r UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES .... . . . . . ...... .. .... . . . . . ........ DIPLOME D'ETUDES APPROFONDIES CHIMIE ET BIOCHIMIE DES PRODUITS NATURELS MEMOIRE PRESENTE LE8 Novembre 1993 PAR SERIGNE MBACKE DIOP SUJET: INFLUENCES DE LA CONCENTRATION INITIALE EN GLUCOSE ET EN MATIERES AZOTEES SUR LA CROISSANCE ET LE METABOLISME DELA CTOBA CILLUS DKP EN CULTURE CONTINUE IURY PRESIDENT: Mr. ABDOULA YB SAMB EXAMINATEURS: MM MOMAR DIENG JEAN LORQUIN MOUHAMÀDOU DIOP SALL EMMANUEL TINE ANNEE UNIVERSITAIRE 1992 - 1993
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DIPLOME D'ETUDES APPROFONDIESCHIMIE ET BIOCHIMIE DES PRODUITS NATURELS
MEMOIRE PRESENTE LE 8 Novembre 1993
PAR
SERIGNE MBACKE DIOP
SUJET: INFLUENCES DE LA CONCENTRATION INITIALE EN
GLUCOSE ET EN MATIERES AZOTEES SUR LA CROISSANCE
ET LE METABOLISME DELACTOBACILLUS DKP EN CULTURE
CONTINUE
IURY
PRESIDENT: Mr. ABDOULAYB SAMB
EXAMINATEURS: MM MOMAR DIENG
JEAN LORQUIN
MOUHAMÀDOU DIOP SALL
EMMANUEL TINE
ANNEE UNIVERSITAIRE 1992 - 1993
YI. M.9L !F.9l9If.ILL'E
.9l. trous !M'ES .9l9If.IS
REMERCIEMENTS
Le présent rapport est l'aboutissement du travail derecherche que nous avons effectué depuis deux ans auLaboratoire de Biotechnolog~e et d'Energétique (LBE) del'ENSUT. .
Nous exprimonsMouhamadou DIOPavoir accepté,préparation derecherches.
toute notre reconnaissance au ProfesseurSALL directeur -du laboratoire pour nous yfourni les conditions favorables à la
ce travail, et pour avoir supervisé nos
Qu'il nous soit permis de remercier M. Yannick COMBET-BLANC,chercheur à l'ORSTOM, pour nous avoir initié aux techniquesde la Microbiologie anaérobie, et aidé à réaliser cetravail.
Nous remercions tout particulièrement M. Emmanuel TINE,maître-assistant à l'ENSUT, qui nous a fait bénéficier deses nombreux conseils et nous a apporté une aide active dansl'élaboration et la présentation de ce mémoire de DEA. Nouslui exprimons toute notre gratitude~
Nous adressons nos remerciements au Professeur AbdoulayeSAMB qui nous fait l'honneur d'accepter la présidence de cejury.
Nous exprimons nos plus sincères remerciements à MM. MomarDIENG Professeur à la Faculté des Sciences et Techniques,Jean LORQUIN chercheur à l'ORSTOM pour avoir accepté dejuger ce travail et d'être membres du jury.
Que M. Demba SOW, maître-assistant à l'ENSUT, trouve icil'expression de notre reconnaissance pour son précieuxconcours dans la réalisation matérielle de ce document.
Nous tenons également à remercier notre ami Marne CambelDIENG pour nous avoir initié au traitement informatique, etdonné un avis critique sur ce travail.
A nos camarades de laboratoire Pape SENE, Gabriel DAH-ZOGBO,et Robert MBIAKE, nous disons merçi pour l'aide précieuse etla disponibilité dont ils ont toujours fait montre.
Nous ne saurions terminer sans associer à ces remerciementsSamba BARRY, technicien au laboratoire, pour son appui toutau long de ce travail.
A mes amis Ibou K. Gueye, Jules, Nabou, Jackie... , à mesfrères Pape, Ousin, et à tous çeux qui, de près ou de loin,auront contribué à la matérialisation du présent document,je traduis mes vifs remerciements.
(principales voies, régulation, enzymes mises en jeu)
1 ~
2.2-SUBSTRAT AZOTE
Les espèces microbiennes hétérotrophes ont besoin de
source d'azote organique ou minéral. Outre son rôle dans
l'édification cellulaire, (20, 27, .34) les nutriments azotés
sont aussi des stimulants de la croissance (33).
Certains n'obtiennent leur azote que par l'intermédiaire
de peptones (petits polypeptides) résultant de l'hydrolyse de
protéines. Ces peptones doivent contenir un ou plusieurs
acides aminés essentiels tels que le tryptophane ou l'acide
glutamique.
Certaines bactéries lactiques peuvent utiliser l'ammoniac
comme source d'azote. Cest le cas de Streptococcus bovis
(48). Cet ammoniac provient soit des sels d'ammonium (sulfate
ou phosphate), ou du catabolisme des acides aminés.
Les extraits de levure, qui sont utilisés comme source
d'azote dans les milieux de culture des Lactobacillus,
contiennent en plus des N'-am~nes, des sucres, des sels
minéraux, et des facteurs de croissance.
2.3 FACTEURS DE CROISSANCE
La culture sur milieux synthétiques de bactéries
hétérotrophes révèle une exigence en substances complexes ne
pouvant provenir que de synthèses à partir des substrats
carboné et azoté disponibles. Elles sont classées en trois
groupes:
2.3.1 VITAMINES:
Elles jouent surtout le rôle de coenzymes. C'est le cas
de nlcotinamide (NAD), de flavine (FAD, FMN) , de thiamine,
indispensables dans les reactions du métabolisme énergétique.
