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UNIVESIDAD DE CHILE FAULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y
TECNOLOGÍA QUÍMICA
LABORATORIO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS Y
MATERIAS GRASAS.
Patrocinante
Profesora (QF.) Lilia Masson S.
Director (es)
Profesora (Q.) Paz Robert C.
Ing. Sr. Miguel Opazo Q.
Planta Materias Grasas, Fábrica
Maipú. Nestlé Chile S.A.
DESARROLLO DE UN SISTEMA DE INTERESTERIFICACION
ENZIMATICA PARA LA OBTENCIÓN DE BASES GRASAS CON
BAJO PORCENTAJE DE ACIDOS GRASOS TRANS
Memoria para optar al título de Ingeniero en Alimentos.
IVAN ROBERTO GUERRERO RIQUELME
Santiago, Chile
2005
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II
DEDICATORIA
A Maria Teresa Riquelme S.M. e Iván Guerrero A.
A Teresa Guerrero R, Marcela Guerrero R. y Felipe Estay G.
A la familia Riquelme, ustedes son mi vida.
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III
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Chile y su Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas,
A la empresa Nestlé Chile S.A., por su apoyo a la investigación y
desarrollo de tecnologías,
A la empresa Novozymes y su coordinador técnico de Aceites y
Grasas para Latinoamérica Luís Alessandro Volpato M.,
A la profesora Lilia Masson, por su gran aporte, confianza,
conocimientos y apoyo a la investigación,
Al ingeniero Miguel Opazo, por su confianza y consejos,
A la profesora Paz Robert, por su aporte, confianza e iluminación,
Al profesor Eduardo Castro, por su constante apoyo y sabiduría,
A todos los trabajadores de la Planta de Materias Grasas, quienes
dieron todas las facilidades para realizar este trabajo,
A los especialistas y profesionales del departamento de Quality
Assurance de la Fábrica Maipú,
A los académicos, funcionarios y especialistas que trabajan en el
Laboratorio de Química de Alimentos y Materias Grasas de la Facultad de
Ciencias Químicas y Farmacéuticas.
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IV
INDICE GENERAL
INDICE DE TABLAS……………………………………...
INDICE DE FIGURAS…………………………………….
INDICE DE GRÁFICOS………………………………….
INDICE DE ANEXOS……………………………………..
NOMENCLATURA………………………………………..
RESUMEN………………………………………………….
SUMARY…………………………………………………...
I. INTRODUCCIÓN……………………………………...
1.1. Antecedentes generales….………………………........
1.1.1. Definición y características…..……………….............
1.1.2. Enzimas y mecanismo de reacción…....…...................
1.1.3. Aplicaciones……………..……………………………
1.1.4. Pérdidas por reacción…….…………….......................
1.2. Características de las materias primas………………….
1.2.1. Aceite de Pescado………………………………….....
1.2.2. Aceite de Soja………………………………………...
1.2.3. Aceite de Maravilla…………………………………...
1.3. Materias grasas de consumo industrial y doméstico……
1.4. Diseño experimental…………………………................
1.5. Objetivos……………………………………………...
1.5.1. Objetivo General……………………………………...
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1.5.2. Objetivos Específicos…………………………………
II. MATERIALES Y MÉTODOS……………………….
2.1. Materiales………………………………………… …..
2.1.1. Materias primas……………………………………….
2.1.2. Material de vidrio.…………………………….............
2.1.3. Otros materiales de laboratorio..……………………...
2.1.4. Reactivos y soluciones.……………………….............
2.1.5. Instrumentos y equipos de laboratorio..………………
2.2. Metodología…………………………………………...
2.2.1. Elección de materias primas y determinación de sus
características físicas y químicas………..…………..............
2.2.1.1. Elección de materias primas………………………..
2.2.1.2. Determinación de las características físicas y
químicas de las materias primas…………………………….
2.2.2. Métodos de análisis.……...……...................................
2.2.2.1. Parámetros físicos.………………………...………..
2.2.2.2. Parámetros químicos….……………………...……..
2.2.3. Caracterización de la enzima………............................
2.3. Determinación de las variables dependientes e
independientes del diseño experimental. Optimización de las
condiciones de proceso y requerimientos de catalizador…....
2.3.1. Determinación de las condiciones de proceso..............
2.3.2. Diseño de experimentos....……………………………
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VI
2.3.2.1. Variables de estudio para la reacción de
interesterificación……………………………………………
2.3.2.2. Variables dependientes……………..........................
2.3.2.3. Diseño factorial fraccionario….…………………….
2.3.2.4. Diseño de optimización…….……….………………
2.4. Establecimiento de los modelos matemáticos...............
2.4.1. Obtención del producto óptimo……………………….
2.5. Caracterización del producto óptimo.…………...........
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN..……………………
3.1. Determinación de las características físicas y químicas
de las materias primas……………...………………………..
3.2. Determinación de las condiciones de proceso.….…..….
3.2.1. Etapas para la realización de la reacción de
interesterificación……………...…………………………….
3.2.2. Diagrama de bloques……...………..............................
3.2.3. Esquema del sistema de reacción…………………......
3.3. Características del producto objeto……………………..
3.4. Resultados del diseño experimental………...…………..
3.4.1. Características de combinación de materias primas en
los niveles de diseño aplicado…………………………….....
3.4.2. Diseño factorial bidimensional en tres niveles (32).......
3.4.3. Análisis estadístico de las respuestas del diseño 32......
3.5. Establecimiento de los modelos matemáticos…………..
3.6. Condiciones de obtención del producto óptimo……...…
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VII
3.7. Caracterización del producto óptimo …..………………
3.7.1. Análisis del producto óptimo con y sin
interesterificación……………………………………………
3.7.1.1. Análisis comparativo del producto óptimo con
respecto al estándar establecido……………………………..
3.7.1.2. Análisis de las características texturales por medio
del ensayo de compresión a los productos optimizados…….
3.7.1.3. Análisis de microscopía de luz polarizada…………
3.7.1.4. Análisis del contenido de AGT en materias primas y
productos optimizados……………………………………....
3.7.1.5. Análisis del perfil de TAG ……...………………….
IV. CONCLUSIONES…………………………………...
V. BIBLIOGRAFÍA…………………………………….
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IX
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Niveles de aplicación de las variables en estudio.....
Tabla 2 Niveles experimentales de las variables en estudio..
Tabla 3 Resultados de análisis físicos y químicos de las
materias primas……………………………………………...
Tabla 4 Composición de ácidos grasos de las materias
primas (% ésteres metílicos)………………………………...
Tabla 5 Condiciones óptimas para una materia grasa
comercial…………………………………………………….
Tabla 6 Características físicas iniciales de la mezcla
AFHP/AVL en diferentes proporciones…………………….
Tabla 7 Características físicas iniciales de la mezcla
AFHV/AVL en diferentes proporciones…………...………..
Tabla 8 Resultados del diseño 32, en base pescado con
interesterificación…………………………………..……….
Tabla 9 Resultados del diseño 32, en base vegetal con
interesterificación……………………………………………
Tabla 10 Resumen de valores P y F del análisis ANOVA
aplicado a las respuestas del diseño en base pescado………
Tabla 11 Resumen de valores P y F del análisis ANOVA
aplicado a la respuesta del diseño en base vegetal...……….
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VIII
Tabla 12 Comparación entre las respuestas del modelo
matemático y las respuestas experimentales para la base de
pescado………………………………………………………
Tabla 13 Comparación entre las respuestas del modelo
matemático y las respuestas experimentales para la base
vegetal……………………………………………………….
Tabla 14 Condiciones experimentales para el producto
óptimo en base pescado y base vegetal.…………………….
Tabla 15 CSG y PF para la mezcla optimizada en base
pescado y base vegetal………………………………………
Tabla 16 Parámetros texturales de las mezclas óptimas en
base pescado y base vegetal…..………………………..........
Tabla 17 Resultados análisis de contenido de AGT por
cromatografía GLC y espectroscopía IR.……………………
Tabla 18 Perfil de triglicéridos, determinado por HPLC
para AVL, AFHV, y mezclas optimizadas con base vegetal
con y sin interesterificación…………………………………
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X
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Tríada catalítica del sitio activo de una lipasa…………
Figura 2. Intercambio de ácidos grasos debido a la acción de una
lipasa 1,3 específica, entre dos triglicéridos diferentes…………...
Figura 3. Representación de la hidrólisis de una molécula de
TAG por presencia de agua en la reacción enzimática…………...
Figura 4. Diagrama de bloque, reacción de interesterificación….
Figura 5. Esquema del sistema de reacción de interesterificación
a nivel de laboratorio……………………………………………...
Figura 6. Microfotografías de luz polarizada para AFHP, MOBP
y MOBPI, con un aumento de 10X……………….........................
Figura 7. Microfotografías de luz polarizada para AFHV,
MOBV y MOBVI, con un aumento de 10X. …………………….
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XII
INDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. CSG para las materias primas en función de la
temperatura…………………………………………………….
Gráfico 2. CSG para las mezclas con base pescado
interesterificadas en función de la temperatura………….…….
Gráfico 3. CSG para las mezclas con base vegetal
interesterificada en función de la temperatura………………...
Gráfico 4. CSG para las mezclas optimizadas con base
pescado en función de la temperatura…………………………
Gráfico 5. CSG para las mezclas optimizadas con base
vegetal en función de la temperatura………………………….
Gráfico 6. Curvas de compresión para la mezcla óptima en
base pescado sin interesterificar (MOBP) y con
interesterificación (MOBPI)………………………………...…
Gráfico 7. Curvas de compresión para la mezcla óptima en
base vegetal sin interesterificar (MOBV) y con
interesterificación (MOBVI)...……………………………...…
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XII
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1 Tablas de Análisis de Varianza y Coeficientes de
Correlación para Respuestas del Diseño Bidimensional factorial
en 3 niveles (32)………………………………………………….
ANEXO 2 Superficie de Respuesta del Diseño de Optimización
de Respuesta Múltiple…………………………………………….
ANEXO 3 Microfotografías de luz Polarizada con aumento de
40X………………………………………………………………..
ANEXO 4 Composición de Ácidos Grasos en Mezclas
Optimizadas……………………………………………………….
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XIII
NOMENCLATURA
AGT: Ácidos Grasos Trans
AFHP: Aceite full Hidrogenado de Pescado
AFHV: Aceite full Hidrogenado Vegetal
AVL: Aceite Vegetal Líquido
CSG: Contenido de Sólidos Grasos
DS: Desviación Estándar
GLC: Cromatografía Gas-Líquido
HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución
IR: Espectroscopía Infra Roja
MOBP: Mezcla Óptima Base Pescado
MOBPI: Mezcla Óptima Base Pescado Interesterificada
MOBV: Mezcla Óptima Base Vegetal
MOBVI: Mezcla Óptima Base Vegetal Interesterificada
PF: Punto de Fusión
RBD: Neutro, Blanqueado y Desodorizado
TAG: Triacilglicerol
x: Promedio
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XIV
RESUMEN
Se ha estudiado la aplicación del proceso de interesterificación
enzimática, con la finalidad de desarrollar un sistema que permita la
obtención a escala industrial de bases grasas alternativas, que contengan un
bajo porcentaje de ácidos grasos trans (AGT).
Las materias primas utilizadas fueron mezclas de aceite de pescado
“full” hidrogenado (AFHP) con aceite vegetal líquido (AVL) para la
mezcla con base pescado, y aceite vegetal “full” hidrogenado (AFHV) con
AVL para la mezcla con base vegetal. El catalizador empleado fue una
lipasa 1,3 específica al 4% y 70 ºC. Las variables estudiadas fueron: % de
materia prima en la mezcla (AFHP o AFHV) y tiempo de reacción. El
efecto se midió sobre las variables punto de fusión (PF) y contenido de
sólidos grasos (CSG) a diferentes temperaturas.
