UNIVERSITI PUTRA MALAYSIA NUKLEAR …psasir.upm.edu.my/8743/1/FSAS_1995_6_A.pdf · Polihedrosis Virus Dalam Spodoptera /itura, Kajian Mikroskop Elektron, Protein dan A~id Nukleik'

UNIVERSITI PUTRA MALAYSIA

NUKLEAR POLIHEDROSIS VIRUS (NPV) DALAM Spodoptera litura- KAJIAN MIKROSKOP ELEKTRON, PROTEIN DAN ASID NUKLEIK.

NAFlZAH BT. MOHD NOH

FSAS 1995 6

NUKJJ~AR I'OlJIIEI>UOSIS VIRUS (NPV) J)ALAM S]Jodo]Jtera iitllra ­

KA.HAN l\llKROSKOP ELEKTRON, PROTEIN IJAN ASID NUKLEIK.

NAlflZAII 81'. l\IOllD NOH

JABATAN JUOKIMIA IJAN MIROBIOLOGI

IfAKULTI SAINS nAN PENGA.nAN ALAM SEKITAR

UNIVERSITII'EUTANIAN l\1AlJAYSIA.

Sl~RJ)ANG, SELANGOR

1994/95

Nuklear I)olihedrosis Virus (NPV) dalanl Spodoptera litura­

Kajinn l\1ikl'oskol) Elektron, l)rotein dan Asid Nukleik.

Oleb

Natizah bt. Mohd Noh

(29892)

Tesis dikemululkan uutuk memcmdti scbahngian dati syal'at lmtul{ijazah Bacelor Sains (Kcpujum)

di ~Jnbabm Bioldmia dan Mikrobiologi,II'nkIlItJ Sains dan Pengajian Alam Seldtar,

Universiti I)ertanian Malaysia.

AprU, 1995

PERAKUAN

Dengan ini, adalah disahkan bahawa laporau projek bertajuk ' Nuklear

Polihedrosis Virus Dalam Spodoptera /itura, Kajian Mikroskop Elektron,

Protein dan A~id Nukleik' telah disemputnakan serta dikemukakan kepada

Jabatan Biokimia dan Mikrobiologi oleh Nafizah bt. Mohd Noh sebagai memenuhi

syarat untuk ljazah Bacelor Sains (Kepujian) dari Fakulti Sains dan Pengajian Alam

Sekitar, {Jniversiti Pertanian Malaysia.

disahkan oleh

Tarikh k-f -- It-<)J..................( . 4t~-~/.~ -------..-..~... /

(Prof. Madya Dr. Norani Abd. Samad)

Penyclia Pcrtama ('

Pcnyclia Kedua

disahkan oleh

Tarikh ....1:...:...(h~.~(pro( Madya Dr. Kamarulzaman Ampon)

Ketua Jabatan, Jabatan Biokimia dan Mikrobiologi

Untuk kalian,

Mak,deritamu dan pengorbananmu hanya

Allah jua yang lebll mengetahui .•.

Abah, Makeik,

Angah, Boy, AIe~ Ina,

Azhar, Nur & Linda,

Hanya inRah sahaja yang dapat

ku hadiahkan buat permulaannya ...

Bersabarlah di atas segala dugaan •••

- ALONG-

PENGIIARGAAN

DENGAN NAMA ALLAII YANG MAfIA PEMURAH LAGI MAliA PENYAYANG.

" Puji-pujian bagi ALLah, yang menciptakan langit dan bumi, menjadikanmalaikat-malaikat jadi utusan yang mempunyai sayap dua-dua, tiga-tiga dancmpat-empat. Allalt menambalt kejadian apa yang dikehendakiNya.Sesungguhnya Allah Maha berkuasa alas tiap-tiap sesuahl."

(AI-Fathir:t)

Setinggi kesyukuraan ke hadrat Ilabi diatas limpah kurnia dan nikmatysltlg dibel'ikan itti maka daI'atjua disempurnakan projek tahun akbir saya.

