unterschritten. In Abb.
6 sind die Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin aller Pferde dargestellt.
anthin erst nach zwei Stunden gemessen werden. Die gemessenen
Coffeinplasmakonzentrationen der Pferde 2 und 4 blieben unterhalb der ermittelten
ierun Wert
oberhalb d ale
offeinplasmakonzentration von 1.283 ng/ml wies Pferd 5 nach zwei Stunden auf. Abb. 27
nd 28 zeigen die gemittelten Plasmakonzentrationsverläufe von Paraxanthin und Coffein und
Theophyllin, Abb. 29 das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin. Die
Einzelwerte der Theophyllin-, Paraxanthin- und Coffeinplasmakonzentrationen aller Pferde
sind in den Tabellen 43, 44 und 45 im Anhang aufgeführt.
Plasma
Abschnitte (Kapitel 4.3.1.1. bis Kapitel 4.3.1.3), in denen jeweils zw
4.3.1.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation
Nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konnten im Plasma maximale
Theophyllinkonzentrationen von 5.165 bis
aus Abbildung 26 ersichtlich, wurden diese bei allen Pferden innerhalb der ersten zwei bis
fünf Minuten erreicht. In den darauffolgenden zehn Minuten fielen die Konzentrationen
zunächst stark ab, um dann bei den Pferden 1, 2, 4, 5 und 6 nochmals geringgradig
anzusteigen, bevor sie nach 30 Minuten langsam kontinuierlich abnahmen. Bei
wurde innerhalb des Probenentnahmezeitraumes von sechzig Stunden die
Quantifizierungsgrenze von 100 ng Theophyllin pro
2
Im Plasma ließen sich außerdem die Metaboliten Paraxanthin und Coffein nachweisen.
Theobromin hingegen konnte nicht detektiert werden.
Die maximalen Paraxanthinkonzentrationen von 370 bis 868 ng/ml wurden bei den Pferden 1,
2, 3, 4 und 6 nach zwei Minuten gemessen. Lediglich bei Pferd 5 konnten die höchste
Konzentration von Parax
Quantifiz gsgrenze von 100 ng/ml. Bei den Pferden 1 und 3 konnte jeweils nur ein
er Quantifizierungsgrenze gemessen werden. Die maxim
C
u
88
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0 10 20 30 40 50 60 70
Stunden nach Applikat
Kon
zent
ratio
n Th
eoph
yllin
[ng/
ml]
Pferd 1 Pferd 2 Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0 0.2 0.4 0.6
ion
0.
m
8 1 1.2
Abb. 26 : Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin bei sechs Pferden nach ein aliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht, Ausschnittsvergrößerung zeigt den Konzentrationsverlauf innerhalb der ersten Stunde
89
ERG
EBN
ISSE
ERGEBNISSE
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 10 20 30 40 50 60 70
Stunden nach Applikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
Paraxanthin- Mittelwerte
Coffein- MittelwerteTheophyllin- Mittelwerte
Abb. 27: Gemittelter Plasmakonzentrations uf von Theophyllin und den Metaboliten Paraxanthin und Coffein (Theobro wurde nicht nachgewiesen)
verlamin
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 7
Stunden n
0
pplikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/
ach A
m Paraxanthin- MittelwerteCoffein- MittelwerteLOQLOD
Abb.28: Gemittelter Plasmakonzentrationsv der Metaboliten Paraxanthin und Coffein nach intravenöser Applikation von g Theophyllin sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) un chweisgrenze (LOD)
erl 4 m
d de
auf g/k
r Na
90
ERGEBNISSE
91
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 0.08 0.25 0.5 1 3 7 12 24 32 48 60
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 29: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und dem Metaboliten Paraxanthin und Coffein im Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin nachgewiesen)
4.3.1.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation
Die maximalen Plasmakonzentrationen von The
zwischen 1.791 ng/ml und 3.483 ng/ml. Der
Konzentration variiert von vierzig Minuten bis zwölf Stunde
wurde von zwei Pferden nach 60 Stunden, von dr
Pferd erst nach 108 Stunden unterschritten.
Auch nach oraler Applikation konnte der Me
maximalen Konzentrationen lagen zwischen
40 Minuten und 12 Stunden erreicht. Ab 48 Stunde
die Werte aller Pferde die Quantifik
Coffein war lediglich in Spuren im Bere
Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.
ophyllin nach oraler Verabreichung lagen
Zeitraum des Erreichens der maximalen
n. Die Quantifizierungsgrenze
ei Pferden nach 96 Stunden und von einem
tabolit Paraxanthin nachgewiesen werden. Die
157 ng/ml und 370 ng/ml und wurden zwischen
n nach der Verabreichung unterschritten
ationsgrenze für Paraxanthin von 100ng/ml.
ich der Nachweisgrenze von 14 ng/ml erkennbar.
Die Einzelwerte d ind in
en Tabellen 46 und 47 im Anhang aufgeführt. Abb. 30 zeigt die
akonzentrationsverläufe aller sechs Pferde, Abb. 31 die gemittelten Plasm
d
er Theophyllin- und Paraxanthinplasmakonzentrationen aller Pferde s
ERGEBNISSE
Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin und Paraxanthin und Abb. 32 deren
prozentuales Verhältnis.
0
500
1000
1500
2000
2500
0 20 40 60 80 100 120
Stunden nach Applikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
Theophyllin- MittelwerteP
rlau
The
araxanthin- Mittelwerte
Abb. 30: Gemittelter Plasmakonzentrationsve f von Theophyllin und Paraxanthin im Plasma nach oraler Applikation von 4 m ewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein in und kein Coffein nachgewiesen)
g/kg Körpergobrom
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 0.16 0.66 3 9
Ze24 48 60
]it [h
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 31: Prozentuales Verhältnis von Theophyl d dem Metaboliten Paraxanthin im Plasma nach oraler Applikation von g Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein in und kein Coffein nachgewiesen)
lin ung/k
obrom 4 mThe
92
0
5 0 0
1
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
4 0 0 0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 2 0
S tu n d e n n a c h A p p lik a t io n
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
P fe rd 1 P fe rd 2 P fe rd 3 P fe rd 4 P fe rd 5 P fe rd 6
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
4 0 0 0
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
Abb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von 4mg Theophy gewicht, Ausschnittsvergrößerung zeigt die ersten 25 Stunden nach Applikation
93
ERG
EBN
ISSE
3 0
llin pro kg Körper
ERGEBNISSE
4.3.1.3. he in te i ö p
W n u m n d im Pla nze nen der
ein lnen de W zw en ng nd 2 an und wurden zwischen
zw und inu ach ave V eich erre De zent sverlauf
f ach initialer Maximalkonzentration bei Pfer 1, 4, 5 und 6 ab, u ann zehn
M en n der ika kon rlic gsa eite
und 3 weicht der Verlauf wie folgt ab: Die Pl akonzentrationen schwanken innerhalb der
ersten zwanzig Minuten stark zwischen hohen
im rla n ferde kontinuierlic a o ati erli
ie Werte der Pferde 1, 2 und 5 unterschreiten bereits nach 96 Stunden die
isen über
en Probenentnahmezeitraum von 168 Stunden Theobrominplasmakonzentrationen oberhalb
er Quantifizierungsgrenze auf. Wie die prozentuale Darstellung in Abb. 33 zeigt, läßt sich
im Plasma lediglich Theobromin
br inap werden. Die Einzelwerte der
r inpl in Tab. 48 im Anhang aufgeführt.
T obrom und Metaboli n nach ntraven ser Ap likation
ie der Abbildu g 34 z entneh en ist, ahmen ie max alen smako ntratio
ze Pfer erte isch 5.715 /ml u 12.40 ng/ml
ei 45 M ten n intr nöser erabr ung icht. r Kon ration
ällt n den den stark m d
inut ach Appl tion tinuie h lan m w r abzufallen. Bei den Pferden 2
asm
und niedrigen Werten, um danach ähnlich wie
Ve uf der a deren P h langs m an K nzentr on zu v eren.
D
Quantifizierungsgrenze, die des Pferdes 6 nach 144 Stunden. Die Pferde 3 und 4 we
d
d
nach intravenöser Verabreichung von Theobromin
nachweisen. Coffein, Theophyllin und Paraxanthin konnten nach intravenöser
Theo om plikation nicht nachgewiesen
Theo om asmakonzentrationen aller Pferde sindb
0%10%2030%40%50%60%70%80%9
100%0%
%
0 0.08 0.25 0.5 1 3 7 13 28 48 96 144
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 33: Prozentuales Verhältnis von Theobr
omin und Metaboliten im Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel (es wurde kein Theophyllin, kein Paraxanthin und kein Coffein nachgewiesen)
94
0
2000
4000
6000
8000
10
12
14
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
000
000
000
0 2 0 60 80 120 140 180
S tu n d en n ach A p p tio n0 4 100
lika160
P ferd 1 P fe rd 2 P fe rd 3 P fe rd 4 P fe rd 5 P fe rd 6 0
2000
0 0.4
Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Theobromin nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theobro kg Körpergewic Ausschnittsvergrößerung gt die erste Stunde nach Applikation
95
ERG
EBN
ISSE
ht,
4000
00
00
00
00
00
60
80
100
120
140
0.2 0 .6 0 .8 1 1.2
min pro zei
ERGEBNISSE
4.3.2. Pharmakokinetische Berechnungen
4.3.2.1. Pharmakokinetik von Theophyllin nach intravenöser Applikation
Die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter für Theophyllin nach intravenöser
Verabreichung erfolgte anhand eines Zwei-Kompartiment-Modells, da aufgrund der in Abb.
