Universität Hohenheim Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen Prof. Dr. Andreas Schaller Charakterisierung der Subtilase LeSBT2 aus Lycopersicon esculentum Diplomarbeit von Katrin Ullrich betreut von Dr. Anna Cedzich Hohenheim, Februar 2006
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Universität Hohenheim · 2010. 1. 7. · Triade im aktiven Zentrum (Siezen und Leunissen, 1997). Alle Serinproteasen besitzen, was das aktive Zentrum betrifft, den gleichen Aufbau.
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Universität Hohenheim Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Prof. Dr. Andreas Schaller
Charakterisierung der Subtilase LeSBT2
aus Lycopersicon esculentum
Diplomarbeit von Katrin Ullrich betreut von Dr. Anna Cedzich
Proteasen werden aufgrund ihrer aktiven Gruppen der katalytischen Zentren in fünf
Hauptklassen unterteilt: Serin-, Cystein-, Aspartat-, Threonin-, und Metalloproteasen.
Serinendo- und -exoproteasen sind gekennzeichnet durch ihre enorm weite Verbreitung und
ihre unterschiedliche Funktionen (Siezen und Leunissen, 1997). Man findet sie sowohl in
prokaryontischen als auch in eukaryontischen Organismen wie zum Beispiel Pflanzen,
Nematoden, Fischen und Säugetieren. Die verschiedenen Familien der Serinproteasen sind
unterteilt in 6 Gruppen, wobei die (Chymo-)Trypsin-ähnlichen und die Subtilisin-ähnlichen
die größten Gruppen darstellen.
Abb. 1.1: Darstellung der sekundären und tertiären Struktur des Subtilisins (PDB code 2SNI) mit der für die Serinproteasen typischen katalytischen Triade im aktiven Zentrum (Siezen und Leunissen, 1997).
Alle Serinproteasen besitzen, was das aktive Zentrum betrifft, den gleichen Aufbau.
Entscheidender Baustein der katalytischen Struktur ist die Ser-His-Asp-Triade, auch
katalytische Triade genannt (Abb.1.1). Sie wurde als erstes in Chymotrypsin entdeckt. Später
wurde eine identische Struktur in Trypsin (Huber et al., 1974 und Stroud et al., 1971) und
eine ebenfalls identische Struktur in der Elastase entdeckt (Watson et al., 1970), beides
Enzyme, die eng mit dem Chymotrypsin verwandt sind. Bedeutender war deshalb die
Entdeckung einer wiederum gleich aufgebauten katalytischen Triade in der Protease
Subtilisin, einem Enzym, dessen Struktur, bis auf das aktive Zentrum, vollständig von der des
1. Einleitung
2
Chymotrypsins abweicht (Kraut et al., 1977; Drenth et al., 1971). Diese Entdeckung zeigt,
dass es sich beim aktiven Zentrum der Serinproteasen um ein Beispiel konvergenter Evolution
handelt (Dodson und Wlodawer, 1998).
Nummeriert werden die drei Aminosäuren der katalytischen Triade nach dem Chymotrypsin,
da der Mechanismus hier erstmals beschrieben wurde (Blow, 1967). In der Tertiärstruktur
kommen sich His57, Asp102 und Ser195 bis auf Wasserstoffbindungsabstände nahe und
bilden ein sogenanntes Ladungsaustauschsystem (charge-relay-system). Das Serin wird stark
nukleophil, da das Proton der Ser195 OH-Gruppe vorübergehend von His57 und Asp102
gebunden wird. Es folgt der nukleophile Angriff am Carbonylatom des Substrates und eine
Protonenübertragung auf das N-Atom der Peptidbindung führt schließlich zur Spaltung der
Peptidbindung (Abb. 1.2, Dodson und Wlodawer, 1998).
Abb. 1.2: Nukleophiler Angriff der katalytischen Triade auf die Peptidbindung. Der Punkt stellt das nukleophile Atom dar (Dodson und Wlodawer, 1998).
1. Einleitung
3
1.2 Subtilasen
Die Subtilisin-ähnlichen Serinproteasen, kurz Subtilasen, stellen die zweitgrößte Gruppe der
Serinproteasen dar. Über 200 Subtilasen sind momentan bekannt und bei mehr als 170 ist die
komplette Aminosäurenabfolge aufgeklärt (Siezen und Leunissen, 1997). Namensgebend für
Subtilasen ist das bakterielle Enzym Subtilisin Carlsberg aus Bacillus licheniformis.
Subtilasen waren lange nur in Prokaryonten bekannt. Später konnte dann auch in einem
eukaryontischen Organismus, der Hefe, Saccharomyces cerevisiae, eine Subtilase, die Kex2p-
Protease, identifiziert werden (Julius et al., 1984). Das Enzym erkennt spezifisch dibasische
Motive, eine Spezifität, die vorwiegend bei Proprotein Convertasen zu finden ist (Fuller et al.,
1989a; Brenner und Fuller, 1992). Aufgrund hoher Sequenzähnlichkeit mit dem katalytischen
Zentrum der Kex2p-Protease konnte 1989 die erste tierische Subtilase, das Furin, identifiziert
werden (Fuller et al, 1989b). Es folgten die Entdeckungen weiterer Subtilasen, die alle C-
terminal von dibasischen Motiven schneiden und in die Reifung von Peptidhormonen,
Neuropeptiden, Wachstumsfaktoren und Rezeptorproteinen involviert sind (Barr et al., 1991;
Seidah und Chrétien,1999). Sie stellen somit eine Klasse von Proprotein Convertasen (PCs)
dar. Die erste pflanzliche Subtilase Cucumisin wurde aus der Melonenfrucht Cucumis melo
isoliert, enzymatisch charakterisiert und anschließend kloniert (Kaneda und Tominaga, 1975;
Yamagata et al., 1989; Yamagata et al., 1994).
Anhand von Sequenzvergleichen der katalytischen Domänen, können die Subtilasen in sechs
Familien unterteilt werden (Siezen und Leunissen, 1997). Vertreter der Subtilisin-Familie
wurden bisher nur in Mikroorganismen entdeckt. Es handelt sich hierbei hauptsächlich um
Enzyme aus Bacillus, mit Untergruppen, bestehend aus dem echten Subtilisin,
hochalkalischen Proteasen und intrazellulären Proteasen. Enzyme, die der Thermitase-Familie
zugeordnet werden, konnten bisher ebenfalls nur in Mikroorganismen gefunden werden. Die
Proteinase K-Familie umfasst eine große Familie sektretorischer Endopeptidasen, die in
Pilzen, Hefen und gramnegativen Bakterien gefunden wurden. Eine kleine Anzahl
hochspezialisierter Endopeptidasen aus grampositiven Bakterien stellt die Familie der
lantibiotischen Peptidasen dar. Bei den Enzymen der Kexin-Familie handelt es sich
größtenteils um eukaryontische Proprotein Convertasen, die in der Prozessierung von aktiven
Peptidhormonen, Wachstumsfaktoren, viralen Proteinen etc. involviert sind (Siezen und
Leunissen, 1997). Sieben der neun bekannten Subtilasen aus Säugetieren gehören in diese
1. Einleitung
4
Familie (Seidah et al., 1999a; Sedan und Chrétien, 1999), während die verbleibenden zwei,
die Site-1-Protease und das Subtilisin-Kexin-Isozym-1, der Pyrolysin-Familie zugeordent
werden (Sakai et al., 1998; Seidah et al., 1999). Die Pyrolysin-Familie zeichnet sich durch
Heterogenität der verschiedenen Enzymgruppen aus, entstanden durch Insertionen und/oder
C-terminale Erweiterungen im aktiven Zentrum. In dieser Familie findet man alle bisher
identifizierten pflanzlichen Subtilasen (Abb. 1.3; Siezen und Leunissen, 1997).
1993 wurde von Rawlings und Barret ein neues Klassifkationssystem (MEROPS) eingeführt.
Sie gruppierten Peptidasen aufgrund Sequenzähnlichkeiten im aktiven Zentrum in Familien
und Familien mit gemeinsamem evolutionärem Ursprung und ähnlicher tertiärer Struktur in
Clans (Rawlings und Barret, 1998). Die Subtilasen werden in diesem Klassifkationssystem
der S8-Familie mit den Subfamilien S8A und S8B zugeordnet. Die meisten Subtilasen aus
Säugetieren gehören der S8B-Subfamilie an, während die pflanzlichen Subtilasen bis auf eine
Ausnahme der S8A-Subfamilie angehören. (Beers et al., 2004)
1. Einleitung
5
FamiliesA
B
E
F
C
D
Proteinase K
Lantibioticpeptidases
Pyrolysin
Kexin
Thermitase
SubtilisinFamilies
A
B
E
F
C
D
Proteinase K
Lantibioticpeptidases
Pyrolysin
Kexin
Thermitase
Subtilisin
Abb. 1.3: Klassifizierung von Subtilasen. Abb. 1.3A: Ein Phylogenetischer Baum der Subtilasenfamilie basierend auf dem Sequenzvergleich der katalytischen Domänen; ein genereller Vergleich (Siezen und Leunissen, 1997). Abb. 1.3B: Detailliertes Dendrogramm der individuellen Familien. Die Abzweigungslänge ist umgekehrt proportional zum Grad der Sequenzähnlichkeit. Dieses Dendrogramm wurde konstruiert nach der Neighborjoining Methode (Saitou und Nei, 1993).
B
A
1. Einleitung
6
1.3 Pflanzliche Subtilasen
Erst nach der Entdeckung tierischer Subtilasen wurde auch in Pflanzen deren Existenz
nachgewiesen. Die Zahl der bekannten Subtilasen in Pflanzen übersteigt die der Säugetiere
bei weitem, aber nur von einigen wenigen wurde bis jetzt die Funktion aufgeklärt. Mithilfe
der Arabidopsis thaliana sdd1-1-Mutante (stomatal density and distribution1-1) wurde
gezeigt, dass die SDD1-Subtilase eine wichtige Rolle in der Steuerung der stomatären Dichte
und Verteilung übernimmt (Abb. 1.4; Berger und Altmann, 2000). In einer weiterführenden
Studie konnte die Expression des SDD1 in den stomatären Vorläuferzellen nachgewiesen
werden. Das SDD1-Protein wird von den Zellen vermutlich in den Apoplasten sezerniert, wo
es an der Prozessierung der für die Dichte und Verteilung der Stomata verantwortlichen
Proteine beteiligt sein könnte (von Groll et al., 2002).
Abb. 1.4: Phänotyp der sdd1-1-Mutante Makroskopische Betrachtung zeigt keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp (A) und der sdd1-1 Mutante (B). In der abaxialen Epidermis der Rosettenblätter sind Unterschiede in der stomatären Dichte zwischen der Wildtyp-Kontrolle (C) und der Mutante (D) erkennbar. Bei einer stärkeren Vergrößerung wird eine veränderte Verteilung der Stomata in der sdd1-1 Pflanze (F) verglichen mit dem Wildtyp (E) deutlich. Wie die Querschnitte zeigen, weist die innere Blattstruktur der Mutante (H) keine Unterschiede zu der des Wildtyps auf (G) (Berger und Altmann, 2000).