1L1.
COENZYMES FONCTIONS
vitamine B6 Coenzyme fondamentale de la biosynthèse des
(Pyridoxine) acides aminés (catalyseur des réactions detransamination et de décarboxylation)
vitamine BI Coenzyme intervenant dans le cycle de Krebs et
(Thiamine) la décarboxylation oxydative de l'acidepyruvique
Coenzyme A Coenzyme en cause dans le fonctionnement de
(dérivé de nombreux systèmes enzymatiques,l'acide particulièrement dans la synthèse des acidespantothénique) gras, la décarboxylation de l'acide pyruvique,
etc.
Acide foliquE Transfert de radicaux monocarbonés (-COO,CH20H, -CH=NH, - CH3, etc.
Biotine Coenzyme des réactions de transport du C02·(Vitamine H)
Coenzymes Constituants fondamentaux des coenzymesd'oxyda- pyrimidiques comme le NAD, le NADP, qui
réduction interviennent dans les réactions de la chaîne
respiratoire
vitamine B2 constituant fondamental des coenzymesflaviniques, comme le FAD, qui participent aufonctionnement des déshydrogènases.
Tableau 1: Action coenzymatique de quelques vitamines
nécessaires aux bactéries hétérotrophes
Certaines de ces vitamines comme les acides pantothéniqueet nicotinique sont exigées par presque toutes les espèces du
, ,genre Lactobacillus, d'autres telles que la thiamine sontexclusives des espèces hétérofermentaires.(4)
2.3.2 BASES PURIQUES ET PYRIMIDIQUES
Pour certaines espèces la synthèse de métabolites aussi
essentiels que les bases puriques et pyrimidiques (entrant
lt:
dans la composition des acides nucléiques) n'est pas
possible. Il doivent être fournis comme tels. Ainsi
Lactobacillus delbrueckii exige des dérivés d'acides
nuléiques pour sa croissance (47).Ces bases sont également identifiées comme facteurs de
croissance contenus dans les extraits de levure (33) et les
infusions de blé (15).
2.3.3 ACIDES AMINES
Les acides aminés nécessaires à l'édification des
protéines cellulaires ne sont pas tous élaborés par
interconversion des voies métaboliques. Dans ce cas ils
doivent être fournis préformés. On comprend dès lors
l'importance de l'extrait de levure comme stimulant de la
croissance, puisque contenant 18 acides aminés; le
tryptophane étant majoritaire (80% ) de la fraction la plus
stimulante pour Streptococcus lactis (33). S.bovis utilise la
glutamine plutôt que son dérivé acide (14) alors que la
phénylalanine stimule la croissance de L.casei (15).
On peut toutefois noter qU'outre ces trois catégories de
substances d'autres peuvent jouer le rôle de facteurs de
croissance. Il en est ainsi pour L. ca sei avec des
polypeptides, des peptides pour S.lactis, des composés azotés
simples pour Lactobacillus et Leuconostoc. Certains auteurs
pensent que des éléments minéraux tels Fe, Mg, et Mo
(présents dans l'extrait de levure) stimulent la croissance
(33) •
le:..
III. MATERIEL ET METHODE
1 LE MICROORGANISME
La souche utilisée est une bactérie lactique isolée du
vin de palme en 1988 par une équipe de chercheurs du
Laboratoire de Biotechnologie et d'Energétique. Les études
préliminaires montrent qU'elle ,appartient au genre
Lactobacillus, et au sous-genre Streptobacter ium.
Lactobacillus DKP présente les caractéristiques suivantes:
- Un optimum de température à 52°C , la crois sance
s'arrête à 60°C.
- Des pH compris entre 5,5 et 8,5 avec un optimum à 7,2
(16) .
- L. DKP a une croissance rapide sur milieux riches, son
taux de croissance spécifique maximal (pmax) serait voisin de
1,5 h- 1 (10).
- Le pourcentage molaire moyen en bases (G + C) de l'ADN
est de 37,2%
- Un large spectre de sucres est utilisé par L. DKP : D
glucose, lactose, saccharose, amidon. Le métabolisme du
glucose est fermentatif, hétérolactique facultatif (10, 16).
- Une observation directe au microscope photonique nous
~ontre que L. DKP se présente sous la forme d'un bacille
grêle très mobile, caractère peu commun au genre.
Des travaux en vue de compléter l'identification
taxonomique se poursuivent.
2 LES MILIEUX DE CULTURE
2.1 LE MILIEU DE DEMARRAGE
Le milieu de démarrage dérive du milieu de culture mère
dont la composition est la suivante:
17
Glucose
Extraits de levure
Biotrypcase
Solution minérale SMY*
20 g/l
10 g/l
10 g/l
100 ml/l
La concentration en
azotés (biotrypcase,extraits
facteur à étudier. En azote
seront de 3 à 6 g/l AZT; 2g/1
prises quand le glucose est le
glucose ou en produits
de levure) est fonction du
limitant, les concentrations
de glucose et 5 g/l AZT seront
facteur limitant.