5 dargestellten halblogarithmischen Darstellung der gemittelten
lasmakonzentrationsverläufe des Theophyllins von einem biexponentiellen Phasenverlauf
ausgegangen werden konnte.
3
P
1
10
100
1000
10000
0 10 20 0 50 60
Z
30 4
eit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
MittelwertLOQLOD
bb.35: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theophyllinkonzentrationsverläufe im r
ie Ergebnisse der pharmakologischen Berechnungen durch das Programm WinNonlin® 4.1
lle 33 dargestellt.
APlasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Theophyllin, sowie deQuantifizierungsgrenze (LOQ) und der Nachweisgrenze (LOD)
D
(Pharsight, Mountain View California, USA) sind in Tabe
Tab.33: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
nter der Kurve (area under the curve) = Hybridkonstante Verteilungsphase = Hybridkonstante der Eliminationsphase
0,5 = Halbwertzeit für die Eliminationsphase
ax = maximale Konzentration
AUC = Fläche uαβα 0,5 = Halbwertzeit für die Verteilungsphase βC mCL = Clearance MRT = mittlere Verweildauer eines Moleküls im Organismus Vss = Verteilungsvolumen im Steady State
4.3.2.2. Pharmakokinetik von Theophyllin nach oraler Applikation
Die Berechnungen der pharmakokinetischen Parameter für Theophyllin nach oraler
Applikation wurde anhand eines Ein-Kompartiment-Modells durchgeführt, da die in Abb. 36
gezeigte halblogarithmische Darstellung der gemittelten Plasmakonzentrationen von
Theophyllin sich monoexponentiell verhielt.
Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnungen sind in Tabelle 34 zusammengefasst.
97
ERGEBNISSE
98
1
10
100
1000
0 20 40 60 80 100 120
Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]10000 Theophyllin- Mittelwerte
LOQLOD
Abb.36: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theophyllinkonzentrationsverläufe im Plasma nach einmaliger oraler Applikation von Theophyllin, sowie der
Tab.34: Pharmakokinetische Daten bis zur oraler Applikation von 4 mg Theoph
AUC = Fläche unter der Kurve (area under the curve)K01 HL = Halbwertszeit der ResorptionskonstanteK10 HL = Halbwertszeit der EliminationskonstanteCL = Clearance Tmax = Zeit bis zum Erreichen der maximaCmax = maximale KonzentrationKel = Eliminationskonstante
Quantifizierungsgrenze nach einmaliger yllin pro kg Körpergewicht
n n
len Konzentration (Cmax)
ERGEBNISSE
Aus den ermittelten Parametern lässt sich zusätzlich die orale Bioverfügbarkeit (F) von
Theophyllin bestimmen. Sie wird über das Verhältnis der Flächen unter den Kurven nach
intravenöser (AUC i.v.) und nach oraler (AUC oral) Verabreichung wie folgt berechn
et:
100..
⋅⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
vi
oral
AUCAUC
F [%]
Die orale Bioverfügbarkeit von Theophyllin wurde mit 85% errechnet.
4.3.2.3. Pharmakokinetik von Theobromin nach intravenöser Applikation
Zur Berechnung der pharmakokinetischen Parameter des intravenös verabreichten
Theobromins wurde, aufgrund des in Abb. 37 dargestellten biexponentiellen Verlaufes der
halblogarithmischen Darstellung der Plasmakonzentrationsmittelwerte, ein Zwei-
Kompartiment-Modell gewählt. Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnungen sind
in Tabelle 35 zusammengefasst.
1
10
100
1000
10000
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Zeit [h]
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
Theobromin- MittelwerteLOQLOD
Abb.37: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theobrominkonzentrationsverläufe im Plasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Theobromin, sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) und der Nachweisgrenze (LOD)
Vss [ml/kg] 680.6 834.5 1221.7 1272.1 1174.5 1247 1071.7 250.3 Tab.35: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht
UC = Fläche unter der Kurve (area under the curve) = Hybridkonstante Verteilungsphase = Hybridkonstante der Eliminationsphase 0,5 = Halbwertzeit für die Verteilungsphase 0,5 = Halbwertzeit für die Eliminationsphase max = maximale Konzentration L = Clearance RT = mittlere Verweildauer eines Moleküls im Organismus ss = Verteilungsvolumen im Steady State
AαβαβCCMV
100
ERGEBNISSE
101
ten im Urin Theophyllin und
l. Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.
izierungsgrenze von 50 ng Theophyllin pro ml
ten Probenentnahmezeitraum in Konzentrationen
ungsgrenze von 50 ng pro ml Urin nachzuweisen. Die höchsten
chen 745 ng/ml und 2.980 ng/ml und wurden
rei bis zwölf Stunden gemessen. Die Einzelwerte der
- und Paraxanthinurinkonzentrationen aller Pferde sind in den Tabellen 49 und 50
Anhang aufgeführt. Das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin wird in
Abb. 39 veranschaulicht. In Abb.38 werden die Theophyllinkonzentrationsverläufe aller
Pferde im Urin nochmals graphisch dargestellt.
4.3.3. Urin
4.3.3.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation
Nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konn
Paraxanthin nachgewiesen werden. Coffein war in Spuren erkennbar, die Werte überschritten
aber nicht die Bestimmungsgrenze von 50 ng pro ml Urin, somit kann Coffein nicht sicher
quantifiziert werden. Die gemittelten rein rechnerischen Coffeinkonzentrationen lagen alle
unter der Detektionsgrenze von 14 ng/m
Theophyllin wies maximale Konzentrationen von 21.636 ng/ml bis 93.373 ng/ml auf. Diese
wurden nach drei bis neun Stunden im Anschluss an die Injektion erreicht. Im weiteren
Verlauf fielen die Konzentrationen zunächst rasch ab, danach sanken sie langsam und
kontinuierlich. Über den Zeitraum der Urinprobenentnahmen von 60 Stunden fiel bei keinem
Pferd die Urinkonzentration unter die Quantif
Urin. Auch Paraxanthin war über den gesam
über der Bestimm
Paraxanthinurinkonzentrationen lagen zwis
ähnlich dem Theophyllin nach d
Theophyllin
im
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
0 10 20 30 40 50 60 70
Stunden nach Applikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
Pferd 1 Pferd 2 Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6
Abb. 38: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
102
ERG
EBN
ISSE
ERGEBNISSE
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 1 3 6 9 12 15 24 28 32 36 48 54 60Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 39: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin und kein Coffein nachgewiesen)
103
ERGEBNISSE
104
gemessen. Die Konzentrationen stiegen bei allen
Pferden innerhalb dieser ersten Stunden stark an, um danach wieder stark abzufallen. Nach
zwanzig Stunden stellte sich der Konzentrationsabfall deutlich langsamer dar. In dem
Zeitraum der Probenentnahmen unterschritten lediglich die Konzentrationen der letzten
beiden Proben von Pferd 1 die Quantifizierungsgrenze von 50 ng Theophyllin pro ml Urin.
Diese Werte befanden sich jedoch noch oberhalb der Nachweisgrenze.
Wie auch nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konnte im Urin der Metabolit
Paraxanthin sicher nachgewiesen und quantifiziert werden. Coffein war auch bei diesen
Proben in Spuren erkennbar, die Konzentrationen erreichten aber nicht die
Quantifizierungsgrenze und überschnitten im Mittel nicht die Detektionsgrenze von 33 ng/ml.
Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.
Maximale Paraxanthinkonzentrationen zwischen 842 ng/ml und 1864 ng/ml konnten in einem
von drei bis elf Stunden nach der Verabreichung gemessen werden. Die
sgrenze von 32 ng/ml wurde im Verlauf des Probenentnahmezeitraums von allen
Pferden unterschritten.
den Tabellen 51 und 52 heophyllin
Theophyllinkonzentrationsverläufe aller Pferde im Urin nochmals graphisch dargestellt.
4.3.3.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation
Nach oraler Verabreichung von 4mg Theophyllin pro kg Körpergewicht wurden im Urin
maximale Theophyllinkonzentrationen von 16.365 ng/ml bis 41.256 ng/ml innerhalb der
ersten drei bis elf Stunden nach Applikation
Zeitraum
Detektion
Die Einzelwerte der Theophyllin- und Paraxanthinurinkonzentrationen aller Pferde sind in
im Anhang aufgeführt. Das prozentuale Verhältnis von T
und Paraxanthin wird in Abb. 41 veranschaulicht. In Abb. 40 werden die
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
0 20 40 60 80 100 120
Stunden nach Applikation
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
Pferd 1 Pferd 2 Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6
Abb. 40: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
105
ERG
EBN
ISSE
ERGEBNISSE
0%10%20%30%
80%
40%50%60%70%
90%100%
0 1.5 6 11 15 30 54 72 108
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
bb.41: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin und kein Coffein nachgewiesen)
A
106
ERGEBNISSE
4.3.3.3. Theobromin und Metaboliten nach intravenöser Applikation
Abb.43 zeigt den Theobrominkonzentrationsverlauf im Urin nach intravenöser Applikation
mg Theobrom Die maximalen Konzentrationen schwanken
zwischen 65.771 ng/ml und 94.889 ng/ml. Sie werden nach drei bis neun Stunden erreicht.
ach diesem anfänglichen starken Anstieg fallen die Konzentrationen zunächst rasch wieder
ung von
heobromin im Urin dedektiert werden. Das prozentuale Verhältnis der im Urin
2
ie Einzelwerte der Theobrominurinkonzentrationen aller Pferde sind in der Tabelle 53 im
rt. In werden die Theobrominkonzentrationsverläufe aller Pferde im
rin nochmals graphisch dargestellt.
von 4 in pro kg Körpergewicht.