Ucapau setinggi-tiuW Terima Kasih kepada penyelia projek, Prof.Madya Dr. Norani Abd. Samad yang mana dengan bimbingan danna.o;ihahlya banyak membautu saya dalam JaYian ini.

Tidak dilupakan kepada Prof. Madya Dr. Ahmad Said Sajap dariFakulti Perlmtanau selaku I'enyelia kedua projek, terima kasilt £Ii alas kritikandan bantuan yang diberikall.

Kepada kakitangan MARDI, Serdang khasnya I'n. Jameah Ismail danEn.Foo yang banyak memberi sumbangan teknikal di dalam menyempumaIcanprojek saya, terima kasih. Penghargaan juga kepada En. Ho dari Unit ElektronMikroskop yang sudi menolong saya dari awalhmgga ke akhir projek mi.

Sekalung budi juga buat leman-teman dari Makmal Virologi, 143; KakNajah, Kak Sudalli, Kak Zuraidah, Kak Mazidah, Omar, Muhajir, Suzi, Chuiroong dan Mages yang sarna-sarna memberi sokongan selama projek inidijaIankan.

Akhirnya buat sahabat-sahabat dan sahabiah-sahabiah GI'lJ sekelian,teruskan mata rantai yang tdah diamanaltkan ini. Khusus kepada housemates7325 (Bailul Aisyalt); Nita, Kak Sue, Kak Min, Kak Gee, Yati, Tini, Zura danNa. Taupa bimbittgan kaliall apakah c1apat ku erlikan hakikat kehidnpan yangsebenarnya.

Hanya Allah jualah yang dapat membalasnya. ....

ZULRI\!DI\U I4IS

ii

lSI KANIlUNGAN MUKASURAT

PENGIIARGAAN It

lSI KANDUNGAN iii

SENARAI JADUAL v

SENARAI RAJAH vi

SENARAI SINGKATAN vii

ABSTRAK viii

ABSll~ACT ix

HAB 1 PENDAIIULUAN 1

BAB2 PJl:NULISAN SEMULA 3

2.1 Latar bdakang sejarah 32.2 Baculovirus 42.3 !\1orfologi 6

2.3.1 Struktur virion 72.3.2 Struktur polihedra dan granul 9

2.4 Infeksi dan replikasi "irus 102.5 Asid nukteik 112.6 Infeksi dan replikasi virus 122.7 Spodoptera litura (sn Prodenia litura) 132.8 Ujian patogenesiti 16

BAB 3 BAlIAN DAN KAEDAH

3.1 Pemeliharaan larva S.1itura3.2 Penulenan virus3.3 Penulenan nukJeokapsid

3.3. J Penyediaan grid

iii

17

191920

22

3.4 Penyediaan sampel \lutuk TEM 22

3.4.1 Polihedra NPV dan tisu lemak S. litura 22

3.5 Gel poliakrilamida (SD8-1'AGE) 26

3.5.1 Penycdiaan 11% gel pemisah 263.5.2 Penyediaan 4% gel penyusun 263.5.3 Penyediaan penanda dan sampel 273.5.4 McnjaJankan elektroforesis SDS-PAGE

dan pcwamaan gel 27

3.6 Pengekstrakan DNA dan pemendakan etanol 283.7 E1ektroforesis gel agarosa 31

DAB 4 KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN 32

4.1 PemeJiharaan larva S. litura yang tcrinfeksi 324.2 Penulenan vims 344.3 Pemerhatian harlan inklusi polihedra 364.4 Penghasilan nukleokapsid 384.5 Pemerhatian melalui TEM 40

4.5.1 NPV tulen 424.5.2 Tu.utan infeksi NPV dalam Imva S.litura 42

4.6 Protein melalui SDS-PAGE 574.7 Pengekstrakan DNA dan analisis gel agarosa 59

BAH 5 KESIMPULAN

RUJUKAN

Al'ENnIKS

iv

62

SENARAI JADUAL

Jadual.ladua) 3.1Jadual 3.2Jadua) 33

Bahan-bahan kimia dan biokimiaPcnulcnan \lirus NPVKaedah pembenaman nipis-ultra

v

Mukasurat182124

SENARAI RAJAH

Ra;ahRajah]R:ti:lh 2R~iall 4.1Rajah 4.2Rajah 4.3

Rajah 4.4aRajah 4.4bR~jah 4.5aR~;ah 4.5bRajah 4.<i

Rajah 4.7

Rajah 4.8Rajah 4.9Rajah 4.10R~iah 4.11Rajah 4.12Rajah 4.13Rajah 4.14R~iah 4.15Rajah 4.16R~jah 4.17Rajah 4.18