Se aplicó un diseño factorial bidimensional en tres niveles, 32,
como diseño de optimización del proceso, encontrándose como resultado
un tiempo de reacción de 5 horas (tiempo máximo) para ambas mezclas y
una proporción de 43,9% para AFHP en la mezcla con base pescado y
36,8% para AFHV en la mezcla con base vegetal.
Se establecieron los modelos matemáticos para PF y CSG a
diferentes temperaturas.
Se determinó el contenido de AGT mediante IR y GLC, estructura
cristalina por microscopía de luz polarizada, características texturales
mediante análisis de compresión y cambios en el contenido de triglicéridos
para la base vegetal mediante HPLC.
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XV
SUMARY
“DEVELOPMENT OF AN ENZYMATIC INTERESTERIFICATION SYSTEM FOR OBTAINING LOW TRANS FATTY ACIDS BASES”
The enzymatic interesterification process has been applied with the
purpose to develop a system for obtaining alternative fatty bases with low
percentage of trans fatty acids (AGT) for industrial production.
The raw materials used were full hydrogenated fish oil (AFHP) and
liquid vegetal oil (AVL) for the fish blend and full hydrogenated vegetal oil
(AFHV) with AVL for the vegetal blend. The catalyst used was 4% 1,3
specific lipase, temperature 70 ºC. The variables studied were: % of raw
material in the blend (AFHP or AFHV) and reaction time. The effect was
measured by melting point variable (PF) and solid-fat content (CSG) at
different temperatures. A 3 levels factorial bidimensional design, 32, for
process of optimization was applied. The results were maximum reaction
time 5 hours for both mixtures and a proportion of 43.9% for AFHP in the
fish base mixture and 36.8% for AFHV in the vegetal base mixture.
The mathematical models for the PF and CSG at different
temperatures were established. AGT, crystalline structure, textural
characteristics and changes in the triacylglicerol content for the vegetal
blend were determined by IR and GLC, polarized light microscopy,
compression analysis and HPLC, respectively.
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INTRODUCCIÓN
1
I. INTRODUCCIÓN
El aspecto nutricional de las grasas y los aceites siempre ha sido un
punto de discusión. Junto con la atención focalizada en la reducción del
nivel de grasa saturada existente en los productos alimenticios, en la
actualidad ha surgido un gran interés en el contenido de ácidos grasos trans
y el aporte de vitaminas liposolubles naturales de los aceites y las grasas.
Con el objeto de estar siempre acorde con los requerimientos de la calidad
nutricional de las grasas, las tecnologías existentes están en proceso
continuo de mejoramiento y a la vez emergen nuevos procesos. En este
sentido, las modificaciones más conocidas son: fraccionamiento,
hidrogenación e interesterificación, siendo la hidrogenación selectiva la que
aporta aproximadamente el 80% de los isómeros trans en la dieta (Kellens,
1997; Amadori, 1995).
El rol biológico que cumplen los ácidos grasos trans en el organismo
animal ha sido controversial. Se ha demostrado que estos ácidos grasos
trans pueden comportarse como un ácido graso saturado, pudiendo incidir
en un aumento de las enfermedades coronarias. Estudios realizados en los
años noventa, han demostrado que la ingesta de ácidos grasos trans
incrementa la concentración plasmática del colesterol LDL de una manera
similar al efecto que ejercen los ácidos grasos saturados (Mensink y Katan,
1990; Judd et al., 1994). Además, en contraste con otros tipos de materia de
materias grasas, los isómeros trans disminuyen el colesterol HDL (Troisi et
al., 1992). Así, el incremento de la razón colesterol LDL/colesterol HDL es
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INTRODUCCIÓN
2
casi el doble del producido por los ácidos grasos saturados (Zock y Katan,
1992).
Se ha estimado que el 90-95 % de los ácidos grasos trans de los
alimentos se genera en el proceso de hidrogenación, lo cual otorga
firmeza a las margarinas y a las grasas plásticas de pastelería
(Shortenings) por saturación de algunos de los dobles enlaces y
cambiando otros a configuración trans. Las margarinas pueden tener un
contenido de ácidos grasos trans entre 30 y 45 % (Valenzuela y Nieto,
1994).
La presencia de un doble enlace en la estructura de un ácido graso
determina en éste un plano de simetría muy particular. Por ejemplo, en un
C18:1 omega-9, el doble enlace puede establecer un plano en el cual los
dos segmentos de la cadena hidrocarbonada pueden quedar hacia un
mismo lado del plano de referencia o pueden quedar en posiciones
contrarias en este mismo plano de referencia. En el primer caso se origina
una isomería cis y la molécula corresponderá al ácido oleico (C18:1
omega-9 cis). En el segundo caso, se trata de una isomería trans y dará
origen a un ácido graso con propiedades físicas muy diferentes al ácido
oleico. Se trata del ácido elaidico (C18:1 omega-9 trans) (Valenzuela y
Nieto, 1994).
De esta forma, la industria de alimentos utiliza procedimientos de
interesterificación química y enzimática de las grasas y aceites con el
propósito de mejorar sus características nutricionales, así como también
sus propiedades de fusión y contenido de grasa sólida. Debido a que los
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INTRODUCCIÓN
3
procedimientos de interesterificación química presentan algunas
limitaciones e inconvenientes, la aplicación de tecnologías que utilizan
enzimas aparece como muy prometedora para el desarrollo de nuevos
tipos de grasas y aceites. Las reacciones de interesterificación catalizadas
por lipasas permiten la modificación estructural de los lípidos al cambiar
en forma selectiva la composición de los triglicéridos bajo condiciones de
reacción muy suaves y controladas (Valenzuela y Nieto, 1994).
La gran ventaja de las enzimas como catalizadores es que ellas
permiten que los ácidos grasos, durante el proceso, se reordenen en la
molécula de glicerol en posiciones determinadas constituyendo una
selectividad por posiciones determinadas, según la enzima utilizada. Esta
selectividad no se puede conseguir en la interesterificación con
catalizadores químicos.
Los principales atractivos de estos catalizadores se refieren a la
especificidad que presentan sobre las posiciones 1, 3 y 2 de la molécula
de glicerol. Además, se trata de productos naturales que, en las
reacciones que participan, operan a temperaturas relativamente bajas o
menores, entre 40 y 60 °C (Amadori, 1995). Por otro lado, las enzimas se
pueden clasificar como catalizadores de grado alimenticio y se pueden
utilizar de forma sencilla, sin necesidad de disponer de un gran
equipamiento como medio de reacción.
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INTRODUCCIÓN
4
1.1. Antecedentes generales
1.1.1. Definición y características
En general, la reacción de interesterificación se divide en tres tipos:
acidólisis, alcohólisis e intercambio éster-éster (transesterificación).
El intercambio éster-éster puede efectuarse en forma aleatoria, es
lo que se conoce como interesterificación al azar, o bien, como
interesterificación dirigida, en la cual, se realiza una separación de los
radicales ácidos de acuerdo a su grado de insaturación y largo de cadena
(Swern, 1982).
La reacción de interesterificación al azar, se aplica considerando
que las materias grasas en sí mismas, o sus mezclas, presentan un grado
de organización en lo que respecta a la distribución de sus ácidos grasos.
La interesterificación química dirigida se realiza por debajo del punto de
fusión de la materia grasa, de modo que las fracciones de mayor punto de
fusión, los glicéridos trisaturados, precipiten, y así, la reacción tenga
lugar en la fase líquida (Swern, 1982).
El proceso de interesterificación modifica la distribución natural,
consistente en un intercambio de los ácidos grasos en el mismo TAG y
entre las moléculas de TAG, produciéndose así un reordenamiento. La
composición porcentual de los ácidos grasos permanece idéntica a la de
la materia grasa o mezcla original, pero la composición en TAG y las
propiedades físicas, como punto de fusión, contenido de grasa sólida y
forma de cristalización, se modifican.
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INTRODUCCIÓN
5
Entre los procedimientos de interesterificación se cuenta el simple
calentamiento de los aceites y grasas a temperaturas que bordean los
300ºC, pero la reacción a esta condición es lenta y normalmente
acompañada de descomposición y polimerización de los TAG.
En la práctica, se requiere de un catalizador, que puede ser químico
o enzimático. Los catalizadores más usados son los metales alcalinos y
sus derivados, siendo el metóxido de sodio el más empleado, debido a sus
ventajas de costo y temperatura de reacción, que puede ser reducida a un
rango entre 30-90ºC (Solís et al., 2001).
Cuando se trata de una reacción enzimática, se utilizan lipasas,
enzimas hidrolíticas del enlace éster. Éstas presentan una especificidad
para los ácidos grasos ubicados en las posiciones 1 y 3, mientras que
otras, actúan sobre los radicales acilos ubicados en las posiciones 1, 2 y
3. Se utilizan normalmente inmovilizadas, y representan una buena
herramienta para la producción de nuevos tipos de triglicéridos
(Valenzuela y Nieto, 1994).
1.1.2. Enzimas y mecanismo de reacción
Las enzimas son catalizadores complejos, constituidas por
proteínas globulares, que a temperaturas en torno a 37 °C, aceleran la
velocidad de las reacciones químicas por un factor de 1012 a 1020 respecto
a la de las reacciones no catalizadas (Fennema, 2000).
Aunque las enzimas se encuentran sometidas a las mismas leyes
naturales que gobiernan el comportamiento de otras sustancias, se
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INTRODUCCIÓN
6
diferencian de los catalizadores químicos ordinarios en varios aspectos
importantes:
• Velocidades de reacción más elevadas
• Condiciones de reacción más suaves
• Mayor especificidad
• Capacidad para la regulación
Dentro de las enzimas, las lipasas se encuentran ampliamente
difundidas, y existen en plantas, animales y microorganismos. Además,
se presentan en numerosos fluidos biológicos, células, semillas y varios
otros tejidos (Voet y Voet, 1995). Las lipasas hidrolizan los enlaces éster
de los TAG en una interfase aceite/agua.
Los recientes avances en la tecnología de las enzimas han
conducido a la preparación de enzimas inmovilizadas que, en principio,
pueden ser usadas repetidamente en operaciones discontinuas o
continuas. En este sentido, la inmovilización se puede llevar a cabo
mediante cinco métodos generales:
• Enlace covalente a una matriz insoluble.
• Inclusión entre las mallas de un gel o (micro)-encapsulación con
membranas semipermeables.
• Adsorción sobre una matriz insoluble.
• Entrecruzamientos para formar agregados insolubles.
• Adsorción seguida de entrecruzamiento.
Las principales fuentes de lipasas de origen animal son el tejido
comestible del primer estómago de terneros, cabritos y corderos, y tejido
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INTRODUCCIÓN
7
pancreático animal, las cuales se utilizan principalmente en el desarrollo
de aromas en la fabricación de queso (Fennema, 2000).
Las lipasas con fines comerciales se obtienen a partir de la
fermentación de microorganismos tales como Aspergillus oryzae,
Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae, Thermomyces lanuginosus
(inmovilizada) y Rhizomucor miehei (inmovilizada), las cuales actúan
sobre las posiciones sn-1,3 de los TAG, mientras que lipasas obtenidas
de microorganismos como Pseudomonas sp, Arthrobacter sp, y Candida
antarctica, actúan sobre la posición sn-2, sin embargo también presentan
actividad sobre las posiciones sn-1,3 (Chandler, 2001).
El mecanismo de acción de una lipasa es análogo al de la
quimiotripsina y consiste en una fase de acilación en la que se forma un
intermediario covalente acil-enzima, con liberación del primer producto
(diglicerato), y una fase de desacilación en la que una molécula de
diglicerato diferente rompe el intermediario con liberación del segundo
producto, un nuevo TAG. Todas estas enzimas tienen un centro activo
formado por tres aminoácidos; Serina (Ser 195), Histidina (His 57) y
ácido Aspártico (Asp 102), que en conjunto reciben el nombre de “tríada
catalítica” (Figura 1) (Fennema, 2000).
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INTRODUCCIÓN
8
Figura 1. Tríada catalítica del sitio activo de una lipasa.
