Untersuchung von humanen Melanozyten aus der äußeren Haarwurzelscheide des Haarfollikels auf unterschiedlichen biokompatiblen Scaffolds als neuer Ansatz in der Vitiligotherapie DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von: Katharina Sülflow, geboren am 12. April 1988 in Rüdersdorf bei Berlin angefertigt am: Sächsischen Inkubator für Klinische Translation (SIKT) / ehemali- gen Translationszentrum für Regenerative Medizin Leipzig (TRM) mit Unterstützung der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie der Universität Leipzig Betreuer: Prof. Dr. med. Jan-Christoph Simon Mitbetreuer: Dr. rer. nat. Vuk Savkovic Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 25.10.2016
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Untersuchung von humanen Melanozyten aus
der äußeren Haarwurzelscheide des Haarfollikels
auf unterschiedlichen biokompatiblen Scaffolds
als neuer Ansatz in der
Vitiligotherapie
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von: Katharina Sülflow,
geboren am 12. April 1988 in Rüdersdorf bei Berlin
angefertigt am: Sächsischen Inkubator für Klinische Translation (SIKT) / ehemali-
gen Translationszentrum für Regenerative Medizin Leipzig (TRM)
mit Unterstützung der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie der
Universität Leipzig
Betreuer: Prof. Dr. med. Jan-Christoph Simon
Mitbetreuer: Dr. rer. nat. Vuk Savkovic
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 25.10.2016
III
Inhaltsverzeichnis
Bibliographische Beschreibung .......................................................... V
Abkürzungsverzeichnis .................................................................... VII
3.1 Handhabung der fünf cGEL-Hydrogele im Vergleich ............................ 51
3.2 Quantifizierung der Melanozytenkultur ............................................... 51
3.3 Epidermale Melanozyten im Vergleich auf fünf cGEL-Hydrogelen ....... 55
3.4 Epidermale und ORS-Melanozyten im Vergleich auf unterschiedlichen biokompatiblen Scaffolds ...................................................................... 62
4.1 Quantifizierung der Zellkultur mit dem konfokalen Mikroskop ........... 72
4.2 Komparative Charakteristiken der NHEMs auf cGEL-Hydrogelen ........ 73
4.3 Komparative Charakteristiken der epidermalen und ORS-Melanozyten auf unterschiedlichen biokompatiblen Scaffolds .................................. 75
welcher als lebenseinschränkend wahrgenommen werden kann (van Ongenae et
al. 2006; Kent und Al'Abadie 1996; Al-Harbi 2013).
Noch ist Vitiligo nicht heilbar, aber durch Bemühungen der aktuellen For-
schung sind viele Fortschritte auf dem Gebiet der Therapieoptionen zu verzeich-
nen. Es gibt konservative Methoden, die eine Linderung für einen kurzen Zeit-
raum verschaffen, aber nicht die kausalen Ursachen therapiert. Einen
vielversprechenden Ansatz bietet der Stammzellpool der Haarfollikel-
Melanozyten aus der äußeren Haarwurzelscheide (Ohyama 2007; Jaks et al.
2010; Nishimura et al. 2011). Im Gegensatz zu bisherigen invasiven Spalthaut-
transplantationen können durch eine nichtinvasive Methode, Melanozyten aus
der äußeren Haarwurzelscheide (ORS, engl. Outer Root Sheath, äußere Haarwur-
zelscheide) gewonnen werden. Das ist eine willkommene Alternative, an der
zurzeit viel geforscht wird (Vanscheidt und Hunziker 2009; Dieckmann und Mil-
kova 2010; Savkovic et al. 2012a; Schneider et al. 2014).
In dieser Arbeit lag das Augenmerk auf der Charakterisierung der HUMORS
auf unterschiedlichen Zellträgern. Collagen Cell Carrier (CCC) und
Poly-ε-Caprolacton (PCL) als zwei medizinisch zugelassene Materialien wurden
gegenüber Hydrogel-Scaffolds getestet (cGEL), die aus einem Teilhydrolysat des
Kollagens bestehen. Es sollte herausgefunden werden, auf welchem Material die
humanen Melanozyten der äußeren Haarwurzelscheide am besten proliferieren,
differenzieren und ihre melanotische Funktion wahrnehmen: die Produktion von
Melanin.
1.2 Das Melanin-Pigmentsystem der Haut
Die Melanogenese bezeichnet den Herstellungsprozess von Melanin, das sich als
wichtigstes Pigment der Haut erweist. Der komplexe Mechanismus der Melanin-
herstellung setzt ein multidimensionales Netzwerk voraus, an dem seit Jahr-
zehnten geforscht wird (Schallreuter et al. 2008).
In der Haut, speziell in der Epidermis, besteht die Aufgabe des Melanins in
dem Schutz der umliegenden Keratinozyten vor ultravioletter Strahlung
(UV-Strahlung). Dies gelingt zum einen durch Einfangen freier Radikale und zum
anderen durch einen mechanischen „Sonnenschirmeffekt“, wodurch ungefähr
99,9% der Strahlungsenergie in harmlose Wärmeenergie umgewandelt werden
können (Röcken 2010).