2.2 LES MILIEUX POUR L'INOCULUM
On ensemence 2ml de la souche dans 38ml d'un milieu
liquide dont la composition est la suivante:
Glucose 5g/1; Extraits de levures 5g/1; NH4Cl 0,5g/1;
Ces milieux dérivent aussi du milieu de base. Leur
composition sera différente selon le facteur à étudier:
- Dans le cas des cultures en azote limitant on utilise
un excès de glucose (concentrations toujours voisines de
35g/1). Les concentrations en azote varient alors de 0,43 g/l
à 8,10 g/l.
Lorsque le glucose est le facteur limitant la
croissance, la concentration en produits azotés est fixée à
environ 4,94 g/l.
Dans les deux cas la concentration de la solution
minérale SMY* du milieu de base reste inchangée.
3 PREPARATION D'UNE CULTURE CONTINUE
La culture continue de L. DKP a été menée dans un
fermenteur Wheaton de 250ml de volume utile 200 ml.
* Pour la canposition voir annexe
1R
1 INSTALLATION
Les différentes ouvertures du réacteur sonthermétiquement fermées avec des bouchons munis de septum. Desaiguilles piquées à travers les septa permettent l'arrivée de
gaz et des différentsmilieux, le prélèvement des échantillons et la sortie de
milieu. Un orifice dans le septum du bouchon central permetla suspension de l'électrode pH stérilisablei le pH estcontrôlé par l'arrivée de soude au niveau du même septum.
Les conditions d'anaérobiose sont assurées par un courant
permanent d'azote gazeux au niveau du fermenteur, suffisantpour chasser tout l'air.
Une agitation de 100 tours/mn est maintenue toute ladurée de la fermentation (agitateur ROTOLAB).
Un régulateur de pH (New Brunswick Scientific Co. modelpH 4000) qui active des valves ajoute de la soude 3N aufermenteur dès que le pH dépasse 7,2. Un pH de 7,1 ± 0,1 est
ainsi mainte'nu toute la durée de la fermentation.
La température constante du réacteur est assurée par un
courant d'eau de 50 oC , chauffé par un
thermoplongeur(Bioblock Scientific), et circulant entre lesparois du fermenteur.
Durant toute la fermentation des pompes péristaltiques
(GILSON) sont utilisées pour approvisionner le réacteur en
milieu neuf, à un taux constant. Une deuxième serie de pompes
péristaltiques (Interscience), opérant à un flux plus élevé,maintient le volume dans le fermenteur constant en aspirant
tout· excédent du volume utile. Le débit est calculé à partir
du volume de milieu déversé dans le fermenteur, par unité detemps.
Les bouteilles de milieux, avec les mêmes conditions
d'anaérobiose, sont maintenues en agitation constante à latempérature du laboratoire.
Dans les conditions de limitation en azote une bouteille
de milieu glucosé (MB), exempte de substrat azoté, assure lacontinuité de la culture. Un flacon contenant les differents
lq
milieux azotés (MD), sans glucose, apporte le complément
nutritif.
3.2 CONDUITE DE LA FERMENTATION
La culture continue débute par l'injection d'un inoculum
dans le milieu de démarrage stérile. Cet inoculum est un
batch d'environ 8 heures, de 2 ml de culture mère de L. DKP
dans 38 ml de milieu pour inoculum, de manière à avoir une
concentration approximative de 1.106 cellules/ml.
Les prélèvements pour la lecture de la densité optique
sont faits à partir du milieu fermenté. L'échantillon est
pr~levé dans un tube stérile contenant une soluton
acidifiante (voir annexe) pour arrêter la croissance
microbienne. Le volume de solution acidifiante diffère selon
que l'on effectue une simple mesure de densité optique (0,5
ml) ou que l'on conserve l'êchantillon en vue d'une analyse
(1 ml).
La prise d'êchantillon est effectuée en fonction du taux
de dilution entre 8 à 12 heures après l'incubation, et toute
les heures jusqu'à la stabilisation de la croissance.
4 METHODES DE MESURE DES PARAMETRES ETUDIES
4.1 MESURE DE LA CROISSANCE
On mesure la densité microbienne dans le fermenteur par
lecture de la densitê optique(D.O) avec un spectromètre
(Spectronic BAUSCH & LOMB Inc. modèle 21). Pour de trop
fortes concentrations bactêriennes , des dilutions appopriées
sont faites avec une solution de dilution (voir annexe)
Il existe un rapport entre 0.0 et poids sec de cellules.
Il diffère selon les bact~ries; pour L. DKP ce rapport est de
0,359/1 de poids sec par unité de D.O (10). La quantité de
biomasse est donc déduite à partir des mesures de D.O.
20
4.2 DETERMINATION DU TAUX DE DILUTION
Le taux de dilution(D) est le rapport entre le débit de
milieux entrant (ou sortant) et le volume utile du
fermenteur. Ce débit est obtenu par mesure du volume de
milieu déversé par unité de temps. Le volume utile du
reacteur est mesuré après la fermentation.
4.3 DOSAGE DES PRODUITS FINAUX
Les concentrations en Lactate, Acétate, et Ethanol du
milieu fermenté sont obtenues par dosages chromatographiques;
celles du glucose résiduel le sont par dosages enzymatiques.
