-
EKSTRAK PROPOLIS SEBAGAIPREVENTIF PADA KULTURMAKROFAGYANG
DIINFEKSI VIRUS Newcastle DiseaseBERDASARKAN PENURUNAN
TNF- (Tumor Necrosis Factor Alpha) DAN IL-6 (Interleukin-6)
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
Oleh : REYUDZKY PUTRI FITYANTI
125130100111029
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN
HEWAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
2017
-
1
LEMBAR PENGESAHANSKRIPSI
Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang
Diinfeksi Virus Newcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF-
(Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)
Oleh :
REYUDZKY PUTRI FITYANTI 125130100111029
Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji pada tanggal
dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar Sarjana
Kedokteran Hewan
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Sri Murwani, drh., MP drh. Dahliatul Qosimah, M.kes NIP.
196301011989032001 NIP. 198201272015042001
Mengetahui, Dekan FakultasKedokteran Hewan
Universitas Brawijaya
Prof. Dr. NIP. 19600903 198802 2 001
-
ii
ii
LEMBAR PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Reyudzky Putri Fityanti
NIM : 125130100111029
Program Studi : Kedokteran Hewan
Penulis skripsi berjudul :
Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang
Diinfeksi VirusNewcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF-
(Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)
Dengan ini menyatakan bahwa :
1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya
sendiri dan tidak
menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di
isi dan
tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.
2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis
terbukti hasil
jiplakan, maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang
akan saya
terima.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.
Malang,April 2017
Yang menyatakan,
Reyudzky Putri Fityanti
NIM. 125130100111029
-
iii
iii
Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang
Diinfeksi Virus Newcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF- (Tumor
Necrosis
Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)
ABSTRAK
Newcastle Disease merupakan penyakit dengan mortalitas tinggi
yang menyerang unggas disebabkan oleh strain virulen avian
paramyxoviridae.Virus merupakan mikroorganisme intraseluler,
sehingga keberadaannya dapat memicu timbulnya respon imun seluler
seperti aktivasi dari makrofag dan meningkatnya produksi sitokin.
Oleh karena itu diperlukan antivirus dan imunostimulator sebagai
upaya pencegahan agar makrofag tidak terinfeksi virus.Propolis
memiliki kandungan aktif yang dapat berperan sebagai antivirus dan
imunostimulator. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui
potensi ekstrak propolis sebagai preventif infeksi ND pada kultur
makrofag berdasarkan penurunan produksi sitokin proinflamasi.
Penelitian ini bersifat eksperimental dengan metode post test only
control group design dan rancangan acak lengkap menggunakan kultur
makrofag yang didapat dari peritoneum mencit strain Balb/Cjantan
umur 6 minggu. Kultur makrofag dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan,
yaitu kontrol negatif (A) kultur makrofag tanpa perlakuan, kontrol
positif (B) kultur makrofag tidak diberi ekstrak propolis tetapi
diinduksi virus ND, (C) kultur makrofag diberi ekstrak propolis 25
µg/ml lalu diinduksi virus ND, (D) kultur makrofag diberi ekstrak
propolis50µg/mllalu diinduksi virus ND, dan (E)kultur makrofag
diberi ekstrak propolis 100µg/ml lalu diinduksi virus ND.Parameter
yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar TNF- -6.
Masing-masing diukur dengan metode flowcytometry setelah melewati
masa inkubasi dan panen sel. Analisa data dilakukan secara
nonparametrik menggunakan Kruskal-Wallis yang dilanjutkan dengan
uji |Ri-Rj|. Hasil dari penelitin ini adalah terjadi penurunan
produksi TNF-
-6 pada kultur makrofag yang diberi preventif ekstrak propolis.
Konsentrasi ekstrak propolis 25 µg/ml merupakan perlakuan terbaik
yang memiliki efek paling besar untuk mencegah peningkatan produksi
TNF- -6.
Kata kunci : Paramyxoviridae, Propolis, kultur makrofag,
Sitokin
-
iv
iv
Propolis Extractasa Preventive InMacrophages CultureInfected By
Newcastle DiseaseViruses Based On Declining of TNF- (Tumor
Necrosis Factor Alpha) and IL-6 (interleukin-6)
ABSTRACT
Newcastle Disease is a high mortality disease affecting poultry,
caused by a virulent of avian Paramyxoviridae. Virus is
intracellular microorganism, its presence can lead to cellular
immune responses such as the activation of macrophages and increase
production of cytokines. Thus antivirus immunostimulator needed as
the preventive action for macrophages not to infected by virus.
Propolis contains active substanceswhich can be acted as antivirus
and immunostimulator. The purpose of this study was to determine
the potential of propolis extract as a preventive in macrophage
cultureinfected by NDV 64 HAU based on decreasing production of
proinflamatory cytokines. This research was an experimental study
with post test only control group design, completely randomized
design, using macrophages culture of Balb/C miceperitoneal, male,
age 6 weeks. Macrophages culture were divided into 5 groups:
negative control (A), macrophages culture without
treatment;positive control (B),macrophages culture were not not
given the propolis extract but induced by NDV; induced virus ND
(C), macrophages culture were given propolis extract 25 µg/ml then
induced by NDV; (D) macrophages culture were given propolis extract
50 µg/ml then induced by NDV; (E) macrophages culture were given
propolis extract 100 µg/ml then induced by NDV. The parameters
observed in this researchwere the levels of TNF- -6. The parameters
were measured using flowcytometry method after incubation and cell
harvest period. Data analysis were done in nonparametric using
Kruskal-Wallis test followed by |Ri-Rj|. The results of this
researchshowed that there is a declining in the production of
TNF-IL-6 in macrophages culture given a preventive action with
propolis extract. Propolis extract concentration 50 µg/ml was the
best treatment which has the biggest effect to prevent increasing
production of TNF- -6.
key word : Paramyxoviridae, Propolis, macrophages cultured,
cytokines
-
v
v
KATA PENGANTAR
Puji Syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan
nikmat,
limpahan rahmat, serta hidayah-Nya sehingga penulis mampu
menyelesaikan
skripsi Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur
Makrofag Yang DiinfeksiVirus Newcastle Disease Berdasarkan
Penurunan
TNF- Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)
Penulis menyampaikan terima kasih kepada segenap pihak, yang
secara
langsung maupun tidak langsung telah membantu dan membimbing
dalam
menyelesaikan Skripsi ini. Secara khusus penulis menyampaikan
terima kasih
kepada:
1. Dr. Sri Murwani, drh., MP.selaku pembimbing I dandrh.
Dahliatul Qosimah,
M.Kes selaku pembimbing II yang telah memberikan bimbingan
serta
nasehat kepada penulis.
2. drh. Ahmad fauzi, M.Sc dan drh. Yudit Oktanella, M.Si selaku
dosen
penguji atas saran yang diberikan.
3.
atas kepemimpinan dan dukungan demi kemajuan FKH UB.
4. Drh. Dyah Ayu Oktavianie A. P., M. Biotech selaku Wakil Dekan
1
Fakultas Kedokteran Hewan atas kepemimpinan dan dukungan
demi
kemajuan FKH UB.
5. Mama dan Ayah (Inda Rekyanti dan Tri Yudono) yang selalu
memberikan
semangat, doa, kasih sayang, dukungan baik secara moril maupun
materil
kepada penulis.
6. Teman-teman satu tim penelitian : Muhtamalia Riska F. D.,
Rakhmah Wira
W., Dien Ayu Utami, dan Didik Afif Sucitra.
7. Keluarga besar serta seluruh mahasiswa FKH UB yang telah
menjadi kolega
baru selama proses pendidikan di Kedokteran Hewan.
8. Serta semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian
penulisan
Skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
-
vi
vi
Penulis menyadari bahwa Skripsi ini masih jauh dari
kesempurnaan, maka saran dan kritik yang konstruktif dari semua
pihak
sangat diharapkan demi penyempurnaan selanjutnya.
Semoga laporan Skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua
pihak,
khususnya bagi penulis dan para pembaca pada umumnya.
Malang, April 2017
Penulis
-
vii
vii
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL
..............................................................................................
i LEMBAR PENGESAHAN
.................................................................................
ii LEMBAR PERNYATAAN
.................................................................................
iii ABSTRAK
...........................................................................................................
iv ABSTRACT
............................................................................................................
v KATA PENGANTAR
..........................................................................................
vi DAFTAR ISI
.......................................................................................................
viii DAFTAR GAMBAR
..............................................................................................
x DAFTAR
TABEL.......................................................................................xi
DAFTAR LAMPIRAN
.......................................................................................
xii DAFTAR SINGKATAN DAN
LAMBANG...............................................xiii BAB 1
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
......................................................................................
1 1.2. Perumusan
Masalah...............................................................................