N
ab. Dieser Konzentrationsabfall stellt sich in der Folgezeit langsamer dar. Die
Quantifizierungsgrenze von 100 ng/ml wird bei vier der sechs Pferde bereits während des
Probenentnahmezeitraumes von 168 Stunden unterschritten.
Weder Theophyllin, Coffein noch Paraxanthin konnten nach intravenöser Verabreich
T
dedektierbaren Substanzen nach intravenöser Applikation von Theobromin wird in Abb. 4
gezeigt.
D
Anhang aufgefüh Abb. 43
U
0%
100%
50%60%70%80%90%
10%20%30%40%
1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96 120 144 168
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
: nis von Theobromin und Metaboliten im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theophyllin, kein Paraxanthin und kein Coffein nachgewiesen)
Abb.42 Prozentuales Verhält
107
0
00
00
00
00
00
00
00
00
00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
100000
0 20 40 60 0 0 140 180
St en nach Appli on
Kon
zent
ratio
n [n
g/m
l]
160
Pferd 1 P ferd 2 P ferd 3 P ferd 4 P ferd 5 P ferd 6
8
und1 0
kati120
000
00000000
den
10002000
300040005000600070008000900000001
0 10 5 20
Abb. 43: Urinkonzentr bromin nach einmaliger intravenöser pli o on 4 mg Theobromin gewicht, Aus ni er ße g gt die ersten 28 Stun nac pp ati
108
ERG
EBN
ISSE
25 30
pro kg Körper
5 1
Apon
kati n vh A lik
ationsverläufe von Theorunsch ttsv grö zei
ERGEBNISSE
4.3.4. Pharmakodynamische Effekte von Theophyllin und Theobromin
ikante Herzfrequenzsteigerung beobachtet
erden.
.3.4.2. Atemfrequenz
Keines der Pferde zeigte während der drei Versuchsabschnitte signifikante Veränderungen der
Atemfrequenz.
.4. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen
OUTAIN un harmakodynamik-
odell, anhand dessen aus den ermittelten pharmakokinetischen Parametern effektive und
relevante Plasma- und Urinkonzentrationen berechnet werden können.
Die effektive Plasmakonzentration
4.3.4.1. Herzfrequenz
Direkt im Anschluss an die intravenöse Applikation von Theophyllin und Theobromin zeigten
sich bei einigen Pferden geringgradige Erhöhungen der Herzfrequenz. Nach oraler
Applikation von Theophyllin konnte keine signif
w
4
4
T d LASSOURD (2002) entwickelten ein Pharmakokinetik-/P
M
ir
(EPC) pro Dosierungsintervall wird unter
Be cht er u d v r u c h
folgender Gleichung berechnet:
rücksi igung d Dosier ng (D), er Bio erfügba keit (F) nd der Clearan e (CL) nac
EPC = Cleara
arkeitBioverfügbDosierung ⋅ g/m
die
leichung bei intravenöser Verabreichung wie folgt vereinfacht werden:
nce [µ l]
Da bei intravenöser Applikation die Bioverfügbarkeit gleich 1 zu setzen ist, kann
G
ClearanceDosierung [µg/ml] EPC =
109
ERGEBNISSE
Die irrelevante Plasmakonzentration (IPC) lässt sich aus der EPC unter Annahme eines
icherheitsfaktors (SF) wie folgt berechnen: S
IPC = SF
EPC [µg/ml]
er eingesetzte Sicherheitsfaktor soll individuelle Schwankungen ausgleichen und die
eisten. Er ergibt sich aus dem Faktor 50, der die Umrechnung der
tor 10, welcher die Variationen innerhalb der
icherheitsfaktor (SF) = 500.
ie irrelevante Urinkonzentration
D
Validität der Daten gewährl
EPC in die IPC darstellt und dem Fak
Tierpopulationen berücksichtigen soll. Somit beträt der S
D (IUC) wird nun anhand der IPC und der Rss (Ratio Steady
e folg
ss
State) wi t berechnet:
IUC = IPC · Rss [ng/ml]
Rss (Ratio Steady State) stellt das Urin-/ Plasmakonzentrationsverhältnis im Steady State dar
und errechnet sich wie folgt:
R = rationsmakonzentttlichePladurchschnitionnkonzentrattlicheUridurchschni
Die durchschnittliche Urinkonzentration errechnet sich durch Addition der
Urinkonzentrationen, die in dem Zeitraum angenommenen Dosierungsintervalls liegen
und anschließender Division durch die Anzahl der addierten Konzentrationen.
Die hnitt e ko ra D ch ch r ziehu er
maximalen Plasmakonzentration (Cma ), der Eliminationskonstanten (β) und des
Dosierungsintervalls (τ) nach KIETZMANN (1983) wie folgt:
des
durchsc lich Plasma nzent tion (C ) erre net si unte Einbe ng d
x
CD = τβ ⋅
mC [ng/ml] ax
110
ERGEBNISSE
4.4.1. Berechnung effektiver und irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen
von Theophyllin
mik-Modells von TOUTAIN und
ASSOURD (2002). Dabei fanden die in Kapitel 4.4. beschriebenen Formeln Anwendung.
Tab.40: Ausscheidungszeiten von Theophyllin aus dem Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 12 bzw. 24 Stunden)
113
ERGEBNISSE
4.5.2. Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation
Die Berechnungen der Ausscheidungszeiten von Theophyllin nach oraler Applikation wurden
nach der oben angegebenen Formel bis zum Erreichen der Nachweis- und der
Quantifizierungsgrenze durchgeführt, und sind in Tab. 41 aufgeführt. Die benötigten
Tab.42: Ausscheidungszeiten von Theobromin aus dem Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 13 bzw. 24 Stunden)
115
DISKUSSION
5 DISKUSSION
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mittels pharmakologischer Studien an jeweils sechs
Pferden und anschließender quantitativer Untersuchungen der Plasma- und Urinproben
Aussagen über das Ausscheidungsverhalten der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin
nach intravenöser und oraler Applikation machen zu können. Anhand der ermittelten Daten
sollte geprüft werden, ob konkrete Aussagen über Nachweisfristen und Ausscheidungszeiten
von Theophyllin und Theobromin im Plasma und im Urin von Pferden gemacht werden
können, und wie sich dies hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd auswirkt.
Dazu wurden nach Optimierung und Validierung der Analysemethode die Plasma- und
Urinproben quantitativ analysiert und die Ergebnisse anschließend pharmakokinetischen
Berechnungen unterzogen. Durch Einbringen der berechneten Daten in das PK/PD-Modell
von TOUTAIN und LASSOURD (2002) konnten die effektiven Plasmakonzentrationen
(EPC), die irrelevanten Plasmakonzentrationen (IPC) und daraus schließlich die irrelevanten
Urinkonzentrationen (IUC) berechnet werden.
5.1. Eignung der Aufarbeitungs- und Analysemethode (HPLC/MS/MS) zur
Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin im Plasma und Urin
Die Grundlage der in dieser Arbeit angewendeten Analysemethode für Theophyllin und
Theobromin im Pferdeplasma und -urin bildete eine Routinemethode, die im Institut für
Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln im Rahmen der Dopinganalytik polarer
Substanzen angewendet wird.
Die im Vorversuch entnommenen Plasma- und Urinproben wurden mittels dieser Methode
untersucht. Dabei zeigte sich, das diese Methode weiter modifiziert werden musste, um die
gewünschte Empfindlichkeit zu erreichen.
ls interne Standards wurden ein am Stickstoffatom markiertes Theophyllin (1,3-15N2-A
Theophyllin) sowie deuteriertes Theobromin (D6-Theobromin) und Coffein (D3-Coffein)
gewählt.
116
DISKUSSION
Als am besten geeignetes Lösungsmittel für die Standardlösungen erwies sich Milli-Q-
Wasser. Bei der Herstellung der internen Standardlösungen musste die D6-Theobromin-
m ca. 10% steigern. Diese Ergebnisse stimmen weitestgehend mit den Angaben von KELLY
ichtigkeit, Präzision, Ermittlung der
uantifizierungsgrenze (LOQ) und der Detektionsgrenze (LOD) sowie Wiederfindung und
Konzentration aufgrund der nur halb so großen Signalintensität von D6-Theobromin im
Gegensatz zu den restlichen internen Standards verdoppelt werden, um eine gut zu
integrierende Peakfläche zu erhalten. Beim sogenannten Tuning des HPLC- Gerätes zeigte
sich, dass der Ionenübergang 181.0/ 124.0 bei Theophyllin und Paraxanthin identisch ist und
somit diese Stoffe über die Differenzmethode anhand des nur bei Paraxanthin
nachgewiesenen Ionenüberganges 181.0/ 55.0 quantifiziert werden mussten.