Einführung
13
Im Mittelpunkt der Produktion von Melanin stehen dabei die Melanozyten. Als
Abkömmlinge des Neuroektoderms wandern Melanozytenvorläufer während
der Embryogenese als Melanoblasten aus der dorsalen Neuralleiste über die
Dermis in die Epidermis. Mit ihren langen, verzweigten Fortsätzen reichen sie
vom Stratum basale der Epidermis bis zum Stratum spinosum
(Abbildung 1.2 A).
Im Melanozyt werden die Enzyme Tyrosinase, Tyrosinase-related protein
(TRP-1) und Tyrosinase-related protein 2/Dopachrome Tautomerase (TRP-
2/DCT) synthetisiert, mit dessen Hilfe Melanin gebildet wird (Abbildung 1.1), was
als Granula in Melanosom-Vesikel verpackt, über die Fortsätze an die Kera-
tinozyten transportiert wird. Die Melanosomen durchlaufen unterschiedliche
Stadien in ihrer Entwicklung. Im Stadium eins liegen die sphärischen Gestalten,
welche vom endoplasmatischen Retikulum abstammen, perinukleär im Mela-
nozyt. Melanosomen im Stadium zwei generieren sich ein Netzwerk aus Fibrillen
zur Melaninproduktion, an denen Melanin im Stadium drei hinterlegt wird. Im
Stadium vier findet man abgedunkelte Melanosomen, die über einen noch nicht
geklärten Prozess an die Keratinozyten transferiert werden. Es bestehen Hypo-
thesen, dass der Melanosomentransfer über Exozytose, Zytophagozytose, Fusion
oder einen Membranvesikeltransport gesteuert wird (Reißig und Salvetter 2007;
Yamaguchi und Hearing 2009).
Abbildung 1.1: Der Pigmentfarbstoff Melanin leitet sich von der nichtessentiellen Aminosäure
Tyrosin ab. Durch das Enzym Tyrosinase und Polymerisationsvorgängen wird Melanin aus Tyrosin
an der Zellmembran von Melanozyten synthetisiert. (Quelle: Königshoff 2012; Beschriftung modi-
fiziert)
Ein Melanozyt steht mit 30-40 Keratinozyten in Verbindung und bildet eine so-
genannte epidermale Einheit. Sowohl intrinsische (z.B Fibroblasten, Keratinozy-
ten, endokrine, inflammatorische und neuronale Zellen) als auch extrinsische
Faktoren (z.B Medikamente und UV-Strahlung) beeinflussen die Rekrutierung
Einführung
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der Melanozyten, die Anzahl der Dendriten und den Transport der Melanoso-
men zu den Keratinozyten (Hirobe 2011; Videira et al. 2013).
Als Schutz der DNA vor UV-Strahlung lagern sich die Melanosomen supranukleär
in den Keratinozyten ab. Dabei entscheidet nicht die Anzahl der Melanozyten
über die Erscheinung des Hautkolorits, sondern die Aktivität der Pigmentzellen
und damit die Produktion von Melanin (Iozumi et al. 1993; Fuller et al. 2001).
Die Zellen sind befähigt zwei unterschiedliche Pigmentstoffe zu produzie-
ren: Eumelanin und Pheomelanin. Durch die Mischung dieser beiden Melanin-
formen entstehen die unterschiedlichen Hauttypen I-VI, welche von Fitzpatrick
(Fitzpatrick 1988; Roberts 2009) kategorisiert wurden und diagnostischen Ein-
satz in der Medizin finden. Das Eumelanin ist in der dunklen bis schwarzen Haut
vorherrschend und bietet einen besonders hohen UV-Schutz. Das Pheomelanin,
das keinen hohen UV-Schutz bietet, ist in der kaukasischen Haut, von sehr hell-
häutigen und rothaarigen Individuen, vertreten (Abbildung 1.2 B).
Abbildung 1.2: Anatomie
der epidermalen Mela-
nozyten
(A) Epidermis mit basal
gelegenen Melanozyten,
die Kontakt zu Kera-
tinozyten über Dendriten
aufbauen.
(B) Unterschied zwischen
verschiedenen Hautty-
pen, wobei hier am ehes-
ten Hauttyp I und Haut-
typ VI dargestellt sind.
(Quelle: Röcken 2010,
Abbildung abgeändert)
1.3 Epidermale und ORS-Melanozyten
Der Großteil der Melanozyten ist in der Epidermis und in den Haarfollikeln be-
heimatet. Melanin und Melanozyten kommen aber auch in der Stria vascularis
der Cochlea, in den Leptomeningen des gesamten Gehirns, im Herzen und im
Auge vor. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass sie auch im Fettgewebe zu fin-
den sind (Plonka et al. 2009; Gola et al. 2012).
Einführung
15
Während der Embryogenese wandern die Melanoblasten als Vorläufer der Me-
lanozyten aus dem Neuralrohr aus und lassen sich auf der Basalmembran der
Epidermis nieder. Mit dem Beginn der Haarmorphogenese verlassen einige Me-
lanoblasten die Epidermis und wandern in die Haarfollikel.