3 1.3. Batasan Masalah
....................................................................................
3 1.4. Tujuan
Penelitian...................................................................................
4 1.5. Manfaat
Penelitian.................................................................................
5
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Newcastle Disease (ND)
.......................................................................
6 2.2 TNF- (Tumor Necrosis Factor Alpha)
.............................................. 12 2.3 IL-6
(Interleukin
6)..............................................................................
14 2.4 Makrofag
.............................................................................................
14 2.5
Propolis................................................................................................
16
BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL 3.1 Kerangka konsep
.................................................................................
18 3.2 Hipotesis penelitian
.............................................................................
21
BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian
............................................................. 22
4.2 Alat dan bahan
4.2.1 Alat penelitian
.........................................................................
22 4.2.2 Bahan penelitian
......................................................................
23
4.3 Tahapan Penelitian
..............................................................................
24 4.4 Langkah Kerja
4.4.1 Persiapan Hewan Coba
............................................................ 24
4.4.2 Rancangan Penelitian
.............................................................. 26
4.4.3 Variabel Penelitian
..................................................................
28 4.4.4 Pembuatan Ekstrak Propolis
.................................................... 28 4.4.5
Pembuatan Kultur Makrofag
................................................... 29 4.4.6
Pemberian Ekstrak Propolis Pada Kultur Makrofag ............... 31
4.4.7 Preparasi Virus ND
.................................................................
31 4.4.8 Penentuan Produksi TNF- .............. 33 4.4.9 Penentuan
Produksi IL-6 Dengan Flowcytometry .................. 34
4.5Analisis Data
...........................................................................................
34
-
viii
viii
BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak
Propolis Terhadap Kadar TNF-
IL-6
.......................................................................................................
39 5.1.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF-
dengan Uji Kruskal-
5.1.2 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar IL-6
dengan Uji Kruskal-Wa
BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 51 DAFTAR PUSTAKA
...........................................................................................
52 LAMPIRAN
..........................................................................................................
58
-
ix
ix
DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 2.1 Struktur Virus Newcastle
Disease
......................................................................
7 4.4 Lokasi Injeksi Virus Newcastle Disease
.......................................................... 32 5.1
Gambaran Kultur Makrofag
.............................................................................
37 5.2 Gambaran Kultur Makrofag Setelah Diberi Ekstrak Propolis
Kemudian Diinkubasi Selama 24 Jam
.....................................................................................
38 5.3 Hasil Uji HA Diperoleh 64
HAU.....................................................................39
5.4 Histogram Rata-rata Kadar TNF-
..................................................................
41 5.5 Histogram Rata-rata Kadar IL-6
......................................................................
48
-
x
x
DAFTAR TABEL Tabel Halaman Tabel 2.5 Kandungan Kimia Propolis
....................................................................
16 Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar
TNF- Uji Kruskal-Wallis dan Ri-Rj5%
........................................................... 44
Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar IL-6
dengan Uji Kruskal-Wallis dan Ri-Rj 5%
.......................................................... 49
-
xi
xi
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman Lampiran 1. Sertifikat Laik
Etik
...........................................................................
58 Lampiran 2. Surat Keterangan Skrining Fitokimia Propolis
................................. 59 Lampiran 3. Surat Keterangan
Kesehatan Mencit ................................................
60 Lampiran 4. Kerangka Operasional
......................................................................
61 Lampiran 5. Pembuatan Ekstrak Propolis
............................................................. 62
Lampiran 6. Pengenceran Propolis
........................................................................
63 Lampiran 7. Preparasi Virus ND
...........................................................................
64 Lampiran 8. Pembuatan Kultur Makrofag
............................................................ 65
Lampiran 9. Perhitungan Makrofag
......................................................................
66 Lampiran 10. Metode Flowcytometry
....................................................................
67 Lampiran 11. Gambar Hasil Flowcytometry
......................................................... 68
Lampiran 12. Data Hasil Analisa Statistik IL-6 dan TNF-
................................. 75
-
xii
xii
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG Simbol/singkatan Keterangan ND
Newcastle Disease TNF- Tumor Necrosis Factor Alpha IL-6 Interleukin
6 HAU HA Unit RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 TAB
Telur Ayam Berembrio HA Test Hemaglutination Test SN Serum
Neutralization ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FAT
Flourescent Antibody Technique IFN Interferon DOC Day Old Chicken
APP Acute Phaseprotein MCP Monocyte Recruitment Protein MMP Matrix
Metalloproteinase ROS Reactive Oxygen Species GF Growth Factor PBS
Phosphate Buffer Saline RBC Red Blood Cell FBS Fetal Bovine Serum
TLR Toll Like Receptor
-
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Newcastle Disease merupakan penyakit infeksius menyerang
unggas yang mematikan. Penyakit ini disebabkan oleh NDV
(Newcastle
Disease Virus) famili Paramyxoviridae yang merupakan virus
RNA.Pada
tahun 1926, wabah ND pertama kali dilaporkan terjadi di pulau
Jawa, dan
sekarang ND merupakan penyakit endemik di Indonesia. Laporan
terakhir
mengenai isolasi virus ND di Indonesia adalah tahun 2009, isolat
tersebut
dinamakan sebagai NDV/Bali-1/07. Meskipun sudah dilakukan
vaksinasi
yang ketat pada peternakan ayam, akhir-akhir ini kasus ND
masih
dilaporkan di lapangan. Hal ini mungkin disebabkan virus
yang
bersirkulasi di lapangan tidak sesuai lagi dengan strain virus
pad vaksin
yang tersedia(Adi et al., 2010).Kerugian yang ditimbulkan ND
berupa
kematian yang tinggi, penurunan produksi telur dan daya tetas,
serta
hambatan terhadap pertumbuhan (Pudjiatmoko et al., 2014).
Tindakan pencegahan harus dilakukan secara komprehensif,
salah
satunya dengan meningkatkan sistem imun menggunakan senyawa
atau
bahan tertentu sebagai imunostimulator. ND bersifat
intraseluler, sehingga
dapat hidup di kultur makrofag. Dalam hal ini makrofag berperan
dalam
fagositosis sertamemproduksi sitokin (Kaihena,2013). Interaksi
antara
antibodi dan molekul antigen dapat mengaktifasi makrofag
menginduksi
ekspresi sitokin proinflamasi. Sitokin proinflamasi yang
berperan sebagai
-
2
indikator terjadinya inflamasi adalah sitokin TNF- -6. Infeksi
yang
berat akan memicu produksi TNF- Hardyanto, 2013).
Sitokin IL-6 merupakan mediator penting dari respon inflamasi
dan
terlibat dalam berbagai kegiatan seluler, termasuk proliferasi
sel,
diferensiasi, dan apoptosis. Fungsi sitokin IL-6 selain sebagai
indikator
inflamasi adalah bersama dengan TNF-
monosit ke tempat inflamasi untuk menyingkirkan antigen atau
stimulus
terjadinya inflamasi (Bratawidjaja, 1998).
Tindakan preventif untuk kasus ND yang umum dilakukan adalah
dengan memberikan vaksinasi. Namun karena kasus ND masih terjadi
di
lapangan, maka perlu dilakukan upaya alternatif. Kali ini kami
akan
mencoba untuk menggunakan Ekstrak Propolis sebagai preventif
pada
kultur makrofag yang diinfeksi virus ND. Propolis adalah salah
satu jenis
bahan yang memiliki potensi sebagai imunostimulator alami
(Herawati et
al, 2015).
Propolis adalah suatu zat yang dihasilkan oleh lebah madu
dengan
cara mengumpulkan resin atau getah dari berbagai macam
tumbuhan,
kamudian resin ini akan bercampur dengan saliva dan enzim yang
ada
pada lebah. Bagi lebah, propolis bersifat desinfektan atau
antimikroba
yang dapat membunuh bakteri atau virus yang masuk ke dalam
sarangnya
(Lofty, 2006). Propolis mengandung senyawa kompleks seperti
vitamin,
mineral, enzim, senyawa fenolik dan flavonoid. Flavonoid
mempunyai
berbagai efek farmakologis antara lain sebagai imunostomulan,
antikanker,
-
3
antioksidan, antiviral, antialergi, antihepatoksik (Koca, 2007);
dan juga
memiliki aktivitas dalam hal meningkatkan respon imun (Wu et al,
2011).
Berdasarkan latar belakang di atas, penelitian ini dilakukan
untuk
mengetahui pengaruh dari ekstrak etanol propolis terhadap
ekspresi dari
TNF- -6.Diharapkanpada penelitian ini pemberian ekstrak
etanol
propolismampu menurunkan produksi TNF- -6 pada kultur
makrofag yang didapatkan dari peritoneal mencit.