Rajah 4.19

Struktur Polihedra NPV dan granulum GVKitaran infeksi NPVLaIVa S.litura sihatLarva S. litura tcrinleksiLapisan virus pada lapisanantara fasaDadan inklusi polihedraKristalin matriks PIBNukleokapsidNukleokapsidPolihedra NPV dengan "irion hersaluttunggal (SNPV)Virion keluar dari polihedra seearaevagmaslInfeksi NPV selepas 3 hari dalam tisu lemakInfeksi NPVselepas 3 haliInfeksi NPV selepas 3 hallInfeksi NPV selepas 4 hariInfeksi NPV selepas 4 hariInfeksi NPV selepas 6 hanInfeksi NPV sclepas 6 hanVirion NPV selepas menguasai tisu selNukteokapsid bersalut tunggalProfit protein NPV (SDS-PAGE)prom DNA NPV(Elektroforesis gel agarosa)Penentuan berat molekul fragmen DNA

vi

Mukasurat5143333

3537374141

43

4446474850515354555658

6061

Scnarai singkatan yang digunalmn dalam penulisan kajian.

BOMAbibb/iDDSADaDNAEDTAGVilbMARDikb1'.1tntmmMNAnmNPVpHPTAPillSnS-PAGE'lunSDSsnTATETEMTEMEDTtlsUAvWHO°cpI~un

Den7ildimetilaminaBcratlberatJJeral/isipilduDodesilenil suksinik anhidratDaltonAsid DeoksiribonukleikEtelencdiaminctelra asitik asidVims granulosisisipadulberatInstitul Penyelidikan Dan Kemajuan Pertanian MalaysiakilobesMolarmililitermilimeterMetil Nadic AnltidratnanometerVirus Nuklear Polihcdrosiseksponen ion hidrogenAsid FosfotungstikPolihedra Badan InklusiNatrium dodesil suHat-gel poJiakrilamidarevolusi llcr minitNatrium dodesil sulfatNama saintifikTris-asetatTris-EDTAMikroskop Eleklron TransmisiN,N,N,N - tetrametil etilindiaminaTris (hidroksimetil) amino metanaUranU asetatVoltOrgani"asi Kesihatan SeduniaDarjah Celsiusmikrolitermikrometer

vii

ABSTRAt\

Baculovirus adalah kurnpulan virus yang rnenyebabl\an penyakitkronil\ pada larva Lepidoptera. KcYian tcrhadap spesis tcrnpatan, larvaSpodoplera lilura iailu perosal\ utama tanaman di Mala}5ia menunjukl\anbahawa virus Nuldear Polihedrosis (NPY) adalah spesifik pada Spodopteralilura. Nuldeol\apsid yangdihasilkan oleh NPV bcrdiamcter 6.45 hingga133.28 mn dan mempunyai paryang anlara 1J.4.5 nrn hingga 980.56 run,berhenlul~ basili lunggal dan diranglwmi selapul tunggal protein malriksyang dilH:nali scbagai polihcdrin. Polihedra alau badan inklusinyarnernpunyai pclbagai benluk dan saiz. AMivili prolease adalah diperlukanuntul\ p(~mccahan polihedrin dari membran dalarn keadaaan berall\ali iaituanlara 1'1-1 9.5 hingga 11.5. Infd\si NF"'V I\e atas larva perumah bcrrnulaselepas 2/~ jam lcrinfcl\si dan selepas 72 jam p.i polihedron yangrnengandlmgi virion lengl\ap terbentul\. Nukleokapsid rnasuk I\e tisu selsccara invaginasi dan al\an mendorninasikan sel perurnah. Kematianben nula pada hari I\ecnam. Prolein I\apsid rnempunyai berat molclwl32/1-00 D dan salu fragnwn DNA dengan berat molelwlnya 9.12 kbdil\csan.