1. Einleitung
7
Eine weitere Arabidopsis thaliana Mutante führte zur Aufklärung der Funktion der ALE1-
Subtilase. Die ale1-Mutante (abnormal leaf shape) zeigt eine veränderte Oberflächenstruktur
der Epidermis im Embryo und in jungen Pflanzen, was einen enormen Wasserverlust und
Organfusionen zur Folge hat. Für das ALE1 Gen konnte mithilfe von in situ Hybridisierung
eine spezifische Expression während der Samenentwicklung im Endosperm und im jungen
Embryo nachgewiesen werden. Ein Fehlen des ALE1-Proteins in diesen Stadien führt zu
Defekten in der Kutikula. Dies lässt darauf schließen, dass ALE1 für die korrekte Bildung der
Oberflächenstruktur benötigt wird (Abb. 1.5). Das Endosperm wurde bisher hauptsächlich als
Nahrungsquelle betrachtet, welches das Wachstum und die Entwicklung des Embryos
unterstützt. Das Expressionsmuster der ALE1-Subtilase weist nun jedoch auf eine mögliche
zusätzliche Rolle des Endosperms bei der Bildung der Embryooberfläche hin (Tanaka et al.,
2001).
Anhand der sdd1-1- und ale1-Mutanten wird deutlich, dass zumindest einige Subtilasen
wichtige Funktionen in der Entwicklung der Pflanzen übernehmen.
Abb. 1.5: Phänotyp der ale1-Mutante Die Samen wurden auf Erde ausgesät und mit einem Deckel zugedeckt. Dieser wurde drei Tage nach der Vernalisation (DAV) entfernt. (A) Wildtyp, 7 DAV; (B,C) ale1-1 Pflanzen, 7 DAV; (D) Wildtyp, 12 DAV; (E) ale1-1 Pflanze, 12 DAV, (F) ale1-1 Pflanze, 16 DAV. Die weißen Pfeile zeigen die fusionierten Organe. (G, H) zeigen Querschnitte der Wildtyp- (G) und ale1-1- (H) Kotyledonen. (I) Querschnitt fusionierter Blätter (Tanaka et al., 2001).
1. Einleitung
8
Eine Reihe weiterer Subtilasen liefert zusätzliche Hinweise für die mögliche Beteiligung
dieser Enzyme an Entwicklungsprozessen und physiologischen Abläufen in Pflanzen, wie
zum Beispiel LIM9, ein Enzym aus Lilium longiflorum, das mit der Pollenentwicklung in
Verbindung gebracht werden konnte (Taylor et al., 1997). In Alnus glutinosa wurde die
Subtilase ag12 identifiziert, die während den frühen Stadien der Wurzelknöllchenentwicklung
exprimiert wird und dadurch einen Beitrag zur Symbiose mit Actinomyzeten liefern könnte
(Ribeiro et al., 1995). In Arabidopsis thaliana ist AIR3 möglicherweise in die Entwicklung
von Seitenwurzeln involviert (Neuteboom et al., 1999), XSP1 wird in Tracheen exprimiert
(Beers und Zhao, 2001) und bei SLP1 und SLP2 handelt es sich um stressinduzierte Gene
(Golldack et al., 2003).
1.3.1 Die Subtilasenfamilie in Tomate
Den ersten Hinweis für die Existenz von Subtilisin-ähnlichen Proteasen in Tomate lieferte die
Entdeckung des SBP50-Protein, das spezifisch mit Systemin interagierte und Kreuzreaktionen
mit einem Antiserum gegen eine Proprotein Convertase (PC) aus Drosophila aufwies
(Schaller und Ryan, 1994). Systemin ist ein Peptidhormon, das nach Verwundung aus
Prosystemin freigesetzt wird (McGurl et al., 1992), essentiell für die wundinduzierte
Akkumulation von Proteinaseinhibitoren ist (Orozco-Cardenas et al., 1993) und das dibasiche
Spaltmotiv Arg10-Asp11 aufweist, das typischerweise von Subtilasen der Kexin-Familie
erkannt wird.
In der letzten Zeit wurden weitere Subtilasen in Tomate entdeckt. Inzwischen umfasst die
Subtilasenfamilie in dieser Pflanze 15 Mitglieder, die aufgrund von Sequenzhomologien fünf
verschiedenen Unterfamilien zugeordnet werden können. Lediglich um Einzelgen-
Subfamilien handelt es sich bei tmp, LeSBT1 und LeSBT2. Dahingegen bestehen die
LeSBT3/4- und die P69-Unterfamilie aus fünf bzw. sechs Mitgliedern. Ein Vergleich der
Aminosäuresequenzen zeigt innerhalb einer Unterfamilie Sequenzidentitäten zwischen 79 und
98 %. Zwischen den einzelnen Unterfamilien beträgt die Sequenzidentität zwischen 34 und
54 % (Abb. 1.6; Meichtry et al., 1999).
1. Einleitung
9
Abb. 1.6: Phylogenetischer Baum der Subtilasenfamilie in Tomate. Dargestellt ist die phylogenetische Beziehung der Tomaten Subtilasefamilie, basierend auf dem Vergleich von Aminosäurensequenzen, die von der genomischen DNA und cDNA abgeleitet wurden. Die Zahlen stellen die PAM-Distanzen (accepted point mutations per 100 residues) zwischen den Sequenzen dar (Meichtry et al., 1999).
Mittels Southern Blot-Analyse konnte nachgewiesen werden, dass bis auf tmp keines der
Subtilasengene Introns enthält (Meichtry et al., 1999). Weiterhin wurde anhand der
Sequenzanalysen festgestellt, dass alle Tomaten-Subtilasen als Präproproteine codiert werden.
Am N-terminus befindet sich eine Anhäufung hydrophobischer Aminosäuren, die
typischerweise in Signalpeptiden gefunden werden und die das Protein in das sekretorische
System leiten. Im Anschluss an das Signalpeptid folgt ein Propeptid, das möglicherweise bei
der Faltung des Proteins mitwirkt, oder als intramolekularer Inhibitor des Enzyms fungiert
(Siezen et al., 1995; Ujwal und Masayori, 1996). Innerhalb der katalytischen Domäne
befindet sich eine Protease-assoziierte Domäne, die vermutlich die spezifische Bindung des
Enzyms an sein Substrat erhöht (Abb. 1.7; Mahon und Bateman, 2000).
1. Einleitung
10
SP PDSP PD
Abb. 1.7: Schematische Darstellung der Subtilasen-Struktur. SP = Signalpeptid; PD = Prodomäne; PA = Protein-assoziierte Domäne; die blauen Rauten stellen die drei charakteristischen Aminosäuren der katalytischen Triade dar.
Die Expression der Tomaten-Subtilasen in verschiedenen Organen wurde mittels Northern
Blot-Analyse ermittelt Die Expression von tmp konnte in keinen Organen nachgewiesen
werden, was nicht weiter verwunderlich ist, da es sich hierbei um ein nahe verwandtes Enzym
von LIM9 aus der Lilie handelt, das nur in bestimmten Stadien der Pollenentwicklung
exprimiert wird. LeSBT3 ist in allen Geweben detektierbar. Die Subtilasen LeSBT1, LeSBT2
und LeSBT4 hingegen zeigen ein gewebespezifisches Expressionsmuster (Abb.1.8; Meichtry
et al., 1999).
Abb. 1.8: Organspezifische Expression der LeSBT-Subtilasen. Dargestellt ist ein Northern Blot der Expression von Subtilasen LeSBT1-3, LeSBT4A, P69 und tmp in unterschiedlichen Organen der Tomate (Meichtry et al., 1999).
1. Einleitung
11
Die P69-Unterfamilie wurde bis jetzt am besten charakterisiert. Bei ihren sechs Mitgliedern
handelt es sich um ca. 69 kDa große Proteine, die im extrazellulären Raum akkumulieren
(Tornero et al., 1996 und 1997). Detaillierte Analyse der einzelnen Gene ergab, dass ihre
Expression durch Umwelteinflüsse, entwicklungs- oder gewebespezifisch reguliert wird
(Jordá et al., 1999). Entwicklungs- und gewebespezifische Expressionsmuster wurden bei
P69A und P69D beobachtet, genauso wie auch bei P69E und P69F. P69A wird konstitutiv in
allen überirdischen vegetativen Teilen der Pflanze außer den Blüten exprimiert, dahingegen
tritt P69D in den Blüten und in jungen, sich im Wachstum befindenden Blättern auf (Jordá et
al., 1999). P69E konnte während allen Entwicklungsstadien in der Wurzel und P69F in den
Hydathoden detektiert werden. Aufgrund ihrer Lokalisation wird vermutet, dass sie eine Rolle
bei der frühen Abwehr von Pathogenen übernehmen (Jordá et al., 2000). Im Gegensatz dazu
werden P69B und P69C in keinem Stadium der Pflanzenentwicklung konstitutiv exprimiert,
sondern werden durch Infektion mit Pseudomonas syringae oder Behandlung mit Salicylsäure
induziert. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass auch diese beiden Enzyme eventuell in die
Pathogenabwehr involviert sind (Jordá et al., 2000).
Die biochemische Charakterisierung der LeSBT1-Subtilase ergab weitere Aufschlüsse über
die LeSBT-Unterfamilien. Die Untersuchungen zeigten, dass drei N-terminale
Prozessierungsschritte zur vollständigen Reifung der LeSBT1 Subtilase notwendig sind.
Zuerst kommt es beim Eintritt in das sekretorische System zur Abspaltung des Signalpeptids,
gefolgt von der Prozessierung der Prodomäne und einer pH-abhängigen Abspaltung der
autoinhibitorischen Domäne. Das pH-Optimum für diese Subtilase liegt im sauren Bereich
zwischen pH 4,0 und pH 5,0. Dies steht im Einklang mit der vermuteten apoplastischen
Lokalisation des Proteins. (Janzik et al., 2000).
1.4 Zielsetzung
Nach der biochemischen und funktionellen Charakterisierung tierischer Subtilasen soll dies
nun auch mit den pflanzlichen Subtilasen erfolgen. 15 Subtilasen wurden bis heute in der
Tomate identifiziert. Sie wurden aufgrund von Sequenzhomologie in fünf Unterfamilien
unterteilt. Für die Mitglieder der P69-Unterfamilie wurde eine entwicklungs- und
gewebespezifische Expression beschrieben und deren mögliche Beteiligung an der
Pathogenabwehr postuliert. Dem tmp konnte anhand der Homologie zu LIM9 eine potentielle
1. Einleitung
12
Funktion in der Pollenentwicklung zugeordnet werden. Dahingegen ist über die Funktion der
Mitglieder der LeSBT1-, LeSBT2- und LeSBT3/4-Unterfamilien wenig bekannt. Mittels
Northern Blot-Analyse konnte eine grobe Übersicht über deren organspezifisches
Expressionsmuster erhalten werden und in einer weiteren Studie wurden die biochemischen
Eigenschaften von LeSBT1 näher untersucht.