Insgesamt unterscheiden wir drei Arten von melanozytären Zellen, welche
in der Haut und den Hautanhangsgebilden zu finden sind. Es gibt die mäßig pig-
mentierten, polydendritischen Melanozyten in der basalen Epidermis; die undif-
ferenzierten, amelanotischen, bipolaren Melanoblasten in der äußeren Haar-
wurzelscheide und die langen, stark pigmentierten Melanozyten, welche an die
Haarpapille angrenzen (Abbildung 1.3 A-C). Die hochdifferenzierten Melanozy-
ten an der Haarpapille produzieren Melanin, welches sie an die umliegenden
Keratinozyten abgeben und so zur Pigmentierung des Haarschaftes beitragen.
Das Besondere an diesen Zellen im Gegensatz zu den epidermalen Melanozyten,
ist ihre Aktivität in Abhängigkeit zum Haarzyklus (Tobin und Bystryn 1996; Grich-
nik et al. 1996; Peters et al. 2002).
Der Haarzyklus ist in eine Wachstums- (anagen), Regressions- (katagen) und
Ruhephase (telogen) geteilt. In der frühen anagenen Phase proliferieren die Me-
lanozyten an der Haarpapille bis sie im späten anagenen Stadium voll ausgereift
sind und letztlich im frühen katagenen Stadium in die Apoptose gehen. Mit dem
Beginn jedes neuen Haarzyklus werden sowohl Melanozyten an der Haarpapille
als auch epidermale Stammzellen, welche sich in dem mittleren Teil des Haarfol-
likels aufhalten, zur Proliferation, Differenzierung und zur Migration aktiviert
(Gola et al. 2012; Seiberg 2013).
Die äußere Haarwurzelscheide ist reich an multipotenten Stammzellen, wel-
che den Stammzellmarker Lgr6 tragen (Biernaskie 2010). Die Stammzellen, wel-
che befähigt sind, die meisten Zelllinien des ausgewachsenen Organismus ent-
stehen zu lassen, emigrieren aus dem embryonalen, dorsalen Ektoderm der
Neuralleiste (NCSC).
Die direkten Abkömmlinge der NSCS heißen NCSC-like-Stammzellen, die,
soweit wir wissen, das höchste Entwicklungspotential unter den Stammzellen
besitzen. Die meisten Zellen im Haarfollikel mit NCSC-like-Stammzellcharakter
halten sich besonders in dem distalen Teil nahe der Verbindung zum Talgdrü-
senkanal, aber auch im mittleren und proximalen Teil der äußeren Haarwurzel-
scheide auf (Abbildung 1.3). Generell besitzen die NSCS-like-Zellen das Potenzial
sowohl Adipozyten, Chondrozyten, glatte Muskelzellen, Osteozyten, Endothel-
zellen, Kardiomyozyten, Neurone, Glia, Melanozyten, Keratinozyten als auch
Einführung
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Fibroblasten entstehen zu lassen. Die wichtigsten Abkömmlinge der NSCS-like-
Zellen der ORS sind dabei die neuronalen Vorläuferzellen und die Hautvorläufer-
zellen (Differenzierung zu Keratinozyten, Melanozyten und Fibroblasten mög-
lich). Die Zellen im proximalen (unteren) Teil der ORS sind weiter differenziert
als im distalen (oberen) Teil. Die Wulstregion besitzt die meisten pluripotenten
Zellen der äußeren Haarwurzelscheide (van Snippert et al. 2010; Yu et al. 2010;
Clewes et al. 2011; Nath et al. 2011; Schneider et al. 2014).
Die Isolierung der ORS-Melanozyten war lange nicht möglich bis Tobin et al.
(1995) die ersten erfolgreichen Langzeitkultivierungsversuche veröffentlichte.
Inzwischen sind die Kultivierungsmethoden soweit fortgeschritten, dass keine
kompletten Hautbiopsien mehr für die Isolierung von Haarfollikeln und Zellen
benötigt werden (Abschnitt 2.4).
Abbildung 1.3: Melanozytäre Zellen der Haut und Hautanhangsgebilde. (A) In der Epidermis sind
die mäßig pigmentierten, polydendritischen Melanozyten; (B) in der äußeren Wurzelscheide
(ORS, engl. outer root sheath) der Wulstregion sind die undifferenzierten, amelanotischen, bipo-
laren Melanoblasten und (C) an der Haarpapille angrenzend sind die langen, stark pigmentierten
Melanozyten zu finden (Grafik nach dem Vorbild aus Medscape, Anatomy of the hair follicle;
Beschriftung und Zellen zusätzlich eingefügt).
Einführung
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Als epidermale Troika - das Dreigespann der Haut - stehen epidermale Mela-
nozyten neben Keratinozyten und Langerhans-Zellen gegenüber der äußeren
Umwelt und ihren Eindringlingen (Abbildung 1.4). Über Dendriten und Zytokine
stehen sie ständig in Verbindung und sorgen für ein interaktives Schutzschild.
Allein die epidermalen Melanozyten, welche gerade einmal drei bis vier Dendri-
ten besitzen, stehen mit mindestens 30 basalen Keratinozyten in Verbindung
und bilden die epidermale Melanin-Einheit (Plonka et al. 2009).
Abbildung 1.4: Epidermale
Troika: Als Führungsspitze
arbeiten Melanozyten Kera-
tinozyten und Langerhans-
Zellen als wichtigste Zellen
der Haut zusammen (Quelle:
Nordlund 2011, Abbildung
modifiziert).