4.3.1 DOSAGES CHROMATOGRAPHIQUES
Un chromatographe en phase gazeus~ Delsi Instruments
serie 300, équipé d'un détecteur à ionisation de flamme, est
utilisé pour les dosages chromatographiques.
a)_ Préparation de l'échantillon
DOSAGE DU LACTATE
La premiére opération est une méthylation:
- 0,5 ml de l'échantillon
- 0,5 ml de l'étalon interne (isobutyrate 300,15 mM)
- 2 ml de methanol
- 0,4 ml d'acide sulfurique à 50%
On agite, puis on porte au bain-marie à 50 oC pendant 30
mn et on laisse refroidir. On procéde ensuite à l'extraction
du lactate méthylé:
- 1 ml d'eau distillée
- 0,5 ml de chloroforme
On injecte 1 ~l de cette solution dans la colonne de
neopentyl glycol adipate
21
DOSAGE DE L'ACETATE
- 0,5 ml de l'êchantillon
- 0,5 ml d'~talon interne (butyrate 24,35 mM + 180,41 mM
acide orthophosphorique)
On injecte 1 III de la solution dans la colonne de
neopentyl glycol adipate.
DOSAGE DE L'ETHANOL
- 0,5 ml de l'~chantillon
- 0,5 ml d'êtalon interne(60,35 ml de propanol-1)
Pour chacun des produits une gamme étalon est faite pour
êtablir une relation entre surface de pics et concentrations.
L'êtalon interne permet de corriger les légères
variations dans le volume injectê.
b)_ Conditions opératoires fixées
- tempêrature de l'injecteur 250 oC
- tempêrature du détecteur 250 oC
- température du four 170 oC
Colonne neopentyl glycol adipatez
- Pression azote 1,8 bar
- D~bit air 180 ml/h
- Dêbit hydrogène 25 ml/h
Colonne Porapack
- Pression azote
- Dêbit air
- dêbit hydrogène 75
1,2 bar
480 ml/h
ml/h
4.3.2 DOSAGE ENZYMATIQUE
Le principe de ce dosage est le suivant:
Le D-Glucose est phosphorylê en glucose-6-phosphate en
prêsence d'hexokinase(HK) et d'ATP avec formation simultanêe
d'ADP
D-Glucose +H.K
-----I~... Glucose-6-P + ADP
22
En présence de glucose-6-p déshydrogénase(G 6 P-DH), le
G6P est oxydé par du NADP en Gluconate-6-p avec formation de
NADPH,H+.
+'G-6-P + NADP
G6P-DH------1....~ Gluconate-6-P + NADPIl,II+
On utilise les Kits Boehringer-Mannheim (cat. n° 716 251)
qui permettent de doser 4 ~g à 50 ~g de D-Glucose à 340 nm
après lecture de la DO au spectromètre uv.
La formule générale de calcul des concentrations pour ce
type de dosage esta
c = v . PM. DOE • d • v. 1000
Oùa
- C =
v =PM =E =
concentration de la substance testée (g/l)
volume final (ml)
poids moléculaire de la substance testée (g/mol)coefficient d'absorption du NADH (6,3 l.mmol- 1 •
cm-1 à 340nm)
- d = chemin optique (cm)
- v = volume de l'échantillon (ml)
- Si l'échantillon est dilUé, le résultat est multiplié
par un facteur de dilution F.
23
5 DETERMINATION DES PARAMETRES ETUDIES
5.1 PARAMETRES DE LA CROISSANCE
Vitesse spécifique de croissance(p)
Le taux (ou vitesse) spécifique de croissance, ~, est pardéfinition la quantité de poids sec for~e par mg de cellules
par heure (mg/mg poids sec par h ou h-l). On obtient ~ par la
relation suivantes
Il =
Lorsque la fermentation est en régime permanent et
stabilisé (conditions réunies lors des mesures) ~ estidentique à 0 le taux de dilution (rapport entre le débit
entrant et le volume utile). C'est donc invariablement que
l'on utilise l'un ou l'autre paramétre.(22, 24, 30, 35)
5.2 PARAMETRES DU METABOLISME
Une grande partie du substrat utilisé sera métabolisée.
La valeur du substrat métabolisé (ds/dt métabolisé) est
donnée pars
ds/d~ m'~. - ~ (Si - Sr)
Où Si, Sr sont les valeurs des substrats initial et
résiduel
Une fois métabolisé le substrat sera trans formé en
biomasse, produits, et en énergie de maintenance.
5 • 2 • 1 BIOMASSE
Le rendement théorique de la biomasse Yx/s est obtenu en
faisant le rapport entre les dérivées de la biomasse et du
substrat considéré (glucose ou nutriments azotés).
Yx/s - dx/ds
24
Ceci donne dans la pratique 1
Yx/s - X/Si-Sr
Ce paramètre exprime la masse de cellules obtenue par
mole (glucose) ou par g (AZT) de substrat considéré.
On peut aussi exprimer à partir de cette équation le taux
spécifique de consommation du substrat qs:
qs - ~ / Yx/s
5.2.2 MAINTENANCE
L'énergie de maintenance par mole de glucose consommé est
obtenue en utilisant l'équation de Pirt (1965):
l/Yx/s - ~~ + l/YO (1)
où ma est le coefficient de maintenance, YG le rendement
maximal de la croissance
L'équation (1) peut être transformée comme suit:
(2)
En traçant la courbe qs en fonction de ~ on détermine mG
par extrapolation à ~ =0 • YG est aussi obtenu graphiquement.
5.2.3 PRODUITS
On exprime les rendements des produits en fonction de la
biomasse (Yp/x), et en fonction du substrat (Yp/s)
Yp/x - p /X
Avec P concentration du produit en g/l, et X est la
biomasse exprimée en g/l. De cette équation on déduit la
productivité en métabolite:
qp - ~/Yp/x
25
Le rendement en produit est alors le rapport entre le
taux de production (productivité) du métabolite et le taux de
consommation du substrats
Yp/s - qp/qs
_ Le rapport molaire en produit est le quotient de la
concentration en lactate sur la somme des concentrations
d'acétate et éthanol (lactate/ éthanol + acétate). Ce rapport
permet de suivre l'évolution du métabolisme du glucose.