En la Figura 2 se muestra el intercambio de ácidos grasos en
posiciones 1 y 3 entre dos triglicéridos, por acción de una lipasa 1-3
específica comercial.
Figura 2. Intercambio de ácidos grasos debido a la acción de una lipasa 1-3 específica, entre dos triglicéridos diferentes.
1.1.3. Aplicaciones
La interesterificación enzimática se presenta como una muy buena
alternativa para la industria de modificación de materias grasas, en lo
referente a la elaboración de bases para margarinas, mantecas plásticas
(Shortenings) y materias grasas modificadas.
En este sentido, los estudios realizados sobre el comportamiento y
finalidad de uso de las lipasas aplicadas a una mezcla de bases grasas,
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INTRODUCCIÓN
9
apuntan en su mayoría a la obtención de margarinas en base a derivados
de la palma.
Así, Zainal y Affandi (1999) utilizaron la interesterificación
mediante lipasa inmovilizada de Rhizomucor miehei (Lipozyme IM60)
para lograr adecuadas propiedades físicas en la mezcla de estearina de
palma y oleína de palmiste, reduciendo además el contenido de isómeros
trans a un 0,5%.
Por otro lado, Zhang et al., (2001) estudiaron la interesterificación
de estearina de palma y aceite de coco, con Lipozyme TL IM 1, 3
específica, en reactores pilotos tipo “Batch” de capacidades desde 1 a
300 kg.
Chu et al., (2001) encontraron que sus mezclas de estearina de
palma y oleina de palmiste, interesterificadas con Lipozyme IM60,
presentaban una estructura cristalina �´ más abundante que en muestras
de margarinas domésticas comunes.
Torres et al., (2002) realizaron la interesterificación enzimática
utilizando Lipozyme Tl IM al 10 %, en mezclas de aceite de maíz y
triestearina. En su trabajo observaron una reducción de la triestearina de
6 a 0,5 % en solo 30 minutos.
Zhang et al., (2004) evaluaron mediante un modelo matemático
exponencial dos grupos de mezclas de aceites (estearina de palma/aceite
de coco y aceite de soja “full” hidrogenada/aceite de soja) trabajando
con una concentración de enzima Lipozyme TL IM al 4 % (p/p) y 70 ºC.
Mediante este modelo se pretendió predecir cambios en el contenido de
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INTRODUCCIÓN
10
grasa sólida para las mezclas trabajadas, obteniéndose un coeficiente de
correlación de 0,99.
1.1.4. Pérdidas por reacción
Las pérdidas de materia grasa se producen debido a su retención en
los gránulos de sílica que protegen la enzima inmovilizada. El valor de
retención estimado es de aproximadamente 1 kg de aceite/kg enzima. De
acuerdo a esto se puede estimar que en cada reacción se pierden 20 g de
aceite si se trabaja con 500 g de aceite y un 4% de enzima.
Podría mencionarse también dentro de este ítem, las pérdidas por
hidrólisis, debido a la humedad presente en las bases grasas sometidas a
reacción. En este sentido, la figura Nº3 representa la hidrólisis de un
TAG producida por la presencia de la molécula de agua, con el
consiguiente aumento de la acidez y la aparición de diglicéridos o
monoglicéridos.
Figura 3. Representación de la hidrólisis de una molécula de TAG por presencia de agua en la reacción enzimática.
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INTRODUCCIÓN
11
1.2. Características de las materias primas
1.2.1. Aceite de Pescado
Chile es uno de los principales productores de aceite de pescado a
escala mundial aportando cerca de 195.263 Ton el año 2004 (Sernapesca,
2004). Esta cifra puede variar debido (entre otros factores) a la aparición
del fenómeno “El Niño” en las costas del Océano Pacífico.
Esta materia prima se utiliza en Chile por la industria de
margarinas para alimentación humana como aceite parcialmente
hidrogenado de origen animal. En este sentido, un 34% del aceite de
pescado es consumido por este tipo de industrias. Del total restante, se
estima que un 54% va a la industria de la acuicultura, un 10% a
elaboración de productos industriales y un 2% es utilizado en la industria
farmacéutica (Fundación Chile, 2003).
El aceite de pescado que se emplea en la industria chilena es
básicamente un producto común de jurel, sardina, anchoveta y salmón,
en el que se presenta una composición ponderada del perfil de ácidos
grasos, que por ser de origen marino, se estima que el orden dentro de las
moléculas es similar (Eisner, 1998).
Desde un punto de vista estructural, los aceites de pescado se
diferencian de la grasa animal y de los aceites vegetales por su alto
contenido de ácidos grasos poliinsaturados omega 3 (AGPI-�3) de
cadena larga de hasta 26 átomos de carbono; siendo los más frecuentes
los de C20 y C22 (Masson y Mella, 1985).
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INTRODUCCIÓN
12
1.2.2. Aceite de Soja
Los principales proveedores de aceite de soja para Chile son
Argentina y Bolivia, abasteciendo el 40% del total de aceite importado
por nuestro país, que se estima en 8.559 Ton en el período Enero-Agosto
del año 2004 (ODEPA, 2005). Esta situación de abastecimiento ha ido
cambiando debido a que se autorizó la importación de mezclas de aceites
donde se combinan principalmente aceite de girasol o maravilla, con soja
u otros aceites, pasando a significar esta mezcla el 85% de las
importaciones (Iglesias, 2001).
El aceite de soja es el más importante de los aceites vegetales
producidos en el mundo, debido a su disponibilidad y bajo costo.
Este aceite presenta muchas ventajas, pero también algunas
desventajas. Dentro de las ventajas se encuentra su alto nivel de
insaturación, además, puede ser hidrogenado selectivamente, la remoción
de fosfátidos, metales y jabones no presenta grandes dificultades y tiene
una buena presencia de antioxidantes naturales (tocoferoles). Entre las
desventajas cabe mencionar sus cantidades relativamente altas de
fosfátidos (superior al 2%) y cantidades altas de ácido linolénico (7-8%),
responsable de la reversión de su sabor y olor.
El aceite de soja posee un contenido de ácido linoleico de
alrededor del 50%, mientras que el ácido oleico se encuentra cerca del
22%. Su contenido de ácido linolénico cercano al 7% lo diferencia de
otros aceites, otorgándole adecuadas propiedades nutricionales (Masson
y Mella, 1985).
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INTRODUCCIÓN
13
1.2.3. Aceite de Maravilla
Chile no tiene producción interna de oleaginosas (solo es capaz de
cubrir cerca del 10% del mercado local), es por esto que se abastece de
materia prima importada para sus refinerías. En este sentido, Argentina
abastece a la industria chilena cubriendo el 95% de las necesidades de
aceite crudo, siendo el resto de origen boliviano (García, 2001). En este
sentido, el total de aceite de maravilla importado fue de 1.124 Ton para
el año 2004, en su mayoría como aceite refinado.
El aceite de girasol (maravilla) tradicional posee una elevada
proporción de ácido linoleico, cercana al 70% (Masson y Mella, 1985),
lo que hace que el proceso de hidrogenación pueda ser mejor controlado.
Por el contrario, el alto contenido en este ácido graso puede provocar
auto oxidación y desarrollo de rancidez.
Es por esto que se han desarrollado híbridos de girasol tradicional
con la finalidad de aumentar el contenido de ácido oleico (alto oleico) y
conferir así mayor estabilidad y valor agregado en la prevención de
diversas patologías (Izquierdo y Aguirrezábal, 2002).
1.3. Materias grasas de consumo industrial y domestico
El empleo de una materia grasa dependerá del uso final que se le
asigne. En este sentido, los “shortenings” o mantecas plásticas deben
producir emulsiones estables bajo el efecto de la temperatura de horneo.
Las bases grasas destinadas a la elaboración de helados deben generar
emulsión, facilitar la aireación y formar parte de su estructura. En el caso
de los productos de panificación, su función es la de formar un complejo
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INTRODUCCIÓN
14
con el almidón y las proteínas de la harina, de manera de otorgar buenos
rendimientos en cuanto al volumen del producto por mayor incorporación
de aire, aumentar su calidad organoléptica e incrementar la vida útil.
Una sustancia es plástica cuando presenta la propiedad de
comportarse como sólido y resistir pequeños esfuerzos, pero ceder y fluir
como un líquido cuando se la somete a un esfuerzo de deformación por
sobre cierto valor mínimo.
La plasticidad de una margarina es función de su contenido de
sólidos a distintas temperaturas, razón por la cual el parámetro de
contenido de sólidos grasos (sólid fat content, SFC o CSG), es un buen
indicador del rango plástico de una grasa. Cuando una materia grasa
plástica se incorpora a una masa, es capaz de extenderse para formar
mínimas láminas que lubrican grandes superficies y favorece la
formación de una estructura homogénea (Swern, 1982).
Para que este tipo de productos cumpla con los parámetros de
calidad exigidos, deben regirse por las disposiciones del Reglamento
Sanitario de los Alimentos (Ministerio de Salud, 2000), el cual en el
Titulo X, de las grasas y aceites comestibles, indica:
“El contenido de humedad y materias volátiles, no deberá ser
mayor a 0,2% en los aceites comestibles y no más de 0,5% en las
mantecas o grasas. No deberán contener más de 0,25% de acidez libre,
expresada como ácido oleico, y no más de 100 ppm de jabón. A la fecha
de elaboración, el límite máximo de peróxidos será de 2,5 meq de
oxigeno peróxido/kg de grasa y 10 meq de oxígeno peróxido/kg de grasa
en su período de vida útil……”.
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INTRODUCCIÓN
15
Por otro lado, en el Artículo 259 se indica:
“Mantecas modificadas son los productos obtenidos de aceites
vegetales o marinos que han sido sometidos a procesos de hidrogenación
y eventualmente a transesterificación, interesterificación y
fraccionamiento. Su punto de fusión máximo será de 45ºC. En materias
primas se permiten puntos de fusión mayores”.
1.4. Diseño experimental
Antes de realizar un trabajo experimental, deben establecerse todas
las propiedades del sistema que se va a estudiar (variables dependientes),
los factores que afectan a estas propiedades (variables independientes),
los factores que permanecerán constantes, la cantidad de experiencias a
realizarse, repeticiones y de que forma deben realizarse.
El diseño experimental permite obtener la máxima información de
un proceso de la forma más rápida, económica y simple posible. Consiste
en planificar los experimentos de manera racional, de tal modo que los
datos obtenidos puedan ser procesados adecuadamente.
Los diseños experimentales del tipo factorial se aplican cuando
existe el interés de estudiar el efecto de 2 o más factores sobre alguna
respuesta a estudiar en experiencias de laboratorio.
Los planes experimentales 3n, corresponden a diseños cuadráticos,
que se utilizan para calcular los coeficientes de modelos cuadráticos, los
cuales permiten encontrar el punto óptimo de una superficie de respuesta
(López, 1997).
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INTRODUCCIÓN
16
1.5. Objetivos
1.5.1. Objetivo General
Desarrollar un sistema de interesterificación de tipo enzimático,
utilizando mezclas de materias grasas altamente hidrogenadas (“full”
hidrogenado) de origen pescado y vegetal, con aceites vegetales líquidos
para la obtención de bases grasas con adecuadas propiedades
tecnológicas y un bajo contenido de ácidos grasos trans.
1.5.2. Objetivos Específicos
• Desarrollar un proceso de interesterificación enzimática sobre la
base de materias grasas hidrogenadas y aceites líquidos en
presencia del catalizador enzimático Lipozyme TL IM.
• Optimizar el proceso de interesterificación enzimática de las
mezclas de materias grasas mediante la aplicación de un diseño
experimental, utilizando para ello la metodología de superficie de
respuesta.
• Evaluar las principales propiedades físicas y químicas de las
materias primas, las propiedades físicas de las mezclas de aceites y
de las mezclas optimizadas antes y después de la
interesterificación; así como también las propiedades tecnológicas
de las bases grasas optimizadas.
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INTRODUCCIÓN
17
• Establecer un modelo matemático, asociado al comportamiento de
las mezclas, que permita formular y establecer condiciones de
proceso para obtener un producto con las cualidades físicas
buscadas.