Im Rahmen dieser Arbeit soll nun eine Charakterisierung von LeSBT2 erfolgen. Bereits in
einer früheren Studie wurde die Expression von LeSBT2 in Blättern, Kotyledonen und in der
Zellkultur festgestellt (Abb.1.8; Meichtry et al., 1999). In vorliegender Arbeit soll nun eine
detaillierte Expressionsanalyse des LeSBT2 unter Anwendung von LeSBT2-Promotor::GUS
transformierten Pflanzen und RT-PCR-Analyse durchgeführt werden. Ein weiteres Ziel war
die molekulare und phänotypische Charakterisierung bereits transformierter RNAi-Pflanzen.
Die aus diesen Experimenten erhaltenen Ergebnisse sollen zur Aufklärung der Funktion von
LeSBT2 in planta beitragen.
2. Material und Methoden
13
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Verwendete Organismen
2.1.1.1 Pflanzen
Lycopersicon esculentum cv. UC82B ROYAL SLUIS (Holland)
HP-SBT2 Transgene Tomatenlinie; wurde durch
Transformation des Wildtyps (Lycopersicon
esculentum cv. UC82B) mit folgendem Konstrukt
erhalten:
35S-P sbt2-senseRB
PDK-Intron anitsense
ocsT nosP nptII LBnosTsbt2-
SBT2::GUS Transgene Tomatenlinie; wurde durch
Transformation des Wildtyps (Lycopersicon
esculentum cv. UC82B) mit folgendem Konstrukt
erhalten:
sbt2-P uidARB nosT nosP nptII LBnosT
Die Pflanzen wurden von Prof. Dr. A. Schaller zur Verfügung gestellt.
2.1.1.2 Bakterienstämme
Escherichia coli DH5α chemisch kompetente Zellen von Invitrogen mit
folgendem Genotyp:
F-φ80dlacZDM15D(lacZYA-argF) U 169 deo R rec
A1 end A1 pho A hsdR17(rk-mk+) snp E44λ-thi-1gyr
A96 rel A1
2. Material und Methoden
14
2.1.2 Oligonukleotide
Alle verwendeten Primer wurden von Operon hergestellt
Nachweis der Kanamycinkasette
nptII(367)for 5´-ATGATCCATCATGGCTGATGC-3´
nptIIR 5´-AAGAAGGCGATAGAAGGCGAT-3´
Nachweis des SBT2-RNAi-Fragments in sense- und antisense-Orientierung
pHann_F1 5´-AAGCAAGTGGATTGATGTGAC-3´
sbt2_2 5´-GGGAAGCTTGGTACCATGGTAGTACTGATTTTACG-3´
pHann_R2 5´-AAGGATCTGAGCTACACATGC-3´
RT-PCR (Actin- bzw. SBT2-spezifisch)
actinfor_RT 5´-TGTGGGAGATGAAGCTCAATCG-3´
actinrev_RT 5´-TCAAACTATCAGTGAGGTCACG-3´
SBT2for_RT 5´-CAGTACTACCATCTACAACAGAGG-3´
sbt2(686)rev-R 5´-TCTTGCTGCAATGATGCTTCTC-3´
Nachweis der Fusion zwischen SBT2-Promotor und uidA
SBT2, Prom-for 5´-GGAAACACATGGACATAGTCC-3´
GUS, rev 5´-CCAACGCTGATCATTCCACAG-3´
Primer für SBT2-Sonde
11ms31 5´-GATGGCTGGGTAGTTC...-3´
Ums51 5´-TCAGTACTACCATCTACAAC-3´
2.1.3 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien
1,4 Dithiothreitol; Roth, Karlsruhe
2-Mercaptoethanol; Serva, Heidelberg
2. Material und Methoden
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2–Propanol; Roth, Karlsruhe
Acrylamid-Rotiphorese; Roth, Karlsruhe
Advantage® 2 Polymerase Mix; Clontech, Palo Alto
Agarose; Life Technologies, Eggenstein
alkalische Phosphatase aus Kälberdarm; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot
Ammoniumsulfat; Merck, Darmstadt
Ampicillin Natriumsalz; Duchefa, Haarlem
Bacto-Trypton; Difco Laboratories, Detroit
Bradford Reagenz (Protein Assay); BioRad, Hercules CA
Brilliant Blau R; Roth, Karlsruhe
Bromphenolblau; Serva, Heidelberg
Calciumchlorid; Fluka AG, St. Louis
Chloroform; Roth, Karlsruhe
CTAB; Roth, Karlsruhe
D(+)-Glucose; Fluka AG, St. Louis
D(+)-Saccharose; Roth, Karlsruhe
Diethylpyrocarbonat; Roth, Karlsruhe
di-Natriumhydrogenphosphat; Merck, Darmstadt
DMSO; Roth, Karlsruhe
DNAse, RNAse frei; Stratagene, Cedar Creek
dNTP-Mix; Bioline, London
EDTA; Fluka AG, St. Louis
Essigsäure; Roth, Karlsruhe
Ethanol; Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid; Roth, Karlsruhe
Formaldehyd, Roth, Karlsruhe
Fotofixierer; Kodak, Paris
Fotoentwickler; Kodak, Paris
GeneRuler™1kb DNA Ladder; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot
Die Auftrennung und Analyse von Proteingemischen erfolgte mittels SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) im diskontinuierlichen Gelsystem nach Laemmli (1970).
Hierzu wurden die Proteinextrakte mit 3x SDS-Puffer versetzt, für 5 min im Wasserbad
gekocht und über ein Polyacrylamidgel in 1x SDS-Laufpuffer bei 100 V aufgetrennt. Als
Größenstandard wurden 4 µl „PageRulerTM Prestained Protein Ladder“ aufgetragen.
2. Material und Methoden
38
2.2.14.2 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen
Die Detektion der Proteinbanden in Gelen erfolgte mithilfe des Farbstoffs Commassie-
Brilliant Blue, der unspezifisch an kationische und hydrophobe Seitenketten des Proteins
bindet. Das Gel wurde dabei ÜN in der Coomassie-Färbelösung inkubiert und dann in
mehreren Schritten mit Entfärbelösung gewaschen.
2.2.14.3 Western Blot
Die in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine wurden nun im
Semi-Dry-Verfahren auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Membran wurde dafür
auf die Größe des Gels zurechtgeschnitten und vor dem Blotten kurz in ddH2O angefeuchtet,
anschließend 10 min in Anodenlösung 1 inkubiert. Das Blotting-Papier wurde ebenfalls auf
die Größe der Membran zurechtgeschnitten und 10 min in den entsprechenden Puffern
inkubiert (6 Lagen in Anodenlösung 2, 3 Lagen in Anodenlösung 1, 6 Lagen in
Kathodenlösung). Die Graphitelektroden wurden ca. 60 min gewässert, anschließend
abgetrocknet und der Blot entsprechend dem Schaubild (Abb.2.2) luftblasenfrei aufgebaut.
Die elektrophoretische Übertragung erfolgte über 90 min bei 100 mA/Gel.
Abb. 2.2: Aufbau der Apparatur beim Western Blot.
2.2.14.4 Immunologischer Nachweis der Proteine
Zur immunologischen Detektion der Proteine wurde die Membran zunächst ÜN in
Blockierungslösung auf dem Schüttler inkubiert, um die freien Protein-Bindestellen
Kathode
6 Lagen Papier in Kathodenlösung
Gel
Membran3 Lagen Papier in Anodenlösung 1
6 Lagen Papier in Anodenlösung 2
Anode
2. Material und Methoden
39
abzusättigen. Am nächsten Tag folgte eine 2-stündige Inkubation mit dem primären
Antikörper (anti-LeSBT2, 1:1000 in Blockierungslösung). Durch die folgenden Waschschritte
(2 x 10 min 1 x TBS pH 7.4 / 0,1 % Tween und 1 x 10 min Blockierlösung) wurden die
unspezifisch gebundenen Antikörper entfernt. Anschließend wurde die Membran für 1 h mit
dem sekundären Antikörper (anti-Rabbit IgG, Peroxidase Conjugate), der 1:10.000 in
Blockierungslösung verdünnt wurde, inkubiert. Danach wurde die Membran 4-mal
gewaschen (3 x 10 min 1 x TBS pH 7.4 / 0,1 % Tween und 1 x 2 min 1 x TBS pH 7.4).
Während des letzten Waschschrittes wurde die ECL-Lösung angesetzt und die Membran
anschließend 1 min darin inkubiert. Danach wurde die Membran blasenfrei in Folie
eingepackt und für ca. 5-10 s gegen einen Röntgenfilm exponiert.
2.2.15 Histologische Methoden
2.2.15.1 Dünnschnitte
Das Pflanzenmaterial wurde für mindestens 1 h in FAA-Lösung fixiert und danach mit
ansteigenden Konzentrationen EtOH (50 %, 70 %, 85 % und 100 %) jeweils 12 h entwässert.
Nach dem Ende der Entwässerung folgte die Präinfiltration mit ansteigenden Konzentrationen
Technovit-Lösung 7100 (25 % Technovit in Ethanol, 50 % Technovit in Ethanol, 75 %
Technovit in Ethanol, 100 % Technovit; Inkubationszeit jeweils 12 h). Hierbei wurde das
EtOH durch ansteigende Konzentrationen der Technovit-Lösung 7100 ersetzt. Nun folgte die
Infiltration mit Technovit 7100 und Härter I. Die Polymerisation mit Härter II erfolgte ÜN.
Mit Techovit 3040 wurde das Polymerisationsprodukt am Histobloc befestigt.
2.2.15.2 Histochemischer GUS-Test
Das zu untersuchende Pflanzenmaterial wurde nach dem Abtrennen in X-Gluc-Färbelösung
überführt und im Vakuum für 3 min infiltriert. Nach diesem Schritt, wurde das Material ÜN
bei 37°C inkubiert und am nächsten Tag mit 70 % EtOH entfärbt.
3. Ergebnisse
40
3 Ergebnisse
3.1 Expression von LeSBT2 in Tomate
Für die Expressionsanalyse von LeSBT2 wurden zum einen LeSBT2-Promotor::GUS
transformierte Pflanzen verwendet, zum andern wurde aus verschiedenen Pflanzenorganen in
unterschiedlichen Entwicklungsstadien RNA isoliert und damit RT-PCR-Analysen mit
LeSBT2-spezifischen Primern durchgeführt.