Als geeignete Säule für die Plasma- und Urinaufarbeitung erwies sich die Oasis® HBL 3cc
(60mg) Extraction Cartridges der Firma Waters. Das im Konzentrationsbereich bis 10000
ng/ml verwendete Volumen von 2,5 ml Urin bzw. Plasma führte zu einer guten Ausbildung
und Integration des Messsignals. Um einer Sättigung der analytischen Säule und des
Detektors vorzubeugen, wurde das Probenvolumen bei Konzentrationen über 10000 ng/ml auf
1 ml reduziert. Um die bei der Urinaufarbeitung zunächst beobachteten und durch
Matrixbestandteile verursachten Störpeaks zu verhindern, wurden die Urinproben vor
Aufbringen auf die Säule zentrifugiert. Die in die Plasmaaufarbeitung eingefügte
Proteindenaturierung führte bei Theophyllin und Theobromin zu einer nahezu doppelt so
hohen Substanzausbeute. Bei Coffein ließ sich die Ausbeute durch die Proteolyse lediglich
u
und LAMBERT (1978), GREEN et al. (1983), INGVAST-LARSSON et al. (1992) und
CHOU et al. (2001) überein, die für Theophyllin eine Proteinbindung von rund 20% bei
Pferden angeben. INGVAST-LARSSON et al. ermittelten allerdings 1989 in einer anderen
Studie eine Plasmaproteinbindung von lediglich 12% für oral verabreichtes Theophyllin. Für
Coffein wird eine Proteinbindung von 2 bzw. 12% angeben. Die von KELLY und
LAMBERT (1978) für Theobromin veröffentliche Proteinbindung von lediglich 3% im
Pferdeplasma deckt sich mit den anhand dieser Studie ermitteln Daten nicht.
Sowohl die Methode zur Aufarbeitung von Plasma als auch die Methode zur Aufarbeitung
von Urin wurden einer Validierung nach den Vorgaben der EHSLC (2002) unterzogen, um
die Eignung der in dieser Studie entwickelten Analysemethode zu beweisen. Die Validierung
umfasste die Parameter Selektivität, Linearität, R
Q
Stabilität.
117
DISKUSSION
Die zur Überprüfung der Selektivität untersuchten Chromatogramme zeigten, dass im Bereich
der Retentionszeiten der Analyten sowie der internen Standards keine Störpeaks erschienen.
Die Substanzen konnten somit ohne Verfälschung von fremden Matrixstoffen dargestellt
werden. Die Kriterien für die Linearität, Richtigkeit und Präzision wurden im Plasma bei
Theophyllin, Theobromin und Coffein anhand von drei Kalibrationskurven über den Bereich
ischen 29 ng/ml und 1.000 ng/ml im Plasma und 32 ng/ml
und 30.000 ng/ml belegt worden.
war im Rahmen der Validierungskriterien ebenfalls sowohl im
rin als auch im Plasma gegeben.
von 20 ng/ml bis 50.000 ng/ml untersucht und erfüllt. Für Paraxanthin war dies nur im
Bereich von 20 ng/ml bis 1.000 ng/ml nötig und konnte ebenfalls bestätigt werden. Im Urin
konnte die geforderte Linearität, Richtigkeit und Präzision bei Theophyllin über drei
Kalibrationskurven im Bereich von 25 ng/ml bis 30.000 ng/ml belegt werden und bei
Paraxanthin und Coffein im relevanten Konzentrationsbereich von 25 ng/ml bis 1.000 ng/ml
ebenfalls. Bei Theobromin wurden über Anwendung eines quadratischen Regressionsmodells
die Kriterien erfüllt.
Die Ergebnisse belegen somit, dass die Methoden geeignet sind, Theophyllin im
Konzentrationsbereich von 13 ng/ml bis 50.000 ng/ml im Plasma und von 20 ng/ml bis
30.000 ng/ml im Urin nachzuweisen. Dies gilt für Theobromin im Plasma von 15 ng/ml bis
50.000 ng/ml und im Urin von 26 ng/ml bis ebenfalls 30.000 ng/ml. Für die Metaboliten
Paraxanthin ist dies im Bereich zw
und 30.000 ng/ml im Urin und bei Coffein im Bereich von 14 ng/ml bis 50.000 ng/ml und im
Urin zwischen 33 ng/ml
Die im Plasma für Theophyllin und ihre Metaboliten ermittelten Quantifizierungsgrenzen
liegen mit 100 ng/ml höher als die im Urin für diese Substanzen berechneten
Bestimmungsgrenzen von 50 ng/ml. Für Theobromin gilt die Quantifizierungsgrenze von 100
ng/ml sowohl im Plasma als auch im Urin. Die Ursache hierfür liegt neben den
Matrixunterschieden in den Validierungskriterien der Leitlinien der EHSLC (2002)
begründet, nach denen die Validierungskriterien bei jeder Substanz einzeln erfüllt sein
müssen.
Die Stabilität der Analyten
U
5.2. Ausscheidungsverhalten von Theophyllin und Theobromin
Die im Plasma ermittelten Maximalkonzentrationen von Theophyllin nach intravenöser
Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht lagen mit 5.165 - 8.834 ng/ml (Mittelwert ±
118
DISKUSSION
Standardabweichung = 7.167 ng/ml ± 1.348 ng/ml) deutlich höher als die nach oraler
Applikation gleicher Menge. Diese Maximalkonzentrationen lagen zwischen 1.791-3.483
Sowohl nach intravenöser als auch nach oraler Verabreichung von Theophyllin war nach
kurzer Zeit der Metabolit Paraxanthin im Plasma nachweisbar. Die maximalen
120
DISKUSSION
Konzentrationen nach intravenöser Applikation lagen im Mittel bei 580 ng/ml (± 39%) und
wurden nach zwei Minuten bis zwei Stunden erreicht. Nach oraler Gabe wurden die höchsten
Plasmakonzentrationen von gemittelt 230 ng/ml (± 31%) in der Zeit von 40 Minuten bis 12
Stunden erreicht. LOEFFLER (2000) konnte weder nach intravenöser noch nach oraler
erabreichung von Theophyllin an Hunde Paraxanthin im Plasma nachweisen.
von Theophyllin konnten TANG-LIU und RIEGELMAN (1981) aber auch lediglich
al. (2000a) wiesen nach
travenöser Theobrominapplikation und KAISER (2006) nach oraler
Parameter, die für intravenös appliziertes Theophyllin und
Theobromin anhand eines Zwei-Kompartiment-Modells und für oral verabreichtes
Theophyllin anhand eines Ein-Kompartiment-Modells berechnet wurden, entsprechen
weitestgehend den Angaben in der Literatur. Die ermittelte Eliminationshalbwertzeit nach
intravenöser Applikation von Theophyllin beträgt im Mittel 13,6 Stunden (± 21%) und nach
oraler Applikation 18,1 Stunden (± 23%). Dies entspricht in etwa den Angaben von
V
Coffein konnte in der vorliegenden Studie nach beiden Applikationsarten von Theophyllin
lediglich in Spuren nachgewiesen werden. Die Konzentrationen lagen nach intravenöser Gabe
bis auf wenige Ausnahmen unter der Quantifizierungsgrenze von 100 ng/ml und nach oraler
Applikation im Bereich der Nachweisgrenze von 14 ng/ml im Plasma. Dies deckt sich mit den
Angaben in der Literatur. TANG-LIU und RIEGELMAN (1981) wiesen in ihrer Studie einen
Metabolismus von Theophyllin zu Coffein beim Menschen nach. Nach ihren Untersuchungen
werden rund 6% des mehrfach oral verabreichten Theophyllins zu Coffein metabolisiert,
bevor dieses vor der renalen Ausscheidung weiter verstoffwechselt wird. Nach einmaliger
Gabe
Spuren von Coffein nachweisen. Laut LOEFFLER (2000) ist nach Theophyllinapplikation bei
Hunden im Plasma Coffein nicht nachweisbar. MC KIERNAN et al. (1981) untersuchten in
ihrer Studie die Metaboliten nicht.
Theobromin konnte weder nach intravenöser noch nach oraler Applikation von Theophyllin
nachgewiesen werden.
Nach intravenöser Verabreichung von Theobromin waren im Plasma lediglich sehr geringe
Spuren von Coffein und Theophyllin erkennbar, die im Bereich der Nachweisgrenzen von 14
ng/ml für Coffein und 13ng/ml für Theophyllin lagen. Paraxanthin konnte nach intravenöser
Theobrominapplikation nicht nachgewiesen werden. LOEFFLER et
in
Theobrominverabreichung ebenfalls lediglich Theobromin im Plasma nach. Demzufolge
scheint keine quantifizierbare Metabolisierung des Theobromins zu Paraxanthin, Theophyllin
oder Coffein stattzufinden.
Die pharmakokinetischen
121
DISKUSSION
LÖSCHER (2006), der diese als tierartlich sehr unterschiedlich und für Pferde mit 10-17
Stunden angibt. LOEFFLER et al. (2000b) ermittelten in ihrer Studie eine
Eliminationshalbwertzeit von 5 Stunden nach intravenöser und von 3 Stunden nach oraler
Verabreichung. Diese Werte sind mit den hier ermittelten schlecht vergleichbar, da es sich bei
den Probanden bei LOEFFLER et al. (2000b) um Hunde und in dieser Studie um Pferde
handelt. Die Clearance nach intravenöser Applikation von Theophyllin beträgt im Mittel 58,4
ml/h/kg (± 27%), nach oraler Verabreichung 70,5 ml/h/kg (± 31%) und nach intravenöser
Applikation von Theobromin 55,4 ml/h/kg (± 74%). KAISER (2006) ermittelte für oral
verabreichtes Theobromin bei Pferden eine durchschnittliche Clearance von 67,2 ml/h/kg (±
29%). Das in dieser Studie ermittelte Verteilungsvolumen von Theophyllin beträgt 1,1 l/kg.
MC KIERNAN et al. (1981) geben dies mit 0,67 l/kg an, GREENBLATT und SHADER
(1985) mit 0,4 l/kg.
ie Theophyllinkonzentration im Plasma beträgt nach intravenöser Applikation in dieser
er
or ng/ml (± 146%) und
ach 108 Stunden noch 27.6 ng/ml (± 86%) im Plasma nachweisbar. Leitet man aus den
lasma die LOQ
nterschritten wird. Diese gemessenen Werte liegen bei Theophyllin nur undeutlich unter der
nach KIETZMANN (1983) für Theophyllin berechneten Ausscheidungszeiten bis zur LOQ
ikation. Die für
Theobromin n unden nur
eringgradig unter den gemessenen.