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MATERIALES Y MÉTODOS
18
II. MATERIALES Y METODOS
2.1. Materiales
2.1.1. Materias primas
• Aceite Vegetal Líquido (AVL) mezcla girasol/soja en relación
60/40, RBD.
• Aceite “full” Hidrogenado Pescado (AFHP). Origen aceite de
Salmón, RBD.
• Aceite “full” Hidrogenado Vegetal (AFHV). Mezcla girasol/soja
en relación 60/40, refinado, neutro y blanqueado.
2.1.2. Material de vidrio
• Reactor de vidrio con doble camisa de calefacción y paleta de
agitación (media luna, teflón), confeccionado especialmente para
pruebas de laboratorio a partir del modelo Novozymes. Capacidad
700 ml aproximadamente.
• Matraz Kitazato 1000 ml, pipeta graduada 20 ml, tubos de RMN,
tubos de colorímetro, matraces Erlenmeyer 250 ml, matraces
esmerilados 250 ml, tubos capilares.
2.1.3. Otros materiales de laboratorio
• Termómetro digital (precisión 0,1ºC) marca EXTECH
INSTRUMENTS, modelo 421305, termómetro certificado
A.O.C.S.
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MATERIALES Y MÉTODOS
19
2.1.4. Reactivos y soluciones
• Enzima Lipasa Inmovilizada, Lipozyme TL IM ® de Novozymes.
• Hexano p.a, Merck
• Acetona p.a, Merck
2.1.5. Instrumentos y equipos de laboratorio
• Balanza granataria marca METTLER TOLEDO, modelo VIPER
SW 6.
• Balanza analítica marca SARTORIUS, modelo 1265 MD.
• Refractómetro, Karl Zeiss.
• Equipo RMN marca BRUKER, modelo Minispec pc 120 s.
• Placa calefactora con agitación marca Torrey Pines Scientific.
• Baños termoregulados marca HAAKE.
• Motor con regulador de velocidad de giro marca JANKE &
KUNKEL IKA-WERK, modelo RW 20 DZM.
• Bomba de vacío marca LEYBOLD-HERAEUS, modelo TRIVAC.
• Baño termorregulador con recirculación marca HAAKE, modelo S
fisons y cabezal modelo F3 fisons.
• Fotocolorímetro marca LOVIBOND, modelo AF710-2.
• Texturómetro Lloyd Instruments, modelo LR-5K, Hampshire,
England.
• Microscopio de luz polarizada Nikon Optiphot II con cámara
Nikon Microfelet de 35-mm.
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MATERIALES Y MÉTODOS
20
2.2. Metodología
El procedimiento de reacción se adaptó a las indicaciones
establecidas por Novozymes mediante comunicación personal (Volpato,
2004).
2.2.1. Elección de las materias primas y determinación de sus
características físicas y químicas.
2.2.1.1. Elección de las materias primas
La elección de las materias primas se realizó de acuerdo a las
necesidades y disponibilidad real de la planta de materias grasas de
Nestlé Chile S.A., Fábrica Maipú.
El almacenamiento de los aceites “full” hidrogenados se realizó en
tambores de 200 L; mientras que el aceite vegetal se almacenó en envase
plástico de 20 L, cerrado, a temperatura ambiente y oscuridad.
2.2.1.2. Determinación de las características físicas y químicas de las
materias primas
La caracterización de las materias primas se efectuó mediante las
metodologías analíticas que se especifican más adelante.
Antes de realizar los análisis de caracterización de las bases grasas
“full” hidrogenadas, éstas se fundieron en estufa a 70 ºC.
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MATERIALES Y MÉTODOS
21
2.2.2. Métodos de análisis
Los análisis, tanto químicos como físicos, se realizaron por
triplicado, sólo con la excepción en que se especifique otra cosa.
2.2.2.1. Parámetros físicos
• Humedad. Método Oficial AOCS Ca 2b-38, 1993.
• Punto de fusión. Método Oficial AOCS Cc 1-25, 1993.
• Contenido de Grasa Sólida (CSG), Resonancia Magnética
Nuclear Pulsante. Método Oficial AOCS Cd 16-81, 1993.
• Color. Método Oficial AOCS Cc13b-45, 1993.
• Índice de Refracción. Método Oficial AOCS 7-25, 1993.
• Curva de Compresión, equipo Universal Lloyd LR 5K
(Rodríguez et al., 2001).
• Microscopía de luz polarizada (Rousseau et al., 1996).
2.2.2.2. Parámetros químicos
• Ácidos Grasos Libres. Método Oficial AOCS Ca 5a-40,
1993.
• Jabones. Método Oficial AOCS Cc 17-79, 1993.
• Índice de Yodo. Método Oficial AOCS Cd 1-25, 1993.
• Índice de Peróxido. Método Oficial AOCS Cd 8-53, 1993.
• Determinación de Ácidos Grasos Trans por Espectroscopía
Infrarroja, método oficial AOCS Cd 14-61, 1993 y
Cromatografía Gas-Líquido (GLC), método oficial AOCS
Ce 2-66, 1993.
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MATERIALES Y MÉTODOS
22
• Determinación de Perfil de Triglicéridos por Cromatografía
Líquida de Alta Resolución (HPLC). Método Oficial AOCS
Ce 5b-89, 1993.
• Determinación de Perfil de Acidos Grasos por
Cromatografía Gas-Líquido (GLC). Método Oficial AOCS
Ce 2-66, 1993.
2.2.3. Características de la enzima
La enzima utilizada fue una lipasa 1, 3 específica inmovilizada en
gel de sílice, proveniente de Thermomyces lanuginosus producida
mediante fermentación sumergida de un microorganismo de Aspergillus
oryzae genéticamente modificado. Esta enzima es producida por
Novozymes bajo el nombre de Lipozyme TL IM y se presenta como un
granulado de sílice con un tamaño de partícula entre 300 y 1000 �m.
2.3. Determinación de las variables dependientes e independientes
del diseño experimental. Optimización de las condiciones de proceso
y requerimientos de catalizador
2.3.1. Determinación de las condiciones de proceso
En esta etapa se establecieron las condiciones de proceso para el
correcto trabajo con el catalizador enzimático, aplicando los
procedimientos de la empresa proveedora de la enzima. Se determinó el
tiempo de secado de la materia prima, acondicionamiento del catalizador
enzimático, condiciones de agitación, vacío, temperatura de trabajo y
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MATERIALES Y MÉTODOS
23
concentración del catalizador. Las etapas del proceso, así como las
condiciones de trabajo se resumen en el diagrama de bloques que se
presenta en la figura 4.
Junto con esto, se establecen las características físicas de la mezcla
objetivo que se espera obtener.
2.3.2. Diseño de experimentos
Establecidos el control del proceso y la caracterización de las
materias primas, se fijaron las variables y el rango dentro del cual se
estudiaría su incidencia sobre las propiedades físicas de la materia grasa.
2.3.2.1. Variables de estudio para la reacción de interesterificación
Las variables independientes establecidas para el proceso son:
• Proporción de las materias grasas a utilizar en las mezclas,
representadas como AFHP (Aceite “full” Hidrogenado Pescado) y
AFHV (Aceite “full” Hidrogenado Vegetal), establecidas como
porcentaje.
• Tiempo de reacción, establecido en horas de reacción.
El estudio del efecto que ejercen las variables, se realizó por medio
de un diseño experimental que permite integrar los distintos niveles de
estudio en un conjunto de experiencias limitadas, como una medida para
el buen aprovechamiento del tiempo de trabajo experimental y
disponibilidad de material.
Page 39
MATERIALES Y MÉTODOS
24
El rango de estudio de las variables, nivel superior (1), inferior
(-1) y centro (0), fueron establecidos en base a ensayos preliminares
realizados y a literatura existente, el cual se presenta en la Tabla 2.
La Tabla 1 muestra los niveles de aplicación de las variables
independientes del estudio.
Tabla 1. Niveles de aplicación de las variables en estudio
Variable Nivel Superior
(1)
Nivel Central
(0)
Nivel Inferior
(-1)
AFH… (%) 80 50 20
Tiempo (h) 5 3 1
Los parámetros constantes del proceso se aplicaron según las
recomendaciones de los proveedores de la enzima, quienes proponen el
trabajo a 70ºC y una concentración del 4% (p/p) para el catalizador
enzimático.
2.3.2.2. Variables dependientes
Las variables dependientes consideradas como respuestas al trabajo
realizado fueron: PF y CGS a las temperaturas de 10; 21,1; 26,7; 33,3 y
37,8 de acuerdo al método AOCS Cd 16-81, 1993.
2.3.2.3. Diseño factorial fraccionario
Teniendo dos variables se obtiene un diseño factorial fraccionario
de nueve experimentos, para cada experiencia.
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MATERIALES Y MÉTODOS
25
Todos los experimentos se realizaron en duplicado con el fin de
establecer la reproducibilidad de los ensayos y calcular el error
experimental sigma extremo (σ. E.).
Donde: σ. E: Sigma extremo
Y1, Y2: Repeticiones de un mismo experimento
N: Número de repeticiones
Los resultados obtenidos como respuestas se introdujeron en el
programa estadístico Statgraphics 5.0, en el cual se realizaron los análisis
de varianza destinados a conocer cual es el efecto que tienen las variables
consideradas como independientes sobre las variables dependientes. Las
diferencias significativas se consideraron a un nivel de 5% de confianza
(P<0,05).
La Tabla 2 muestra los niveles experimentales aplicados a las
variables en estudio. En esta, se presentan los números “prima” como
repeticiones de los experimentos correspondientes al diseño aplicado. La
variable AFH… indica cualquiera de las dos bases grasas utilizadas en
este estudio, base pescado con AFHP y base vegetal con AFHV.
σσσσ. E. = √√√√[����(Y1 – Y2)2] 2 ⋅⋅⋅⋅ N
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MATERIALES Y MÉTODOS
26
Tabla 2. Niveles experimentales de las variables en estudio
Experimento AFH… (%) Tiempo (h)
1 y 1’ - 1 (20) - 1 (1)
2 y 2’ - 1 0 (3)
3 y 3’ - 1 1 (5)
4 y 4’ 0 (50) - 1
5 y 5’ 0 0
6 y 6’ 0 1
7 y 7’ 1 (80) - 1
8 y 8’ 1 0
9 y 9’ 1 1
2.3.2.4. Diseño de optimización
La realización de un diseño de optimización permite establecer las
variables que tuvieron un efecto significativo mayor sobre los resultados
y poder así encontrar un modelo matemático con el cual se puedan
establecer los parámetros y condiciones para elaborar un producto
determinado. A partir de esta optimización, se realizaron triplicados del
producto óptimo.
2.4. Establecimiento de los modelos matemáticos
Los resultados encontrados para las variables de respuesta fueron
procesados en el programa estadístico Statgraphics 5.0. Mediante éste se
aplicaron las funciones correspondientes a los diseños de superficie de
respuesta con la finalidad de analizar el impacto de las variables sobre los
Page 42
MATERIALES Y MÉTODOS
27
resultados obtenidos, mediante análisis de varianza y la obtención de las
ecuaciones que representarán el comportamiento de cada una de ellas,
por medio de una regresión múltiple.
En la determinación del análisis de varianza, se consideró como
criterio de error, el sigma extremo, calculado a partir de las repeticiones
de los experimentos.
Luego de realizado el análisis de varianza respectivo, se obtuvieron
los coeficientes de correlación (r2) los cuales representan la proporción o
grado de ajuste de los datos al modelo obtenido.
Finalmente se presentan los modelos obtenidos que presentaron
los mejores ajustes y un efecto significativo sobre los resultados a un
nivel del 5% de significación (P<0,05).
2.4.1. Obtención del producto óptimo
Las respuestas entregadas por los modelos matemáticos fueron
analizadas comparándolas con los resultados experimentales obtenidos.