3.1.1 Überprüfung der LeSBT2-Primer Spezifität
Bevor mit der RT-PCR begonnen werden konnte, musste die Spezifität der zu verwendenden
LeSBT2-Primer überprüft werden. Hierzu wurde eine PCR durchgeführt, bei der diese Primer
auf cDNAs von LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4 getestet wurden. Die Größe des
erwarteten PCR-Produkts betrug 399 bp. Anhand der Abbildung 3.1.1 wird ersichtlich, dass
nur auf der cDNA von LeSBT2 ein PCR-Produkt gebildet wurde. Es wurde somit davon
ausgegangen, dass die Primer für LeSBT2 spezifisch sind und im Folgenden für die RT-PCR
eingesetzt werden können
LeSB
T1Le
SBT2
LeSB
T3Le
SBT4
0-W
ert
750 bp500 bp
250 bp
1000 bp1500 bp2000 bp
Abb. 3.1.1: Spezifität der LeSBT2-Primer Abgebildet ist das Ergebnis der PCR auf cDNA von LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4 mit der für LeSBT2 spezifischen Primerkombination.
3. Ergebnisse
41
3.1.2 Expression von LeSBT2 in verschiedenen Organen der Tomate
RT-PCR-Analyse
Für diesen Versuch wurde eine ca. 6 Wochen alte Pflanze verwendet. Es wurden Proben von
folgenden Organen genommen: Wurzel, unterer und oberer Teil des Stängels, junge,
halbentwickelte und vollentwickelte Blätter, Blattstiele von jungen und vollentwickleten
Blättern und offene Blüten. Die RNA der verschiedenen Organe wurde isoliert und über
Reverse Transkription die cDNA gewonnen, die nun über PCR auf die Präsenz von SBT2
untersucht werden konnte. Um die Menge und Qualität der cDNA zu überprüfen, wurde
zuerst eine Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primern durchgeführt. Wurden nach 25
Zyklen Unterschiede in der Intensität erhaltener Actin-Banden festgestellt, musste die Menge
an eingesetzter cDNA entsprechend korrigiert werden. Außerdem sollte mithilfe dieser
Kontroll-PCR die Kontamination der erhaltenen cDNA mit genomischer DNA überprüft
werden, da das SBT2-Gen im Gegensatz zum Actin-Gen keine Introns enthält und ein PCR-
Produkt basierend auf der Amplifikation genomischer DNA nicht von dem Ergebnis
vervielfältigter cDNA unterschieden werden kann. Die erwarteten Größen der PCR-Produkte
betrugen beim Actin auf der genomischen DNA 614 bp und auf der cDNA 410 bp. Die PCR
mit SBT2-spezifischen Primern wurde immer mit doppelter Menge cDNA und bei 30 Zyklen
durchgeführt. Die berechnete Größe des PCR-Produkts betrug 399 bp. Anhand der Abbildung
3.1.2 wird erkennbar, dass LeSBT2 in allen untersuchten Organen exprimiert wurde.
Allerdings ist die Expression in vollentwickelten Blättern und deren Blattstielen, in der
Wurzel, im unteren Teil des Stängels und in offenen Blüten nur sehr schwach. Eine höhere
Menge an LeSBT2 mRNA wurde in halbentwickelten Blättern, in Blattstielen junger Blätter
und im oberen Teil des Stängels detektiert. Die eindeutig höchste Expression dieses Gens
konnte in jüngsten Blättern nachgewiesen werden. Zusammenfassend konnte somit
festgestellt werden, dass insgesamt in jungen, grünen Organen LeSBT2 am stärksten
exprimiert wird. Die zusätzlich durchgeführte PCR mit Actin-spezifischen Primer zeigt, dass
in allen Reaktionsansätzen die gleiche Menge an cDNA eingesetzt wurde (nach 25 Zyklen)
und diese zudem frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (nach 30 Zyklen).
3. Ergebnisse
42
Actin
Actin
LeSBT2
Wur
zel
Stän
gel u
nten
Stän
gel o
ben
BS ju
nger
Blät
ter
BS vo
llent
w. B
lätte
r
Jüng
ste B
lätte
rVo
llent
wick
elte
Blät
ter
Blüt
en
Halbe
ntwi
ckelt
e Bl
ätte
rgD
NA0-
Wer
t
30Zyklen
25Zyklen
30ZyklenActin
Actin
LeSBT2
Wur
zel
Stän
gel u
nten
Stän
gel o
ben
BS ju
nger
Blät
ter
BS vo
llent
w. B
lätte
r
Jüng
ste B
lätte
rVo
llent
wick
elte
Blät
ter
Blüt
en
Halbe
ntwi
ckelt
e Bl
ätte
rgD
NA0-
Wer
t
30Zyklen
25Zyklen
30Zyklen
750 bp500 bp
250 bp
750 bp
500 bp
250 bp
750 bp500 bp
250 bp
Abb 3.1.2: Expression von LeSBT2 in verschiedenen Organen der Tomate. Dargestellt ist das Ergebnis der RT-PCR mit LeSBT2- und Actin-spezifischen Primern. LeSBT2 wird am stärksten in jungen, grünen Organen der Tomate exprimiert (oben). Die Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primer zeigt, dass gleiche Mengen an cDNA eingesetzt wurden (Mitte) und dass diese frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (unten). BS = Blattstiel
3. Ergebnisse
43
Histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression
Parallel zur Expressionsanalyse mittels RT-PCR wurde die histochemische Lokalisation der
LeSBT2-Promotor::GUS Expression in Blättern, Blattstielen und Stängeln durchgeführt. Für
diesen Versuch wurden von fünf unabhängigen Linien Pflanzen der T2-Generation verwendet.
Dabei konnte eine Aktivität der β-Glucuronidase nur in zwei Linien in den Schließzellen der
Stomata untersuchter Organe beobachtet werden. Die gezeigten Bilder stellen exemplarisch
die Färbung der Stomata in den Blättern dar (Abb. 3.1.3). Zur Bestätigung erhaltener
Resultate wurden weitere Pflanzen transformiert. Die bereits erhaltenen Ergebnisse konnten
in vier weiteren Linien verifiziert werden.
A B Abb. 3.1.3: Histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression in Stomata Abgebildet ist die Unterseite eines Tomatenblatts mit GUS-Aktivität in den Schließzellen der Stomata in der Übersicht (A) und im Detail (B).
In zwei unabhängigen Linien, die eine besonders starke Aktivität der β-Glucuronidase
zeigten, konnte zusätzliche Blaufärbung der Trichome festgestellt werden (Abb. 3.1.4).
3. Ergebnisse
44
A
B
C
Abb. 3.1.4: : Histochemische Lokalisation der LeSBT2 Promotor::GUS Expression in Trichomen Abgebildet sind die Oberseite eines Blattes mit hoher GUS-Aktivität in der Aufsicht (A), die Blaufärbung in den Trichomen (B) und ein gefärbtes Trichom im Detail (C).
Blätter mit starker Aktivität der β-Glucuronidase wurden nach der Technovit-Methode
eingebettet, um Querschnitte anfertigen zu können. Die Blätter sollten so auf das
Vorhandensein der GUS-Aktivität in weiteren Komponenten untersucht werden. Wie die
Abbildung 3.1.5 zeigt, konnte in Querschnitten von Blättern die Blaufärbung in den Stomata
bestätigt werden. In einer Linie konnte zusätzlich im Leitbündelgewebe von der GUS-
Aktivität hervorgerufene Färbung beobachtet werden.
3. Ergebnisse
45
Abb. 3.1.5: Histochemische Lokalisation der SBT2 Promotor::GUS Expression in Blättern Abgebildet sind die Querschnitte zweier Blätter mit GUS-Aktivität in den Stomata (A) und im Leitbündelgewebe (B); S= Stomata, P= Palisadenparenchym, C= Cuticula, oE= obere Epidermis, X= Xylem, Ph= Phloem, uE= untere Epidermis, SP= Schwammparenchym
3.1.3 Expression von LeSBT2 in verschiedenen Stadien der
Blütenentwicklung
RT-PCR-Analyse
Nachdem eine schwache Expression von LeSBT2 in offenen Blüten festgestellt wurde
(Kapitel 3.1.2), trat die Vermutung auf, dass auch in diesen Organen LeSBT2 ein
entwicklungsspezifisches Expressionsmuster aufweisen könnte. Aus diesem Grund wurden
verschiedene Stadien der Blütenentwicklung genauer untersucht. Das Blütenmaterial wurde
dabei in fünf verschiedenen Entwicklungsstadien gesammelt: Stadium 1 stellt fünf Tage,
Stadium 2 drei Tage vor der Anthese dar, Stadium 3 beschreibt den Tag der Anthese, die
Stadien 4 und 5 bezeichnen die Tage 2 und 4 nach der Anthese (Abb. 3.1.6). Bei der
folgenden RT-PCR-Analyse wurde vorgegangen, wie bereits im Kapitel 3.1.2 beschrieben.
A B
S
P
oEC
SP
PhX
uE
3. Ergebnisse
46
12
34
5
12
34
5 Abb 3.1.6: Die fünf verschiedenen Stadien der Blütenentwicklung. 1= 5 Tage vor der Anthese; 2= 3 Tage vor der Anthese; 3= Tag der Anthese; 4= 2 Tage nach der Anthese; 5= 4 Tage nach der Anthese
Die RT-PCR-Analyse ergab, dass auch in Blüten LeSBT2 entwicklungsabhängig exprimiert
wird. Die Abbildung 3.1.7 zeigt eine Abnahme der Expression von LeSBT2 vom Stadium 1
bis zum Stadium 3. In den Stadien 4 und 5 traten keine weiteren Veränderungen der LeSBT2
mRNA-Menge auf. Ähnlich wie in Blättern (Kapitel 3.2.1) nimmt auch in Blüten die
Expressionsrate von LeSBT2 mit fortschreitender Entwicklung stetig ab.
SBT2
Actin
Actin
Stad
ium
1St
adiu
m 2
Stad
ium
3St
adiu
m 4
Stad
ium
5gD
NA
0-W
ert
30Zyklen
25Zyklen
30Zyklen
750 bp500 bp
250 bp
750 bp
500 bp
250 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Abb. 3.1.7: Expression von LeSBT2 in verschiedenen Stadien der Blütenentwicklung Dargestellt ist das Ergebnis der RT-PCR mit LeSBT2- und Actin-spezifischen Primern. Die höchste Expressionsrate von LeSBT2 konnte im Stadium 1 nachgewiesen werden (oben). Die Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primern zeigt, dass gleiche Mengen an cDNA eingesetzt wurden (Mitte) und dass diese frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (unten).
LeSBT2
3. Ergebnisse
47
Histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression
Für diesen Versuch wurden von T2-Pflanzen dreier unterschiedlicher Linien Blüten in
verschiedenen Entwicklungsstadien gesammelt und mithilfe der X-Gluc-Färbelösung
angefärbt. In lediglich einer Linie konnte Aktivität der β-Glucuronidase in Blüten
nachgewiesen werden. Anhand der Abbildung 3.1.8 wird ersichtlich, dass der LeSBT2-
Promotor in allen Entwicklungsstadien hauptsächlich in den Kelchblättern aktiv war.