Urin konnten nach intravenöser Applikation Maximalkonzentrationen von 21.636 ng/ml
is 93.373 ng/ml und nach oraler Verabreichung Maximalkonzentrationen von 18.287 ng/ml
bis 41.256 ng/ml nachgewiesen werden. Theobromin ließ sich im Urin in
Maximalkonzentrationen von 65.771 ng/ml bis 94.889 ng/ml nachweisen. Diese im
Verhältnis zu den Plasmakonzentrationen sehr viel höheren Urinkonzentrationen belegen die
Anreichung des Theophyllins im Urin. Bei dem physiologischen Plasma-pH-Wert von 7,36
bis 7,44 liegt Theophyllin zu 96% und Theobromin zu 99,7% in der ionisierten Form vor.
D
Studie bei d letzten Blutprobenentnahme nach 60 Stunden im Mittel noch 373,5 ng/ml (±
aler Applikation sind nach 96 Stunden im Mittel noch 8565%). Nach
n
Verlaufskurven der Plasmakonzentrationen die Zeit ab, bei der die Quantifizierungsgrenze
von 100 ng/ml unterschritten wird, ergibt sich, dass nach intravenöser Theophyllingabe im
Mittel nach 71,5 ± 19 Stunden und nach oraler Verabreichung im Mittel nach 79,8 ± 20
Stunden im Plasma die LOQ unterschritten wird. Für Theobromin nach intravenöser Gabe
lässt sich ableiten, dass nach durchschnittlich 156 ± 18 Stunden im P
u
von 88 ± 22 Stunden nach intravenöser und 86 ± 17 Stunden nach oraler Appl
Stach KIETZMANN (1983) berechneten Werte liegen mit 151 ± 70
g
Im
b
122
DISKUSSION
Diese wird stark glomerulär filtriert. Im alkalischen Milieu des Pferdeurins mit einem pH-
Wert von 7,6-9,0 (SAMS, 1992; KRAFT und DÜRR, 1991) bzw. von 6,8-8,4 laut SCHÄFER
(1999) sinkt die Ionisationsrate auf bis zu 85% bei Theophyllin und auf 99,0% beim
Theobromin. Lediglich die 15% bzw. die 1% des glomerulär filtrierten Theophyllins bzw.
Theobromins, welche jetzt in nicht-ionisierter Form vorliegen, können tubulär rückresorbiert
werden. LOEFFLER (2000) ermittelte nach intravenöser und oraler Verabreichung von
Theophyllin an Hunde im Verhältnis zu dieser Studie doppelt so hohe Urinkonzentrationen
und eine erheblich geringere Zeitspanne, in welcher Theophyllin in Urin nachweisbar ist. Dies
lässt sich auch durch den sauren Urin des Hundes erklären. Im pH-Wert-Bereich zwischen
5,5-7,0 liegt Theophyllin zu 99% in der ionisierten Form vor, so dass eine tubuläre
Rückresorption nahezu ausgeschlossen werden kann.
Die starken interindividuellen Schwankungen der Urinkonzentrationen von ± 67% nach
intravenöser T
rheblichen E ussrate. Eine
rhöhte Urinflussrate führt zu einer geringeren tubulären Rückresorption und einer
esteigerten Clearance (GRAMATTE, 2002). Die renale Clearance unterliegt außerdem
edliche Flüssigkeitsaufnahme begründet sein. Da es sich bei diesem Versuch um
intravenöser und ± 34% nach oraler Theophyllinverabreichung und von ± 16% nach
heobromingabe resultieren aus verschiedenen Ursachen.
E influss auf die Konzentration eines Stoffes im Urin hat die Urinfl
e
g
Beeinflussungen durch Veränderungen des Urin-pH, welcher wiederum durch Faktoren wie
Ernährung und körperliche Belastung verändert werden kann. Laut TOBIN (1986) kann der
Urin-pH aufgrund von körperlicher Anstrengung auf Werte von unter 5 sinken. Auch
aufgrund von Hungerzuständen kann der Urin-pH absinken (SCHÄFER, 1999).
Vergleichende Untersuchungen des Urin-pH-Wertes in Abhängigkeit von der Fütterung von
WOOD et al. (1990) zeigten, dass dieser bei Weidepferden durchschnittlich um 0,5 höher
liegt als bei Stallpferden. Da Theophyllin und Theobromin nur im geringen Maße tubulär
rückresorbiert werden, führt eine gesteigerte Urinflussrate zu einer verminderten
Urinkonzentration dieser Stoffe (SAMS, 1992; DELBEKE und DEBACKERE, 1991). Eine
unterschiedlich ausgeprägte Harnproduktion kann außerdem durch Stress oder
unterschi
eine „dirty“-Studie handelt, können weder unterschiedliche körperliche Belastung,
individueller Stress noch unterschiedliche Flüssigkeitsaufnahme der Pferde ausgeschlossen
werden, und werden somit zum Teil eine Ursache der interindividuellen Schwankungen der
Ergebnisse sein. Laut DYKE und SAMS (1994) hätte der gesamte Urin der Probanden über
die Versuchsdauer gesammelt werden müssen, um über die Harnproduktion eine genauere
Aussage über die Substanzmenge im Urin und somit genaue Angaben zur Ausscheidungsrate
123
DISKUSSION
der Substanzen machen zu können. Auch Nierenerkrankungen der Probanden könnten die
Nierenfunktionen und somit die Harnproduktion beeinträchtigen. Da die Kreatininwerte der
Pferde untersucht wurden und sich im Normbereich befanden, erscheint diese Ursache
allerdings sehr unwahrscheinlich.
Sowohl nach der intravenösen als auch nach der oralen Verabreichung von Theophyllin war
der Metabolit Paraxanthin im Urin nachweisbar. Die maximalen Konzentrationen nach
intravenöser Applikation lagen im Mittel bei 1.375 ng/ml (±60%) und wurden nach drei bis
zwölf Stunden erreicht. Nach oraler Gabe wurden die höchsten Urinkonzentrationen von
gemittelt 1.388 ng/ml (±27%) in der Zeit von drei bis elf Stunden erreicht. Coffein war in
Spuren erkennbar, die Werte überschritten aber nicht die Bestimmungsgrenze von 50 ng pro
ml Urin, und Theobromin wurde nicht nachgewiesen. LOEFFLER (2000) wies weder nach
travenöser noch nach oraler Verabreichung von Theophyllin an Hunde Paraxanthin im Urin
unter identischen Bedingungen das Ausscheidungsverhalten von
in
nach.
Nach intravenöser Applikation von Theobromin konnten weder Theophyllin, Coffein noch
Paraxanthin sondern ausschließlich Theobromin im Urin detektiert werden. KAISER (2006)
wies ebenfalls nur Theobromin nach oraler Applikation von Theobromin an Pferde im Urin
nach. Vergleicht man nach Verabreichung verschiedener Methylxanthine die prozentualen
Verhältnisse der im Urin nachweisbaren Substanzen, so lässt sich am Metabolitenmuster
eindeutig auf die verabreichte Muttersubstanz schließen. Da sich die Metaboliten der
einzelnen Stoffe im Urin nach intravenöser und oraler Verabreichung nur unwesentlich
unterscheiden, sind in den folgenden Abbildungen zur Veranschaulichung lediglich die
prozentualen Verhältnisse nach intravenöser Applikation dargestellt.
KAISER (2006) untersuchte
Coffein nach intravenöser und oraler sowie von Theobromin nach oraler Verabreichung. Sie
ermittelte das in Abb. 44 dargestellte Metabolitenmuster, welches deutlich zeigt, dass nach
Coffeinapplikation neben dem Coffein auch Paraxanthin, Theophyllin und Theobromin im
Urin nachzuweisen sind.
124
DISKUSSION
0%
20%
90%
100%
40%
50%
60%
70%
80%
30%
10%
0 1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
sen werden.
Abb. 44: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Coffein pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt (nach KAISER, 2006)
In Abbildung 45 ist das prozentuale Metabolitenmuster im Urin nach Applikation von
Theophyllin dargestellt. Es können neben dem hauptsächlich detektierten Theophyllin
lediglich bis zu 5% Paraxanthin und weder Coffein noch Theobromin nachgewie
Abbildung 46 zeigt das prozentuale Metabolitenmuster im Urin nach Applikation von
Theobromin. Hier wird ausschließlich Theobromin im Urin nachgewiesen.
125
DISKUSSION
100%
20%
30%
60%
90%
70%
80%
40%
50%
0%
10%
0 1 3 6 9 12 15 24 28 32 36 48 54 60
Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 45: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt
70%80%90%
100%
60%
0%10%20%30%40%50%
1 3 6 9 13 24 28 36 48 72 96 120 144 168Zeit [h]
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 45: Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen der LOQ dargestellt
126
DISKUSSION
Die nach dem Pharmakokinetik-/Pharmakodynamik-Modell von TOUTAIN und LASSOURD
(2002) berechneten irrelevanten Plasmakonzentrationen von Theophyllin in einem
Dosisintervall von 12 Stunden betrugen 12 ng/ml (± 24%) und in einem Dosisintervall von 24
Stunden 6 ng/ml (± 24%). Die irrelevanten Urinkonzentrationen von Theophyllin in einem
Dosisintervall von 12 Stunden lagen bei 20 ng/ml (± 53%) und in einem Dosisintervall von 24
Stunden bei 34 ng/ml (± 107%). Anhand dieser Werte zeigt sich, dass sowohl die irrelevante
42%) und in
inem Dosisintervall von 24 Stunden bei 36 ng/ml (± 40%). Da für die LOQ von Theobromin
ppm im Pferdefutter. Da bei Nachweis von Theobromin aufgrund des
derartiger Untersuchungen keine sicheren Informationen
ur Streuung der Gesamtpopulation gewinnen lassen und somit eine allgemeingültige
Aussage nicht möglich ist. Nimmt man jedoch an, dass die ermittelte Streuung der Ergebnisse
Plasmakonzentration als auch die irrelevante Urinkonzentration von Theophyllin im Bereich
der in dieser Studie ermittelten Nachweisgrenzen dieses Stoffes im Plasma bzw. im Urin
liegen. Wird also mit der hier beschriebenen Methode Theophyllin im Plasma oder Urin
nachgewiesen, kann eine pharmakologische Wirkung von Theophyllin nicht ausgeschlossen
werden.