Somit sind Melanozyten nicht nur eine „Melaninfabrik“, sondern ausgesprochen
vielseitige und wichtige Zellen des Organismus. Als aktive Partner in der Immun-
abwehr der Haut, beteiligen sie sich an der Stressantwort und übernehmen im-
munmodulatorische Eigenschaften. Nicht nur ihre Präsenz in der Haut und in
den Haarfollikeln, sondern auch im zentralen Nervensystem und in einigen vis-
zeralen Organen zeigt nochmals die alternative Wirkungsweise dieser beeindru-
ckenden Zellen, die noch nicht komplett verstanden ist (Yajima und Larue 2008).
Keratinozyten, Langerhans-Zellen, Fibroblasten und Gefäß- und Nervenanbin-
dungen beeinflussen die Melanozyten in ihrer Funktionalität (Plonka et al. 2009).
Aufgrund vieler Einflussgrößen (Hormone, Zellinteraktionen, Wachstumsfak-
toren) in der physiologischen Umgebung von Melanozyten, sollten Ergebnisse
die mit Melanozyten-Monolayer-Monokulturen erhoben wurden, unter Vorbe-
halt benutzt werden. Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen, dass die zukünftige
Erforschung der Zellen in einer Umgebung stattfinden sollte, die der physiologi-
schen Atmosphäre so nahe wie möglich kommt (Geckil et al. 2010; Mansbridge
2009). Für Melanozyten bedeutet das, dass eine 3D-Kultur der Extrazellulären
Matrix (EZM) ähnelt.
Einführung
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Die funktionellen Melanozyten, die bereits in der Haut bestehen, präsentieren
die einfachste Basis für eine kausale Therapie der Vitiligo. Im Rahmen einer Be-
dside-Prozedur können die epidermalen Melanozyten aus einem präparierten
Hautstück enzymatisch isoliert und gemeinsam mit Keratinozyten, als eine ur-
sprüngliche epidermale Mischung, auf die dermabradierte Fläche der weißen
Flecken transplantiert werden. Nachteile dieser Prozedur sind die invasive Ge-
winnung der epidermalen Mischung durch Biopsieentnahme, der große Bedarf
des Materials (Biopsiefläche ist gleich der Anwendungsfläche) und die Gefahr
von Übertragung der ansässigen Hautflora. Hierbei ist insbesondere die Gefahr
von Mykosen zu erwähnen, die in 27% der Fälle auftreten und zu einer Absto-
ßung des Transplantates führen (Mulekar und Isedeh 2013; Isedeh et al. 2015).
Kultivierung und Vermehrung der Zellen unter sterilen Bedingungen lösen
diese Probleme teilweise. Zum einen kann die Biopsiefläche vermindert werden
und zum anderen erhöht sich die Anzahl der Zellen durch Vermehrung. Antibio-
tika und sterile Bedingungen reduzieren die Gefahr der Infektion (Schneider et
al. 2014; Sülflow et al. 2016)
Durch eine nichtinvasive Gewinnung von autologen Vorläufermelanozyten
können aus der äußeren Scheide der epilierten Haarwurzel humane Melanozy-
ten differenzieren, die auf einem geeigneten Zellträger kultiviert und als Patch
auf vorbereitete Hautareale transplantiert werden können. Alles in allem um-
fasst dies ein Forschungsgebiet, das als Regenerative Medizin bezeichnet wird.
Die angedachte Therapie der Vitiligo, welche die transplantierten autologen
ORS-derivierten Melanozyten umfasst, gehört in den Bereich der Advanced
Therapy Medicinal Products (ATMP). Sie bietet eine kausale, autologe, individua-
lisierte, sterile und langfristige Lösung für die Therapie der Ursachen von Vitiligo.
1.4 Vitiligo – Eine Krankheit
Umgangssprachlich als „Weißfleckenkrankheit“ bekannt, weisen Vitiligo-
Patienten bei dieser Erkrankung stellenweise depigmentierte Hautareale auf
(Abbildung 1.5). Mit einer Prävalenz von circa einem Prozent zählt diese Erkran-
kung zu einer der häufigsten Pigmentstörungen weltweit. Dabei gibt es hinsicht-
lich der Hautkolorierung, der ethnologischen Zugehörigkeit und des Geschlechts
keine gesicherten Unterschiede im Auftreten (Hartmann 2009).
Einführung
19
Klinik
Oft erscheinen bei den Vitiligo-Patienten kreide- oder milchweiße Flecken an
Händen, Unterarmen, Füße, Achseln, an der unteren Brust, der dorsalen Hand,
in der Leiste, im Gesicht und um Körperöffnungen (Auge, Mund, Anus, Bauchna-
bel) (Yaghoobi et al. 2011).