Mikroskopische Betrachtung der Kelchblätter zeigte, dass auch hier die GUS-Aktivität in den
Stomata auftritt. Die beobachtete Blaufärbung in späteren Stadien der Blütenentwicklung
widerspricht nicht den Ergebnissen der RT-PCR, da die β-Glucuronidase eine hohe Stabilität
aufweist und wenn sie im Stadium 1 der Blütenentwicklung gebildet wird wahrscheinlich
auch zum späteren Zeitpunkt noch aktiv ist. Auffällig ist auch die zunehmende GUS-Aktivität
in der Stigmaoberfläche bis zum Stadium 4. Im Stadium 5 ist hier jedoch keine Färbung mehr
sichtbar, was möglicherweise mit beginnender Seneszenz der Blüte und dem damit
einhergehenden Abbau der Proteine erklärt werden kann.
Stadium 3
Stadium 5Stadium 4
Stadium 2Stadium 1
Fruchtknoten
Griffel
Stigma
KelchblattKronblatt
Pistill
Abb. 3.1.8: Histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression in verschiedenen Stadien der Blütenentwicklung Abgebildet sind Blüten in den Entwicklungsstadien 1-5. GUS-Aktivität konnte in allen Stadien hauptsächlich in den Kelchblättern nachgewiesen werden. Außerdem wurde eine zunehmende Aktivität der β-Glucuronidase in der Stigmaoberfläche bis zum Stadium 4 nachgewiesen werden, die allerdings im Stadium 5 vollkommen fehlt.
3. Ergebnisse
48
3.1.4 Expression von LeSBT2 während der Samenquellung und –keimung
RT-PCR-Analyse
Für diesen Versuch wurden 60 Samen, aufgeteilt auf drei Petrischalen, auf nassem
Filterpapier ausgelegt und im Brutschrank bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 24, 48 und
72 Stunden wurden je 20 vorgequollene Samen geerntet. Ferner wurden zehn Tage alte
Keimlinge, die steril im Kulturraum bei 22°C und einer Photoperiode von 12 Stunden
angezogen wurden, für die RT-PCR verwendet. Aus den vorgequollenen Samen, sowie
Wurzeln, Hypokotylen und Kotyledonen der Keimlinge wurde RNA isoliert und wie bereits
in Kapitel 3.1.2.1 beschrieben eine RT-PCR-Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse in der
Abbildung 3.1.9 zeigen, dass LeSBT2 bereits 24 h nach Beginn der Quellung sowie zu
späteren Zeitpunkten exprimiert wurde. Im Keimling war die Expression von LeSBT2 in
Hypokotylen und Kotyledonen erkennbar, nicht jedoch in der Wurzel.
Actin
Actin
LeSBT2
24h
48h
72h
Wur
zel
Hypo
koty
lKo
tyle
done
ngD
NA
0-W
ert
30Zyklen
25Zyklen
30Zyklen
750 bp
500 bp
250 bp
750 bp
500 bp
250 bp
750 bp
500 bp
250 bp
Abb. 3.1.9: LeSBT2-Expression während der Samenquellung und –keimung Abgebildet ist das Ergebnis der RT-PCR-Analyse mit LeSBT2- und Actin-spezifischen Primern. LeSBT2 wurde schon 24 h nach der Quellung, sowie zu späteren Zeitpunkten exprimiert. Im Keimling war Expression von LeSBT2 nur in Hypokotyl und Kotyledonen erkennbar (oben). Die Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primern zeigt, dass gleiche Mengen an cDNA eingesetzt wurden (Mitte) und dass diese frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (unten).
3. Ergebnisse
49
Histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression
Für die histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression wurden von drei
unabhängigen, homozygoten Linien Tomatensamen, wie bereits in 3.1.4.1 beschrieben,
vorgequollen und mit der X-Gluc-Färbelösung auf die Lokalisierung der β-Glucuronidase-
Aktivität untersucht. Von denselben Linien wurden auch 12 Tage alte Keimlinge auf die
Aktivität des LeSBT2-Promotors untersucht. Anhand der Abbildung 3.1.10 wird ersichtlich,
dass die GUS-Aktivität nach dem Aufbrechen der Samenschale im micropylaren Endosperm
nachgewiesen werden konnte. Dieses Ergebnis konnte in zwei unabhängigen Linien
beobachtet werden. Auch in Keimlingen zweier unabhängiger Linien konnte GUS-Aktivität
detektiert werden. Die Blaufärbung beschränkte sich hier auf Hypokotyl, Kotyledonen und
Primärblätter. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten somit die der RT-PCR-Analyse.
24h
48h
72h
Abb.3.1.10: Histochemische Lokalisation der LeSBT2 Promotor::GUS Expression während der Samenquellung und -keimung GUS-Aktivität wird nach dem Aufbrechen der Samenschale am micropylaren Endosperm detektierbar. Im Keimling kann die Aktivität der β-Glucuronidase in den oberirdischen Organen lokalisiert werden.
12 Tage
3. Ergebnisse
50
3.2 Charakterisierung der LeSBT2-RNAi Tomatenpflanzen
3.2.1 Identifizierung transgener Pflanzen der T1-Generation
Samen der T0-Generation von sieben Linien wurden auf Kanamycin-haltiges Medium
ausplattiert, lediglich bei zwei Linien sind Kanamycin-resistente Keimlinge gewachsen. Es
bestand die Möglichkeit, dass die Pflanzen zwar keine Resistenz mehr gegen Kanamycin
aufwiesen, das Transgen aber enthielten. Aus diesem Grund wurden von jeder Linie 20
Samen auf Erde ausgesät und die Keimlinge über PCR auf die Anwesenheit des nptII-Gens,
sowie des LeSBT2-RNAi-Fragments in sense- und antisense-Orientierung analysiert. Es
wurde dabei für das PCR-Produkt des nptII-Gens eine Größe von 445 bp erwartet, für die
Produkte der LeSBT2-RNAi- Fragmente in sense- und antisense-Orientierung wurden 323 bp
und 325 bp berechnet. Anhand der Abbildung 3.2.1 wird ersichtlich, dass in vier von
insgesamt sieben Linien das T-DNA-Konstrukt in das Genom integriert wurde. Je zwei
Pflanzen dieser Linien wurden für die weiteren Untersuchungen verwendet.
Abb. 3.2.1: Identifizierung transgener Pflanzen der T1-Generation Abgebildet sind die Ergebnisse der PCR-Analyse auf das Vorhandensein des nptII-Gens, des sense- und des antisense-LeSBT2-Fragments. Die verwendeten Primer pHannF1, sbt2_2, pHannR2, nptII(367)for und nptIIR sind in den entsprechenden Farben als Pfeile unterhalb des schematisch dargestellten Konstrukts eingezeichnet. Die roten Zahlen bezeichnen die Pflanzen, die für die weiteren Arbeiten verwendet wurden. + = Positiv-Kontrolle, hierfür wurde eine bereits als positiv identifizierte Pflanze verwendet
3. Ergebnisse
51
3.2.2 Western Blot Analyse der Expression von LeSBT2
Das Prinzip der RNA-Interferenz (RNAi) beruht auf posttranskriptioneller Hemmung der
Genexpression. Durch die Transkription der im T-DNA-Konstrukt enthaltenen LeSBT2-
Sequenzabschnitte mit Selbstkomplementarität kommt es nämlich zur Ausbildung
doppelsträngiger Fragmente der LeSBT2 mRNA, die zu 21-23 bp großen RNA-Fragmente, so
genannten siRNAs (small interfering RNA), zerschnitten werden. Ein Strang der gebildeten
siRNAs wird dann von einem Enzymkomplex, dem RISC-Komplex (RNAi-induzierter
Silencing-Komplex) integriert, was letztendlich zum Abbau der zelleigenen LeSBT2 mRNA
führt. Folgend wird auch kein LeSBT2-Protein gebildet.
Im Western Immunoblot mit dem anti-LeSBT2 Antikörper sollte nun das Fehlen des LeSBT2-
Proteins in transgenen Pflanzen überprüft werden. Hierzu wurden junge Blätter transgener
Pflanzen der T1-Generation geerntet und eine Extraktion der gesamten Proteine durchgeführt.
Die erhaltene Proteinlösung wurde dann in SDS-PAGE mit anschließendem Western Blot
analysiert. Es konnte jedoch in Proteinextrakten der Wildtyp-Pflanzen, die als Positiv-
Kontrolle dienten, kein LeSBT2 nachgewiesen werden. Es trat die Vermutung auf, dass
LeSBT2 im Gesamtproteinextrakt nicht in ausreichender Menge vorhanden war, um detektiert
werden zu können. Es ist bekannt, dass LeSBT2 ein Signalpeptid enthält und dadurch in den
Apoplasten sekretiert werden kann (Meichtry et al., 1999). Daher wurden nur apoplastische
Proteine aus Blätter isoliert und ebenfalls mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.
Das LeSBT2-Protein, dessen Aminosäuresequenz ein berechnetes Molekulargewicht von
etwa 70 kDa beträgt, war nun als etwa 90 kDa große Bande detektierbar. Diese Diskrepanz
könnte möglicherweise auf posttranslationelle Proteinmodifikationen, wie z. B.
Glykosylierung, zurückgeführt werden. Wie allerdings in Abbildung 3.2.2 zu sehen ist,
konnte kein Unterschied zwischen RNAi- und Widtyp-Pflanzen festgestellt werden. In allen
Pflanzen wurden gleich hohe Mengen des LeSBT2-Proteins nachgewiesen. Als Ursache
hierfür könnte möglicherweise eine unzureichende Spezifität des polyklonalen anti-LeSBT2
Antikörpers genannt werden.
3. Ergebnisse
52
wt1
wt2
1/55
1/64 7/51
7/52
9/52
9/53
10/5
010
/51
130 kDa100 kDa70 kDa
A
130 kDa100 kDa70 kDa
A
70 kDa100 kDa130 kDa
50 kDa
40 kDa
B
70 kDa100 kDa130 kDa
50 kDa
40 kDa
B Abb. 3.2.2: Western Blot-Analyse der Expression von LeSBT2 in Blättern der T1-Generation transgener Pflanzen A: Dargestellt sind die Ergebnisse des Western Blots, inkubiert mit dem primären anti-LeSBT2-Antikörper. Pro
Spur wurden 3 µg apoplastischer Proteine aufgetragen. Die Proteinlösung aus Wildtyp-Pflanzen diente als Positiv-Kontrolle. Das LeSBT2-Protein konnte in allen Pflanzen als etwa 90 kDa Bande nachgewiesen werden.
B: SDS-PAGE-Polyacrylamidgel angefärbt mit Coomassie Blue zur Kontrolle des Proteinauftrags. Pro Spur wurden 5µg Protein aufgetragen.