1.2. Perumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka
perumusan
masalah dari penelitian ini adalah :
1. Apakah ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap
kultur makrofag
yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan
produksi
Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-
2. Apakah ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap
kultur makrofag
yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan
produksi
Interleukin 6(IL-6)?
1.3 Batasan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka penelitian
ini
dibatasi pada :
1. Hewan model yang digunakan adalah mencit jantan (Mus
musculus) galur
Balb/C. Mencit yang digunakan berjumlah 4 ekor, usia 6-8minggu
dengan
berat badan 20-30 gram (Rahayuningsih, 2010). Mencit didapatkan
dari
Dinas Pertanian Kota Malang. Penggunaan hewan coba telah
mendapatkan
-
4
sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas
Brawijaya
Malang No: 610-KEP-UB.
2. Prosedur kultur makrofag dari peritoneum mencit menggunakan
medium
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) dilakukan
dengan
menggunakan metode yang digunakan oleh Rahayuningsih (2010).
3. Virus Newcastle Disease diperoleh dari PUSVETMA yang
kemudian
dikembangbiakan pada Telor Ayam Berembrio (TAB) dan
dilakukan
Hemaglutination Test (HA) untuk mengetahui titer virus. Titer
dari virus
yang diinfeksikan pada kultur makrofag adalah 64 HAU (Hoss et
al,
1989).
4. Propolis didapatkan dari lebah jenis Trigona sp yang
menghisap bunga
randu dan bunga hutan di Peternakan Lebah Lawang Rimba Raya.
Kemudian dilakukan ekstrak di Laboraturium Farmakologi
Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya Malang dengan menggunakan
metode
dari Jaya et al (2008).
5. Penentuan perlakuan yang diberikan pada kultur makrofag
dibedakan
menjadi lima (A) kontrol negatif, (B) kontrol positif,
(C)pemberian ekstrak
propolis25µg/ml, (D) pemberian ekstrak propolis 50µg/ml, dan
(E)
pemberian ekstrak propolis 100µg/ml(Herawati et al, 2015).
6. Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar TNF-
-6
-
5
1.4. Tujuan penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Mengetahui potensi ekstrak propolis sebagai preventif
terhadap kultur
makrofag yang diinfeksi virusNewcastle Disease melalui
penurunan
produksi Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-
2. Mengetahui potensi ekstrak propolis sebagai preventif
terhadap kultur
makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui
penurunan
produksiInterleukin 6(IL-6).
1.5 Manfaat penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
mengenai potensi ekstrak propolissebagai preventif terhadap
kultur
makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui
penurunan
produksi sitokin proinflamasi, Tumor Necrosis Factor Alpha
(TNF-
Interleukin-6 (IL-6). Selain itu juga sebagai referensi atau
acuan dalam
penelitian selanjutnya terhadap tindakan preventif terhadap
virus
Newcastle Disease.
-
5
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1Newcastle Disease (ND)
2.1.1 Etiologi
Newcastle disease (ND) merupakan suatu penyakit pernapasan
dan
sistemik, yang bersifat akut dan mudah sekali menular, yang
disebabkan
oleh virus dan menyerang berbagai jenis unggas, terutama ayam
(Tabbu,
2000). ND disebabkan oleh virus berukuran 150-250 milimikron
yang
memiliki amplop dan kapsid berbentuk heliks yang simetris.
Spesies : Newcastle Disease Virus
Genus : Avulavirus
Famili : Paramyxoviridae
Ordo : Mononegavirales
Grup : ss-RNA
Genom virus ini mempunyai enam protein utama yang
menyusunnya yaitu Nucleocapsid protein (N), Phosphoprotein (P),
Matrix
protein (M), Fusion protein (F), Hemagglutininneuraminidase
protein
(HN) dan Large polymerase protein (L) (Rout & Samal 2008).
Gambar
2.1 merupakan gambaran struktur virus ND. Terdapat dua protein
non-
struktural lainnya yang dihasilkan selama proses transkripsi gen
P yaitu V
dan W. Protein N, P, HN dan F terletak di bagian luar envelope
sedangkan
protein M terdapat di lapisan dalam virion (Peeters et al.
2004).Ada dua
protein penting pada virus ND, yakni HN dan F. Protein H
merupakan
-
6
protein yang melekat dan mengikat pada reseptor pada bagian
luar
membran sel inang, termasuk sel darah merah. Bagian N
(neuraminidase)
merupakan enzim aktif yang membantu dalam pelepasan virus
dari
membran sel inang. Aktivitas enzim ini mempengaruhi waktu
yang
dibutuhkan bagi virus untuk mengelusi dari sel darah merah.
Protein F
berfungsi untuk fusi antara amplop virus dengan membran sel
inang
(Pudjiatmoko et al., 2014).
Gambar 2.1 Struktur Virus Newcastle Disease (Chang and Dutch,
2012)
2.1.2 Gejala Klinis
Penyakit ini menyebar dengan cepat pada spesies ayam, kalkun
dan
spesies unggas yang lain. Periode inkubasi dan gejala klinis
ND
dipengaruhi oleh beberapa faktor. Masa inkubasi ND pada unggas
antara
3-6 hari tergantung pada jenis spesies inang, kekebalan inang
serta
konsentrasi dan strain virus ND. Gejala klinis non-spesifik
yang
ditunjukkan oleh ND meliputi depresi, bulu rontok, sulit
bernafas dengan
mulut terbuka, hipertermia, anoreksia, lesu dan hipotermia
sebelum
kematian.Meskipun demikian, dugaan terhadap ND muncul apabila
organ
-
7
limpa, timus, bursa fabricius dan saluran pencernaan unggas yang
sakit
mengalami perdarahan dan nekrosis (Courtney et al. 2013).
Berdasarkan gejala klinis yang diperlihatkan ayam terinfeksi
virus
ND dikelompokkan dalam lima patotipe yaitu viscerotropic
velogenic,
sangat patogenik dengan ciri kematian yang tinggi dan lesi
hemoragik
pada usus; neurotropic velogenic, dengan ciri kematian yang
tinggi, gejala
pernafasan dan saraf; mesogenic, dengan kematian rendah,
gejala
pernafasan dan saraf; lentogenic, dengan gejala klinis ringan
dari saluran
pernafasan; dan asymptomatic enteritic, dengan bentuk infeksi
subklinis
enteric (OIE, 2012).
Tekanan respon kekebalan inang oleh infeksi virus ND
menyebabkan kerusakan organ limfoid primer bersifat sementara
atau
permanen (Nasser et al. 2000). Sistem kekebalan spesifik
(humoral dan
seluler) tidak dapat berfungsi secara optimal pada ayam yang
terinfeksi
virus ND karena jaringan limfoid tidak berkembang sehingga
menyebabkan kelainan patologi atau kerusakan pada organ limfoid
seluler
seperti limpa dan timus (Rue et al, 2011).
2.1.3 Cara Penularan
Penularan virus ND yang utama terjadi secara per inhalasi
atau
lewat saluran pernafasan. Virus ND dikeluarkan oleh ayam
terutama lewat
berbagai ekskresi. Barang atau bahan-bahan yang ada di
kandang,
termasuk alas kandang (liter), dapat tercemar virus ND dan
terbawa angin
ke peternakan ayam yang jaraknya berdekatan. Penularan virus ND
juga
-
8
dapat terjadi per os pada ayam yang berdekatan dalam satu
kandang.
Ayam yang selamat dari serangan virus ND, tetapi masih
meninggalkan
gejala saraf hendaknya disingkirkan (dipotong) agar tidak
menularkan
penyakit pada ayam lain (Soeharsono, 2005).
2.1.4 Patogenesitas
Protein HN berperan dalam tahap penempelan virus ND pada
reseptor sel inang yang mengandung sialic acid yaitu
glycoprotein dan
glycolipid (Iorio et al. 2009). Protein F sebagai perantara
penempelan
virus dengan penyatuan virus dan membran sel inang. Selanjutnya,
RNA
virus dilepaskan ke dalam sitoplasma kemudian terjadi replikasi.
Proses
masuknya virus ke dalam sel melalui dua cara, yang pertama
adalah
penyatuan secara langsung antara envelope virus dengan membran
plasma
dan yang kedua adalah diperantarai oleh reseptor endositosis
(Ferreira et
al, 2004).
Disamping mempunyai reseptor yang cocok dengan virus ND, sel
inang juga harus memiliki enzim tripsin yang fungsinya mirip
protease
untuk memecah protein F0 menjadi F1 dan F2 pada infeksi ND
avirulen
walaupun protease tidak selalu diperlukan untuk penempelan virus
ND
virulen (Sakaguchi et al. 1991). Penyebaran reseptor sel pada
ayam yang
peka terhadap virus ND avirulen bersifat terbatas dan hanya
ditemukan
pada saluran pencernaan dan pernafasan atas, sedangkan replikasi
virus
ND virulen terjadi di sebagian besar jaringan inang (Brown et
al. 1999).