Abbildung 1.5: Vitiligo-Läsionen. (A) linker Unterarm dorsal: Konfluierende Vitiligoflecken an der
Dorsalseite des Unterarmes durchsetzt mit follikulärer Repigmentierung; (B) symmetrische Vitili-
goflecken an Knien einer jungen Frau. (Fotos: K. Sülflow)
Anhand der Erscheinung werden zwei Formen unterschieden. Die segmentale
Vitiligo (SV) beginnt schnell, stabilisiert sich nach ein bis zwei Jahren und kann
Berichten zufolge den Dermatomen2 bzw. Blaschkolinien3 folgen. Die SV ist sel-
ten und steht der non-segmentalen Vitiligo (NSV) in 85 - 90% der Fälle gegen-
über. Die NSV kann sich lebenslang entwickeln und ist häufig assoziiert mit Auto-
immunerkrankungen und dem Köbner-Phänomen4. Die Einteilung nach
Nordlund charakterisiert die Erscheinung der Hautflecken in lokalisiert (fokal,
unilateral, mukosal), generalisiert (vulgaris, akrofaszial, gemischt) und universal
auf fast der gesamten Körperoberfläche auftretend (Guerra et al. 2010; Lotti et
al. 2008; Yaghoobi et al. 2011, Nordlund und Lerner 1982).
Wenn die Erkrankung besonders früh auftritt oder atypische weiße Flecken
in Erscheinung treten, müssen andere Krankheiten ausgeschlossen werden. Da-
2 Dermatom: Ein Hautbezirk, welcher durch die Rr. anteriores und posteriores der einzelnen Rü-ckenmarksegmente sensorisch innerviert wird (Mense 2010). 3 Blaschkolinien: beschreiben Ausbreitungswege von Zellen während der Embryogenese (Pschy-rembel Klinisches Wörterbuch 2012). 4 Köbner-Phänomen: ist ein isomorpher Reizeffekt - dabei lassen sich durch äußere Reize Hauter-scheinungen hervorrufen (Moll 2010).
B A
Einführung
20
bei kann es sich um Erbkrankheiten wie Piebaldismus, Tuberöse Sklerose,
Naevus depigmentosus oder das Wardenburg-Syndrom handeln. Auch die atopi-
sche Dermatitis, der Lichen striatus oder eine Kontaktdermatitis kann sich ähn-
lich einer Vitiligoerkrankung manifestieren. In der Kindheit und im Erwachse-
nenalter sollte differentialdiagnostisch an eine postinfektiöse Hypopigmentation
nach Lepra- oder Treponemeninfektion wie Pinta, Jaws und Syphilis oder der
Hautmykose Pityriasis versicolor gedacht werden (Le Poole und Boissy 1997;
Lotti et al. 2008).
Ätiopathogenese
Trotz jahrelanger Forschung ist die Ursache für Vitiligo bislang noch nicht ausrei-
chend geklärt. Es wird von einer multifaktoriellen Krankheit mit genetischen und
nicht-genetischen Faktoren ausgegangen, die im Allgemeinen mit dem Fehlen
von funktionellen Melanozyten einhergeht.
Unterschiedliche Theorien finden dabei Zugang in die aktuelle Literatur. Da-
bei stößt man auf die Autoimmun-, die Neural-, die biochemische und die Auto-
zytotoxizitätshypothese (Guerra et al. 2010). Die Autoimmunhypothese stützt
sich auf die Assoziation von Vitiligo mit anderen Autoimmunerkrankungen. Es
scheinen einige pathologische Variationen in bestimmten Genen prädisponie-
rend für einen Ausbruch zu sein (Grimes et al. 1996; Ongenae et al. 2003). Die
Neuralhypothese beschreibt den Verlust von Melanozyten über einen neuro-
chemischen Faktor, der aus Nervenendigungen (Erklärungsmodel für SV) oder
von Hautzellen freigesetzt wird, welcher Pigmentzellen zerstört (Cucchi et al.
2000). Die biochemische Hypothese stützt sich auf Phenol- und Catecholderi-
vate, welche bei genetisch anfälligen Patienten eine Vitiligoerkrankung triggern
kann (Boissy und Manga 2004; Westerhof und d‘Ischia 2007). Die Autozytotoxizi-
tätshypothese beschreibt den Anstieg von freien Radikalen bei erhöhtem Stress,
welche wichtige Moleküle der Zellen zerstören können. Bei Vitiligo-Patienten
wurden erniedrigte Katalasewerte nachgewiesen, die zusammen mit anderen
Enzymen normalerweise für den Abbau der Radikale verantwortlich sind (Schall-
reuter et al. 1991; Hartmann 2009).
Therapie
Da die Ursache der Erkrankung noch nicht vollkommen verstanden ist, gibt es
ein breites Spektrum an verschiedenen Therapiemethoden. Dabei steht jeder
Einführung
21
Therapieansatz für sich mit unterschiedlichen Indikationen, Effektivität und mög-
lichen Nebenwirkungen zur Verfügung (Lotti et al. 2009).
Eine der Hauptsäulen ist die Phototherapie (Breitband UV-B280-320nm,
Schmalband UV-B311nm [NB-UVB]) und die Photochemotherapie (UV-A plus ein
oraler Photosensibilisator wie Psoralen [PUVA]). Unterschiedliche Studien zei-
gen, dass die NB-UVB-Therapie, der seit über 60 Jahren praktizierten PUVA über-
legen ist, da die unerwünschten Nebenwirkungen (phototoxische Reaktion,
Nausea, Pruritus, Steigerung des Hautkrebsrisikos) geringer sind und die Repig-
mentierungsrate höher ist (Le Poole und Boissy 1997; Lotti et al. 2008; Guerra et
al. 2010).