3. Ergebnisse
53
3.2.3 RT-PCR-Analyse der Expression von LeSBT2
Aufgrund der Ergebnisse im Western-Immunoblot wurden die RNAi-Pflanzen als nächstes
mittels RT-PCR auf der mRNA-Ebene analysiert. Es sollten so mögliche Unterschiede in der
Expression von LeSBT2 zwischen Wildtyp- und transgenen Pflanzen untersucht werden.
Hierzu wurde junges Blattmaterial geerntet und daraus RNA isoliert. Als Positivkontrolle
wurden RNA-Proben von Wildtyp-Pflanzen verwendet. Bei der RT-PCR-Analyse wurde
vorgegangen wie bereits im Kapitel 3.1.2 beschrieben. Die Abbildung 3.2.3 zeigt, dass in
allen RNAi-Pflanzen deutlich weniger LeSBT2 exprimiert wird als in Wildtyp-Pflanzen.
Zwischen, aber auch innerhalb der RNAi-Linien bestanden jedoch deutliche Unterschiede in
der Expressionsrate von LeSBT2. Während bei den Pflanzen 1/55 und 9/53 kaum Expression
feststellbar war, war in der Pflanze 7/51 deutlich exprimiertes LeSBT2 erkennbar. Das
Vorhandensein der LeSBT2 mRNA in allen untersuchten RNAi-Pflanzen weist allerdings
darauf hin, dass das „Silencing“ des LeSBT2 wahrscheinlich nicht vollständig war.
SBT2
Actin
Actin
wt1
wt2
1/55
1/64
7/51
7/52
9/52
9/53
10/5
010
/51
gDNA
0-W
ert
30Zyklen
25Zyklen
30Zyklen
750 bp500 bp
250 bp
750 bp500 bp
250 bp
750 bp500 bp
250 bp
Abb. 3.2.3: RT-PCR-Analyse der Expression von LeSBT2 in den RNAi-Pflanzen Abgebildet ist das Ergebnis der RT-PCR-Analyse mit LeSBT2- und Actin-spezifischen Primern. In allen RNAi-Pflanzen ist eine deutlich reduzierte Expression von LeSBT2 erkennbar (oben). Die Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primern zeigt, dass gleiche Mengen an cDNA eingesetzt wurden (Mitte) und dass diese frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (unten).
LeSBT2
3. Ergebnisse
54
3.2.4 Northern Blot-Analyse der Expression von LeSBT2
Die Ergebnisse der RT-PCR sollten nun im Northern Blot bestätigt werden. Hierfür wurde aus
jungem Blattmaterial der T1-Generation transgener Pflanzen RNA isoliert. Als
Positivkontrollen dienten wiederum Proben von Wildtyp-Pflanzen. Die RNA wurde
elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und dann mit einer
radioaktiv markierten LeSBT2-Sonde hybridisiert. Anhand der Abbildung 3.2.4 wird
ersichtlich, dass die RNAi-Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen einen deutlichen
Unterschied in der Expressionsrate von LeSBT2 zu den Wildtyp-Pflanzen aufwiesen. Die
Transkriptmenge war in den transgenen Pflanzen stark reduziert, allerdings immer noch
nachweisbar. Somit konnten die Ergebnisse der RT-PCR-Analyse bestätigt werden.
wt1
wt2
1/55
1/64
7/51
7/52
9/52 9/53
10/5
010
/51
SBT2
Abb. 3.2.4: Northern Blot-Analyse der Expression von LeSBT2 in Blättern der T1-Generation transgener Pflanzen. Abgebildet ist das Ergebnis der Hybridisierung der Membran mit einer radioaktiv markierten LeSBT2-Sonde. In den LeSBT2-RNAi-Pflanzen ist im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen eine deutlich reduzierte Expressionsrate von LeSBT2 zu erkennen (oben). Kontrollgel, das den gleichmäßigen Auftrag der RNA zeigt (unten).
LeSBT2
3. Ergebnisse
55
3.2.5 Southern Blot-Analyse der LeSBT2-RNAi Pflanzen
Des Weiteren sollte über Southern Blot-Analyse getestet werden, ob es sich bei den vier
transgenen Linien um unabhängige Linien handelt. Hierzu wurde genomische DNA isoliert,
mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen, Hind III und Eco RI, verdaut, elektrophoretisch
aufgetrennt und dann auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Als Positivkontrolle für die
Hybridisierung mit der radioaktiv markierten nptII-Sonde wurde pART27, das zuvor mit
Not I geschnitten wurde, verwendet. Wie die Abbildung 3.2.5 zeigt, konnten drei unabhängige
Linien identifiziert werden. Die Linien 7 und 9 zeigten das gleiche Integrationsmuster, was
darauf schließen lässt, dass beide Linien aus dem selben Transformationsereignis entstanden
sind. Anhand der auftretenden Bandenzahl konnte die Zahl der integrierten Genkopien
bestimmt werden. Für die Linie 1 wurden vier und für die Linien 7, 9 und 10 mindestens zwei
Genkopien nachgewiesen.
wt 1/55
7/51
9/52
10/5
1
5000 bp4000 bp3500 bp
6000 bp
8000 bp10000 bp
wt 1/55
7/51
9/52
10/5
1
3000 bp2500 bp
2000 bp
1500 bp
wt 1/55
7/51
9/52
10/5
1
5000 bp4000 bp3500 bp
6000 bp
8000 bp10000 bp
wt 1/55
7/51
9/52
10/5
1
3000 bp2500 bp
2000 bp
1500 bp
+ +
Hind III Eco RI
Abb. 3.2.5: Southern Blot-Analyse der SBT2-RNAi Pflanzen Abgebildet sind die Ergebnisse der Southern Blot-Analyse. Die dafür verwendete genomische DNA wurde zum einen mit Hind III und zum anderen mit Eco RI verdaut. Die Membran wurde mit einer radioaktiv markierten nptII-Sonde hybridisiert. Es konnten drei unabhängige Linien identifiziert werden. + = Positiv-Kontrolle, Plasmid-DNA (pART27, geschnitten mit Not I); 100 und 30 pg
Für die Identifizierung homozygoter Linien wurde eine Segregationsanalyse der
Nachkommen der T1-Generation durchgeführt. Es wurden hierfür je Linie von 12 Pflanzen
jeweils 30 Samen auf kanamycinhaltiges Medium ausplattiert (siehe Tabelle 3.2.1). Nach
etwa zwei Wochen wurde das Experiment ausgewertet. Waren alle Keimlinge einer Pflanze
gegen Kanamycin resistent, konnte davon ausgegangen werden, dass es sich um eine
homozygote Pflanze handelte. In der Linie 10 konnten vier homozygote Pflanzen gefunden
werden. Die Pflanzen der Linien 1, 7 und 9 konnten allerdings nicht auf diese Weise getestet
werden, da sie keine Kanamycinresistenz mehr aufwiesen. Sie mussten deshalb über PCR
getestet werden. Hierzu wurden pro Linie von jeweils acht T1-Pflanzen je 20 Samen auf Erde
ausgesät und nach der Keimung über PCR auf das Vorhandensein des LeSBT2-RNAi-
Fragments in sense-Orientierung getestet. Es konnte so in der Linie 9 eine und in der Linie 1
zwei homozygote Pflanzen identifiziert werden.
T0-Pflanze Anzahl getesteter Linien in
der T2-Generation
Anzahl homozygoter
Pflanzen der T1-Generation
1 8 2
7 8 0
9 8 1
10 12 4 Tabelle 3.2.1: Identifizierung homozygoter SBT2-RNAi-Linien Dargestellt sind die Ergebnisse der Segregationsanalyse zur Identifikation homozygoter Linien. In der Linie 1 konnten zwei, in der Linie 9 eine und in der Linie 10 vier homozygote T1-Pflanzen gefunden werden.
3.2.7 Phänotyp der LeSBT2-RNAi Pflanzen
3.2.7.1 Makroskopische Betrachtung
Nachdem eine deutlich reduzierte Expression von LeSBT2 in den transgenen Linien gezeigt
wurde, sollte nun die phänotypische Charakterisierung dieser Pflanzen erfolgen. Dabei wurde
deren Wuchsform analysiert. 6 Wochen alte RNAi-Pflanzen wurden mit gleichaltrigen
Wildtyp-Pflanzen verglichen. Betrachtet wurden vier Pflanzen je Linie. In der Linie 7 konnten
drei Pflanzen mit verzögertem Wachstum beobachtet werden. Bei den Linien 1 und 9 wiesen
alle untersuchten Pflanzen verzögertes Wachstum auf. Dagegen zeigte die Linie 10 keinen
3. Ergebnisse
57
Unterschied zu den Wildtyp-Pflanzen auf. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte die
genauere Betrachtung der Southern Blot-Analyse liefern. Es ist zu erkennen, dass die Linien
1, 7 und 9 je eine DNA-Bande gleicher Größe aufweisen, was bedeuten könnte, dass bei
diesen Linien eventuell eine Kopie des Transgens an derselben Position ins Genom eingefügt
wurde (Abb. 3.2.5). Es ist somit nicht auszuschließen, dass es sich hierbei um einen
Positionseffekt handeln könnte. Andererseits war die Zahl der betrachteten Pflanzen zu
gering, um eine sichere Aussage treffen zu können.
WT HP 10-51 WT HP 1-51
WT HP 9-52 WT HP 7-52 Abb. 3.2.6: Makroskopische Betrachtung der Phänotypen der SBT2-RNAi Pflanzen Zu sehen ist ein teilweise verzögertes Wachstum der RNAi-Pflanzen. Pro Linie wurden vier ca. sechs Wochen alte Pflanzen betrachtet. Von der Linie 7 wiesen drei, von den Linien 1 und 9 alle und von der Linie 10 keine der Pflanzen verzögertes Wachstum auf.
3. Ergebnisse
58
3.2.7.2 Mikroskopische Betrachtung der unteren Blattepidermis
Die histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS-Expression in den
Schließzellen der Stomata ließ vermuten, dass LeSBT2 eine dem SDD1 ähnliche Funktion
übernehmen könnte. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, ist die Subtilase SDD1 in die
Steuerung der stomatären Dichte und Verteilung involviert (Berger und Altmann, 2000; von
Groll et al., 2002). Aus diesem Grund wurde die untere Blattepidermis der RNAi-Pflanzen
morphologisch untersucht. Die untere Epidermis halbentwickelter Tomatenblätter wurde
hierzu abgezogen, zur Anfärbung der Zellwandkomponenten mit Toulidinblau inkubiert und
mikroskopisch analysiert. Wie die Abbildung 3.2.7 zeigt, konnten jedoch weder in der Dichte,
noch in der Verteilung der Schließzellen Unterschiede zwischen RNAi-Pflanzen und Wildtyp
festgestellt werden. Die untere Blattepidermis der Pflanze HP 1-64 scheint eine veränderte
Oberflächenstruktur gegenüber der Wildtyp- und der HP 10-52-Pflanze zu haben. Dies ist
aber wahrscheinlich auf eine allmähliche Austrocknung des Präparats zurückzuführen. Da
auch in den Trichomen GUS-Aktivität detektierbar war (Abb. 3.1.4), wurden anschließend
auch diese mikroskopisch analysiert. Es konnten jedoch auch hier keine eindeutigen
Unterschiede bezüglich Dichte, Verteilung oder Morphologie festgestellt werden.