Les voies métaboliques de la dégradation du glucose
peuvent être définies avec le calcul du pourcentage de
conversion du glucose en lactates% conversion G ----->L = L/Glc • 100
L et Glc correspondent aux concentrations respectives du
lactate et du glucose consommé.
_ Le pourcentage de recouvrement en carbone (% C)des
produits du métabolisme sur le glucose traduit l'orientation
du métabolisme glucidique; il permet de confirmer si tout le
glucose a été utilisé pour l'élaboration de certains produits
du métabolisme.
%C _ (nL. L) + (nA. A) + (nE. TI)
nG. G
Avec L, A, E et G concentrations respectives de lactate,
acétate, éthanol, et glucose. Les coefficients nX
représentent le nombre de carbone par mole du produit
considéré. Il est exprimé pars
nX - 12 CI... / PMx
12 =poids molaire du carboneC/m =nombre d'atomes de carbone par molécule
PMx =poids moléculaire du produit X.
26
5 .3 PARAMETRES ENERGETIQUES
L'énergie issue du catabolisme du glucose est stockée
sous forme d' ATP. Le gain net d' ATP par mole de glucose
transformé en pyruvate est de 2 moles; la formation d'acétate
donne un supplément d'une mole d' ATP. Toutefois, tout le
glucose n'est pas fermenté (il sert de source de carbone et
d'énergie) et la partie dissimulée est approchée par
l'équation suivante 1 (38)
Ole. diBBimul~ - 180 -5/4Yglc
180
Par conséquent le taux spécifique de production d'ATP,
qATP, est ainsi calculé (35)1
qATP = 2qGlc (180 -S/4Yglc) + qu:é
180
En utilisant l'équation déduite de celle de Pirt commeprécedemment on obtient YATP et sa valeur maximale Ymax, ainsi
que le coefficient de maintenance pour l'ATP (mATP)1
qATP - ~/YATP - ~/Ymax + mATP
27
1 GLUCOSE LIMITANT
Le glucose est un facteur limitant pour la croissance de
L. DKP jusqu'à une concentration de 20 g/l (16). Il nous a
paru int~ressant, à une concentration moyenne de 8,2 g/l de
glucose, d'~tudier les effets de cette limitation du substrat
~nerg~tique sur L. DKP en culture continue. La variation dutaux de dilution D (de 0,18 à 1,26 h- 1 ) permettra de suivre
cet effet sur la croissance et le métabolisme fermentatif.
Aux plus faibles valeurs de ~ les rendements sont faibles(12,86 g en poids sec d'organismes par mole d'ATP).
Rendement maximal en ATP et énergie de maintenance
Le rendement maximal en ATP (Ymax) et le coefficient de
maintenance pour l'ATP sont calculés à partir des résultatsexpérimentaux.
0,06:a- y =0,007 + 0,029x R =0,88
I!I.0,05
SI.S 0,04•.,-~
0,03
.. 0,02li
0,01-~ 0,00;,1
-0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
Fig.?: qATP en fonction de JlJl(h-l)
La fonction qATP = f (~) permet de tirer l'équation de ladroite suivante:
y = 0,007 + 0,029x
Cette équation de la forme:
qATP = mATP + ~/Ymax
Nous donne par sa résolution mATP = 0, 007mol ATP / gbiom.h, et Ymax = 34,48 g de biomasse par mole d'ATP.
La valeur maximale theorique de 35,96 g/mol ATP n'est pas
atteinte, 0,007mole d'ATP étant utilisée pour la maintenance
cellulaire.
37
2 AZOTE LIMITANT
La concentration de 3,5g/l en azote est limitante pour lacroissance dans les cultures en batch (10). Nous avons alorsessayé, à partir de charges azotées variant entre 0,43g/l et
8, 19/1, de voir l'influence de cette limitation sur lemétabolisme de L. DKP et sur sa croissance dans un chemostat.
Pour cela nous avons fait varier le taux de dilution de 0,16h-1 à 1,05 h-1•
2.1 ETUDE DE LA CROISSANCE
2.1.1 Production de biomasse
La production de biomasse en fonction du taux de dilution
et de la concentration en matières azotées est donnée par la
figure 8.
1,50
1,25
C-1,00-b.O....... 0,75lI:I
tata 0,50<:E:0 0,25....= 0,00
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
1,02
7,0 8,0 AZT (g/l)
Fig. 8: Evolution de la biomasse en fonction de AIT et de D
Ce graphe permet de faire les observations suivantes:
- AZT est limitante pour la croissance à faibles
concentrations (de 0,43 g/l à 3,61 g/l). En effet pour les
concentrations inférieures à 3,61g/l on note une augmentation
linéaire de la biomasse avec la charge azotée. Au delà cet
effet s'atténue puis disparait, laissant apparaître une
38
croissance limite Xmax pour chaque valeur de D étudiée (à
1,02 h-1 on note une valeur de xmax égale à 0,65g/1).
- Le taux de dilution influe également sur la croissance
du microorganisme. L'augmentation de D a pour effet de
diminuer la production de la biomasse avec comme conséquence
des valeurs de Xmax faibles. La détermination puis la
comparaison entre ces valeurs permet de mieux apprécier les
variations de la croissance cellulaire.