Se utilizaron estos modelos para estimar las condiciones de trabajo
necesarias para disminuir el tiempo de reacción y encontrar las
proporciones de bases full hidrogenadas que, al trabajarlas en distintas
proporciones, entreguen valores de PF y CSG cercanos a los establecidos
como estándar.
Page 43
MATERIALES Y MÉTODOS
28
2.5. Caracterización del producto óptimo
Con el propósito de visualizar los cambios experimentados por las
mezclas de las materias primas utilizadas en el proceso de
interesterificación, se compararon las mezclas de los productos
optimizados sin reacción contra los productos optimizados con reacción.
Con este fin se estudiaron los parámetros PF, CSG, respuesta frente a
ensayos de compresión y estructura de la red cristalina por
microfotografías de luz polarizada y perfil de TAG.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
29
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Determinación de las características físicas y químicas de las
materias primas.
En la Tabla 3 se presentan los resultados de los análisis físicos y
químicos de las materias primas utilizadas en la reacción de
interesterificación.
Tabla 3. Resultados de análisis físicos y químicos de las materias primas.
AVL AFHV AFHP Análisis x ± DS x ± DS x ± DS
Í. Refracción (40ºC) 1,4651 0 1,4639 0 1,4515 0 AGL ( % ác. oleico) 0,04 0,01 0,67 0,02 0,47 0,04 Jabón 0 0 0 Color (5 ¼") Lovibond 35 / 2,8 18 / 2,0 35 / 4,0 Índice de Yodo 128* 5,9 9,4 Índice de Peróxidos (mEqO2/Kg) 1,44 0,08 O,98 0,07 1,22 0,08 AGT (IR) (%) 2,96 0,62 4,28 0,21 6,46 0,19 Punto de Fusión (ºC) - 66,7 0,05 56 0,05 CSG (RMN) (%)
10 ºC 4,5 96,4 94,2 21,1 ºC 2,3 95,8 92,6 26,7 ºC 0 95,7 92,4 33,3 ºC 0 96,1 91,6 37,8 ºC 0 95,7 88,7
* calculado de acuerdo a la composición en ácidos grasos determinada por GLC
Las bases grasas con alto nivel de saturación ó bajo nivel de índice
de yodo presentaron valores de punto de fusión superior a 45 ºC, por lo
que no representarían un alimento comestible de acuerdo al Reglamento
Sanitario de los Alimentos (2000). Sin embargo, podrían ser utilizadas
como materias primas para la producción de otros alimentos.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
30
Los parámetros de calidad tales como son humedad, AGL e índice
de peróxidos, se encuentran dentro de los valores recomendados por el
proveedor de la enzima, cumpliendo con los requerimientos para ser
utilizadas en la reacción de interesterificación. Los valores estimados por
parte de Novozymes para estos parámetros son:
• AGL (%): lo mas bajo posible.
• I.P: < 2 mEq de oxigeno peróxido/kg de grasa.
• Humedad: < 0,05%
El cumplimiento de estas condiciones permite evitar la reacción
entre el sitio activo de la enzima y compuestos de oxidación secundarios.
Por otro lado, se evita la hidrólisis de los ácidos grasos y por consiguiente
el aumento de la acidez en el producto final.
Finalmente, el contenido de AGT, medido por espectroscopía
infrarroja indica valores levemente superiores para las grasas “full”
hidrogenadas en comparación con el aceite vegetal líquido.
La Tabla 4 muestra la composición en ácidos grasos de las
materias primas utilizadas en el estudio.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
31
Tabla 4. Composición de ácidos grasos de las materias primas (% ésteres metílicos).
Ac. Grasos AVL AFHP AFHV
% ésteres metílicos
C 12:0 Ac. Láurico 0,00 0,09 0,00
C 14:0 Ac. Mirístico 0,23 5,36 0,44
C 15:0 Ac. Pentadecanoico 0,88 0,56 0,09
C 16:0 Ac. Palmítico 8,50 24,34 8,53
C 18:0 Ac. Esteárico 4,53 33,06 87,25
C 20:0 Ac. Araquídico 0,31 13,32 0,89
C 22:0 Ac. Behénico 0,54 17,18 1,04
C 24:0 Ac. Lignocérico 0,20 1,28 0,27
Total Saturados 15,20 95,18 98,50
C 16:1 Ac. Palmitoleico 0,83 0,70 0,12
C 18:1 t (w 9) Ac. Eláidico 0,77 0,69 0,58
C 18:1 c (w 9) Ac. Oleico 22,19 0,26 0,42
C 20:1 c Ac. Eicosaenoico 0,20 0,44 0,00
C 22:1 Ac. Docosaenoico 0,00 0,58 0,00
Total Monoinsaturados 23,98 2,67 1,11
C 18:2 Ac Octadecadienoico (trans-9, trans-12) 0,10 0,40 0,00
C 18:2 Ac Octadecadienoico (cis-9, trans-12) 0,63 0,00 0,00
C 18:2 Ac Octadecadienoico (trans-9, cis-12) 0,11 0,00 0,00
C 18:2 Ac. Octadecadienoico (cis-9, cis-12) 56,44 0,20 0,39
C 18:3 Ac. Octadecatrienoico (cis,cis,cis -9,12,15) 3,27 0,00 0,00
Total Poliinsaturados 60,55 0,59 0,39
No identificados 0,27 1,55 0,00
Total 100,0 100,0 100,0
Total AGT 1,61 1,09 0,58
Page 47
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
32
El ácido graso presente en mayor proporción en AFHV es el ácido
esteárico (18:0) seguido del ácido palmítico (16:0), representando ambos
el 90% del total de ácidos grasos saturados. Para el caso de AFHP, se
suman a los mencionados anteriormente, valores altos de ácido
araquídico (20:0) y ácido behénico (22:0), aportando todos ellos, cerca
del 90% de los ácidos grasos saturados. Por el contrario, AVL presenta
un grado de saturación bastante bajo (15,2%) representado
principalmente por el ácido palmítico y el ácido esteárico. Dentro de los
ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados de AVL, el ácido oleico
(18:1, w9) y ácido linoleico (18:2, w6), respectivamente, son los que se
encuentran en mayor porcentaje.
Los valores de AGT de las materias primas determinados por GLC
se encuentran en un rango entre 0,5 y 2%, menores a los encontrados por
IR, con una diferencia cercana a los 4 puntos porcentuales.
En el Gráfico 1 se muestran las curvas de CSG para las materias
primas en función de la temperatura a partir de los resultados presentados
en la Tabla 3.
Page 48
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
33
0102030405060708090
100
10 15 20 25 30 35 40
Temperatura (ºC)
CS
G (
%)
AFHP AFHV AVL
Gráfico 1. CSG para las materias primas en función de la temperatura.
A partir del Gráfico 1 es posible observar una tendencia plana en el
rango de temperaturas para CSG en las tres materias primas utilizadas en
este estudio. Así, AFHP se comporta como una grasa levemente más
“blanda” que AFHV, lo que coincide con su menor valor de PF. En este
sentido, el comportamiento del contenido de sólidos se podría explicar
por la morfología de la red cristalina asociada a la estructura propia de
cada base hidrogenada, donde los cristales con morfología definida se
distribuyen de una forma más ordenada (como es en el caso de AFHV)
provocando así una estructuración más fuerte. Una forma no definida,
como en AFHP, provoca la estructuración de una red cristalina más débil
y por lo tanto más fácil de romper que AFHV. En adelante es posible
observar la estructura de la red cristalina mediante el análisis de
microfotografías de luz polarizada.
Page 49
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
34
El aceite vegetal líquido (AVL), como se esperaría, no presenta PF
ni tampoco un contenido de sólidos apreciable, aunque es posible
observar un pequeño porcentaje a las temperaturas más bajas de
medición de CSG (10 y 21,1ºC) debido a la presencia de ácidos grasos
saturados (15,2%).
Como se verá más adelante, la tendencia plana que presentan las
curvas de sólidos de las materias primas se mantiene en la mezcla antes y
después de la interesterificación, otorgando un comportamiento
característico de la curva de sólidos dependiendo de la tendencia de las
materias primas.
En cuanto a la presencia de sólidos en AVL a las temperatura mas
bajas de medición de CSG, Grimaldi et al. (1998) midieron CSG en
muestras de aceites vegetales hidrogenados, utilizados como base para la
fabricación de margarinas, mediante los métodos AOCS y IUPAC. A
partir de sus resultados, encontraron que los valores obtenidos por el
método IUPAC fueron mayores que los obtenidos por el método AOCS,
sólo a las temperaturas de 10 y 21,1 °C, por lo que los valores
encontrados en esta medición podrían ser mas bajos cuando se aplica el
método IUPAC.
3.2. Determinación de las condiciones de proceso
3.2.1. Etapas para la realización de la reacción de interesterificación
• Montaje total del equipamiento requerido, ajuste de temperatura de
trabajo y condiciones de agitación (Figura 5).
Page 50
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
35
• Llenado de reactor con 500 g de AVL, acondicionado a una
temperatura de 70ºC.
• Dosificación de enzima a utilizar para las reacciones de
interesterificación. Dicha cantidad fue de 20 g.
• Acondicionamiento de la enzima con AVL. Esta etapa tiene como
objetivo remover aire y humedad (� 5%) contenidos en el gel de
sílica. La ausencia de este paso provoca un aumento de acidez en
el producto. Este acondicionamiento inicial se llevó a cabo por 30
minutos de agitación a 300 rpm y 70 °C, y fue repetido en tres
ocasiones. En total fueron realizados cuatro acondicionamientos.
• Finalizada la etapa de acondicionamiento de la enzima, se procedió
a evacuar el contenido del reactor mediante filtración con retención
solo de la enzima inmovilizada, para luego agregar la primera
mezcla a interesterificar en cantidad de 500 g. La reacción se llevó
a cabo por 5 horas seguidas a 300 rpm de agitación y 70 °C, y se
tomaron muestras a tiempo 1, 3 y 5 horas para luego realizar los
análisis respectivos de CSG y PF. Para la toma de muestras fue
necesario detener la agitación del sistema con el fin de decantar
totalmente la enzima y evitar mediciones inapropiadas. La toma de
muestra fue realizada mediante pipeta graduada de 10 ml.
3.2.2. Diagrama de bloque
En la Figura 4 se muestra el diagrama de bloque para la reacción
de interesterificación y las condiciones necesarias para el
funcionamiento.
Page 51
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
36
Figura 4. Diagrama de bloque para la reacción de interesterificación.
3.2.3. Esquema del sistema de reacción
A continuación, la Figura 5 muestra el esquema del sistema de
reacción utilizado en la reacción de interesterificación a nivel de
laboratorio.
AFHP / AFHV (20%, 50% y 80%) AVL (80%, 50% y 20%)
Carga de reactor 20 g enzima, 500 g AVL para acondicionamiento de enzima (70 °C, 300 rpm y 30 min.)
Análisis CSG, PF, AGT y otros
Mezcla materias primas (70-80 °C)
Descarte AVL acondicionamiento. Carga con 500 g mezcla de reacción.
Reacción de Interesterificación 70 °C, 300 rpm y 4% enzima (1, 3 y 5 horas de reacción)
Page 52
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
37
Figura 5. Esquema del sistema de reacción de interesterificación a nivel de laboratorio.
3.3. Características del producto objeto
Es primordial plantearse un producto objeto antes de conocer los
resultados obtenidos y así tener una base comparativa entre lo que se
espera y lo que se obtiene a partir de los cambios producidos en la
reacción enzimática. Es así como en la Tabla 5 se muestran las
condiciones óptimas para una materia grasa comercial. Estas condiciones
representan el CSG a diferentes temperaturas de manipulación y
Matraz receptor
Motor agitador
Baño termorregulador
Reactor enzimático
Bomba de vacío
Page 53
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
38
almacenamiento, y el PF para una materia grasa estándar para la
producción de margarinas.
Tabla 5. Condiciones óptimas para una materia grasa comercial.