Virus ND avirulen yang diinokulasikan lewat mulut bereplikasi
di
-
9
esofagus, tembolok dan proventrikulus satu hari pasca-inokulasi,
lalu
bereplikasi di duodenum, jejunum, ileum dan sekum, kemungkinan
terjadi
sebagai akibat dari viremia pada hari keempat hingga keenam
pasca-
infeksi (Bouzari & Spardbrow, 2006).
2.1.5 Diagnosis
Diagnosa awal terhadap ND tipe velogenik viserotropik dapat
didasarkan atas gejala klinik yang diperkuat oleh pemeriksaan
patologik.
ND tipe Velogenik Neurotropik bersifat kurang spesifik
dibandingkan
dengan VVND. Diagnosa awal untuk bentuk ini dapat didasarkan
atas
adanya gejala gangguan pernapasan dan gangguan saraf. Sedangkan
untuk
infeksi virus ND yang disebabkan oleh galur mesogenik dan
lentogenik,
sulit untuk didiagnosa berdasarkan gejala klinik dan perubahan
patologik
tertentu. Diagnosa akhir didasarkan atas isolasi dan
identifikasi virus
penyebab penyakit (Tabbu, 2000).
Menurut Pudjiatmoko et al. (2014), diagnosa penyakit
Newcastle
Disease dapat didasarkan atas epizootiologi, tanda-tanda klinis,
kelainan
patologi anatomi yang dikukuhkan dengan hasil pemeriksaan
laboratorium, sebagai berikut:
a) Isolasi dari swab trakea atau kloaka atau suspensi 10% dari
otak
atau paru, dalam larutan NaCl fisiolofis yang mengandung
antibiotik diinokulasikan pada telur ayam berembrio (TAB)
umur
9-11 hari.
-
10
b) Pemeriksaan serologi, dengan menguji adanya antibodi
dalam
tubuh dengan uji HI, uji Serum Neutralization (SN) dan
Enzyme
linked immunosorbent assay (ELISA).
c) Pengujian adanya antigen dapat dilakuukan pula dengan uji
Flourescent Antibody Technique (FAT) atau dengan rapid test.
2.1.6 Imunitas Terhadap Virus
Respon kekebalan non-spesifik (alamiah) terdiri dari
faktor-faktor
yang sudah ada sejak lahir atau sebelum tubuh terinfeksi
mikroorganisme.
Respon kekebalan ini bersifat cepat dan paling awal dalam
pertahanan
terhadap infeksi mikroorganisme.Komponen sistem imun non
spesifik
tidak mempunyai kemampuan untuk bereplikasi secara cepat, akan
tetapi
selalu siap untuk melawan dan mencerna bahan-bahan asing dalam
waktu
yang singkat. Sel-sel dalam sistem imun non spesifik meliputi
granulosit
yang berfungsi memfagosit atau mencerna, natural killer cells
khusus
untuk sel kanker, makrofag dan komplemen yang kesemuanya
berfungsi
sebagai pertahanan pertama terhadap adanya infeksi(Ferdous et
al.
2008)dan mediator peradangangan sitokin (Scott & Owens,
2008).
Menurut, ada beberapa mekanisme utama respons nonspesifik
terhadap virus, yaitu :
1. Infeksi virus secara langsung akan merangsang produksi
IFN
oleh sel-sel terinfeksi; IFN berfungsi menghambat replikasi
virus (Sinthari, 2014).
-
11
2. IFN tidak akan bekerja sendirian. IFN akan merangsang
makrofag untuk meningkatkan sintesis dari sitokin lain
seperti
TNF- -6 (Ishartadiati, 2008).
2.1.7 Pengendalian dan Pencegahan
Tujuan dari pengendalian ND adalah mencegah ayam yang peka agar
tidak
terinfeksi oleh virus tersebut atau mengurangi jumlah ayam yang
peka
dengan program vaksinasi. Untuk mencegah masuknya dan
menyebarnya
virus ND ke dalam suatu peternakan, maka diperlukan
pengamanan
biologis yang ketat dan pelaksanaan aspek manajemen lainnya
secara
optimal untuk menghilangkan faktor pendukung / sumber infeksi
virus.
Sistem perkandangan, sanitasi/desinfeksi, kualitas DOC, kualitas
dan
kuantitas pakan, pengaturan pekerja atau pengujung dan
system
transportasi sapronak/pronak juga penting untuk
diperhatikan.
Pengamanan biologis yang ketat perlu didukung oleh program
vaksinasi
terhadap ND yang sesuai untuk merangsang timbulnya kekebalan
pada
suatu kelompok ayam yang peka (Tabbu, 2000).
2.2Tumor Necrosis Factor -
Tumor Necrosis Factor -
proinflamasi dalam sistem imun. TNF-
termasuk makrofag (Widegren, 2008). TNF-
memiliki susunan struktur trimer yang pada awalnya berbentuk
prekursor
(pTNF-
-
12
bentuk terlarut (sTNF-
biologis dari TNF- diantaranya :
1. Mengerahkan neutrofil dan monosit ke tempat infeksi serta
mengaktifkan sel-sel tersebut untuk menyingkirkan mikroba.
2. Merangsangan yang multiple terhadap limfosit T teraktifkan,
misalnya
respon proliferasi limfosit T terhadap antigen, peningkatan
reseptor
untuk IL-2 dan IFN- tkan ekspresi antigen
MHC kelas 1 pada fibroblast dan sel endotel(Abbas et al.,
2010).
3. Merangsang fagosit mononuklear untuk mensekresi IL-1 dengan
efek
seperti TNF.
4. Menjadi reseptor pengatur respon kekebalan serta mampu
menimbulkan efek seluler yang beragam termasuk apoptosis,
nekrosis,
efek keradangan, efek proliferasi atau yang mempromosikan
pertumbuhan dan efek hematopoietik.
5. Mengaktivasi produksi khemokin yang memiliki efek
kemotaksis
terhadap sel-sel inflamasi.
Interaksi antara faktor-faktor tersebut merupakan mekanisme
efektor yang terjadi pada respon imun yang dapat bersifat
protektif atau
bahkan menyebabkan kerusakan jaringan yang disebut reaksi
hipersensitifitas (Thomas, 2001).
Tumor Necrosis Factor dibentuk atas 212 asam amino diatur
pada
homotrimers yang stabil dengan berat molekul 51 kD. Seperti
sitokin 14
proinflamasi yang lain, ekspresi dan sintesa dari TNF-
-
13
dihasilkan oleh sel-sel hematopoetik saja (Raharjo, 2010).
TNF-
mengalami peningkatan produksi pada keadaan inflamasi akut dan
kronik
(Popa et al., 2007). Infeksi yang berat dapat memicu produksi
TNF- dalam
jumlah besar. Peranan yang menguntungkan dari TNF-
sebagai respon imun terhadap bakteri, jamur, virus, dan invasi
parasit
(Tracey and Cerami, 1994).
2.3 Interleukin-6 (IL-6)
Interleukin-6 ini merupakan salah satu IL dengan berat molekul
22-29 kD
yang memegang peranan sangat penting pada reaksi inflamasi
dan
menginduksi produksi antibodi (Silva et al., 2007).IL-6
berfungsi dalam
imunitas nonspesifik dan spesifik. Diproduksi fagosit
momonuklear, sel
endotel vascular, fibroblast, dan sel lain sebagai respon
terhadap mikroba
dan sitokin lain. IL-6 mempunyai berbagai fungsi. Dalam
imunitas
nonspesifik, IL-6 merangsang hepatosit untuk
memproduksiacute
phaseprotein(APP) dan bersama CSF merangsang progenitor di
sumsum
tulang untuk memproduksi neutrofil. Dalam imunitas spesifik,
IL-6
merangsang pertumbuhan dan diferensiasi sel B menjadi sel mast
yang
memproduksi antibodi.Pelepasan IL-6 ini merangsang sel makrofag
muda
menjadi matang dan sel makrofag yang sudah matang akan mampu
melakukan fagositosis lebih efisien (Martinez dan Dunn, 2011;
Mosser,
2003).IL-6 bersama dengan TNF-a dan IL-1, meningkat pada
kondisi
septik atau peradangan aseptik.
-
14
2.4 Makrofag
Makrofag adalah salah satu tipe sel darah putih yang memakan
benda
asing. Makrofag mempunyai peranan kunci dalam respon imun
yang
bereaksi terhadap benda asing. Makrofag terutama berasal dari
sel dari
sum-sum tulang, dari promonosit yang akan membelah
menghasilkan
monosit yang beredar dalam darah. Pada tahap kedua monosit
berimigrasi
kedalam jaringan ikat tempat mereka menjadi matang dan inilah
yang
disebut makrofag. Makrofag membantu dalam proses
penghancuran
antigen. Makrofag juga mengeluarkan substansi yang menstimulasi
sel
lainnya yang juga berperan dalam sistem imun, dan juga terlibat
dalam
presentasi antigen, dalam hal ini makrofag membawa antigen
di
permukaan sel dan mempresentasikan kepada sel T (Effendi,
2003).