Xmax à 0,16 h- 1 peut être déterminée par la
représentation en double inverse de la biomasse en fonction
de la charge azotée.
y = 0 /226 + 0/976x R = 1,003,0
2,5
l>4 2,0-...1,5
1,0
0,5
0,00,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 lIAZT
F~. 9: Représenafunendouble inveœ de X=f(A21) à 0 ,16 h-l
On a une relation de type l/X = 0,226 + 0,976/AZT.
L'intersection de cette droite avec l'axe des ordonnées
donne l'inverse de la croissance maximale, d'où Xmax = 4,42
g/l.
La diminution du taux de dilution de 1,02' h- 1 à 0,16 h- 1
accroît de 6,8 fois la production maximale de biomasse.
2.1.2 Rendements de la croissance
Le graphe 10 exprime le rendement de la croissance
(AZT/X) en fonction de D.
39
12
10
4
2
0,800,600,400,20 1,00D(h-l)
Fig. 10: Rendement (AZT/X) en fonction du taux de dilution
Fig. 12: rendements en acétate(Ace/X) et éthanol(Eth/X) en fonction de D à SOg/l AZT
Alors que le rendement éthanol varie avec D, celui de
l'acétate varie en sens inverse; L'acétate est synthétisé
prioritairement à faible taux de dilution. L'allure du graphe
permet de conclure que la somme de ces produits
hétérolactiques donne un rendement globalement constant.
2.3 PARAMETRES ENERGETIQUES
Au regard de la consommation du glucose nous avons
calculé, de la même manière que pour le glucose limitant, le
taux de production et le rendement en ATP.
La variation de ces paramètres en fonction de la charge
azotée est donnée à faibles taux de dilution (0,16 h- 1 et
0,53 h- 1 )par le tableau Il.
45
AZT y ATP
0,54 0,015 0,032 5,00
1,67 0,013 0,028 6,07
2,51 0,012 0,027 6,67
0,53 h- 1
0,73 0,060 0,120 4,42
1,77 0,032 0,062 8,55
2,67 0,020 0,042 12,62
Tableau Il: Evolution des paramètres énergétiques à faibles
taux de dilution (0,16 h-1 et 0,53 h- 1 )
Alors que les taux de consommation spécifique du glucose
(qGlc) et de production spécifique d'ATP (qATP) évoluent à
l'inverse de la charge azotée, le rendement en ATP varie avec
AZT. On note la diminution de YATP avec le taux de dilution
pour les faibles charges azotées:
- Le rendement est de 5g de biomasse/mole d'ATP à 0,16 h
l pour 0,54g/1 AZT
- Pour une valeur supérieure en AZT (0,73g/l) on obtient
à 0,53 h- l un rendement en ATP de 4,42g/mole.
Cette tendance se maintient puisque pour un taux de
dilution de 1,02 h- l (Tab.12) le rendement à 1,10g/1 AZT
n'est que de 2,12g de cellules/mole d'ATP.
AZT qGlc qATP y ATP
(qll) (mollq.h) (mollq.h) (qlmol)
1,10 0,236 0,471 2,12
1,47 0,125 0,246 4,15
2,56 0,088 0,172 5,93
2,73 0,078 0,151 6,89
3,61 0,013 0,020 48,50
5,44 0,012 0,021 50,00
Tableau 12: Evolution des paramètres énergétiques à 1,02 h-1 •
Ce tableau montre surtout l'évolution des paramètres
énergétiques en fonction de la charge azotée. Elle est
46
identique à celle des faibles valeurs de D lorsque la
concentration en substances azotées est encore limitante.Lorsque AZT atteint la concentration de 3,61g/l, YATP devient
relativement important, 50g de biomasse/mole d'ATP.La production d'ATP évolue inversement au rendement d'ATP
(Fig. 13).
- Aux plus faibles charges azotées on a une production
maximale d'ATP alors que le rendement biomasse/mole d'ATP estrelativement faible.
...... 60 0,50
~-a- yATP a.
50 ..... qATP b.O0,40 -10"4
~i 40il 0,30 .....51 30 ~,0
0,20 -lM
~-20
~ 0,10 11:I'10
~
0 0,001 2 3 4 5 6
AZT(c l1)
Fig. 13: Evolution comparée de qATP et de Y ATP en fonction de AZT
- Lorsque le substrat azoté n'est plus en concentrations
limitantes pour la croissance, la production et le rendement
en ATP tendent à devenir constants.
47
v. DISCUSSION
1 GLUCOSE LIMITANT
Lorsque la source d'énergie et de carbone est en
concentrations limitantes pour la croissance de Lactobacillus
DKP, le taux de dilution D apparaît comme un facteur pouvant
contrôler l'accroissement de la biomasse.
Il ressort de nos résultats que le taux de dilution (qui
est identique au taux de croissance en régime de culture
stabilisé et permanent) est limitant pour la croissance entre
les valeurs 0,16 h- 1 et 0,6 h- 1 (Fig. 1). Au delà, le taux de
croissance est plus faible, tendant à se stabiliser entre 0,8
h- 1 et 1 h- 1 • L'équation des inverses de la biomasse et du
taux de dilution a permis d'estimer une valeur maximale
théorique de la croissance; Xmax = 0,65g/1 de biomasse.