Temp. (ºC) CSG (%)
10 54-59
21,1 33-38
26,7 23-26
33,3 9-12
37,8 0-3
PF(ºC) 35-37
3.4. Resultados del diseño experimental
3.4.1. Características de la combinación de materias primas en los
niveles de diseño aplicado.
En las tablas 6 y 7, se muestran las características físicas iniciales
de las mezclas a las que se les aplicó el diseño experimental. Con estas
mezclas, se puede realizar una comparación entre la mezcla inicial y la
mezcla obtenida luego de la reacción de interesterificación.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
39
Tabla 6. Características físicas iniciales de la mezcla AFHP/AVL en diferentes proporciones.
AFHP/AVL
20/80 50/50 80/20 T (ºC)
CSG (%)
10 21,1 51,4 77,6
21,1 20,1 48,9 76,8
26,7 18,8 46,7 74,5
33,3 16,0 43,2 70,8
37,8 13,0 38,9 67,8
PF (ºC) 47,9 51,8 54,5
Tabla 7. Características físicas iniciales de la mezcla AFHV/AVL en diferentes proporciones.
AFHV/AVL
20/80 50/50 80/20 T (°C)
CSG (%)
10 22,2 52,0 78,3
21,1 21,7 51,3 79,6
26,7 20,7 49,8 78,1
33,3 18,4 47,0 75,9
37,8 15,8 43,5 73,7
PF (ºC) 58,2 63,4 66,3
Page 55
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
40
3.4.2. Diseño factorial bidimensional en tres niveles (32).
En la Tabla 8 se muestran los resultados asociados al diseño
factorial bidimensional en tres niveles, realizado con una repetición para
la mezcla AFHP/AVL en diferentes proporciones y tiempos de reacción.
Tabla 8. Resultados de experimento 32, en base pescado con interesterificación.
Matriz de diseño PF (ºC) CSG (%)
Exp. AFHP (%) tiempo (h) x ± D.S. 10ºC 21,1ºC 26,7ºC 33,3ºC 37,8ºC
1a 20 1 47,9 0,06 22,1 19,0 17,3 13,6 10,1 1b 20 1 47,1 0,15 22,9 19,3 17,6 13,2 10,1 2a 50 1 51,8 0,06 52,2 46,2 42,6 37,6 32,8 2b 50 1 50,7 0,20 52,8 46,9 43,4 38,8 33,9 3a 80 1 54,5 0,00 77,4 76,8 73,6 68,4 64,4 3b 80 1 53,6 0,06 74,8 74,1 70,9 65,7 61,4 4a 20 3 45,5 0,01 21,6 16,7 14,6 10,4 7,0 4b 20 3 45,0 0,00 19,5 15,6 14,5 11,2 8,0 5a 50 3 49,3 0,10 45,5 42,9 36,6 29,8 24,6 5b 50 3 49,5 0,10 47,6 43,8 38,7 32,7 27,4 6a 80 3 53,5 0,20 76,9 76,6 72,7 65,2 60,0 6b 80 3 53,2 0,00 74,0 73,1 69,8 62,3 57,0 7a 20 5 43,9 0,00 19,5 14,6 11,7 7,9 4,4 7b 20 5 43,9 0,10 17,6 13,1 11,9 8,9 6,2 8a 50 5 47,7 0,11 43,4 38,3 31,8 23,8 19,5 8b 50 5 48,4 0,20 44,8 41,0 34,5 27,7 22,4 9a 80 5 53,2 0,00 77,4 75,6 71,9 62,6 56,4 9b 80 5 52,8 0,15 73,8 71,1 68,4 59,5 53,4
a y b representan las repeticiones de cada experimento.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
41
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
10 15 20 25 30 35 40
T (ºC)
CS
G (
%)
Exp 1a
Exp 1b
Exp 2 a
Exp 2 b
Exp 3 a
Exp 3 b
Exp 4 a
Exp 4 b
Exp 5a
Exp 5b
Exp 6 a
Exp 6 b
Exp 7a
Exp 7b
Exp 8 a
Exp 8 b
Exp 9 a
Exp 9 b
Gráfico 2. CSG para las mezclas con base pescado interesterificadas, en función de la temperatura.
Del gráfico Nº 2, es posible apreciar el cambio del contenido de
sólidos grasos (CSG) en las mezclas con base pescado (AFHP, AVL),
trabajadas con el fin de realizar la optimización del proceso de
interesterificación. Las tendencias de las curvas son, en la mayoría de los
casos, paralelas entre ellas y presentan una desviación mayor a los 37,8 ºC
de medición del CSG.
En la Tabla 9 se muestran los resultados para la mezcla en base
vegetal (AFHV/AVL) en diferentes proporciones y tiempos de reacción.
Page 57
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
42
Tabla 9. Resultados del diseño 32, en base vegetal con interesterificación.
Matriz de diseño PF (ºC) CSG (%)
Exp. AFHV (%)
tiempo (h) x ± D.S. 10ºC 21,1ºC 26,7ºC 33,3ºC 37,8ºC
1a 20 1 55,0 0,10 20,9 21,2 19,6 17,2 14,2 1b 20 1 58,2 0,06 22,2 21,7 20,7 18,4 15,8 2a 50 1 62,7 0,06 46,4 49,6 47,4 43,2 38,9 2b 50 1 63,1 0,00 49,2 50,8 49,2 45,4 42,3 3a 80 1 65,2 0,06 78,1 80,3 79,0 75,8 72,8 3b 80 1 65,1 0,00 77,5 79,7 78,5 75,9 73,0 4a 20 3 53,0 0,11 16,4 16,6 15,3 12,9 9,9 4b 20 3 55,5 0,15 15,5 18,3 16,5 14,0 11,7 5a 50 3 60,9 0,20 43,6 48,3 42,9 37,1 31,7 5b 50 3 62,2 0,11 47,3 50,8 48,6 43,8 40,0 6a 80 3 64,8 0,00 78,3 77,6 80,3 73,6 69,3 6b 80 3 64,8 0,00 77,8 80,4 79,6 74,9 71,6 7a 20 5 50,5 0,11 14,3 12,4 10,7 8,3 6,1 7b 20 5 52,4 0,20 14,7 15,5 13,9 11,0 9,1 8a 50 5 59,1 0,15 42,2 47,5 40,1 33,4 28,3 8b 50 5 61,8 0,06 46,8 50,3 47,2 41,9 37,0 9a 80 5 64,4 0,06 79,6 76,5 81,2 71,7 66,5 9b 80 5 64,3 0,10 77,6 77,1 80,1 73,3 69,4
a, b representan las repeticiones de cada experimento
Del gráfico Nº 3, es posible apreciar el cambio del CSG en las
mezclas con base vegetal, trabajadas con el fin de realizar la optimización
del proceso de interesterificación. Las tendencias de las curvas son, en la
mayoría de los casos, paralelas entre ellas y presentan una desviación
mayor a los 37,8 ºC de medición del contenido de sólidos grasos. Los
cambios más favorables se aprecian a concentraciones del 50% de AFHV.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
43
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
10 15 20 25 30 35 40
T ("C)
CS
G (%
)
Exp 1a
Exp 1b
Exp 2a
Exp 2b
Exp 3a
Exp 3b
Exp 4a
Exp 4b
Exp 5a
Exp 5b
Exp 6a
Exp 6b
Exp 7a
Exp 7b
Exp 8a
Exp 8b
Exp 9a
Exp 9b
Gráfico 3. CSG para las mezclas con base vegetal Interesterificada, en función de la temperatura.
3.4.3. Análisis estadístico de las respuestas del diseño 32
En este punto se presenta un resumen de los resultados de los
análisis de varianza (ANOVA) aplicados a las respuestas, con el objetivo
de conocer el efecto de las variables independientes.
En el Anexo 1 se presentan las tablas de ANOVA individuales,
con los efectos no significativos eliminados, de manera de obtener el
coeficiente de correlación (r2) que corresponde a cada ajuste.
Page 59
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
44
Tabla 10. Resumen de valores P y F del análisis ANOVA aplicado a la respuesta del diseño en base pescado. Pto.Fusión CSG 10°C CSG 21,1°C CSG 26,7°C CSG 33,3°C CSG 37,8°C
Efectos F P F P F P F P F P F P
A % AFHP 2256,5 0,0000 2197,2 0,0000 3843,6 0,0000 2423,7 0,0000 1588,7 0,0000 1760,9 0,0000 B tiempo 167,4 0,0000 13,2 0,0039 25,8 0,0004 26,0 0,0003 34,5 0,0001 47,5 0,0000
AA 0,0 0,8673 0,2 0,6964 7,9 0,0170 24,9 0,0004 24,2 0,0005 37,2 0,0001 AB 29,6 0,0002 1,4 0,2567 1,9 0,1913 1,6 0,2337 0,1 0,7649 1,2 0,3066 BB 0,3 0,6180 0,5 0,5016 0,0 0,8884 0,0 0,8830 0,1 0,7512 0,3 0,5915 r2 0,9955 0,9951 0.9972 0,9956 0,9934 0,9941
Tabla 11. Resumen de valores P y F del análisis ANOVA aplicado a la respuesta del diseño en base vegetal. Pto.Fusión CSG 10°C CSG 21,1°C CSG 26,7°C CSG 33,3°C CSG 37,8°C
Efectos F P F P F P F P F P F P
A % AFHV 1667,7 0,0000 36658,3 0,0000 6111,5 0,0000 19225,7 0,0000 19525,4 0,0000 15389,7 0,0000
B tiempo 50,8 0,0000 67,0 0,0000 22,8 0,0006 28,7 0,0002 124,3 0,0000 142,7 0,0000
AA 185,5 0,0000 1,2 0,3017 16,2 0,0020 1,8 0,2018 0,0 0,9139 4,2 0,0655
AB 19,4 0,0011 73,2 0,0000 3,9 0,0729 65,0 0,0000 15,2 0,0025 2,2 0,1647
BB 0,0 0,9730 10,0 0,0091 0,1 0,2893 0,2 0,6842 0,0 0,8797 0,0 0,9064
r2 0,9943 0,9997 0,9982 0,9994 0,9994 0,9993
En estas tablas 10 y 11, los valores de P<0,05 y F>4 indican efecto
significativo de las variables sobre las respuestas.
De acuerdo a este análisis se tiene que ambas variables, % aceite
“full” hidrogenado y tiempo de reacción, ejercen un efecto significativo
sobre los resultados. De esta forma es como llegan a establecerse los
modelos matemáticos correspondientes a cada respuesta, considerando
aquellas variables o combinación de variables que tengan un efecto
significativo en las respuestas del diseño.
Page 60
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
45
3.5. Establecimiento de los modelos matemáticos
A continuación se presentan los modelos matemáticos y los
coeficientes de correlación (r2) que han sido calculados para cada una de
las ecuaciones mostradas, donde A1=%AFHP, A2=%AFHV y B=Tiempo
de reacción (h). La entrada de datos debe realizarse en forma absoluta, es
decir, con el valor numérico correspondiente válido para un rango de
trabajo entre 20 y 80% de AFHP o AFHV, un tiempo de 1 a 5 horas de
reacción, y en condiciones de trabajo de 70ºC y 4% de catalizador
enzimático.
Modelo para la Mezcla Optimizada Base Pescado (MOBP).
P.F = 45,7465 + 0,1055�(A1) - 1,0146�(B) + 0,0094�(A1)�(B) r2 = 0,9954
CSG 10ºC = 5,2153 + 0,9197�(A1) - 1,0708�(B) r2 = 0,9941
CSG 21,1ºC = 4,6287 + 0,7157�(A1) - 1,1917�(B) + 0,00254�(A1)2 r2 = 0,9967
CSG 26,7ºC = 8,9722 + 0,3908�(A1) - 1,4667�(B) + 0,00553�(A1)2 r2 = 0,9949
CSG 33,3ºC = 9,1236 + 0,2542�(A1) - 1,9542�(B) + 0,00631�(A1)2 r2 = 0,9932
CSG 37,8ºC = 8,3259 + 0,1374�(A1) - 2,1�(B) + 0,00715�(A1)2 r2 = 0,9933
Page 61
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
46
Modelo para la Mezcla Optimizada Base Vegetal (MOBV).