Wie die Photo- und Photochemotherapie zielen auch die Pharmazeutika da-
rauf ab, vorhandene Melanozyten oder das Stammzellreservoir der Haarwurzel
zu aktivieren und damit die Melanozytenproliferation zu steigern. Topische Kor-
tikosteroide werden gerne als First-Line-Therapie verschrieben, da sie kosten-
günstig und leicht zu applizieren sind. Aufgrund des erhöhten Auftretens von
unerwünschten Nebenwirkungen ist die Verabreichung beschränkt. Die Anwen-
dung ist auf drei Monate bei regelmäßiger Anwendung begrenzt, da hochpoten-
te Kortikosteroide zu Hautatrophie, Blasenbildung, Erythemen und zu einem
erhöhten Risiko der Entwicklung eines Nicht-Melanom-Hautkrebs führen können
(Lotti et al. 2008).
Weiterhin als effektiv wird der Einsatz von Calcineurin-Inhibitoren wie Ta-
crolimus und Pinecrolimus beschrieben. Die Wirksamkeit ist mit der inhibieren-
den Wirkung auf die T-Lymphozytenaktivierung zu erklären, wodurch proin-
flammatorische Zytokine wie TNFα reduziert werden. Allerdings sind die Effekte
oft auf die Kopf-Hals-Region beschränkt (Grimes et al. 2004; Silverberg et al.
2004; Lotti et al. 2008).
Natürliche Heilmittel, die dem Konsumenten freiverkäuflich zur Verfügung
stehen, können aufgrund der schlechten Qualität der Studienlage nicht empfoh-
len werden, obwohl sich Ginkgo biloba und L-phenylalanin als am erfolgverspre-
chendsten darstellten (Szczurko und Boon 2008).
Wenn bei der Anwendung von konservativen Therapien der Erfolg ausbleibt,
rücken die operativen Methoden in den Vordergrund. Sie sind besonders erfolg-
versprechend, wenn eine stabile Vitiligo vorliegt und depigmentierte Haare in
den Vitiligoläsionen vorhanden sind. Es gibt die Möglichkeit der chirurgischen
Gewebetransplantation in Form von Spalthaut, Stanzbiopsie, induzierter Saug-
blase und die Transplantation von autologen kultivierten oder nicht-kultivierten
Einführung
22
Hautzellsuspensionen (van Geel et al. 2001). Der Nachteil all dieser Methoden ist
die Zufügung einer zusätzlichen Wunde bei der Entnahme von Haut im Gesun-
den zur Materialgewinnung. Damit steigen das postoperative Infektionsrisiko
und die Schmerzen. Doch durch die Entdeckung und Nutzbarmachung von adul-
ten Stammzellen aus der äußeren Haarwurzelscheide eröffnen sich neue erfolg-
versprechende Therapiemöglichkeiten.
1.5 Dreidimensionale Zellkultur
Regenerative Medizin ist ein Begriff, der erst in den 90er Jahren des 20. Jahr-
hunderts Eingang in die Forschung gefunden hat. Dabei wird mit Hilfe von Zellen
an Zell- und Gewebeersatz für den medizinischen Nutzen geforscht. Unter-
schiedliche Methoden kommen dabei zum Einsatz, aber „das Ziel ist immer
gleich: Möglichst den gesunden und funktionalen Originalzustand eines be-
troffenen Gewebes wiederherzustellen, anstatt es nur behelfsmäßig zu ersetzen
und zu reparieren.“ (Bundesministerium für Bildung und Forschung, Regenerati-
ve Medizin - Heilen mit Zellen, 2013).
Tissue Engineering als Teilgebiet der Regenerativen Medizin befasst sich in-
tensiver mit der Heranzüchtung von Ersatzgeweben im Labor. Viele Fortschritte
sind bereits zu verzeichnen. Im Bereich Herz (Stock et al. 2002; Lalit et al. 2014),
Leber (Huebert und Rakela 2014), Nerven (Tamaki et al. 2014), Knorpel und Kno-
chen (St. Skoloudik et al. 2014) werden bedeutende Beiträge geleistet, um die
Medizin der Zukunft zu gestalten. Dabei bleibt die Haut als das größte und rege-
nerationsfreudigste Organ nicht außen vor.
Der Weg der Translation eines Haut-Therapie-Produktes vom Labor bis zur
Anwendung in der klinischen Praxis nimmt in der Regel viel Zeit in Anspruch
(Purnell und Hines 2009). Inzwischen haben einige Hautäquivalente wie In-
tegra®5, Apligraf®6, Epidex®7 und auch ReCell®8 diesen Weg mit Erfolg gemeistert
und konnten so vielen Patienten mit unfallbedingten, infektiösen, chronischen
oder brandbedingten Wunden helfen (Renner et al. 2009; Böttcher-Haberzetha
2010; Singh et al. 2015).
5 Integra®: eine auf Collagen-Glycosaminoglycan basierte, artifizielle Haut, Integra Life Science. 6 Apligraf®: zweischichtiger dermo-epidermaler Hautersatz (Apligraf). 7 Epidex®: epidermale Hautzellersatz aus patienteneigenen Zellen der ORS gewonnen, euroderm biotech and aesthetics, Euroderm GmBH Leipzig (Hunziker). 8 ReCell®: Aus invasiver Hautbiopsie gewonnene Zellsuspension aus Melanozyten (Avita Medical).