Au delà de 1 h-1 il apparait un autre facteur limitant de
la croissance cellulaire dans le fermenteur. L'influence de
cette nouvelle limitation est notable sur le rendement
biomasse sur glucose consommé Yglc qui, une fois la valeur
maximale de 64 g de biomasse par mole de glucose atteinte à 1
h- 1 , chute progressivement. Toutefois elle n'affecte pas le
taux de consommation spécifique du glucose, qGlc, qui
augmente proportionnellement à D à toutes les valeurs
étudiées.
Ce taux de consommation a, en outre, permis de déterminer
avec l' ~quation de Pirt le rendement maximal réel de la
croissance. Ce rendement dit "vrai" (30) à une valeur de
64,5g/mole. Le coefficient de maintenance pour le glucose (fiG)
a pu être également déterminé, sa valeur est de 0,002 mole de
glucose par gramme de biomasse et par heure. Cette valeur
négligeable du taux de glucose utilisé pour la maintenance
cellulaire et autres fonctions non anaboliques, en culture
continue, confirme les résultats de Major et coll. (21) pour
L. delbrueckii (fiG = -0,03g/mole).
48
Les produits majoritaires du métabolisme du glucose chez
L. DKP sont en cultures discontinues le lactate, l'acétate,
l'éthanol et le formiate (10). La détermination de la
concentration des trois premiers en cultures continues a
permis d'évaluer le recouvrement en carbone: 54 %; le
formiate (non déterminé) représentant du point de vue molaire
la somme acétate + éthanol (schéma 2).
On note une prépondérance de la voie hétérolactique sur
l'homolactisme, avec des concentrations en éthanol et acétate
supérieures aux quantités de lactate obtenues à toutes les
valeurs de D étudiées. Aux faibles taux de dilution notamment
(0,16 h- 1 et 0,31 h-1 ), on ne note pas de production d'acide
lactique. Toutefois la tendance à l'homolactisme lorsque D
augmente est notable; puisque le taux de conversion du
glucose en lactate varie de 0 à 12,5%. Le rapport molaire
(Lactate/ Acétate + Ethanol) varie également de 0 et 0,16.
L'action du taux de dilution sur la disponibilité en
substrat expliquerait les faibles quan:tités de lactate
obtenues. Ainsi à faible taux de dilution la culture, déja
limitée en glucose, se trouve en état de restriction
énergétique. Les voies métaboliques produisant plus d'ATP
sont privilégiées. La voie homolactique ne fournissant que 2
moles d' ATP par mole de glucose consommée, alors que la
formation d'acétate par hétérolactisme génère Imole d'ATP
supplémentaire, on comprend dès lors la prédominance de la
voie hétérolactique dans de telle conditions de culture.
Du point de vue énergétique le taux de production
spécifique d'ATP, qATP, continue d'augmenter avec le taux de
croissance lorsque le rendement YATP s'abaisse à un taux de
croissance égal à 1 h- 1 • Ce résultat indique qu'à partir de
cette valeur il y a dissociation entre production d'énergie
par voie catabolique et l'utilisation de cette énergie pour
les réactions de biosynthèse (anabolisme) • C'est le
découplage énergétique que plusieurs auteurs ont observé chez
des bactéries (22, 34, 45).
49
A partir du taux de production d'ATP nous avons déterminé
le coefficient de maintenance pour l'énergie chez L. DKP:
mATP = 0,007mol ATP/g biom • h
Le rendement maximal de la croissance pour l' ATP est par
conséquent déduit du taux de croissance ~ et du coefficient
de maintenance.
Ymax = 34,5 moles d'ATP/g de biomasse
Ce rendement énergétique est relativement important
comparé aux 25, 4g/mol obtenus pour Aerobacter aerogenes
(35),ou aux 24,3g/mol trouvés avec Lactobacillus casei (9).
L'énergie produite après découplage est orientée vers des
réactions de "déversement énergétique" (energy spilling
reactions) , (22, 45). Parmi celles-çi on peut citer 1 a
formation de produits de stockage d'énergie tels que les
polysaccharides. Ce phénomène expliquerait l'aspect visqueux
et trouble observé dans nos cultures à très forts taux de
dilution. Cet aspect de la culture, caractérisé par des amas
cellulaires importants allant jusqu'à la formation de"billes" (1mm <il), n'a pas permis d'évaluer le taux de
croissance aux valeurs supérieures à 1,26 h- 1 •
2- AZOTE LIMITANT
Une double limitation s'exerce sur la croissance de L.
DKP dans les conditions de nos cultures:
- Limitation par la charge azotée identique à celle
observée dans les batch (10). Pour des concentrations en AZT
inférieures à 3,5g/l l'augmentation de biomasse est
proportionnelle à celle de AZT. Au delà, il apparaît une
limitation qui serait liée à un autre nutriment tel que les
oligoéléments.
-Limitation par le taux de dilution à toutes les valeurs
étudiées (de 0,16 h- 1 à 1,26 h- 1). La biomasse s'accroît
substantiellement avec l'élevation de D. La biomasse
maximale, Xmax, la plus importante est alors de 4,42g/l et
est obtenue à 0,16 h-1 •
50
Le rendement AZT/biomasse évolue avec le taux de
dilution. Les meilleurs rendements sont enregistrés à faibles
valeurs de D où seulement 1,06 g AZT produisent 19 de
biomasse.
Ces deux facteurs limitants ont une action double.