VUl

Al55TRACT

Barulovirus is a group of ~inJSes that caused a chronic but fataldescasc in Lepidoteran lal1'ae. Studies 0/1 local species, Spodoptera liturawhich dc.5troyed mtJior crops in Malaysia revealed that Nuclear PolyhedrosisI1ll1s fNPVJ is spesific to Spodoptera litura. Nucleocapsid., produced bythew' vim5 are lalge which 6.45 nm to 133 nm i/1 diameter and 44.5 nmto 980.56 nm i/1 length bacilifolm in shape, enveloped as a single NPVfSIYPVJ by a parauystalin matrix protein Imown as polihedrin. Theocclusion bodies vades i/1 size and shapes. The protease activity 1WJ5

Icquired for a complete dissociation of polihedti/1 livm the viral membranunder aI/cali condition ",fth pli 9.5 to Il5. NPV infection of latvae beganat 24 hour post inoculation fp.i) and that aRer 72 hour p.i a completefJolj.i1edron with J1rions foremed Nucleocapsid entered and dominated1l<;,5ue cell., t/llvugh invagination caused morlality Iftfthin 6 days. nlecapsid plotein had a molecular weight of 32400 D. Only one fragmentDNA 'tith molecular we~qht 9.12 I{b was detected

IX

BABI

PENGlrNALAN

Sehingg.1 kini, terdapat hampir 10 kumpulan virus yang dikenalpasti

menjangkiti serangga (Tinsley dan Kelly, ]988). Baculoviru.~ telah direkodkan

sebagai saJah satu kumpulan virus serangga yang besar iaitu lebih dan 300 spesies

seranggga, dati Order Lepidoptera, Diptera, Himenoptera dan Coleoptera dijangkiti

(Tinsley dan Kelly, ]985). Baculovirus adalah kumpulan partikel virus yang

mempunyai struktur yang kompleks. Partikel Baculovirus kebanyakannya

dibungkus dalam protein kristalin yang dikenali sebagai poJihedra, kapsuJ, granul

juga dikenali sebagai hadan inklusi polihedra (PID).

Daculovirus terbahagi kepada 3 jenis sub kumpulan utama yang berbeza

dati segi morfoJoginya. Nuklear polihedrosis virus (NPV) mempamerkan bentuk

polihedra dan ada 2 stmktur yang jeJa~ berkaitan dengan nukJeokapsid yang

bcrsalut; NPV yang mempunyai nukJeokapsid bersalut tunggal (SNPV) dan NPV

yang mempwlyai lebih dari satu nukJeokapsid dalam satu salut (MNPV).

Kumpulan Granulosis virus pula mengandungi hanya satu sahaja nukJeokapsid

daJam satu salut. Kumpulan ketiga tidak dilingkungi oleh salut. Kebanyakan virus

serangga tClmasuk dalam kumpulan NI)V.

PoJihedron NPV mernpunyai banyak partikeJ-partikel virus terangkum

dalam 8atn mattiks protein. Amnya polihedra ini bel1indak sebagai vektor bagi

panikel virus untuk melliangkiti satu serangga ke serangga yang lain dan juga dati

satu organ ke organ yang Jain. Beberapa spesis NPV yang melliangkiti serangga,

/fellotlls zea, Autographa c(llifornia dan Spodoptera littoralis telah diuji

kcbcrkcsanamlya untuk manipulasi kawalan biologi mc1alui bebcrapa ujian yang

dikendalikan oleh Agensi Perlindungan Persekitaran (EPA), Amerika Syarikat dan

Pertubuhan Kesihatan Sedunia (WHO) (Burges et al., 1980). Antara kelebihan

NVV scbagai kawalan biologi ialah ianya tidak melliangkiti serangga yang tidak

mel bahaya dan tidak bereplikasi pada mikroorganisma lain, invertebrata melainkan

Ar1ropoda. Entomopalogen ini ad.dah spesiftk pada perumah tertentu sahaja

(Order Lepidoptera) maka hidupan lain, yang lebih berkepentingan dapat

diselamatkan. Penghasilan vims dari serangga adalah sesuai untuk k~ian kawaJan

biologi secara mikrobial. Serangga ini bolch dihidupkan dalam jumlah yang banyak

dan murah boleh didapati. Conlohnya, Galleria mellonella boleh dikultur dalam

medium timan alau diberi makanan diet tiruan (Smith, 1967).