P.F = 47,1366 + 0,5168�(A2) - 1,1208�(B) - 0,00365�(A2)2 +0,0125�(A2)�(B) r2 = 0,9943
CSG 10ºC = 4,1854 + 0,9363�(A2) - 3,3625�(B) + 0,0279�(A2)�(B) + 0,2188�(B)2 r2 = 0,9997
CSG 21,1ºC = -2,6028 + 1,2744�(A2) - 1,725�(B) + 0,0158�(A2)�(B) - 0,00303�(A2)2 r2 = 0,9982
CSG 26,7ºC = 2,3236 + 0,9510�(A2) - 2,5125�(B) + 0,0379�(A2)�(B) r2 = 0,9993
CSG 33,3ºC = -0,6271 + 0,9612�(A2) - 2,0771�(B) + 0,0173�(A2)�(B) r2 = 0,9994
CSG 37,8ºC = -3,1333 + 0,8978�(A2) - 1,4333�(B) + 0,000944�(A2)2 r2 = 0,9992
En las tablas 12 y 13 que se presentan a continuación, se muestra
la comparación de datos experimentales y calculados a partir del modelo
para la base pescado y vegetal respectivamente.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
47
Tabla 12. Comparación entre las respuestas del modelo matemático y las respuestas experimentales para la base pescado.
RESPUESTAS VARIABLES PF (ºC) CSG 10ºC CSG 21,1ºC CSG 26,7ºC CSG 33,3ºC CSG 37,8ºC
Exp. AFHP (%)
Tiempo (h) Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod.
1a 20 1 47,9 22,1 19,0 17,3 13,6 10,1 1b 20 1 47,1
47,0 22,9
22,5 19,3
18,8 17,6
17,5 13,2
14,8 10,1
11,8
2a 50 1 51,8 52,2 46,2 42,6 37,6 32,8 2b 50 1 50,7
50,5 52,8
50,1 46,9
45,6 43,4
40,9 38,8
35,7 33,9
31,0
3a 80 1 54,5 77,4 76,8 73,6 68,4 64,4 3b 80 1 53,6
53,9 74,8
77,7 74,1
77,0 70,9
74,2 65,7
67,9 61,4
63,0
4a 20 3 45,5 21,6 16,7 14,6 10,4 7,0 4b 20 3 45,0
45,8 19,5
20,4 15,6
16,4 14,5
14,6 11,2
10,9 8,0
7,6
5a 50 3 49,3 45,5 42,9 36,6 29,8 24,6 5b 50 3 49,5
49,4 47,6
48,0 43,8
43,2 38,7
37,9 32,7
31,8 27,4
26,8
6a 80 3 53,5 76,9 76,6 72,7 65,2 60,0 6b 80 3 53,2
53,4 74,0
75,6 73,1
74,6 69,8
71,2 62,3
64,0 57,0
58,8
7a 20 5 43,9 19,5 14,6 11,7 7,9 4,4 7b 20 5 43,9
43,7 17,6
18,3 13,1
14,0 11,9
11,7 8,9
7,0 6,2
3,4
8a 50 5 47,7 43,4 38,3 31,8 23,8 19,5 8b 50 5 48,4
48,3 44,8
45,9 41,0
40,8 34,5
35,0 27,7
27,9 22,4
22,6
9a 80 5 53,2 77,4 75,6 71,9 62,6 56,4 9b 80 5 52,8
52,9 73,8
73,4 71,1
72,2 68,4
68,4 59,5
60,7 53,4
54,6
Page 63
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
48
Tabla 13. Comparación entre las respuestas del modelo matemático y las respuestas experimentales para la base vegetal.
RESPUESTAS VARIABLES PF (ºC) CSG 10ºC CSG 21,1ºC CSG 26,7ºC CSG 33,3ºC CSG 37,8ºC
Exp. AFHV (%)
Tiempo (h) Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod.
1a 20 1 55,0 20,9 21,2 19,6 17,2 14,2 1b 20 1 58,2
55,1 22,2
20,3 21,7
19,3 20,7
19,6 18,4
16,9 15,8
13,5
2a 50 1 62,7 46,4 49,6 47,4 43,2 38,9 2b 50 1 63,1
63,4 49,2
49,3 50,8
52,6 49,2
49,3 45,4
46,2 42,3
43,3
3a 80 1 65,2 78,1 80,3 79,0 75,8 72,8 3b 80 1 65,1
65,0 77,5
78,2 79,7
80,4 78,5
78,9 75,9
75,6 73,0
73,0
4a 20 3 53,0 16,4 16,6 15,3 12,9 9,9 4b 20 3 55,5
53,4 15,5
16,5 18,3
17,3 16,5
16,1 14,0
13,4 11,7
10,6
5a 50 3 60,9 43,6 48,3 42,9 37,1 31,7 5b 50 3 62,2
62,4 47,3
47,1 50,8
50,6 48,6
48,0 43,8
43,8 40,0
40,4
6a 80 3 64,8 78,3 77,6 80,3 73,6 69,3 6b 80 3 64,8
64,8 77,8
77,7 80,4
78,4 79,6
80,0 74,9
74,2 71,6
70,2
7a 20 5 50,5 14,3 12,4 10,7 8,3 6,1 7b 20 5 52,4
51,7 14,7
14,4 15,5
15,3 13,9
12,6 11,0
9,9 9,1
7,8
8a 50 5 59,1 42,2 47,5 40,1 33,4 28,3 8b 50 5 61,8
61,4 46,8
46,6 50,3
48,6 47,2
46,8 41,9
41,4 37,0
37,5
9a 80 5 64,4 79,6 76,5 81,2 71,7 66,5 9b 80 5 64,3
64,5 77,6
78,9 77,1
76,4 80,1
81,0 73,3
72,8 69,4
67,3
3.6. Condiciones de obtención del producto óptimo
En la Tabla 14, se resumen las condiciones de reacción que debe
cumplir las combinaciones de AFHP/AVL y AFHV/AVL respectivamente
para lograr el producto óptimo para aplicaciones industriales en base a
resultados obtenidos a partir de la metodología de superficie de respuesta
(ANEXO 2).
Page 64
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
49
Tabla 14. Condiciones experimentales para el producto óptimo en base pescado y base vegetal.
% AFHP Tiempo (h) % Enzima Temperatura (ºC)
43,9 5 4 70
% AFHV Tiempo (h) % Enzima Temperatura (ºC)
36,8 5 4 70
3.7. Caracterización del producto óptimo.
3.7.1. Análisis del producto óptimo con y sin interesterificación.
3.7.1.1. Análisis comparativo del producto óptimo con respecto al
estándar establecido.
En la Tabla 15 se muestra el CSG y el PF a las diferentes
temperaturas de medición para las mezclas con base pescado sin
interesterificación (MOBP) y con interesterificación (MOBPI), así como
también para las mezclas con base vegetal sin interesterificación
(MOBV) y con interesterificación (MOBVI).
Como se puede apreciar, en todos los casos el PF excede la
normativa del Reglamento Sanitario de los Alimentos, que se establece
en 45 ºC para mantecas modificadas, pero queda abierta la posibilidad de
ser utilizada como materia prima para su utilización en otros alimentos.
Page 65
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
50
Tabla 15. CSG y PF para la mezcla optimizada en base pescado y base vegetal.
CSG (%)
T (ºC) MOBP MOBPI MOBV MOBVI
10 46,2 38,2 39,1 29,9
21,1 42,9 34,1 39,2 32,5
26,7 41,1 27,2 37,6 26,3
33,3 37,7 21,4 34,5 22,6
37,8 33,4 16,5 31,7 18
PF (ºC) 51,3 47,5 61,0 56,9
En los gráficos 4 y 5 se presentan las tendencias en el CSG para las
mezclas optimizadas comparadas con el estándar asumido. El estándar se
presenta en el gráfico como “Optimo”, con el fin de tener una visión de
lo que se tiene y de lo que se busca.
01020304050
60708090
100
10 15 20 25 30 35 40
Temperatura (°C)
CSG
(%)
MOBP PF=51,3°C MOBPI PF=47,5°C Estándar PF=36°C
Gráfico 4. CSG para las mezclas optimizadas con base pescado en función de la temperatura.
Page 66
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
51
0102030405060708090
100
10 15 20 25 30 35 40
Temperatura (°C)
CSG
(%)
MOBV PF=61°C MOBVI PF=56,9°C Estándar PF=36°C
Gráfico 5. CSG para las mezclas optimizadas con base vegetal en función de la temperatura.
Como se puede observar, en ambos casos la tendencia de la curva
de CSG es “plana” en comparación con la curva estándar y las mezclas
con interesterificación se comportan de forma “paralela” a las mezclas
sin interesterificar, es decir, se comportan de forma similar a sus materias
primas. El resultado del análisis de CSG por RMN para las mezclas
interesterificadas muestra que a mayores temperaturas de medición, se
produce una marcada disminución del porcentaje de sólidos con respecto
a las mezclas sin reacción. Una tendencia más inclinada reportó
Rodríguez et al., (2001) para la interesterificación química de una mezcla
sebo/aceite de girasol, debido a que el sebo es una materia grasa
naturalmente saturada.
En ambos casos (base pescado y base vegetal) el contenido de
sólidos grasos a las temperaturas de 21,1 y 26,7 ºC para las mezclas
interesterificadas, se encuentra muy cercano a lo establecido como
Page 67
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
52
estándar, encontrándose cerca del rango de 33-38 % y 23-26 % para las
temperaturas antes mencionadas. En este sentido, Zhang et al., (2001) en
mezcla de estearina de palma y aceite de coco, encontraron curvas
excepcionales que muestran un rango de sólidos desde un 60,3 % a 10 ºC,
hasta menos de 0,5 % a 40 ºC. Gamboa y Gioielli (2003) trabajaron con
aceite de pescado y grasa de palmiste, indicando que un contenido de
sólidos no superior a 32 % a la temperatura de 10 ºC es imprescindible
para garantizar un comportamiento ideal de esparcimiento a la
temperatura de refrigeración.
Con respecto al cambio en el PF, se logró una disminución
cercana a 4 grados luego de la reacción enzimática tanto para MOBP
como para MOBV. Los resultados se alejan bastante del estándar
estimado de 36 ºC, además de no cumplir con los valores establecidos por
el Reglamento Sanitario de los Alimentos (2000) para una grasa
comercial.
3.7.1.2. Análisis de las características texturales por medio del
ensayo de compresión a los productos optimizados.
Mediante este análisis se pretende estudiar las propiedades de
textura para los productos óptimos de las bases pescado y vegetal, con y
sin reacción de interesterificación, mediante curvas de compresión a
velocidad constante. De estas curvas es posible obtener información tal
como fuerza de ruptura, cohesividad y elasticidad (Rodríguez et al.,
2001).
Page 68
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
53
Los ensayos de compresión fueron realizados a temperatura
ambiente de aproximadamente 25ºC con un acondicionamiento o período
de cristalización de 24 horas.
Los gráficos 6 y 7 presentan las curvas de compresión de las
mezclas óptimas con y sin interesterificación. La pendiente inicial que
presentan las curvas, muestran la deformación elástica no recuperable de
las grasas. La zona redondeada que sigue a la pendiente inicial representa
el comportamiento viscoso de las muestras (de Man et al., 1991).
La fuerza de ruptura para MOBP fue de 4,1 N aproximadamente,
mientras que para MOBPI fue de 3,5 N. Por otro lado, para la mezcla
óptima con base vegetal la fuerza de ruptura fue de 3,9 N para MOBV
aproximadamente, mientras que MOBVI no mostró fuerza de ruptura. Es
posible apreciar de su gráfica el cambio en los parámetros texturales de
las bases grasas, pasando de un estado “quebradizo” a un estado más
plástico, requerido al momento del uso de emulsionantes.