Das gleiche gilt für Theobromin. Für Theobromin wurden irrelevante Plasmakonzentrationen
in einem Dosisintervall von 12 Stunden von 14 ng/ml (± 37%) und in einem Dosisintervall
von 24 Stunden von 8 ng/ml (± 37%) errechnet. Die irrelevanten Urinkonzentrationen von
Theobromin in einem Dosisintervall von 12 Stunden lagen bei 40 ng/ml (±
e
im Plasma 15 ng/ml und im Urin 26 ng/ml ermittelt wurde, kann auch bei einem
Theobrominnachweis im Plasma oder Urin anhand dieser Untersuchungsmethode eine
pharmakologische Wirkung nicht ausgeschlossen werden. Dem entgegen steht der
international geltende Grenzwert von 2000 ng Theobromin pro ml Urin. Da es weder in der
Human- noch in der Veterinärmedizin zugelassene Theobrominpräparate gibt, sind die
Hauptursachen von Theobrominnachweisen bei Pferden Futtermittelkontaminationen. Diese
sind laut HAYWOOD et al. (1990) und HARKINS et al. (1998) aus produktionstechnischen
Gründen nicht generell zu vermeiden. Nach der Anlage 1 der Futtermittelverordnung vom
7.03.2005, zuletzt geändert am 02.11.2006, ist die Verwendung von Kakaoschalen im
Rahmen der Tierernährung statthaft und es gilt nach Anlage 5 eine Höchstmengenbegrenzung
von 300
Metabolitenmusters im Urin sicher zwischen Theobromin und Coffein als verabreichte
Muttersubstanz unterschieden werden kann, ist diese Grenzwertregelung sinnvoll.
Betrachtet man die Streuung der Ausscheidungszeitenergebnisse bei nur jeweils sechs
Pferden, wird klar, dass sich anhand
z
127
DISKUSSION
dieser Studie den Durchschnitt der Gesamtpopulation widerspiegelt, könnte anhand zu
rrechnender Konfidenzintervalle eine Abschätzung der Ausscheidungszeit erfolgen
. Setzt man z.B. den für die Ausscheidungszeit von Theophyllin bis
um Erreichen der LOD ermittelten Wert von 128 Stunden gleich 100 Zeiteinheiten, so kann
unter 192 Stunden liegt. Eine
icherheit von 99,9% kann für eine Ausscheidungszeit von 180 Zahleneinheiten, also 230
Stunden, erwartet werden.
eine Sicherheit von 95% bzw. 99,9% bieten.
e
(KIETZMANN, 2006a)
z
anhand der Standardabweichung von 24 % errechnet werden, dass die Ausscheidungszeit bei
95% der Gesamtpopulation unter 150 Zahleneinheiten, also
S
Nach KIETZMANN (2006a) kann davon ausgegangen werden, dass die Annahme einer
Standardabweichung von 50% des Mittelwertes ein ausreichend hohes Maß an Sicherheit
bietet. Die auf dieser Basis abgeleitete Karenzzeit, die das Doppelte oder Dreifache der
errechneten Ausscheidungszeit beträgt, würde
50
100
150
200
250
300
ober
es K
onfid
enzi
nter
vall
99,9 % 99 %
95 %
Mittelwert = 100
00 10 20 30 40 50
Standardabweichung in der Stichprobe
Abb. 47: Konfidenzintervalle (nur oberer Grenzbereich angezeigt) für eine ermittelte
cherheit Ausscheidungszeiten bis zum
grenze von 384 Stunden für intravenös appliziertes Theophyllin und
Kenngröße (z.B. Ausscheidungszeit, angenommen mit einem Mittelwert von 100 Zeiteinheiten) in Abhängigkeit von der Streuung der Stichprobe (nach KIETZMANN, 2006a)
Somit ergeben sich für die Gesamtpopulation, bei maximal angenommener
Standardabweichung von 50%, mit 99,9%iger Si
Erreichen der Nachweis
von 654 Stunden für intravenös verabreichtes Theobromin.
128
DISKUSSION
5.3. Bewertung der Ergebnisse
Mit dieser Studie wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis von Theophyllin,
heophyllin ist in der Veterinärmedizin nicht als Therapeutikum zugelassen ist, und somit ist
rechneten irrelevanten
zu ahnden.
Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Blutplasma und Urin von Pferden entwickelt und
validiert. Diese kann in der Routinediagnostik zum einheitlichen Nachweis von
Methylxanthinen in der Dopinganalytik genutzt werden.
Durch die Ermittlung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin und
Theobromin nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) sollte geprüft werden, ob die
Festlegung eines Grenzwertes für Theophyllin im Plasma und/oder Urin möglich und sinnvoll
ist.
T
auch kein Handelspräparat für Pferde erhältlich. Ein Einsatz von Theophyllin wäre daher nur
auf der Basis einer Umwidmung im Rahmen eines Therapienotstandes möglich.
Die anhand des Modells von TOUTAIN und LASSOURD (2002) be
Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin lagen nach einem Dosierungsintervall von
12 Stunden unter der Nachweisgrenze und in einem Dosierungsintervall von 24 Stunden im
Bereich der Nachweisgrenze von 13 ng/ml im Plasma bzw. von 20 ng/ml im Urin. Somit ist
bei Nachweis von Theophyllin im Plasma oder im Urin eine pharmakologische Wirkung nicht
auszuschließen. Während für Theobromin international ein Grenzwert von 2000 ng/ml Urin
besteht, ist von der Einführung eines Grenzwertes für Theophyllin im Pferdeplasma oder
Pferdeurin abzuraten und jeglicher Nachweis von Theophyllin als dopingrelevant zu
interpretieren und
129
ZUSAMMENFASSUNG
6 ZUSAMMENFASSUNG
Sophie Koppe (2007):
nsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
iel der vorliegenden Arbeit war, neben der Optimierung und Validierung einer geeigneten
rden, die Untersuchung
von Theophyllin und Theobromin.
en mit angeschlossenem Tandemmassenspektometer. Die
alidierung umfasste die Kriterien Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität
ng/ml für Theobromin. Die Detektionsgrenzen im Plasma
gen bei 13 ng/ml für Theophyllin, 15 ng/ml für Theobromin, 14 ng/ml für Coffein und 29
rmittelt.
alig 4
ravenös verabreicht und anschließend über einen
eitraum von 60 bis 108 Stunden Plasma- und Urinproben entnommen.
inprobenentnahmen von 60 Stunden fiel bei
einem Pferd die Urinkonzentration unter die Quantifizierungsgrenze von 50 ng Theophyllin
ze erkennbar, Theobromin
Untersuchungen zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und
Theobromin hi
Z
Analysemethode zur Detektion und Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin sowie
der Metaboliten Paraxanthin und Coffein im Plasma und Urin von Pfe
des pharmakokinetischen Verhaltens
Die Validierung und Messung der Plasma- und Urinproben erfolgte auf einem
Hochflüssigkeitschromatograph
V
und Wiederfindung. Die Quantifizierungsgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin
und Coffein betrugen im Plasma 100 ng/ml und im Urin 50 ng/ml für Theophyllin,
Paraxanthin und Coffein und 100
la
ng/ml für Paraxanthin. Im Urin wurden Nachweisgrenzen von 20 ng/ml für Theophyllin, 26
ng/ml für Theobromin, 33 ng/ml für Coffein und 32 ng/ml für Paraxanthin e
In drei Versuchsabschnitten wurden jeweils sechs Pferden einmalig 4 mg/kg Körpergewicht
Theophyllin intravenös, einmalig 4 mg/kg Körpergewicht Theophyllin oral bzw. einm
mg/kg Körpergewicht Theobromin int
Z
Nach intravenöser Applikation von Theophyllin lagen die Maximalkonzentrationen von
Theophyllin im Plasma in einem Bereich von 5.165 bis 8.834 ng/ml und im Urin bei 21.636
bis 93.373 ng/ml. Über den Zeitraum der Ur
k
pro ml Urin. Es wurde sowohl im Plasma als auch im Urin der Metabolit Paraxanthin
nachgewiesen, Coffein war in Spuren im Bereich der Nachweisgren
wurde nicht nachgewiesen.