Objektifkajlan termasuklah:

1. Untuk mengk~ji ullrastmklur polihedra NPV tulen dan dari larva

Spodoptera lilura yang diinfeksi.

2. Pencntuan protein polihedra NPV.

3. Menganalisis genom DNA Spodoptera litura NPV.

2

HAR2

PENULISAN SEMULA

2.1 Latnr belakang s('jarah

Penyakit virus serallgga mula tercatat seawal 1527 dari sebuah sajak oleb

Vida yang menceritakan penyakit 'jaundice' yang menyerang ulat sutera, Bombyx

mori (Smith, 1967). Comlia dan Maestri (1856) yang mula mengk:ui NPV telah

dapat mcmbuktik.1n kcwl~judan polihedra berbentllk kristal dalam penyakit

'jaundice' dan mengaitkannya dengan 'malady'. Hanya, Bergold (1947) melatui

pengemparan secara analitikal dan mikroskop elektron tetah dapat menwUukkan

ultrastmktur partikel vims tersebut.

Penggunaan virus sebagai vektor pembawa penyakit telah direkodkan oleh

Wahl, B. (1905), dimana ia dapat mcnuqjukkan perhubungan antafa infeksi yang

dikaitkan dengan penyakit 'polyerdekranheit' pada larva Nun, Lymantria monacha

yang bolch mcnembusi ultraturasan (Enstwistle dan Evans, 1985). Balsh (1946)

telah berjaya menggun.1kan virus yang di}lencil dari 'sawfly' spruce Eropah,

Gilpinia hercyniae dali Kanada yang boleh mengawal larva serangga di

Newfoundland.

3

2.2 Baculovirus

Baculo berasal dati pcrkataan baculum yang bennaksud batang, dati bentuk

morfologi wion. Baculovirus dari famili Baculoviridae adalah patogenik kepada

scrangga. Sebanyak 1270 interaksi antara perumah serangga dan virus serangga

telab dikenalpasti; 71% dijumpai dalam Lepidoptera, 14% dalam Diptera, 7%

dalam Ilymcnoptera, 5% dalam Coleoptera dan 3% dalam Orthopfera, Isoptera,

Hemiptera dan NeuTOptera (Entwistle dan Evans, 1985). Baculovirus telah

digunakan untuk mengawal serangga di Kanada, Sweden, Perancis, Jennan, Rusia,

Romania, Bulgaria, Israel, Mesir, Chechoslavakia dan Amerika Syarikat (HeimpeU,

1977).

Berdasarkan stmktumya, empat sub-kumpulan telah dicadangkan

klasifikasinya oleh Jawatankuasa Taksonomi Virus Antarabangsa (1990). (Rajah

1). Kumpulan A; NPV terdiri nukleokapsid bersalut tunggal (SNPV) atau lebih

dali satu nukleokapsid tersusun secara berganda (MNPV) dalam satu salut. Dalam

MNPV lebih seratus nukleokapsid berdiameter ukuran antara 1 hingga 15J..UU

terdapat dalam satu polihedra (Vlak dan Rohrmann, 1985). Matriks proteinnya

dipanggil polihedrin. Dadan inklusi terdiri dati pelbagai bentuk dan saiz contolUlya,

Bomb)'x mori NPV berbentuk dodekahedron dan Lymantria monacha NPV

berbentnk tetrahedron (Smith, 1976).