Page 69
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
54
0
4
8
12
16
20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Deformación (mm)
Fuer
za (N
)
MOBAI MOBA
Gráfico 6. Curvas de compresión para la mezcla óptima en base pescado sin interesterificar (MOBP) y con interesterificación (MOBPI).
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Deformación (mm)
Fuer
za (N
)
MOBVI MOBV
Gráfico 7. Curvas de compresión para la mezcla óptima en base vegetal sin interesterificar (MOBV) y con interesterificación (MOBVI).
Page 70
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
55
Tabla 16. Parámetros texturales de las mezclas óptimas en base pescado y base vegetal.
Mezcla Fuerza Ruptura (N)
Cohesividad (mm)
Elasticidad (N/mm)
MOBV 3,92 5,09 0,77 MOBVI - - - MOBP 4,11 0,75 5,48 MOBPI 3,51 1,17 2,99
La Tabla 16 muestra los resultados de fuerza de ruptura,
cohesividad y elasticidad para las mezclas óptimas en base vegetal sin
interesterificar (MOBV) y con interesterificación (MOBVI), así como
también para las mezclas óptimas en base pescado sin interesterificar
(MOBP) y con interesterificación (MOBPI). La cohesividad representa la
deformación a la cual se produce la fuerza de ruptura, mientras que la
elasticidad se ve representada por la pendiente inicial de la curva, antes
de aplicada la fuerza de ruptura.
Se puede observar que en las mezclas con base pescado, la
elasticidad es alta comparada con la mezcla vegetal, esto se podría deber
a la morfología de los cristales en la red cristalina, la cual es menos
definida para las mezclas con base pescado. En la base vegetal en
cambio, se ve una elasticidad baja para la mezcla sin interesterificar y en
la mezcla interesterificada no es posible apreciar este parámetro,
comportándose como una mezcla viscosa por no presentar fuerza de
ruptura ni deformación.
Page 71
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
56
3.7.1.3. Análisis de microscopía de luz polarizada
Por medio de este análisis se realizaron microfotografías a la
estructura cristalina de las materias grasas correspondientes a materias
primas y productos optimizados con y sin reacción de interesterificación.
La preparación de las muestras se lleva a cabo colocando una gota
de la materia grasa sobre un porta objetos, calentando hasta fusión total y
luego superponiendo un cubre objeto sobre la superficie presionando
firmemente.
La amplificación visual fue de 10X y 40X mientras que el tiempo
de exposición fue de 20-40 segundos a una temperatura aproximada de
5ºC (Rousseau et al., 1996b).
En esta sección se discuten las fotografías realizadas con un
aumento de 10X. Las fotografías con un aumento de 40X se presentan en
el ANEXO 3, donde es posible apreciar de mejor forma la estructura de
los cristales.
Las fotografías de las materias primas muestran características muy
distintas en cuanto al tamaño, forma y distribución de los cristales. La
fotografía A de la figura 6 muestra la estructura cristalina del AFHP con
tamaño de cristal promedio de 10 �m, donde no se observa una forma
definida pero su distribución es bastante homogénea presentando cristales
muy pequeños pero sin distribución espacial definida. Por el contrario la
fotografía D de la figura 7 muestra la estructura cristalina del AFHV con
tamaño promedio de 25 �m, en la cual se observa claramente una forma
estrellada (predominante en los cristales de mayor tamaño) y una
distribución más tendiente a la formación de red de grupos.
Page 72
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
57
Las fotografías B y C de la figura 6 muestran las mezclas
optimizadas MOBP y MOBPI. En ellas se puede observar un cambio
notable en la estructura cristalina así como también en su distribución
espacial, ocasionado por el reordenamiento de los TAG. También es
posible apreciar un aumento en el tamaño de los cristales después de la
interesterificación (8 �m aprox. para MOBP y 20 �m para MOBPI) y la
presencia de “lagunas” o zonas de grasa líquida, lo que comprueba el
efecto de la reacción sobre los parámetros de PF y CSG. La red cristalina
se presenta muy bien estructurada por lo que se puede deducir buenas
propiedades de plasticidad para esta mezcla. Rodríguez et al. (2001)
luego de la interesterificación de aceite de maravilla, aceites vegetal y
animal parcialmente hidrogenados con sebo, concluyen que un tamaño
pequeño de los cristales eran esenciales para una mejor consistencia y
aceptabilidad del producto final.
En las fotografías E y F de la figura 7 se muestran las mezclas
optimizadas MOBV y MOBVI. En estos casos no se observa un cambio
notable en la estructura o forma cristalina, pero si en su distribución
espacial, también ocasionado por el reordenamiento de los TAG. Se
puede apreciar una disminución fuerte en el tamaño de los cristales (20
�m para MOBV y 10 �m para MOBVI) y la formación de “lagunas” o
zonas de grasa líquida se presenta igual que en el caso anterior, lo que
comprueba el efecto de la reacción sobre los parámetros de PF y CSG.
El cambio físico observable mediante los parámetros de PF y CSG
fue descrito por Rousseau et al. (1996b) como el reordenamiento de los
Page 73
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
58
cristales por efecto de las fuerzas de Van der Waals, responsables de la
formación de la red cristalina.
Base Pescado
AFHP
MOBP
MOBPI
Figura 6. Microfotografías de Luz Polarizada para AFHP, MOBP y MOBPI, con un aumento de 10X. La barra blanca representa 50 �m.
A
B C
Page 74
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
59
Base Vegetal
AFHV
MOBV
MOBVI
Figura 7. Microfotografías de Luz Polarizada para AFHV, MOBV y MOBVI, con un aumento de 10X. La barra blanca representa 50 �m.
E
D
F
Page 75
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
60
3.7.1.4. Análisis del contenido de AGT en materias primas y los
productos optimizados
Tabla 17. Resultados análisis de contenido de AGT por espectroscopía IR y cromatografía GLC.
AGT IR (%) AGT GLC (%) MATERIA PRIMA
x ± D.S. Contenido AVL 2,96 0,62 1,61 AFHV 4,28 0,21 0,58 AFHP 6,46 0,19 1,09
AGT IR (%) AGT GLC (%) MEZCLA x ± D.S. Contenido
MOBV 0 0 0,82 MOBVI 0 0 1,05 MOBP Trazas - 1,12 MOBPI Trazas - 1,05
Trazas: menor a 0,5 %.
En la tabla 17 se presenta el contenido de AGT para las materias
primas utilizadas y para las mezclas optimizadas antes y después de la
reacción de interesterificación. Esta determinación fue realizada tanto por
espectroscopía IR (AOCS Cd 14-61, 1993) como por cromatografía GLC
(AOCS Ce 1c-89).
El principio de la espectroscopía IR radica en que los dobles
enlaces trans, muestran una absorción, en forma aislada, a los 10,3 �m
(965 cm-1) aproximadamente y por consiguiente el contenido de AGT se
Page 76
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
61
mide por medio de la intensidad de la absorción comparada con un
estándar 100% trans (Trielaidina).
Los resultados encontrados por espectroscopía IR, muestran un
contenido de AGT, para las materias primas, mayor que la determinación
por GLC (ANEXO 4). En este sentido Adam et al. (2000) recomiendan la
espectroscopía IR para contenidos de AGT mayores al 5%, por lo que la
técnica GLC arrojaría mejores resultados para la determinación de AGT
en estas materias primas.
Para los resultados encontrados en las mezclas optimizadas, se
observa el cumplimiento del objetivo de producir materias grasas con
bajo contenido de AGT. Mediante los análisis respectivos es posible
observar valores muy cercanos a cero para la mezcla con base vegetal, y
cercano al 1% para la mezcla con base pescado. Este mayor contenido de
AGT se explica por el aporte del aceite “full” hidrogenado de pescado
(45% en la mezcla).
3.7.1.5. Análisis del perfil de TAG.
En la Tabla 18 es posible apreciar el perfil de triglicéridos tanto
para las materias primas como para las mezclas optimizadas en base
vegetal. No fue posible realizar esta determinación en mezclas con base
pescado debido a la diversidad de TAG que se pueden encontrar luego de
la reacción de interesterificación.
Page 77
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
62
Tabla 18. Perfil de TAG, determinado por HPLC para AVL. AFHV, y mezclas optimizadas con base vegetal con y sin interesterificación.
TAG AVL (%) AFHV (%) MOBV (%) MOBVI (%) LnLnLn 3,7 nd 2,7 0,4 LnLnL 0,7 nd 0,2 0,5 LnLL 0,7 nd nd 1,6 LnLnO 0,3 nd nd 0,3 LLL 23,8 nd 19,8 10,8 LnOL 0,8 nd 0,9 0,6 PLLn 1,5 nd 1,4 0,8 OLL 25,0 nd 21,2 12,5 PLL 11,3 nd 8,4 5,7 MOL 10,0 nd 8,7 4,9 OOL 11,8 nd 11,5 17,7 POL 1,5 nd 0,8 0,9 StPL 2,5 1,2 2,2 1,2 OOO 5,0 nd 4,2 10,8 StOL 1,6 nd 1,0 6,9 PPP Nd 3,9 1,2 0,8 StPM Nd 3,9 0,8 nd POSt Nd 3,7 nd 1,8 PPSt Nd 4,9 1,3 13,5 StOSt Nd 1,6 nd 1,7 PStSt Nd 25,2 5,2 3,5 StStAr Nd 1,9 nd nd StStSt Nd 53,8 8,7 3,1 Total 100,00 100,00 100,00 100,00
nd: no detectado; Ln: ac. Linolénico; L: ac. Linoleico; O: ac. Oleico; St: ac. Esteárico; P: ac. Palmítico; M: ac. Mirístico; Ar: ac. Araquídico.
En la Tabla 18, se puede observar el nivel de interesterificación
en la mezcla antes y después de la reacción. Los cambios más
importantes están representados por PPSt, LLL, OLL y OOL. En general
los ácidos grasos que presentan un intercambio más alto son el ácido
esteárico (C18:0, St), el ácido oleico (C18:1, O) y el ácido palmítico
(C16:0, P).
Page 78
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
63
Para el caso de StStSt, se esperaba un valor más alto en su
concentración, debido a la alta presencia de este en AFHV. Es probable
que esto suceda por problemas de solubilidad de la triestearina, o bien,
que la triestearina quede retenida por efecto de la fase móvil utilizada,
bajando el rendimiento de ella en su determinación.
Page 79
CONCLUSIONES
64
IV. CONCLUSIONES
• A partir de la optimización mediante la Metodología de Superficie de
Respuesta para la reacción de interesterificación de las mezclas de
AVL/AFHP y AVL/AFHV, en diferentes proporciones y tiempos de
reacción, se estableció un 43,9% de concentración para la mezcla en
base pescado y 36,8% para la mezcla en base vegetal, con 5 horas de
reacción a 70°C y 300 rpm de agitación para ambos casos.
• Se logró el objetivo de desarrollar bases grasas con bajo contenido de
AGT. La determinación de AGT mediante los métodos de
espectroscopía IR y cromatografía GLC para las mezclas
optimizadas, muestran niveles cercanos a un 1% por GLC y no
detectado por IR.
• Las curvas de CSG v/s Temperatura para las mezclas AVL/AFHP y
AVL/AFHV presentaron un comportamiento paralelo, antes y
después de la reacción de interesterificación, y una tendencia plana
en comparación con el estándar establecido. La mezcla AVL/AFHP
fue mas blanda con respecto a la mezcla AVL/AFHV.
• Se cumplió el objetivo de obtener modelos matemáticos para las
mezclas AVL/AFHP y AVL/AFHV, los cuales correlacionaron las
variables independientes (% de aceite “full” hidrogenado y tiempo
de reacción) sobre las dependientes (PF y CSG), en las condiciones
experimentales utilizadas.
Page 80
CONCLUSIONES
65
• Con el análisis del perfil de TAG, Microscopía de luz polarizada y
análisis de características texturales, fue posible apreciar la
efectividad de la reacción de interesterificación.
Page 81
BIBLIOGRAFÍA
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