130
ZUSAMMENFASSUNG
Nach oraler Verabreichung von Theophyllin konnten Maximalkonzentrationen von
in Höhe von 16.365
is 41.256 ng/ml gemessen werden. Lediglich bei einem Pferd sank die Urinkonzentration
renze
öser Applikation nur der Metabolit Paraxanthin
obromin lagen die Maximalkonzentrationen von
heobromin im Plasma bei Werten von 5.715 bis 12.402 ng/ml und im Urin bei 65.771 bis
on 8 Stu den fi bei keinem
. Es
auch im Urin weder Theophyllin, Paraxanthin noch Coffein in
uantifizierbarer Menge nachgewiesen. Somit kann anhand des nachweisbaren
n erden. Wird
rden
eophyllin appliziert worden.
hnungen
002)
echnungen wurden sogenannte irrelevante Plasma- und
rinkonzentrationen ermittelt, bei denen eine Wirkung von Theophyllin auf den Organismus
ante Plasmakonzentration in einem
. im Bereich der Nachweisgrenzen von Theophyllin in den
in im
ußerdem kann aufgrund der erheblichen interindividuellen Streuung und geringen Anzahl
Theophyllin
phyllin im Plasma oder im Urin sollte als dopingrelevant gelten
nd entsprechend geahndet werden.
Theophyllin im Plasma in Höhe von 1.791 bis 3.483 ng/ml und im Urin
b
innerhalb des Probenentnahmezeitraumes von 108 Stunden unter die Quantifizierungsg
von 50 ng/ml. Es wurde wie nach intraven
nachgewiesen.
Nach intravenöser Applikation von The
T
94.889 ng/ml. Über den Zeitraum der Urinprobenentnahmen v 16 n el
Pferd die Urinkonzentration unter die Nachweisgrenze von 26 ng Theobromin pro ml Urin
wurde sowohl im Plasma als
q
Metabolitenmusters eindeutig auf die verabreichte Muttersubstanz geschlosse w
lediglich Theobromin nachgewiesen, ist reines Theobromin verabreicht worden. We
Theophyllin und Paraxanthin nachgewiesen, ist Th
Die ermittelten Ergebnisse wurden anschließend pharmakokinetischen Berec
unterzogen und mit Hilfe des PK-/PD-Modells nach TOUTAIN und LASSOURD (2
quantitativ verknüpft. Durch diese Ber
U
ausgeschlossen werden kann. Die ermittelte irrelev
Dosisintervall von 12 Stunden lag bei 14 ng/ml und die irrelevante Urinkonzentration bei 40
ng/ml, und somit unter bzw
verschiedenen Matrices. Daraus lässt sich schließen, dass jeder Nachweis von Theophyll
Plasma oder im Urin anhand der beschriebenen Analysemethode als positiver Dopingbefund
zu betrachten ist. Deswegen erscheint die Einführung eines Grenzwertes für Theophyllin nicht
sinnvoll.
A
von Probanden keine absolut sichere Aussage über die Ausscheidungszeiten von
und Theobromin gemacht werden.
Jeglicher Nachweis von Theo
u
131
SUMMARY
7 SUMMARY
Sophie Koppe (2007):
he methylxanthines theophylline and
vance in horse-doping
ethod for the analysis detection
f horses and to investigate the pharmacokinetic behaviour of
affeine and theobromine.
of samples was made by using a high performance liquid
hromatograph (HPLC) with connected tandem-mass-spectrometer. Validation contained the
it of
eobromine, paraxanthine and caffeine was fixed at 100
g/ml in plasma and at 50 ng/ml in urine for theophylline, paraxanthine and caffeine. For
eobromine it was fixed at 100 ng/ml. The limit of detection was found at 13 ng/ml for
9 ng/ml for
he limit of detection was found at 20 ng/ml for theophylline,
t 26 ng/ml for theobromine, at 33 ng/ml for caffeine and at 32 ng/ml for paraxanthine.
body
theobromine at a single
ns of theophylline in
lasma after intravenous administration ranged between 5165 and 8834 ng/ml.
centrations in urine ranged between 21636 and 93373 ng/ml. 60
a ons o all si horses were not below limit of
uantification. In plasma and urine the metabolites paraxanthine and caffeine were detectable.
eobromine was not
aximum concentrations of theophylline in plasma after oral administration ranged between
791 and 3483 ng/ml. Maximum concentrations of theophylline in urine ranged between
Investigation of pharmacokinetic mechanisms of t
theobromine with respect to its rele
Aim of this study was to optimize and validate a suitable m
and quantification of theophylline, theobromine and the metabolites paraxanthine and caffeine
in blood and urine samples o
c
Validation and measurement
c
criteria selectivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The lim
quantification for theophylline, th
n
th
theophylline, at 15 ng/ml for theobromine, at 14 ng/ml for caffeine and at 2
paraxanthine in plasma. In urine t
a
Theophylline was administered to six horses at a single intravenous dose of 4 mg/kg
weight, theophylline at a single oral dose of 4 mg/kg body weight, or
travenous dose of 4 mg/kg body weight. Maximum concentratioin
p
Maximum theophylline con
hours after administration urine concentr ti f x
q
But caffeine concentrations were mainly around limit of detection. Th
detectable.
M
1
132
SUMMARY
16365 and 41256 ng/ml. 108 hours after administration the urine concentration of only one
fter administration of theobromine its maximum concentrations in plasma ranged between
ours after
orses were still above limit of detection. No
etabolites could be detected in plasma and urine.
ected
ication of theobromine can be submitted, and
heophylline and paraxanthine in plasma or urine, application of
eophylline can be submitted.
pharmacokinetic/pharmacodynamic approach of
OUTAIN and LASSOURD (2002) to calculate the irrelevant plasma and urine
ntration, irrelevant plasma concentration and irrelevant
rine concentration by the pharmacokinetic/pharmacodynamic model of TOUTAIN and
ne the irrelevant plasma concentration (at 14
l of 2 hou are elow
. Therefore it is concluded that any detection of theophylline
plasma or urine by this method has to be considered as a positive result of dopingtest. That
al
ariability. It must be concluded that a prediction about excretion times of theophylline and
ible.
les should be considered as relevant for
d appropriately.
horse was below limit of quantification. In plasma and urine the metabolite paraxanthine was
detectable.
A
5715 and 12402 ng/ml and in urine between 65771 and 94889 ng/ml. 168 h
administration all urine concentrations of the six h
m
Using the pattern of metabolites the parent substance can be concluded. If there is det
almost sole theobromine in plasma or urine, appl
if there is detected t
th
Afterwards the results were integrated into a
T
concentrations where caffeine has no effect on the organism anymore.
Calculation of effective plasma conce
u
LASSOURD (2002) showed that for theophylli
ng/ml) and urine concentration (at 40 ng/ml) at a dosing interva 1 rs b
respectively at limit of detection
in
is why an establishment of a selected cut-off value for therapeutics seems not to be acceptable
for theophylline.
In addition a considerable variance of measured data demonstrates the interindividu
v
theobromine based on this data by a small number of probands is not reliably poss
Any detection of theophylline in plasma or urine samp
doping and should be punishe
133
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147
TABELLENVERZEICHNIS
9 TABELLENVERZEICHNIS
Dopingformen nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999)
Tab. 2:
Tab. 4:
Tab. 6: in und Theophyllin im
Plasma zur Erstellung der drei Kalibrationsgeraden
Tab. 7:
Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im Plasma
Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im Urin
Tab. 10: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Plasma
Tab. 11: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Urin
Tab. 12: Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in
den Matrices Urin und Plasma für den Stabilitätstest
Tab. 13: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im
Plasma
Tab. 1:
Zusammenfassung der 2006 im Institut für Biochemie der Sporthochschule
Köln im Auftrag der Pferdesportverbände durchgeführter Analysen
Tab. 3: Pharmakodynamische Wirkungen der Methylxanthine (LÖSCHER, 2006)
Rasse, Geschlecht, Alter und Gewicht der Versuchspferde
Tab. 5: Entnahmezeitpunkte von Blut- und Urinproben im Hauptversuch
Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobrom
Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und
Paraxanthin im Urin zur Erstellung der drei Kalibrationsgeraden
Tab. 8:
Tab. 9:
148
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 14: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im
Urin
in, Coffein und Paraxanthin
im Plasma
Bestimmungsgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin
a
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Plasma
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Plasma
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Plasma
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Urin
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Urin
Tab. 23: Urin
Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Plasma
Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Plasma
Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Urin
Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Urin
Tab. 15: Bestimmungsgrenzen von Theophyllin, Theobrom
Tab. 16:
im Urin
Tab. 17: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Plasm
Tab. 18:
Tab. 19:
Tab. 20:
Tab. 21:
Tab. 22:
Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im
Tab. 24: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Urin
Tab. 25:
Tab. 26:
Tab. 27:
Tab. 28:
149
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 29: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im
offein im
Urin
Tab. 31: Coffein
im Plasma
Tab. 32:
wicht
ab. 35: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
cht
konzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN
und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 12 Stunden
ab. 37
nem Dosisintervall von 24 Stunden
h TOUTAIN
ab. 39: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nach TOUTAIN
Plasma
Tab. 30: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und C
Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und
Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein
im Plasma
Tab. 33: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körperge
Tab. 34: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
oraler Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
T
intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewi
Tab. 36: Irrelevante Plasma- und Urin
T : Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theophyllin nach TOUTAIN
und LASSOURD (2002) in ei
Tab. 38: Irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen von Theobromin nac
und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 13 Stunden
T
und LASSOURD (2002) in einem Dosisintervall von 24 Stunden
150
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 40: Ausscheidungszeiten von Theophyllin aus dem Plasma nach intravenöser
OD
den)
Tab. 41: eophyllin aus dem Plasma nach oraler Applikation
von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ und der LOD
Tab. 42: Theobromin aus dem Plasma nach intravenöser
Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, LOD
bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 13 bzw. 24 Stunden)
Tab. 43:
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
Tab. 44: einmaliger intravenöser
kg Körpergewicht einschließlich
Tab. 45: ach einmaliger intravenöser Applikation
t einschließlich Mittelwert und
Tab. 46:
von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Tab. 47:
von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Tab. 48: akonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen von LOQ, L
bzw. der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 12 bzw. 24 Stun
Ausscheidungszeiten von Th
Ausscheidungszeiten von
Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich
Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach
Applikation von 4 mg Theophyllin pro
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
Plasmakonzentrationen von Coffein n
von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewich
Standardabweichung der sechs Pferde
Plasmakonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation
Standardabweichung der sechs Pferde
Plasmakonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation
Standardabweichung der sechs Pferde
Plasm
151
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 49: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht e
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
inschließlich
Tab. 51: Urinkonzentrationen von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Tab. 52:
Körpergewicht einschließlich Mittelwert und
Standardabweichung der sechs Pferde
Tab. 53:
ichung der sechs Pferde
Tab. 50: Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht einschließlich
Mittelwert und Standardabweichung der sechs Pferde
Standardabweichung der sechs Pferde
Urinkonzentrationen von Paraxanthin nach einmaliger oraler Applikation von
4 mg Theophyllin pro kg
Urinkonzentrationen von Theobromin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht einschließlich
Mittelwert und Standardabwe
152
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1:
Abb. 3:
Ein- Kompartiment- Modell nach intravenöser Applikation
Abb. 7:
Abb. 9: ittels
PLC/MS/MS im Konzentrationsbereich bis 10.000 ng/ml
Abb. 10:
bb.11: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theophyllin
bb. 12: ESI-Produktionenspektrum von 1,3-15N2-Theophyllin
Abb. 13: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theobromin
Abb. 14: ESI-Produktionenspektrum von D6-Theobromin
Abb. 15: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Coffein
Strukturformeln der Methylxanthine
Abb. 2: Resorption nach einer Kinetik 0. Ordnung (FREY, 2002)
Resorption nach einer Kinetik 1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)
Abb. 4: Halblogarithmische Darstellung einer Resorption nach einer Kinetik
1. Ordnung (MUTSCHLER, 1996)
Abb. 5:
Abb. 6: Zwei- Kompartiment- Modell nach intravenöser Applikation
Zwei- Kompartiment- Modell nach einmaliger oraler Applikation
Abb. 8: Drei- Kompartiment- Modell nach einmaliger oraler Applikation
Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeurin m
H
Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeplasma
mittels HPLC/MS/MS im Konzentrationsbereich bis 10.000 ng/ml
A
A
153
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 16: ESI-Produktionenspektrum von D3-Coffein
bb. 18: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwerturinproben zu den
entsprechenden Retentionszeiten von Theobromin und Paraxanthin.