4

A: Viru~ Nuklear Pollhedro5is B: Virus Granulosis

Virion (Nukteokapsidbersalut tunggal, SNPV)

Oran .

protein membrnn

teras pc bin DNA

virion

PolJhidnn

Villon (nukleokapsidsallJlan betgmda ,MNPV)

PolihedraGranulum

Rajah 1: Struktur polihedra NPV dan granulum GV

(Vlak dan Rohrmann, 1985)

5

Virus granulosis dati kumpulan B mempunyai satu atau dua nukleokapsid

sahaja dalam satu lapis salut. Protein matriknya dikenali sebagai granulin. Ia

meml'unyai bentuk ovisilindrikal berdimensi antara 250 hingga 300 tun dan 400

hingga 500 nm panjang (Summers, 1977). Kumpulan C pula tiada mempunyai

protein matriks yang menyelaputinya dan dan hanya mempunyai satu nukleokapsid

yang bersclaput scpet1i <Ii 01J1ctes rhinoceros NPV. Baculovirus dalam kumpulan

D pula dikaitkan dengan kehadiran ceeair kaliks dan tidak bersalut. Genomnya

dibungkus secara sel1nder samada tunggal atau berganda.

NPV mernpunyai saiz rnencapai 15 pm dan dipercayai spesif1k pada spesies

serangga tertentu (Summers, 1975). Polihedra S. litura NPV adalah bujur di

bawah rnikroskop cahaya (Kotula~ 1994). Ketika ini peng.kelasan virus adalah

mengikut nama pernmah yang didudukinya eontohnya, Autographa california

MNPV (AcMNPV) alau Orgyia pseudotsugata SNPV (OpSNPV).

Bagaimanapun pada masa ini terdapat Baeulovirus yang boleh menginfeksi lebih

dati satu spesis pemmah, maka perlu diadakan pengkelasan lain.

2.3 Morfologi

Keunikan pada ViOlS ini adalah partikel virusnya yang terangkum dalam

kristalin protein atau barlan inklusi polihedra (PID). Virion terdiri dati satu atau

6

lebib nukleokapsid yang lladat elektron berbentuk rod dan bersalut.

Nukteokapsidnya mempunyai purata diameter antara 30 nm hingga 60 nm dan

paqjangnya antara 250 run hingga 300 nm; datam sub-famili Eubaculavirinae.

Bagi virion yang dati sub-famiJi Nudibaculavirinae pula mengandungi satu atau

dua jenis. Oryctes rhinoceros mempunyai projeksi yang berbentuk paqjang dan

ekor yang tajam (10 x 270 nm) terlekat pada hujung nukleokapsid yang bersaiz 100

x 200 nm. Sementara virus yang menjangkiti Heliothis zea yang tidak mempunyai

matriks protein mempunyai morfologinya yang sarna seperti baculovirus yang ada

mat.riks protein tetapi mempunyai panjang dua kali ganda, berukuran 80 nm x 414

nm (Wilson, 1991).

2.3.1 8truktur virion

Nukleokapsid dikenatpasti berbentuk rod berdiameter 40 nm dan panjang

350 nm (Kelly, 1985). Bahagian luamya adalah kapsid. Kapsid dipercayai

menolong mengekalkan bentuk rod dan silinder nukleokapsid. Kapsid

menghasilkan bebera}')a bentuk struktur. Beaton dan Filshie (1976) mendapati 4.5

nm subunit tersusun datam bentuk cakera dan ianya sarna bagi NPV dan GV.

Harrap (1972) pula mendapati kewujudan substtuktur yang be1um dapat

dikenalpasti lagi citinya. Budey et ai. (1982) mengesahkan pemerhatian tersebut

yang memperlihatkan ke~iudan hentuk kapsid terdiri dari monomer sistem heliks­

12 yang tersUSlID dalam bentuk cincin 3 lapisan berulang padajarak 13.2 mn.