Makrofag juga melepaskan TNF-
(Baratawidjaja, 2004).
Monosit berdiferensiasi menjadi makrofag yang memproduksi
berbagai
macam sitokin (TNF- -1, IL-10, IL-6 TGF- -8, MCP-
1), growth facor, metalloproteinase dan dapat memodifikasi
lipoprotein
melalui oksidasi. Monocyte recruitment protein-1 (MCP-1),
berperan
dalam perekrutan monosit dari sirkulasi. (Osterud &
Bjorklid, 2003; van
Haelst, 2005). Kerja kolektif dari macrophage-derived cytokine
dan lipid-
mediator adalah menginduksi inflamasi lokal yang banyak
mengandung
neutrofil yang akan memfagositosis dan menghancurkan patogen
(Abbas
and Litchtman, 2003).
-
15
Makrofag memegang peranan utama dalam proses inflamasi dan
kekebalan alami. Aktivitasnya besar, tergantung pada
kapasitasnya untuk
memproduksi free-oxygen radicals, protease, complement factor,
dan
sitokin (Hansson, 2001). Pada umumnya makrofag atau monosit
yang
diaktifkan dengan berbagai rangsangan, dengan cepat
menginduksi
produksi sejumlah sitokin seperti TNF- - - -6.
Makrofag, limfosit, fibroblast, sel endotel, otot polos yang
ditemukan
dalam vaskuler dengan inflamasi dapat mengekspresikan reseptor
TNF
(Baratawidjaja,2004).
2.5 Propolis
Ada banyak produk yang dihasilkan dari lebah, diantaranya
adalah
madu, royal jeli, polen, dan juga propolis. Propolis adalah
kompleks dari
resin yang dikumpulkan dari berbagai tanaman oleh lebah madu
yang
kemudian bercampur dengan air liur lebah madu. Lebah
menggunakan
propolis dalam pembuatan, pemeliharaan, perlindungan, dan
untuk
mensterilkan sarangnya (Marcucci et al, 2001). Komposisi dari
propolis
sangat kompleks. Unsur utamanya adalah lilin lebah, resin, dan
senyawa
volatil. Lilin lebah adalah hasil sekresi dari lebah itu
sendiri, sedangkan
resin dan volatil berasal dari tanaman (Rachmadian, 2011).
Beberapa
kandungan kimia telah diidentifikasi dalam propolis, diantaranya
adalah
resin, lilin lebah, minyak esensial, protein, senyawa organik
lainnya yang
akan ditampilkan pada Tabel 2.5. berikut :
-
16
Tabel 2.5 Kandungan Kimia Propolis (Sivasubramaniam &
Seshadri, 2005)
Kelas Komponen Jumlah Group Komponen
Resin 45-55% Flavonoid, asam fenolat dan esternya Lilin dan asam
lemak 25-53% Sebagian besar dari lilin lebah dan beberapa
dari tanaman Minyak esensial 10% Senyawa volatile Protein 5%
Protein kemungkinan berasal dari polen dan
amino bebas Senyawa organik lain dan mineral
5%% Mineral yang paling terkenal adalah Fe dan Zn, selain itu
adalah Au, Ag, Cs, Hg, La, dan Sb. Senyawa lain seperti keton,
laktan, kuinon, asam benzoate, gula, vitamin B3
Senyawa yang terkandung dalam propolis secara garis besar
dikelompokkan dalam tiga kelompok yaitu flavonoid, turunan
cinnamic
acid, dan terpenoid. Senyawa tersebut memiliki peran penting
dalam
aktivitas biologis propolis, antara lain sebagai
imunomodulator,
antimikrobial, antioksidan, antiinflamasi, antifungal,
antiprotozoa,
antiparasit, dan antiproliferatif (Rachmadian, 2011).
-
35
BAB 3
KERANGKA KONSEPTUAL
3.1 Kerangka Konsep
Keterangan :
: Variabel Terikat : Induksi NDV
: Variabel Bebas : Pemberian Propolis
: Efek Pemberian Propolis
: Efek Pemberian NDV
Mencit
Kultur Makrofag Ekstrak Propolis
TNF- IL-6
Aktivitas Makrofag
KulturMakrofagDiinfeksi Virus ND (64 HAU)
Proliferasi dan Diferensiasi Makrofag Imunostimulator
Antivirus
ROS Sitokin MMP GF
Penurunan Aktivasi dari Makrofag
-
18
Ekstrak propolis mengandung flavonoid, tanin, dan saponin.
Flavonoid sebagai antioksidan dapat melindungi dari radikal
bebas dengan
cara mentransfer ion hidrogen ke ion yang mengalami radikal
bebas
sehingga menjadi stabil. Keadaan ion yang telah stabil
menyebabkan
menurunnya keadaan stres oksidatif. Tannin atau polifenol
bekerja
menghambat pelepasan mediator inflamasi dan menghentikan reaksi
rantai
radikal bebas. Sedangkan saponin akan mencegah kerusakan membran
sel
akibat radikal bebas. Telah dibuktikan bahwa flavonoid mampu
mempercepat fagositosis. Fagositois yang berlebih akan
memerlukan O².
Hal ini akan menyebabkan terjadinya respiratory burst. Jika
tidak
tergantung dengan O² maka fagositosis akan menggunakan enzim
sebagai
antioksidan endogen (SOD, NO, H²O²). Pada saat terdapat antigen
yang
harus difagositosis namun antioksidan endogen tidak tersedia
dalam jumlah
yang cukup, maka diperlukan antioksidan tambahan untuk
membantu
menurunkan produksi dari ROS. Radikal bebas yang banyak dan
tidak
diimbangi dengan antioksidan yang cukup akan menyebabkan
stres
oksidatif yang meningkat. Pemberian ekstrak propolis akan
mencegah
terjadinya peningkatan produksi dari makrofag seperti ROS,
Sitokin
proinflamasi (TNF- -6), MMP, dan Growth Factor. Sehingga
fungsi
makrofag akan kembali normal.
Pada saat NDV diinfeksikan ke dalam kultur makrofag, akan
terjadi
diferensiasi dan proliferasi dari makrofag. Hal ini akan
menyebabkan
peningkatan dari sitokin proinflamasi diantaranya TNF- -6.
TNF-
-
19
merupakan sitokin yang mengawali proses apoptosis dan
menginduksi
sitokin-sitokin lainnya seperti IL-6. Sedangkan IL-6 akan
membuat
makrofag mampu melakukan fagositosis dengan lebih efisien.
Aktivitas dari
makrofag tergantung pada kapasitasnya untuk memproduksi
free-oxygen
radicals (ROS), sitokin, matrix metalloprotease (MMP), dan
growth factor
(GF).
ROS adalah beberapa jenis molekul dan radikal yang berasal
dari
molekul oksigen (O2) yang digunakan dalam pernapasan. Efek
toksik ROS
pada DNA adalah dapat modifikasi basa DNA atau pemotongan
cincin
DNA sehingga mengakibatkan penuaan dan kanker. Sedangkan efek
toksik
pada protein adalah inaktivasi enzim, depolarisasi protein yang
dapat
mengakibatkan radang inflamasi. Sitokin merupakan protein sistem
imun
yang mengatur interaksi antarsel dan memacu reaktivitas
imun.
Metaloproteinase matriks atau MMP merupakan protease dengan
aktivitas
degradasi terhadap proteinjaringan ikat seperti kolagen,
elastin, proteoglikan
dan laminin. MMP telah dikenal perannya dalam pertumbuhan sel
kanker
dan metastasisdan telah sering menjadi target terapi anti kanker
karena
ekspresinya yang berlebih.Sedangkangrowth factor sebagian besar
berperan
untuk memicu siklus sel dan menghambat apoptosis.Aktivasi
makrofag
karena pemberian NDV juga akan menyebabkan peningkatan produksi
dari
ROS, sitokin, MMP, dan GF. Sehingga akan menyebabkan
kerusakan
jaringan.
-
20
3.2 Hipotesis Penelitian
Berdasarkan kerangka konseptual yang telah ada, maka
hipotesis
yang
dapat diajukan adalah sebagai berikut ini :
1. Pemberian ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap
kultur
makrofag yang diinfeksi virus ND dengan menurunkan produksi
Tumor
Necrosis Factor Alpha (TNF-
2. Pemberian ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap
kultur
makrofag yang diinfeksi virus ND dengan menurunkan produksi
Interleukin 6 (IL-6).