A toutes les valeurs du taux de dilution étudiées les
quantités de métabolites augmentent avec AZT jusqu'au delà de
3,5 g/l, concentration limitante pour la croissance. Par
contre l'augmentation du taux de dilution diminue les
concentrations en métabolites (Tab. 5 et 6) et par conséquent
les rendements Produits/Biomasse (Fig. Il).
Elle provoque également une modification de la voie
métabolique. Pour une valeur moyenne de 2,55 g d'AZT et à untaux de dilution de 0,16 h- 1 on enregistre un taux de
conversion du glucose en lactate de 56,4%. Ce taux devient
égal à 5,2% à D = 1,02 h- 1 • Ainsi donc on note une nette
évolution du métabolisme vers l'hétérolactisme en augmentant
le taux de dilution.
Les concentrations élevées en substrat azoté favorisent
outre la formation de lactate, d'acétate, et d'éthanol, celle
d'autres métabolites. Cet effet est beaucoup plus marqué aux
forts taux de dilution (1,01 h-1 ) puisque pour 1,1 g/l d'AZT
seuls 5,47% du carbone se retrouvent dans les produits du
métabolisme (acétate, éthanol et lactate; formiate N.D).
Lorsque la concentration en AZT atteint 5,44 g/l on retrouve
jusqu'à 90,73% du carbone dans le lactate, l'éthanol et
l'acétate.
Différents auteurs (35, 45) s'accordent pour dire que du
point de vue des paramètres énergétiques, l'équation de Pirt,
adéquate pour les cultures où la source d'énergie est
limitante n'est plus valable lorsque celle-çi est en
concentration suffisante. De ce fait nous n'avons pu
déterminer Ymax et mATP. Toutefois nous avons observé que le
taux de production spécifique d'ATP, qATP, diminue de manière
51
inverse à
dilution.
rendement
1,02 h- 1 •
la charge azotée alors qu'il croît avec le taux de
Pour une valeur moyenne de 2,55 g/l d' AZT le
YATP augmente de 0,16 h- 1 à 0,53 h- 1 puis décroît à
Dans les conditions de substances azotées limitantes
l'évolution de ces deux paramètres traduit l'absence de
régulation entre la production d'énergie par catabolisme et
son utilisation pour l'anabolisme. En d'autres termes on note
l'apparition du phénomène de découplage énergétique.
S2
VI. CONCLUSION
Nous avons au cours de ce travail pu étudier l'influence
des concentrations limitantes en glucose et source d'azote
sur la croissance et le métabolisme glucidique de
Lactobacillus DKP.
Nos résultats montrent, dans le cas de limitation en
substrat énergétique, que toute augmentation du taux dedilution (D) jusqu'à 0,6 h- 1 contribue à accroître la
quantité de biomasse.
Au delà de cette valeur nous avons noté l'influence d'un
autre facteur limitant de la croissance qui pourrait être
attribué à un nutriment présent en quantité moindre mais dont
la nature reste à déterminer.
La variation du taux de dilution induit des changements
dans le métabolisme glucidique en l'orientant
préférentiellement vers la voie hétérolactique. Nous avons pu
noter une légère tendance à l'homolactisme aux forts taux de
dilution.
Les constantes de la croissance (Xmax, III<;) et du
métabolisme énergétique (mATP, Ymax), ont pu également être
déterminées.
Aux forts taux de dilution, alors qu'on observe un arrêt
ou une diminution de la croissance, la production d'énergie
se poursuit traduisant le phénomène de découplage
énergétique. Ce surplus d'énergie est dispersé par "energy
spilling" ou stocké dans la formation de produits.
L'aspect visqueux des milieux de culture fermentés aux
forts taux de dilution (D= 1,5 h- 1) pourrait être attribué à
la présence de mucopolysaccharides qu'il serait intéressant
d'identifier.
Par ailleurs nous avons pu au cours de notre étude
montrer que la charge azotée est un facteur limitant au même
titre que le taux de dilution sur la croissance de L. DKP.
S3
Seule la variation du taux de dilution dans les
conditions de l'expérience est responsable de l'orientation
du métabolisme vers l' homolactisme (aux faibles taux de
dilution) ou l'hétérolactisme (aux forts taux de dilution).
Les faibles quantités d' AZT orientent le métabolisme
glucidique vers la formation de produits autres que
l'éthanol, l'acétate, ou surtout le lactate.
Il serait à ce titre intéressant de déterminer les
concentrations de ces produits du métabolisme et de
comprendre les mécanismes réactionnels les générant.
Enfin nous avons noté que les conditions limitantes en
azote aux forts taux de dilution induisent le découplage
énergétique.
S4
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L'influence des concentrations limitantes en glucose et ensubstrat azoté sur la croissance et le métabolisme glucidiquede Lactobacillus DKP a été étudiée en cultures continues.Lorsque le substrat énergétique est limitant pour lacroissance, on note une augmentation proportionnelle de labiomasse avec le taux de dilution. Le métabolisme est" alorspréferentiellement hétérolactique. L'élevation du taux dedilution s'accompagne d'une légère tendance à l'homolactisme,et provoque le phénomène de découplage énergétique.La croissance de L. DKP est aussi limité par les faiblesconcentrations du substrat azoté. La variation de la chargeazotée oriente dans ce cas le métabolisme glucidique vers laformation de produits autres que le lactate, l'acétate etl'éthanol. Le changement homolactisme vers hétérolactisme est,dans ces conditions, sous l'influence du taux de dilution quiinduit également un découplage énergétique pour ses valeursélevées.