Einführung
23
Das Augenmerk der vorliegenden Arbeit liegt auf drei unterschiedlichen Scaf-
folds, die der Extrazellulären Matrix (EZM) der Haut nachempfunden sind und
auf denen die ORS-Melanozyten getestet wurden.
Für gewöhnlich werden Zellen in 2D-Kulturen auf Polypropylen (PP)-
Kulturplatten kultiviert. In vielen Studien wurde aber gezeigt, dass Zellen in einer
2D-Kultur nicht die Zellentwicklung in vivo imitieren können und die Expression
von bestimmten gewebespezifischen Genen oder Proteinen ausblieben (Cushing
2007; Mansbridge 2009; Geckil et al. 2010; Sommer 2012). Es gibt eine Vielzahl
von Materialien und Methoden, die sich in den letzten zwei Dekaden angesam-
melt haben um Zellträger für die 3D-Zellkultur und den medizinischen Einsatz zu
verwenden. Die Vorteile der 3D-Kultivierung sind vielfache. Zum einen sind sie
der physiologischen Umgebung am nächsten, bieten eine größere Adhäsions-
oberfläche, die Geometrie kann entscheidend für den Differenzierungsprozess
sein und Voruntersuchungen zeigten bereits eine erhöhte melanotische Zellakti-
vität in 3D-Zellkulturen (Savkovic et al. 2016).
Aus der Fülle an Angeboten wurden in dieser Arbeit drei unterschiedliche
Um eine endgültige Aussage über den optimalen Zellträger für ORS-
Melanozyten zu treffen, sollten weitere Investitionen in die Wiederholung des
Experimentes mit Zellen in unterschiedlichen Passagen durchgeführt werden.
Außerdem sollte die Zellkultur zu verschiedenen Zeitpunkten gestoppt und da-
raufhin die Zellen auf Viabilität, melanozytenspezifische Markerexpression, Gen-
expression und Funktionalität getestet werden.
81
5 Ausblick
Die Untersuchung von normalen humanen epidermalen Melanozyten und hu-
manen Haarfollikel-Melanozyten aus der äußeren Haarwurzelscheide auf unter-
schiedlichen Zellträgern zeigte den cGEL Typ4 als vielversprechenden Zellträger.
Auf funktioneller Seite überzeugten die Melanozyten auf der cGEL Variante 4 mit
signifikant höherem Melaningehalt, was von entscheidender Bedeutung für die
Repigmentierung von Vitiligoflecken ist. Durch die gute Handhabung würde dar-
über hinaus der Transfer bei zukünftigen Transplantationen erleichtert. Auch
wenn Zellen auf dem CCC eine höhere Proliferationsrate verzeichneten, über-
zeugten die Zellen auf cGEL Typ4 durch einen hohen Differenzierungsgrad.
Zusammenfassend ist die Arbeit dem Ziel, einen nichtinvasiven Therapie-
ansatz für Patienten mit Vitiligo zu entwickeln, nähergekommen. So kann der
cGEL Typ4 nach weiteren Investitionen vielleicht bald als Träger einer Keratino-/
Melanozytensuspension Teil einer klinischen Studie werden. In Zukunft ist noch
viel von dem multipotenten, wenn nicht sogar pluripotenten Stammzellpool der
äußeren Haarwurzelscheide und den cGELen zu erwarten.
83
6 Zusammenfassung
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
Untersuchung von humanen Melanozyten aus der äußeren Haarwurzelscheide
des Haarfollikels auf unterschiedlichen biokompatiblen Scaffolds als neuer An-
satz in der Vitiligotherapie
eingereicht von:
Katharina Sülflow
angefertigt am:
Sächsischen Inkubator für klinische Translation (SIKT)/ ehemaligen Translations-
zentrum für Regenerative Medizin Leipzig (TRM) mit Unterstützung der Klinik für
Dermatologie, Venerologie und Allergologie der Universität Leipzig
betreut von: Prof. Dr. med. Jan-Christoph Simon/Dr. rer. nat. Vuk Savkovic
April 2016
Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit den humanen Melanozyten aus
der äußeren Haarwurzelscheide, die zu Transplantationszwecken auf unter-
schiedlichen Zellträgern getestet wurden, um eine effiziente und schmerzärmere
Therapie für Patienten mit einer Depigmentierungsstörung wie Vitiligo zu entwi-
ckeln. Vitiligo ist gekennzeichnet durch weiße, depigmentierte Areale der Haut
mit besonderen Prädilektionsstellen an Kinn, Kopf, Armen und Händen. Etwa ein
Prozent der Weltbevölkerung ist davon betroffen. Die genaue Ursache der Er-
krankung ist bisher nur unvollständig geklärt, aber es ist bekannt, dass sich in
Zusammenfassung
84
der Epidermis entweder nicht mehr funktionsfähige oder gar keine Melanozyten
befinden. Durch das außergewöhnliche Erscheinungsbild sind die Betroffenen
oft einer hohen psychischen Belastung ausgesetzt, die einen hohen Leidensdruck
bis hin zu Depressionen nach sich ziehen kann. Während konservative Methoden
oft keinen zufriedenstellenden Therapieerfolg zeigen, bergen die operativen
Verfahren das Risiko von postoperativen Schmerzen und einem erhöhten Infek-
tionsrisiko an den Eingriffsstellen. Durch die erfolgreiche Etablierung einer nicht-
invasiven Methode ist es nun möglich, humane Melanozyten aus der äußeren
Haarwurzelscheide, die einen großen Anteil multipotenter Stammzellen behei-
matet, durch einfaches Zupfen von Kopfhaaren zu isolieren, differenzieren und
zu proliferieren.