-
35
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Oktober 2016. Pelaksanaan
penelitian terdiri atas beberapa tahapan meliputi :
1. Pembuatan ekstrak propolisdi Laboraturium Farmakologi
Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya.
2. Aklimatisasi mencit dilakukan di Laboratorium Farmakologi
Universitas
Muhammadiah Malang.
3. Preparasi NDV di Laboraturium Imunologi Fakultas Kedokteran
Hewan
Universitas Brawijaya.
4. Pembuatan kultur makrofag dilaksanakan di Laboratorium
Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.
5. Pengukuran Tumor Necrosis Factor (TNF- Interleukin-6
(IL-6)
menggunakan teknik flowcytometry dilaksanakan di
Laboratorium
Fisiologi Hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
(MIPA)
Universitas Brawijaya Malang.
4.2 Alat dan Bahan
4.2.1 Alat Penelitian
Alat pemeliharaan hewan coba terdiri atas kandang kotak
plastik
dengan ukuran 35 x 27,5 x 12 cm untuk setiap kelompok perlakuan,
tutup
kandang yang terbuat dari kawat, meja untuk meletakkan kandang,
tempat
-
22
pakan dan minum, lampu serta alas kandang berupa sekam. Alat
yang
digunakan untuk preparasi dan pembuatan kultur makrofag terdiri
atas
blade, spuit 10 cc, tabung sentrifuse steril, hemasitometer,
microplate 24
sumuran, inkubator CO2. Alat preparasi virus ND adalah
Peneropong
telur, Pengebor telur, Spuit 1 ml, Forceps, Gunting, Inkubator
Telur (37°
C, 62% kelembaban), microplate 96 sumuran dengan dasar U,
dan
Mikropipet. Alat untuk membuat ekstrak propolis adalah
Erlenmeyer 500
ml dan 1000 ml, pengaduk, corong gelas, pipet, kertas saring,
Rotary
evaporator, Thermostirer, Vortex-mixe, waterbath, Magnetic
stirrer 5 cm,
aliminium foil, kulkas, Thermometer, dan botol untuk menyimpan
dosis.
Alat untuk pengujian flowcytometry terdiri atas spuit 5 mL,
sentrifuge
tube, mikropipet 10 dan 1000 mikroliter, tabung dan rak
eppendorf,
sentrifus, masker, sarung tangan dan tissue tabung propilen,
microtube,
Pro
4.2.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi mencit
Balb/C, bahan pemeliharaan hewan coba yaitu pakan, air minum
dan
sekam. Bahan preparasi virus ND berupa Phospat Buffered Saline
(PBS)
dan alkohol 70%. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan
ekstrak
propolis adalah propolis yang diambil dari peternakan lebah
Rimba Raya
Lawang, E-pure, etanol dan DMSO. Bahan yang dilakukan untuk
preparasi NDV adalah Telur Berembrio, Alkohol 70%, Lilin yang
telah
-
23
dicairkan, RBC 10% (Washed red blood cells), PBS (Phosphat
Buffer
Saline).Bahan yang digunakan untuk preparasi dan pembutan
kultur
makrofag terdiri atas alkohol 70%,larutan RPMI dingin, PBS,
medium
komplit (RPMI 1640, FBS 10%, penicillin, streptomycin dan
glutamin),
asam asetat 3%. Bahan pada uji flowcytometry terdiri atas PBS
steril,
antibodi intraseluler (TNF - -6).
4.3 Tahapan Penelitian
Berikut ini adalah tahapan penelitian yang dilakukan:
1. Persiapan hewan coba
2. Rancangan penelitian
3. Variabel penelitian
4. Pembuatan ekstrak propolis
5. Preparasi virus ND
6. Pembuatan kultur makrofag dari peritoneum mencit
7. Pemberian ekstrak propolis pada kultur makrofag
8. Pemberian virus ND pada kultur makrofag
9. Penentuan produksi TNF- -6 dengan flowcytometry
4.4. Langkah Kerja
4.4.1 Persiapan Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit
Balb/c jantan umur 6 minggu dengan berat badan 20-30 gram
(Rahayuningsih,2010). Strain yang dipilih adalah Balb/C sebab
strain ini
dapat menimbulkan respon imuntias apabila diinokulasi dengan
virus
-
24
Newcastle Disease (Hoss et al,1989). Penelitian ini menggunakan
hewan
coba mencit Balb/c karena merupakan mencit yang sering digunakan
pada
penelitian bertujuan umum maupun penelitian di bidang
imunologi.
Sebelum perlakuan terlebih dahulu mencit diaklimatisasi
selama
lima hari dengan cara ditempatkan pada sebuah kandang yang
terbuat dari
plastik dan diberi pakan berupa susu PAP berbentuk pelet dan air
minum
secara ad libitum (Mangkoewidjojo, 2006). PAP adalah pelet
buatan
pabrik dan tebuat dari biji-bijian seperti jagung, wheat bran,
tetes tebu,
palm olein, asam amino esensial, mineral esensial, premix, dan
vitamin.
Kandungan protein pada susu PAP yang tinggi namun memiliki
kandungan serat yang rendah. PAP biasa digunakan sebagai pakan
kelinci
dan pakan untuk menggemukkan anak sapi. Kandungan gizi susu
PAP
adalah : Protein 16%, Lemak kasar 3-7%, Serat kasar 8%, Kalsium
0,9-
1,2%, dan Phosphor 0,6-1,0%. Menurut Harmita dan Maksum
(2008),
mencit bersifat penakut, fotofobia, cenderung berkumpul
dengan
sesamanya dan lebih aktif pada malam hari dibandingkan siang
hari
sehingga perlu dilakukan aklimatisasi. Hal ini juga dijelaskan
oleh
Institute of Laboratory Animal Resources Commision an Life
Science
(2010) bahwa sebelum hewan coba digunakan dalam percobaan,
diberikan
aklimatisasi atau masa adaptasi minimal selama lima hari untuk
tujuan
meminimalisasi stress dan hewan coba dapat mengekspresikan
tingkah
laku alaminya. Hewan coba dikandangkan dalam lima kandang
kelompok
sesuai dengan kelompok perlakuan yang akan diberikan. Setiap
kandang
-
25
berisi 4 ekor mencit.Kandang mencit diletakkan pada lokasi yang
bebas
dari kebisingan dan polutan dengan suhu ruang 20-24ºC dan siklus
gelap-
terang selama 12 jam.Kandang dibersihkan dan diganti alas
kandang setiap
hari.
4.4.2 Rancangan Penelitian
Penelitian bersifat eksperimental dengan menggunakan
Rancangan
Acak Lengkap (RAL) yaitu penggunaan media yang sama atau
dianggap
seragam dalam penelitian (Kusriningrum, 2008). Penelitian
menggunakan
metode Post test only control group design dimana percobaan
(eksperimen) yang dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh
yang
timbul sebagai akibat dari adanya perlakuan tertentu.
Pengukuran
parameter produksi TNF- -6 dilakukan untuk mengetahui
pengaruh
pemberian ekstrak etanol propolis pada kultur makrofag yang
diinduksi
virus ND. Hewan coba dalam penelitian ini dibagi menjadi lima
kelompok
perlakuan yang berbeda, antara lain:
1. Kelompok A (kontrol negatif): Kultur makrofag yang tidak
diberi
ekstrak propolis dan tidak diinduksi virus ND.
2. Kelompok B (kontrol positif): Kultur makrofag yang diinduksi
virus
ND dosis 64.
3. Kelompok C (perlakuan satu): Kultur makrofag yang diberi
ekstrak
propolis konsentrasi 25µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis
64
HAU.
-
26
4. Kelompok D (perlakuan dua): Kultur makrofag yang diberi
ekstrak
propolis konsentrasi 50µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis
64
HAU.
5. Kelompok E (perlakuan tiga): Kultur makrofag yang diberi
ekstrak
propolis konsentrasi 100µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis
64
HAU.
Jumlah hewan model yang diperlukan dalam penelitian
ditentukan
dengan melakukan optimasi terlebih dahulu. Pada saat optimasi,
dari satu
ekor mencit dapat diambil 2,5 ml yang mengandung 2.500.000
sel
makrofag. Jumlah sampel minimal dihitung menggunakan rumus
(Kusriningrum, 2008).
Sehingga:
P (n-1) 15 Keterangan:
5 (n-1) p = jumlah kelompok perlakuan
5n-5 n = jumlah ulangan yang diperlukan
5n
5n
n
Berdasarkan hasil perhitungan di atas, untuk lima kelompok
perlakuan
diperlukan jumlah ulangan lebih besar sama dengan empat atau
minimal
empat kali ulangan dalam setiap kelompok. Penelitian ini
menggunakan
empat kali ulangan dalam setiap kelompok perlakuan sehingga
jumlah
kultur makrofag yang diperlukan sebanyak 20 sumuran kultur
makrofag.