3. Ergebnisse
59
WT
HP 1-64 HP 10-52 Abb. 3.2.7: Mikroskopische Betrachtung der unteren Blattepidermis von SBT2-RNAi Pflanzen (HP 1-64, HP 10-52) Es konnten keine Unterschiede bezüglich Dichte und Verteilung der Stomata zwischen Wildtyp und RNAi-Pflanze festgestellt werden.
4. Diskussion
60
4 Diskussion Subtilisin-ähnliche Serinproteasen, kurz Subtilasen, sind eine Gruppe weit verbreiteter
Enzyme. Sie treten in prokaryontischen wie auch in eukaryontischen Organismen auf. In
Tomate konnten bisher 15 Mitglieder der Subtilasenfamilie identifiziert werden, die in fünf
Unterfamilien unterteilt werden: tmp, P69, LeSBT1, LeSBT2 und LeSBT3/4 (Meichtry et al.,
1999). Die P69-Unterfamilie wurde bislang am besten charakterisiert (Tornero et al., 1996
und 1997; Jordá et al., 1999 und 2000). Auch für tmp konnte aufgrund hoher
Sequenzähnlichkeit zu LIM9 eine potentielle Funktion in der Pollenentwicklung postuliert
werden (Taylor et al., 1997). Für die LeSBT-Unterfamilien liegen dagegen kaum
Informationen über mögliche Funktionen in der Pflanze vor.
Wie bereits in der Einleitung erwähnt, sollte im Rahmen dieser Arbeit eine nähere
Untersuchung der Subtilase LeSBT2 erfolgen. Hierzu sollte zum einen eine detaillierte
Expressionsanalyse dieses Gens in Tomate durchgeführt werden, zum anderen sollten
LeSBT2-RNAi-Pflanzen molekular und phänotypisch charakterisiert werden. Diese
Ergebnisse sollten Aufschluss über potentielle Funktionen von LeSBT2 geben.
4.1 Expressionsanalyse von LeSBT2 in Tomatenpflanzen
Die Analyse der Expression von LeSBT2 erfolgte einerseits unter Verwendung LeSBT2-
Promotor::GUS transformierter Pflanzen, anderseits über RT-PCR-Analyse verschiedener
Organe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Da die Subtilasen untereinander teilweise
hohe Sequenzähnlichkeiten aufweisen (Abb. 1.6, Meichtry et al., 1999), musste zu Beginn der
RT-PCR-Analyse die Spezifität der LeSBT2-Primer überprüft werden. Sie wurden hierzu
über PCR auf cDNAs von LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4 getestet und haben sich
dabei als spezifisch erwiesen (Abb. 3.1.1). Somit konnten sie im Folgenden für die RT-PCR-
Analyse eingesetzt werden. Eine vorläufige Expressionsanalyse der verschiedenen
Tomatensubtilasen wurde bereits früher mittels Northern Blot-Analyse durchgeführt. Es
wurde dabei festgestellt, dass LeSBT2 in Kotyledonen, Blättern und in der Zellkultur, nicht
aber in Blüten und Wurzeln exprimiert wird (Abb.1.8; Meichtry et al., 1999). Diese
Ergebnisse führten zu der Vermutung, dass die Expression von LeSBT2 in der Pflanze
hauptsächlich in grünen Organen stattfindet. Aufgrund dieser Hypothese wurden besonders
4. Diskussion
61
diese Organe in der folgenden RT-PCR-Analyse näher untersucht. Die Untersuchung ergab,
dass LeSBT2 am stärksten in jüngsten Blättern exprimiert wird. Geringere LeSBT2 mRNA-
Mengen konnten in Blattstielen, offenen Blüten, Wurzeln und dem Stängel detektiert werden.
Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass mit zunehmendem Alter des Pflanzenmaterials
eine stetige Abnahme der Expression von LeSBT2 stattfand (Abb.3.1.2).
Unter Anwendung von LeSBT2-Promotor::GUS transformierten Pflanzen konnte GUS-
Aktivität in den Schließzellen der Stomata von Blättern, Blattstielen und Stängeln
nachgewiesen werden (Abb. 3.1.3). Außerdem wurde die GUS-Aktivität in Zellen des
Leitbündelgewebes und in Trichomen beobachtet (Abb. 3.1.4 und 3.1.5).
Die Abnahme der Expression von LeSBT2 mit fortschreitender Entwicklung der grünen
Organe und die beobachtete GUS-Aktivität in den Schließzellen der Stomata führten zu der
Vermutung, dass LeSBT2 in die Entwicklung der Stomata involviert sein könnte. LeSBT2
könnte somit Funktionshomologie zu SDD1 aus Arabidopsis aufweisen, das für die Steuerung
der stomatären Dichte und Verteilung benötigt wird (Berger und Altmann, 2000; von Groll et
al., 2002). Da die Stomata eine Verbindung zwischen dem Pflanzeninnern und der Außenwelt
darstellen, sind sie potentieller Eintrittsort für Pathogene. Es könnte daher auch sein, dass es
sich bei LeSBT2 um ein präinfektionell exprimiertes Protein handelt, das eine Funktion in der
Abwehr von Pathogenen übernimmt. Ähnliches konnte auch schon für P69E und P69F
gezeigt werden. Beide Enzyme werden konstitutiv in Wurzeln und Hydathoden exprimiert
und ebenfalls mit der Pathogenabwehr in Verbindung gebracht (Jordá et al., 2000).
Die RT-PCR-Analyse der Blüten in verschiedenen Entwicklungsstadien zeigte ebenfalls eine
Abnahme der LeSBT2 mRNA mit fortschreitender Entwicklung (Abb. 3.1.7). Unter
Anwendung LeSBT2-Promotor::GUS transformierter Pflanzen konnte die Aktivität des
LeSBT2-Promotors in Blüten bestätigt werden. Blaufärbung zeigte sich vor allem in den
Stomata der Kelchblätter. Interessanterweise konnte aber auch eine zunehmende Aktivität der
β-Glucuronidase in der Stigmaoberfläche beobachtet werden.
Es ist bekannt, dass die Proteine der Stigmaoberfläche an unterschiedlichen Prozessen
beteiligt sind. Zum einen sind sie verantwortlich für die gametophytische
Selbstinkompatibilität monözischer Pflanzen (Clarke AE et al., 1989). Zum andern findet hier
nach der Bestäubung mit kompatiblem Pollen eine Degradation der Zellwände im
umliegenden Gewebe statt. Dies dient der Bildung longitudinaler Kanäle, durch die
anschließend der Pollenschlauch wachsen kann (Dumas et al., 1978; Janson et al., 1994). In
der Stigmaoberfläche von Tomate konnte das Vorhandensein von Polygalacturonasen gezeigt
4. Diskussion
62
werden, die vermutlich in die Initiation der longitudinalen Kanäle involviert sind (Hong et al.,
2000). Da LeSBT2 in der Stigmaoberfläche dasselbe Expressionsmuster wie die
Polygalacturonasen aufweist, könnte hier vielleicht eine Interaktion dieser Enzyme
stattfinden. Eine weitere denkbare Möglichkeit ist die Pathogenabwehr. Die Zellen der
Stigmaoberfläche geben ein Sekret ab, das reich an Proteinen, freien Aminosäuren, Fetten und
Kohlenhydraten ist (Kandasamy und Kristen, 1987). Dies stellt optimale
Wachstumsbedingungen für Pathogene dar. Es ist jedoch bekannt, dass eine Infektion des
Pistills nur selten vorkommt (Jung, 1956). Es könnte daher auch sein, dass LeSBT2 in der
Stigmaoberfläche bei der Pathogenabwehr benötigt wird. Interessanterweise konnte auch
schon die spezifische Expression von P69D im Narbengewebe beobachtet werden (Jordá et
al., 1999).
Bei der anschließenden RT-PCR-Analyse der Expression von LeSBT2 während der
Samenquellung und –keimung konnte in allen untersuchten Stadien (24 h, 48 h und 72 h nach
Beginn der Samenquellung) gleichmäßige Mengen an LeSBT2 mRNA nachgewiesen werden.
In LeSBT2-Promotor::GUS transformierten Pflanzen wurde in vorgequollenen Samen GUS-
Aktivität im Bereich des micropylaren Endosperms lokalisiert (Abb. 3.1.10). Dies gibt
Hinweise auf eine mögliche Beteiligung der LeSBT2 beim Aufbrechen der Samenschale, da
hierfür zunächst eine Degradation des micropylaren Endosperms stattfinden muss. Erst dann
kann die Wurzelspitze die Samenschale durchbrechen (Groot et al., 1988). Eine weitere
mögliche Funktion von LeSBT2 könnte auch hier in der Pathogenabwehr bestehen. Beim
Aufbrechen der Samenschale wird ein potentieller Angriffspunkt für Pathogene geschaffen,
der besonders wertvoll ist, da im Samen viele Nährstoffe enthalten sind. Es ist daher
außerordentlich wichtig, einen effektiven Schutz gegen Pathogene aufzubauen. Es ist bekannt,
dass während der Keimung hauptsächlich im Bereich des micropylaren Endosperms β-1,3-
Glucanasen und Chitinasen exprimiert werden (Morohashi und Matsushima, 2000; Wu et al.,
2000). Auch Polyphenoloxidasen konnten hier identifiziert werden (Morohashi 2002). Es
wurde vielfach belegt, dass diese Enzyme, entweder allein oder in Kombination mit anderen
Enzymen, in die Pathogenabwehr involviert sind (Simmons, 1994; Jach et al., 1995,
Jongedijk et al., 1995; Lozovaya et al., 1998; Gomez et al., 2002). Somit könnte auch
LeSBT2 in keimenden Samen in die Abwehr von Pathogenen involviert sein.
Im Keimling konnte in der RT-PCR-Analyse eine Expression des LeSBT2-Gens in
Hypokotylen und Kotyledonen gezeigt werden. Keine mRNA dieses Gens konnte in Wurzeln
4. Diskussion
63
detektiert werden (Abb. 3.1.9). In Keimlingen mehrerer Linien LeSBT2-Promotor::GUS
transformierter Pflanzen konnte festgestellt werden, dass der LeSBT2-Promotor in den
Stomata der Hypokotyle und der Kotyledonen aktiv war. Es wurde keine GUS-Aktivität in
der Wurzel 12 Tage alter Keimlinge detektiert (Abb. 3.1.10). Da aber LeSBT2 mRNA in
Wurzeln sechs Wochen alter Pflanzen detektierbar war (Kapitel 3.1.2) tritt die Vermutung
auf, dass LeSBT2 auch in der Wurzel entwicklungsabhängig exprimiert werden könnte,
allerdings nicht wie in den übrigen Organen mit abnehmender, sondern mit zunehmender
Expression in fortschreitender Entwicklung.