7

Pelbagai struktur telah diperhatikan pada hujung nukleokapsid yang dikesan

mclalui peJbagai pewamaan. Tipula paludosa NPV mempunyai ekor yang

berdiameter 10 nm dan panjang 300 11m. Ekor tcrsebul bcrlipat atau melingkari

antara nukleokapsid dan salut (Kelly, 1985). Ada juga struktur yang seperti kuku

diperhatikan samada satu atau kedua-dua hujung (Teakle, 1969). Polatiti dalam

nukleokapsid ini menolong <lalam pembuangan kot pada genom virus iaitu dalam

replikasi vinlS dalam sel perumah (Blissard dan Rohrntann, 1990). Kebanyakan

nukleokapsid terdiri dati 2 jenis protein utama iaitu protein teras dan protein salut,

yang menghasilkan 3 hingga 4 polipeptida minor (Summers dan Smith, 1918).

)artikel virus terdiri dari nukleokapsid yang bersalut berbentuk rod dan

kebanyakannya telah dipencilkan mengandtmgi. satu nukteokapsid yang bersalut.

Perbezaan antara SNPV dan MNPV masih lagi dipertikaikan. Salut nukleokapsid

mungkin diperolehi samada secara de novo dalarn nukleus atau melalui penwlasan

dalam membran plasma (Blissard dan Rolumann, 1990). Kebanyakan virus yang

memperolehi salut pada membran plasma adalah sarna ada tunggal alau dubel

manakala nukleokapsid pada MNPV terbentuk dalam nukleus (Kelly, 1982).

Terdapat perbezaan diantara salutan virus yang terbentuk di nukleus dan membran

plasma dali segi serologi. Vims yang berasal dari nukleus wujud dalam polihedra

dan berfungsi untuk metliangkiti serangga lain, manakala virus yang mempunyai

salut dari membran akan menjangkiti tisu-tisu sel perumah (Blissard dan

Rohrarnnn, 1990). Vinls dalam polihedra mempunyai bentuk tertentu yang

8

membolchkannya bergabung dengan membran plasma perot pada plI yang

hcralkali tinggi. Virus yang berasal dati membran plasma pula menjangkiti sel

pcrumah pada pH neutral atau hampir asidik. Salut dipercayai mengandungi lipid

kerana kebolehannya untuk larut dalam eter dan serbuk pencuci semasa penyediaan

nukleokapsid (Kelly, 1985).

2.3.2 Struktur polihedra dan granul.

Protein ktistaljn mClllpakan perkara yang paling menarik dalam pencirian

Baculovims. Baculovirus adalah satu-satunya kumpulan yang menghasilkan protein

kristalin intranuklear walaupun diketahui sitoplac;mik polihedrosis dan virus pox

diJingkungi dalam sitoplasmik kristalin protein. (Kelly, 1985). Berbanding dengan

GV, polihedra adalah matriks kristalin yang besar bersaiz antara 1 hingga 4 J..Ut1

(Kelly, 1985). Satu-satu polihcdra boleh mengandungi lebih seratus partikel. Bagi

GV, granulnya berbentuk ovisilindtikal, panjangnya antara 0.3 hingga 0.5 JUll dan

lebar antara 0.] hingga 0.4 ~un, dan mengandungi hanya satu partikel virus (Kelly,

]985). flagaimanapun kini ldah ada bukti yang menunjukkan bahawa GV boleh

mengandungi 2 hingga 5 partikel virus (Crook et al., 1982). Bahagian yang paling

menarik pada polihedron adalah kekisi kristalinnya yang bersiJang-siJang.

Polihcdron juga dipercayai mempunyai agregasi oktomer polipeptida sehagai

suhunitnya (Kelty, 1985). Kriteria utama polihedra adalah ianya stahiJ pada pH

9

sederhana dan tahan pH beraJkati tinggi. Polihedra boteh tedamt dati pH 9.5 ke

atas (Kelly, 1985).

Pemecahan in vitro akan melarutkan polihedra dan membebaskan partikel

V1t1Js. Aktivili protease bolch memudahkan pemecahan. Protcin polihedron

mempunyai titik isoclcktrik 5.8 dan akan dikristalisasikan pada pH yang rcndah

(Kclly, 1985). Polihedra yang matang dikelitingi oleh satu lapisan luar yang jelas;

din~juk scbagai salutan polihedron. Fungsinya mungkin sebagai pelindung pada

radiasi ultra violet dan juga untuk interaksi dengan lapisan permukaan luar.