-
27
Satu sumuran berisikan 500.000 sel makrofag (Akrom, 2013).
Sehingga
satu ekor mencit dapat dipakai untuk satu kali pengulangan, jadi
pada
penelitian ini dibutuhkan empat ekor mencit karena terdapat
empat kali
pengulangan.
4.4.3 Variabel Penelitian
Variabel yang diamati dari penelitian ini adalah:
1. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak propolis
dengan
konsentrasi bertingkat 25 µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml.
Penetapan
konsentrasi yang digunakan didasarkan pada modifikasi dari
penelitian yang telah dilakukan oleh Herawati et al (2015).
Variabel
bebas lainnya adalah virus ND yang diberikan dengan dosis 64
HAU.
2. Variabel tidak bebas (variabel terikat)
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah TNF- -6.
3. Variabel kontrol (variabel kendali)
Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah mencit strain
Balb/C,
umur 6-8 minggu, jenis kelamin jantan, berat badan 20-25
gram,
pakan yang diberikan seragam yaitu pakan standar berbentuk
pelet
(Mangkoewidjojo, 2006).
4.4.4Pembuatan Ekstrak Propolis
Langkah pertama adalah mengekstraksi propolis dengan etanol
sebagai pelarut memekai perbandingan propolis : etanol adalah 1
: 10. Alat
-
28
yang digunakan yaitu Thermostirer berkecepatan 150 rpm selama 4
jam
dan diputar dengan bantuan Magnetic Stirer 5 cm. Hasilnya
disaring
dengan menggunakan kertas saring sehingga didapat filtrate
propolis.
Filtrat dipisahkan dari pelarut dengan cara penguapan dalam
rotary
evaporator pada suhu 70°C berkecepatan 2-3 rpm (Jaya et al,
2008).
4.4.4.1 Penentuan Konsentrasi Ekstrak Propolis
Penelitian ini menggunakan konsentrasi ekstrak propolis
untuk
virus uji 0% (kontrol positif), 25µg/ml, 50µg/ml, dan100µg/ml.
Menurut
Herawati et al (2015) pengencer yang digunakan adalah dimethyl
sulfoxide
(DMSO). Alasannya adalah karena DMSO memiliki polaritas yang
sama
dengan propolis. Jumlah ekstrak propolis yang dimasukkan
kedalam
sumuran adalah 500 µl (Herawati et al, 2015). Jadi hel pertama
yang
dilakukan adalah pembuatan stok propolis 1000 µg/ml DMSO.
Kemudian
diencerkan kembali dengan medium komplit menggunakan rumus
V1.M1=V2.M2 sampai mendapatkan konsentrasi yang diinginkan.
Perhitungannya terdapat pada Lampiran 6 (halaman 64). Dalam
media
perlakuan terdapat komposisi sebagai berikut:
Perlakuan C : 500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis
konsentrasi 25 µg/ml
+ suspensi virus ND 64 HAU 100 µl
Perlakuan D:500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis
konsentrasi 50 µg/ml
+ suspensi virus ND 64 HAU 100 µl
Perlakuan E : 500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis
konsentrasi 100
µg/ml + suspensi virus ND 64 HAU 100 µl
-
29
4.4.5 Pembuatan Kultur Makrofag
4.4.5.1 Isolasi Makrofag
Prosedur dibawah ini dilakukan untuk mendapatkan 5x105
sel/sumuran. Mencit dieuthanasia dengan dislokasi servikalis,
kemudian
diletakkan dalam posisi terlentang, kulit abdomen dibuka
sehingga tampak
peritoneum kemudian dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian
diinjeksi dengan 10cc larutan RPMI dingin ke dalam rongga
peritoneum.
Peritoneum digoyang-goyangkan pelan untuk mendapatkan
makrofag
yang cukup banyak. Setelah itu cairan disedot kembali sampai
habis dan
dimasukkan dalam tabung sentrifuse steril. Cairan kemudian
disentrifus
dengan kecepatan 800 rpm pada suhu ruang (25 °C) selama 8
menit.
Setelah supernatan dibuang, ditambahkan 1cc RPMI 1640,
penicillin-
streptomycin sebanyak 10 µl. Sel-sel makrofag dihitung
dengan
hemasitometer. Makrofag diwarnai dengan Trypan Blue 0,05%
dengan
perbandingan 1:1. Campuran makrofag dan TB dimasukkan ke
dalam
haemositometer dengan kemiringan 45°, sampel dimasukkan pada dua
sisi
pengisian lalu didiamkan selama 1 menit sebelum dilakukan
perhitungan
dibawah mikroskop inverted dengan perbesaran 400x. Sel yang
hidup
tidak terwarnai dan sel yang mati berwarna biru (Rahayuningsih,
2010).
Cara perhitungan sel adalah :
a) Sel yang menempel garis kanan dan bawah dimasukkan dalam
perhitungan, sedangkan yang menempel pada garis kiri dan atas
tidak
dihitung. Sel yang menggumpal dihitung sebagai satu sel.
-
30
b) Diperkirakan jumlah sel dalam 1 kotak besar 20-60 atau
100-300 dalam
4 kotak besar. Apabila lebih banyak, harus dilakukan pengenceran
lagi.
c) Jumlah sel per ml dan jumlah sel yang hidup per ml dalam
suspensi
dapat dihitung dengan rumus :
Total sel/ml = total sel x faktor pengenceran x 104 4 Jumlah sel
hidup = sel hidup x faktor pengenceran x 104 4
Setelah dilakukan perhitungan sel dalam suspensi sampel,
maka
dilakukan pengenceran dengan densitas 5x105 sel/500 µl dengan
rumus
V1xC1=V2xC2.
4.4.5.2 Kultur Makrofag
Suspensi sel yang didapat kemudian dikultur dalam medium
komplit (RPMI 1640, penicillin-streptomycin) di dalam microplate
24
sumuran dasar rata, masing-masing sumuran 500 mikroliter
(kepadatan
5x105 sel/500 µl), kemudian diinkubasi dalam inkubator CO² pada
suhu
370C selama 24 jam. Fungsi inkubator CO² adalah untuk
mempertahankan
suhu optimal dengan tingkat CO² 5% (Rahayuningsih, 2010).
4.4.6Pemberian Ekstrak Propolis pada Kultur Makrofag
Penelitian ini menggunakan beberapa level konsentrasi
ekstrak
propolis. Medium kultur diganti dengan medium komplit ditambah
ekstrak
dengan konsentrasi 25µg/ml, 50µg/ml, dan 100µg/ml. Kultur
makrofag
yang ada dalam sumuran sejumlah 500 µl di beri ekstrak
propolis
-
31
sebanyak 500 µl. Kemudian diinkubasi selama 24 jam (Herawati et
al,
2015).
4.4.7 Preparasi Virus ND
4.4.7.1 Membiakkan Virus Pada Telur Ayam Berembrio
Virus dibiakkan pada TAB berumur 9-11 hari. Telur diteropong
terlebih
dahulu untuk memastikan tempat injeksi. Dilakukan candling
untuk
mengetahui letak embrio ayam dan lokasi pembuluh darah,
selanjutnya
diberi tanda dari cangkang telor supaya lokasi injeksi virus
tidak mengenai
embrio dan pembuluh darah tersebut. Gambar 4.4 merupakan
gambaran
lokasi injeksi virus Newcastle Disease di allantois sac.
Gambar 4.4 Lokasi Injeksi Virus Newcastle Disease (Murwani et
al, 2013)
Kemudian telur disterilkan pada tempat injeksi. Setelah virus
diinokulasikan,
lubang ditutup dengan menggunakan paraffin. Telur diamati
setelah 16-18
jam untuk memastikan bahwa embrio sudah mati, kemudian telur
dapat
disimpan dalam suhu 4° C. Cara memastikan bahwa embrio sudah
mati
adalah dengan melakukan candling kembali dan embrio tidak
akan
merespon terhadap cahaya (Suryana, 2001).
-
32
4.4.7.2 Hemaglutination (HA) Test
Uji HA dilakukan untuk mengetahui titer dari virus yang akan
diinduksikan pada kultur makrofag. Hal pertama yang dilakukan
adalah
memasukkan 0,025 ml PBS dari sumuran 2-12. Suspensi virus
dimasukkan
ke dalam sumuran 1 sebanyak 0,025 ml. Selanjutnya ambil 0,025 ml
dari
sumuran 1 dan campurkan ke sumuran 2 sampai sumuran ke-11.
Ambil
0,025 ml pada sumuran ke-11 untuk dibuang. Kemudian
ditambahkan
0,025 ml RBC ke semua sumuran lalu campur hingga homogen.