Ein ähnliches Expressionsmuster konnte auch schon bei At-SLP2, einem Enzym aus
Arabidopsis, das auf der Aminosäureebene 60 % Sequenzübereinstimmung zu LeSBT2
aufweist, gezeigt werden. At-SLP2 mRNA konnte in Wurzeln vier Wochen alter Pflanzen
nicht nachgewiesen werden, wohingegen in zehn Wochen alten Pflanzen eine recht starke
Expression des Gens beobachtet werden konnte (Golldack et al. 2003). Es besteht daher die
Möglichkeit, dass im Falle des LeSBT2 ein ähnliches Expressionsmuster vorliegt.
Insgesamt zeigte die Expressionsanalyse, dass LeSBT2 zum einen entwicklungsspezifisch,
zum andern an potentiellen Angriffsorten für Pathogene exprimiert wird. Es könnte somit
sein, dass LeSBT2 in der Entwicklung oder bei der Pathogenabwehr eine Rolle spielt.
4.2 Charakterisierung der LeSBT2-RNAi Tomatenpflanzen
Um weiteren Aufschluss über mögliche Funktionen von LeSBT2 zu erhalten, wurde die
molekulare und phänotypische Charakterisierung von LeSBT2-RNAi-Pflanzen durchgeführt.
Die Identifizierung von RNAi-Pflanzen der T1-Generation musste über PCR erfolgen, da nur
bei einer von sieben getesteten Linien Kanamycin-resistente Keimlinge gewachsen sind. Es
konnte schließlich in vier Linien das ins Pflanzengenom integrierte T-DNA-Konstrukt
nachgewiesen werden (Abb. 3.2.1).
Die Analyse der Expression von LeSBT2 in transgenen Pflanzen wurde zunächst auf der
Proteinebene mittels Western Blots durchgeführt. Wie viele andere Mitglieder der
Subtilasenfamilie besitzt auch LeSBT2 ein Signalpeptid, welches das Enzym in den
Apoplasten leitet (Meichtry et al, 1999). Aus diesem Grund wurden die apoplastischen
Proteine junger Blätter in SDS-PAGE mit anschließender Western Blot-Analyse eingesetzt.
Es konnte jedoch kein „Silencing“ des LeSBT2-Gens nachgewiesen werden, da in allen
4. Diskussion
64
Pflanzen eine gleich hohe Expression von LeSBT2 erkennbar war (Abb.3.2.2). Dies könnte
entweder bedeuten, dass kein „Silencing“ dieses Proteins auftritt, oder dass möglicherweise
der verwendete anti-LeSBT2 Antikörper mit anderen Proteinen kreuzreagiert.
Im nächsten Schritt wurde dann das „Silencing“ von LeSBT2 auf der mRNA-Ebene unter
Anwendung der RT-PCR-Analyse überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass in allen LeSBT2-
RNAi-Pflanzen eine deutlich geringere Expression von LeSBT2 beobachtet werden konnte als
in den Wildtyp-Pflanzen (Abb. 3.2.3). Es könnte sich somit um unvollständiges „Silencing“
des LeSBT2-Gens handeln. Die Resultate der RT-PCR-Analyse konnten mithilfe der Northern
Blot-Analyse bestätigt werden. Hier zeigten die Ergebnisse ebenfalls eine deutlich reduzierte
Expression von LeSBT2 in RNAi-Pflanzen (Abb. 3.2.4).
In der darauf folgenden Southern Blot-Analyse konnten innerhalb der vier transgenen Linien
drei unabhängige Linien identifiziert werden (Abb. 3.2.5)
Die makroskopische Analyse der Pflanzen auf Unterschiede in Wuchsform oder Entwicklung
zeigte verzögertes Wachstum bei Pflanzen der Linien 1, 7 und 9, nicht jedoch bei der Linie 10
(Abb. 3.2.6). Eine mögliche Erklärung dafür liefert eine genauere Betrachtung der Southern
Blot-Analyse. Diese zeigt, dass unter Umständen in den Linien 1, 7 und 9 je eines der Inserts
an der jeweils gleichen Position ins Genom integriert worden sein könnte. Möglicherweise
wurde hierbei die Sequenz eines anderen Gens unterbrochen, was zu verzögertem Wachstum
führen könnte. Weitere Unterschiede in der Morphologie der Pflanzen konnten nicht
festgestellt werden.
Die Resultate der Expressionsanalyse von LeSBT2 zeigten, dass dieses Enzym entwicklungs-
und gewebespezifisch exprimiert wird. Weiterhin konnte in verschiedenen Organen der
Pflanze die Aktivität des LeSBT2-Promotors hauptsächlich in den Schließzellen der Stomata
nachgewiesen werden. Diese Befunde führten zu der bereits erwähnten Hypothese, dass dem
LeSBT2 eine dem SDD1 ähnliche Funktion zugesprochen werden könnte. Wie jedoch in
Abbildung 3.2.7 zu erkennen ist, waren bei einem Vergleich der unteren Blattepidermis
transgener Pflanzen mit der von Wildtyp-Pflanzen weder in der Dichte, noch in der
Verteilung der Stomata Unterschiede festzustellen. LeSBT2 scheint somit keinen Einfluss auf
die korrekte Entwicklung der Stomata zu haben. Für die Aufklärung der Funktion der
LeSBT2-Protease sind deshalb weiterführende Studien notwendig.
4. Diskussion
65
4.3 Ausblick
Mit dem Ziel, die Funktion von LeSBT2 aufzuklären, sollten zukünftig zusätzliche
Untersuchungen des Phänotyps von LeSBT2-RNAi-Pflanzen stattfinden. Nicht beachtet
wurden bislang Querschnitte von Blättern der RNAi-Pflanzen. Auch der Phänotyp von
Pflanzen mit Überexpression von LeSBT2 wurde noch nicht analysiert. Des Weiteren sollten
Versuche unter Trockenstress durchgeführt werden, um eine mögliche Beeinträchtigung der
Reaktion der Schließzellen in RNAi-Pflanzen oder Pflanzen mit Überexpression von LeSBT2
zu überprüfen. Da LeSBT2 schon während der Samenquellung nachzuweisen ist, könnten
auch Keimungsversuche mit Samen der RNAi-Pflanzen und der Überexpressions-Pflanzen
Aufschlüsse über mögliche Funktionen des Enzyms liefern.
Ebenso könnte über eine Expressionsanalyse von LeSBT2 nach Pathogenbefall die potentielle
Beteiligung dieser Protease an der Pathogenabwehr untersucht werden.
Außerdem sollte die Aktivität des LeSBT2-Promotors in Stigmaoberfläche und
Leitbündelgewebe unter Anwendung von in situ Hybridisierung bestätigt werden. Eine
Bestätigung dieser Ergebnisse könnte weitere Hinweise auf die Funktionen dieses Enzyms
liefern. Darüber hinaus sollte auch die Expression von LeSBT2 in der Wurzel näher untersucht
werden. At-SLP2 aus Arabidopsis, das auf Aminosäureebene 60 % Sequenzidentität zu
LeSBT2 aufweist, wird in vollentwickelten Wurzeln stärker exprimiert als in jungen
(Golldack et al. 2003). Es besteht daher die Möglichkeit, dass auch in der Tomatenwurzel ein
entwicklungsabhängiges Expressionsmuster für LeSBT2 vorliegt. Außerdem sollte auch die
Lokalisation des Proteins in der Wurzel unter Verwendung LeSBT2-Promotor::GUS
transformierter Pflanzen analysiert werden.
Mit dieser Arbeit konnte eine detaillierte Expressionsanalyse von LeSBT2 erstellt werden.
Ferner konnte die molekulare Charakterisierung von LeSBT2-RNAi-Pflanzen abgeschlossen
und die phänotypische Analyse dieser Pflanzen begonnen werden. Die hier erzielten
Ergebnisse stellen die Grundlage weiterer Arbeiten zur Aufklärung der Funktion dieses
Enzyms in planta dar.
5. Zusammenfassung
66
5 Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine detaillierte Expressionsanalyse von LeSBT2 durchgeführt
werden. Ferner sollte die molekulare und phänotypische Charakterisierung von LeSBT2-
RNAi-Pflanzen erfolgen. Diese Ergebnisse sollten Aufschlüsse über potentielle Funktionen
dieser Protease liefern.
Über RT-PCR-Analyse konnte die Expression von LeSBT2 in allen Organen nachgewiesen
werden, wobei die höchsten Mengen an LeSBT2 mRNA in jungen, grünen Organen
detektierbar waren. Auch Blüten zeigten in frühesten Entwicklungsstadien die höchste
Transkritpmenge. Bei der Samenquellung und -keimung konnte in allen untersuchten Stadien
gleiche Mengen an LeSBT2 mRNA nachgewiesen werden. Im Keimling war die Expression
von LeSBT2 auf Hypokotyl und Kotyledonen beschränkt. Zur Bestätigung dieser Ergebnisse
wurden LeSBT2-Promotor::GUS transformierte Pflanzen analysiert. Die Resultate zeigten,
dass in Blättern, Blattstielen, Stängeln und Kelchblättern in Stomata GUS-Aktivität auftrat.
Außerdem wurde die Promotoraktivität von LeSBT2 in Trichomen und Leitbündelgewebe der
Blätter und in der Stigmaoberfläche der Blüten gezeigt. In vorgequollenen Samen konnte
Aktivität des LeSBT2-Promotors im micropylaren Endosperm festgestellt werden.
Im Anschluss daran erfolgte die Charakterisierung der LeSBT2-RNAi-Pflanzen. Im Western
Immunoblot konnten keine Unterschiede in der Menge des vorhandenen LeSBT2-Proteins
zwischen Wildtyp- und RNAi-Pflanzen festgestellt werden Da die Ursache hierfür eine
unzureichende Spezifität des Antikörpers sein konnte, wurden die RNAi-Pflanzen
anschließend auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR untersucht. Es konnte im Vergleich zu
Wildtyp-Pflanzen eine deutlich reduzierte, allerdings immer noch nachweisbare Expression
von LeSBT2 in den transgenen Pflanzen gezeigt werden. Diese Ergebnisse konnten in der
Northern Blot-Analyse bestätigt werden. Die Southern Blot-Analyse ergab, dass von vier
transgenen Linien drei unabhängig sind. Makroskopische Betrachtung der RNAi-Pflanzen
zeigte verzögertes Wachstum in drei von vier untersuchten Linien, was aber eventuell auf
einen Positionseffekt des Transgens zurückzuführen sein könnte. Bei der Analyse der unteren
Blattepidermis wurden zwischen RNAi- und Wildtyp-Pflanzen keine Unterschiede in der
Dichte und Verteilung der Stomata festgestellt. Für die Aufklärung potentieller Funktion von