Ketcbalan salutan antara 6 hingga 10 nm dan tcrdiri dari karbohidrat (Minion et al.,

1979).

2.4 Strnktur protein

Pencirian melalui struktur protein mempunyai potensi untuk pengkelasan

virus meskipun hanya melibatkan beberapa spesis Baculovirus tertentu sahaja.

Protein kapsid virion adaJah kompleks dan mengandungi antara 12 hingga 30 jalur

polipeptida, bergantung pada spesis tertentu. prom polipeptida polihedrin untuk

setiap Baculovirus adalah spesifik antara MNPV dan SNPV. Summers dan Smith

(1978) mcndapati bahawa kapsid AcMNPV mengandungi 2 potipeptida ut.1ma, VI'

18.5 dan VI' 37. Kapsid Rachiplusia ou MNPV terdiri dari 5 potipeptida utama.

to

Sementara kapsid protein Heliothis zea SNPV terdiri dari 3 polipeptida utama iaitu

VP 16, VI' 28 dan VP 63; VP 16, VP 17 dan VP 31 adalah untuk GV.

Jalur-jaluf protein polihedra dikesan meJalui SDS-PAGE selepas

pemecahan di bawah keadaan alkali dengan kehadiran alkalin protease. Granulin

biasanya difosforilasi dan memainkan peranan penting sebagai protein kromosomal

unluk mengaktivasikan transkripsi olelt pelbagai gen pada peringkat sel (Kurstak,

1978). Protein matriks hadan inklusi terdid dati satn aggregasi poJipeptida ulama

dengan berat moJckul antara 27,000 D hingga 34,000 D; bergantung pada spesis

(Kelly, 1985). Tiada perbezaan yang nyata antara protein matriks NPV dan GV.

Bagaimanapun dengan penentuan saiz dan profd protein melalui SDS-PAGE dan

pemetaan peptida dapat membezakan antara pemencilan virus yang berlainan

(Enswistle dan Evans, 1985).

2.5 Asid nukleik

Genom Baculovirus wujud dalam 3 bentuk iaitu linear (dlDNA), bulat

relaks (reDNA) dan 'covelently closed' (ccDNA) (Summers, 1977). Derat

molekuLnya antara 90 hingga 230 kb dan ia merangkurni 8 hingga 15% berat zarah

virus. Manakala panjang DNA llaculovirus lebih kurang 40 ~un (Kelly, 1985).

Kandungan guanin dan sitosinnya antara 28 hingga 59% (Wilson, 1991). Berat

II

molekul DNA dati 4 spesis yang menjangkiti Spodoptera lain iaitu S. !mgiperda, S.

exempta, S. exigua dan S. littoralis lebih kurang 67.8 x 106, 82.5 X 106

, 65.4 X 106

dan 62.4 x 106 D masing-masing (Kelly, 1977).

Vi antara teknik-teknik yang telah digunakan untuk mengkaji DNA

ternlasuklah kajian mikroskop elektron, sedimentasi , perkaitan kinetik (kinetic

reassociation), analisis dengan enzim pembatas dan hibtidisasi (Smith dan

Summers, 1978). DNA NPV yang dipencil dati empat spesis Spodoptera

menunjukkan jujukan nukleotida homolog iaitu antara 15% dan 17%.

2.6 Infeksi dan replikasi virus

nacutovirus memulakan replikasinya pada bahagian perut tengah

(endodermal) larva setelah ditelan oleh serangga. Matriks protein polihedra akan

pecah apabila melalui perut larva yang mempunyai persekitaran alkalin (pH 9.5

hingga 11.5) dan memisahkan selaput nukleokapsidnya. Alkalin protease yang

terkandung dalam perut tengah larva membantu meninggikan kadar pemecahan

nukteokapsid (Vlak dan Rohrmann, 1985). Virion terbebas akan memasuki

perumah melatui percantuman setaput virion dengan mikrovilus pada sel epitelia di

perut tengah. Nukleokapsid akan dibawa ke nukleus dan kot protein akan tanggal

seawal-awalnya satu jam selepas infeksi. Virus akan melalui pusingan replikasi

12