Für die somit gewonnenen HUMORS (engl. HUman Melanocytes from the
Outer Root Sheath, humane Melanozyten aus der äußeren Haarwurzelscheide)
war die Wahl auf einen biokompatiblen, dreidimensionalen Zellträger gefallen,
um zukünftige Transplantationsversuche effizient zu gestalten.
Es wurde nach einem Trägermaterial gesucht, welches biologisch abbaubar,
immunologisch inaktiv, atoxisch, sowie der epidermalen physiologischen Umge-
bung ähnlich war - kurzum eine gute temporäre Nische für HUMORS bietet. Kol-
lagen als Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix bot dafür die besten Vo-
raussetzungen. Es wurden zwei verschiedene kollagen-basierte Scaffolds in
dieser Studie untersucht: der kommerziell erhältliche, dezellularisierte, bovine
Collagen Cell Carrier® (CCC) und das cGEL, eine enzymatisch degradierte bovine
Gelatine, welche chemisch mit den polymerischen Copolymeren oPNMA-x/
oPDMA-x vernetzt wurde.
Als weiteren vielversprechenden Zellträger fiel die Wahl auf den gesponne-
nen, biologisch abbaubaren Polyester Poly-ε-Caprolacton (PCL), der großes Inte-
resse in den letzten Jahren im Bereich der regenerativen Forschung gefunden
hat und durch seine besondere Verarbeitung (gesponnene Fibrillen) eine große
Ähnlichkeit zur extrazellulären Matrix besaß.
im Folgenden wurden Daten der Proliferation genutzt, welche mit der Zell-
zahl positiv korrelierten. Nach der Testung von Handhabung und Charakterisie-
rung von ausgesäten normalen humanen epidermalen Melanozyten (NHEM) auf
fünf verschiedenen cGELen, fiel die Wahl auf die cGEL Variante 4. Dieser wurde
als vielversprechender Zellträgerkandidat im weiteren Schritt mit dem CCC und
dem PCL verglichen.
Zusammenfassung
85
Zur Charakterisierung der Zellen wurden Daten der mitochondrialen Aktivität
(Marker für Proliferation) und der enzymatischen Aktivität (TYR, TRP-1, TRP-
2/DCT), durch Messung des Melaningehaltes nach der Zugabe von L-DOPA, er-
hoben. Weiterhin wurde der gesamte Melaningehalt pro Kultur ermittelt, um
eine Aussage über die melanotische Funktionalität zu treffen. Mittels Immunflu-
oreszenzanalyse wurde die melanozytäre Markerexpression (NKI/beteb und
Tyrosinase) genutzt um Aussagen zur Differenzierung, zu der Morphologie und
der Immigration der ausgesäten NHEMs und HUMORS auf den Scaffolds zu tref-
fen.
Die HUMORS exprimierten auf allen Scaffolds die melanozytenspezifischen
Marker. Die mitochondriale Aktivität der HUMORS, welche mit der Zellzahl kor-
relierten war auf den CCC signifikant höher als auf den anderen Zellträgern und
der adhärenten Zellkultur. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass
Zellen, insbesondere Stammzellen ihr volles Entwicklungspotential erst in einer
dreidimensionalen Kultur ausbilden können, da es die extrazelluläre Matrix am
besten imitiert. Dagegen spricht das Ergebnis der mitochondrialen Aktivität auf
dem cGEL Typ4, welches signifikant geringer war gegenüber der adhärenten
Zellkultur. Eine mögliche Ursache kann die hohe Steifigkeit sein, die von einigen
Autoren als große Herausforderung der Hydrogele beschrieben wird.
Auch wenn HUMORS auf dem cGEL Typ4 in der Proliferation im Vergleich zu
den HUMORS auf dem Collagen Cell Carrier® geringer war, überzeugten die Da-
ten der Melaningehaltmessungen. Denn obwohl weniger Melanozyten zu ver-
zeichnen waren, konnte ein signifikant höherer Melaningehalt pro Kultur auf der
cGEL Variante 4 gemessen werden. Da Melanin das entscheidende Produkt der
humanen Melanozyten der äußeren Haarwurzelscheide bei der Pigmentierung
von Vitiligo-Läsionen ist, sollten auch weitere Investitionen in die Optimierung
des cGEL Typ4 erfolgen. Denn mit diesem Beitrag kann es in Zukunft möglich
sein, Patienten mit Vitiligo durch autologe Zelltransplantationen durch einfaches
Zupfen von Kopfhaaren eine nichtinvasive, effektive Therapieoption anzubieten.
87
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Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Der Pigmentfarbstoff Melanin ........................................................ 13
Abbildung 1.2: Anatomie der epidermalen Melanozyten ...................................... 14
Abbildung 1.3: Melanozytäre Zellen der Haut und Hautanhangsgebilde .............. 16