HPLC/MS/MS-Chromatogramme von inprobe denen ng
t xa ro z t z tsp en
Retentions iten.
Abb. 20: /M - at e L rtpl obe den
rec R ns on in eop
Abb. 21: /M –C tog von Plasma , d 0 ng in
kti op ro sma zugesetzt wurden, zu den
rec R ns
Abb. 22: ra rv ng K on ung es
la ef n f ei asm on ions iegen
Messpunkte
Abb. 23: rat rve nga r K ons ung es
elat eff n f eob im a; zent sstufe
n z ess vo
bb. 24: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
tufe
bb. 25: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Urin; je Konzentrationsstufe
liegen zwei Messpunkte vor
Abb. 17: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Paraxanthin
A
Abb. 19: Ur n, 100 Theobromin
respek ive Para nthin p ml Urin ugesetz wurden, u den en rechend
ze
HPLC S/MS Chrom ogramm von eerwe asmapr n zu
entsp henden etentio zeiten v Coffe und Th hyllin
HPLC S/MS hroma ramme proben enen 10 Coffe
respe ve The hyllin p ml Pla
entsp henden etentio zeiten.
Kalib tionsku e mit A abe der alibrati sgleich und d
Korre tionsko fiziente ür Coff n im Pl a; je K zentrat stufe l
zwei vor
Kalib ionsku mit A be de alibrati gleich und d
Korr ionsko iziente ür Th romin Plasm je Kon ration
liege wei M punkte r
A
Korrelationskoeffizienten für Theophyllin im Urin; je Konzentrationss
liegen zwei Messpunkte vor
A
154
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
A akonzentrationsverläufe von T llin ch n
li v p n g y kg
Körpergewicht, Ausschnittsv rößerung zeigt den Konzentrationsverlauf
innerhalb der ersten Stunde
Abb. 27: ittelter Plasm entr ver n T ylli den Metaboliten
Abb. 28: ittelter Plasm verlauf der M
Coffein ntra er Applikation von 4 mg/kg Theophyllin sowie der
tifi gsg (LO d d hw nze )
Abb. 29: ntu erh von phy nd d etab Para n im
a nach intravenöser Applikatio g Körp icht i ttel
m Erreichen von LOQ
Abb. 30: ittelter Plasma zentr sverl on T ylli Parax n im
a nach oraler Applikation von 4 g K gewi Mit zum
chen LOQ
g/kg Körpergewicht im Mittel bis zum
Erreichen von LOQ
bb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler
Applikation von 4mg Theophyllin pro kg Körpergewicht,
Ausschnittsvergrößerung zeigt die ersten 25 Stunden nach Applikation
bb. 33: Prozentuales Verhältnis von Theobromin und Metaboliten im Plasma nach
intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel
bb. 26 : Plasm heophy bei se s Pferde nach
einma ger intra enöser A plikatio von 4 m Theoph llin pro
erg
Gem akonz ations lauf vo heoph n und
Paraxanthin und Coffein
Gem akonzentrations etaboliten Paraxanthin und
nach i venös
Quan zierun renze Q) un er Nac eisgre (LOD
Proze ales V ältnis Theo llin u em M oliten xanthi
Plasm n von 4 m /kg ergew m Mi
bis zu
Gem kon ation auf v heoph n und anthi
Plasm mg/k örper cht im tel bis
Errei von
Abb. 31: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und dem Metaboliten Paraxanthin im
Plasma nach oraler Applikation von 4 m
A
A
155
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Theobromin nach einmaliger intravenöser
ka n 4 eo p örpergewic
h r z erste Stunde nach Applikation
Abb. 35: ische Darstellung der ge
ophy onze onsverläufe im Plasma nach einm intra er
likati on T hyllin wie ant ungs e (LO d der
Abb. 36: ische Darstellung der g
phy onzentrationsv fe i a nach einm orale
likati on T yllin wie d ant ungs e (LO d der
Abb. 37: loga ische Darstellung der gemittelten
obrom onze onsv fe im ma nach einm r intra er
likat n T omin, sowie der Quantifizierungsgrenze (LOQ) und
ach grenz OD)
bb. 38: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger intravenöser
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
bb. 39: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach
intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im
Mittel bis zum Erreichen von LOQ
bb. 40: Urinkonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler
Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
bb. 41: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin im Urin nach
oralerApplikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht im Mittel bis
zum Erreichen von LOQ
Appli tion vo mg Th bromin ro kg K ht,
Aussc nittsverg ößerung eigt die
Halblogarithm mittelten
The llink ntrati aliger venös
App on v heop , so der Qu ifizier grenz Q) un
Nachweisgrenze (LOD)
Halblogarithm emittelten
Theo llink erläu m Plasm aliger r
App on v heoph , so er Qu ifizier grenz Q) un
Nachweisgrenze (LOD)
Halb rithm
The ink ntrati erläu Plas alige venös
App ion vo heobr
der N weis e (L
A
A
A
A
156
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 42: ntu erh on Theobro d liten im Urin nach
intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin kg K ge
b Er v
Abb. 43: on tion ufe he aliger intravenöser
ika n 4 heo n p örpergewich
chnittsvergr z er St nac ikat
Abb. 44: nt er vo in ro eo und
an Urin nach intravenös lika on offe kg
erg t im l b Er de da t
Abb. 45: ntuales Verh von in, rom heo und
ant Urin nach intravenös lik on heop
g K gew M is z reic er LO arges
:
obromin
Erreichen der LOQ dargestellt
bb. 47: Konfidenzintervalle (nur oberer Grenzbereich angezeigt) für eine ermittelte
Kenngröße (z.B. Ausscheidungszeit, angenommen mit einem Mittelwert von
100 Zeiteinheiten) in Abhängigkeit von der Streuung der Stichprobe
(KIETZMANN, 2006)
Proze ales V ältnis v min un Metabo
pro örper wicht im
Mittel is zum reichen on LOQ
Urink zentra sverlä von T obromin nach einm
Appl tion vo mg T bromi ro kg K t,
Auss ößerung eigt die sten 28 unden h Appl ion
Proze uales V hältnis n Coffe , Theob min, Th phyllin
Parax thin im er App tion v 4 mg C in pro
Körp ewich Mitte is zum reichen r LOQ rgestell
Proze ältnis Coffe Theob in, T phyllin
Parax hin im er App ation v 4 mg T hyllin
pro k örper icht im ittel b um Er hen d Q d tellt
Abb. 46 Prozentuales Verhältnis von Coffein, Theobromin, Theophyllin und
Paraxanthin im Urin nach intravenöser Applikation von 4 mg The
pro kg Körpergewicht im Mittel bis zum
A
157
ANHANG
11 ANHANG
Konzentrati n h d o i e n P
und Coffein im Pla a nac intra öser Applikation von Theophyllin und
Theobromin und oraler Verabreichung von Theophyllin
Zeit nach
onen vo Theop yllin un Theobr min sow e den M tabolite araxanthin
sm h ven
Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Sta - ndardAppl on ikati 1 2 3 4 5 6 wert abweichung