Sumuran
ke-12 hanya berisi PBS dan RBC karena digunakan sebagai
kontrol
negatif. Jika sudah terjadi endapan eritrosit pada sumuran
ke-12, maka
dapat diamati aglutinasi yang terjadi pada dasar sumuran
dengan
memiringkan plat titermikro. Endapan yang tidak dapat
mengalir
merupakan positif HA (OIE, 2012).
4.4.7.3 Pemberian Virus ND Pada Kultur Makrofag
Kultur makrofag yang sudah diberi ekstrak kemudian diinkubasi
selama 24
jam diinduksi virus ND dengan dosis infeksi 64 HAU. Kemudian
dilakukan inkubasi kembali selama 30 menit (Herawati et al,
2015).
4.4.8Penentuan Produksi TNF- Flowcytometry
Kultur makrofag yang sudah diinduksi dengan NDV dan diberi
ekstrak propolis dengan berbagai macam dosis ditambahkan PBS
sebanyak 1 mL lalu dihomogenkan dengan cara pipetting.Fungsi
dari PBS
ini adalah untuk pencucian dan pengenceran setelah panen dari
kultur sel.
Setelah itu diambil 100 µl kemudian dimasukkan ke dalam
microtube
-
33
baru. Selanjutnya ditambahkan 500 l PBS, kemudian
disentrifugasi
dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Hasil
dari
sentrifugasi diambil bagian peletnya kemudian ditambahkan
antibodi cell
surface molecule yang digunakan untuk staining molekul permukaan
sel
sebanyak 50 l, lalu diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 40C.
Setelah
itu ditambahkancytofix cytopermyang berfungsi untuk fiksasi
dan
permeabilisasi sel untuk pewarnaan sitokin intraseluler dengan
antibodi
anti-sitokin fluorochrome-terkonjugasisebanyak 100 µl,
kemudian
diinkubasi selama 20 menit dengan suhu 40C, lalu ditambahkan
washpermuntuk mencuci sel-sel dan untuk mencairkan antibodi
anti-
sitokin untuk pewarnaan 1 mL dan disentrifugasi lagi dengan
kecepatan
2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Setelah didapatkan
pelet hasil
sentrifugasi ditambahkan antibodi intraseluler (TNF-
ditambahkan 300 l PBS, lalu dimasukkan dalam kuvet
flowcytometry
4.4.9Penentuan Produksi IL-6 dengan Flowcytometry
Kultur makrofag yang sudah diinduksi dengan NDV dan diberi
ekstrak propolis dengan berbagai macam dosis ditambahkan PBS
sebanyak 1 mL lalu dihomogenkan dengan cara pipetting.Fungsi
dari PBS
ini adalah untuk pencucian dan pengenceran setelah panen dari
kultur
sel.Setelah itu diambil 100 µl, kemudian dimasukkan ke dalam
microtube
baru. Selanjutnya ditambahkan 500 l PBS, kemudian
disentrifugasi
dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Hasil
dari
-
34
sentrifugasi diambil bagian peletnya kemudian ditambahkan
antibodi cell
surface molecule yang digunakan untuk staining molekul permukaan
sel
sebanyak 50 l, lalu diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 40C.
Setelah
itu ditambahkan cytofix cytoperm sebanyak 100 µl, kemudian
diinkubasi
selama 20 menit dengan suhu 40C, lalu ditambahkan washperm 1 mL
dan
disentrifugasi lagi dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit
dengan
suhu 40C. Setelah didapatkan pelet hasil sentrifugasi
ditambahkan IL-6
sebanyak 50 µl, kemudian ditambahkan 300 l PBS, lalu dimasukkan
ke
dalam kuvet flowcytometry
4.5 Analisis Data
Analisa data yang digunakan dalam penelitian ini adalah
analisa
kuantitatif One Way ANOVA, a
One Way ANOVA dimaksudkan untuk melihat pengaruh terhadap
pemberian ekstrak propolis sebagai preventif pada kultur
makrofag yang
diinfeksi virus ND, kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk
melihat
perbedaan tiap perlakuan.
-
35
BAB 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebelum penelitian berlangsung, dilakukan optimasi terlebih
dahulu untuk
mengetahui berapa jumlah sel makrofag yang dihasilkan dari satu
ekor
mencit. Setiap sumuran dalam kultur berisi 500.000 sel makrofag.
Setelah
dilakukan optimasi, dari satu ekor mencit mampu menghasilkan
2.500.000
sel. Peneitian ini memerlukan sebanyak 20 sumuran, sehingga
jumlah
mencit yang dibutukan hanya 4 ekor. Makrofag diisolasi dari
peritoneum
mencit dengan menginjeksikan medium RPMI 1640 kedalam rongga
peritoneum mencit. Selanjutnya makrofag dikultur dalam medium
komplit
(RPMI 1640, penicillin-streptomycin) dalam microplate 24 sumuran
dasar
rata. Masing-masing sumuran berisikan makrofag dengan
kepadatan
500.000 sel. Kemudian kultur makrofag tersebut dibagi menjadi
lima
perlakuan. Kontrol negatif berupa kultur makrofag tanpa ekstrak
propolis
dan tanpa virus ND. Kontrol positif berupa kultur makrofag tanpa
ekstrak
propolis tapi diberi virus ND. Perlakuan 1 adalah pemberian
ekstrak
propolis konsentrasi 25 µg/ml, perlakuan 2 konsentrasi 50 µg/ml,
dan
perlakuan 3 konsentrasi 100 µg/ml.
Makrofag merupakan sel yang memiliki peran utama dalam
proses
fagositosis atau penghancuran antigen. Propolis memiliki
kandungan
flavonoid, tanin atau polifenol, dan saponin.
Kandungan-kandungan dari
propolis tersebut mampu meningkatkan proliferasi dari makrofag
sehingga
dapat meningkatkan jumlah makrofag. Selain itu propolis juga
mampu
-
36
menstimulasi fagostosis. Menurut Tyastuti et al (2006), propolis
dapat
meningkatkan persentase fagositosis makrofag pada ayam yang
terkena
ND. Propolis juga dapat membersihkan polutan dan racun dalam
tubuh,
sehingga metabolisme sel dapat berlangsung optimal (Prasetyo et
al,
2013).
Berikut ini merupakan gambar makrofag yang diambil setelah
dilakukan proses kultur, sehingga makrofag masih dalam keadaan
hidup :
Gambar 5.1 Gambaran Kultur Makrofag Keterangan : Gambaran kultur
makrofag yang tidak diberi ekstrak propolis, A : Perbesaran 100x, B
: Perbesaran 400x, C : Sel Makrofag, D : Eritrosit
Perbesaran 100x
Perbesaran 400x
A
B
C
D
-
37
Gambar 5.2 Gambar Kultur Makrofag Setelah Diberi Ekstrak
Propolis Kemudian Diinkubasi Selama 24 Jam (Perbesaran 100x).
Keterangan: A: Ekstrak Propolis 25 µg/ml, B: Ekstrak Propolis 50
µg/ml, C: Ekstrak Propolis 100 µg/ml. D: Makrofag. Terjadi
peningkatan proliferasi dan diferensiasi dari makrofag pada kultur
makrofag yang diberi ekstrak propolis. Sehingga jumlah makrofag
pada kultur yang diberi ekstrak propolis akan meningkat.
Percesaran 100x
Perbesaran 100x
Perbesaran 100x
A
B
C
D
D
D
-
38
Makrofag berukuran 10-30 mm, berbentuk bulat, permukaan
mengkilat, kompak serta besarnya sama. Makrofag merupakan sel
yang
panjang umurnya dan dapat bertahan berbulan-bulan bila berada di
dalam
jaringan (Effendi, 2003). Setelah diinkubasi selama 24 jam,
makrofag
diberi ekstrak propolis dengan beberapa tingkat konsentrasi yang
berbeda.
Kultur makrofag yang telah digolongkan menjadi 5 perlakuan
kemudian
diinduksi virus Newcastle Disease 64 HAU. Virus ND ditanam dalam
telur
ayam berembrio. Kemudian setelah embrio mati, dilakukan uji HA
untuk
mengetahui titernya. Gambar hasil uji HA adalah sebagai berikut
:
Gambar 5.3 Hasil Uji HA diperoleh 64 HAU
Dari Gambar 5.3dapat dilihat bahwa hasil uji HA diperoleh titer
2
pangkat 6 yang setara dengan 64 HAU. Selanjutnya dilakukan panen
sel
makrofag untuk diketahui pengaruh pemberian ekstrak propolis
sebagai
preventif terhadap virus ND melalui produksi kadar TNF- -6.
Pada
penelitian secara in vivo, kadar TNF- -6 meningkat pada hari
ketiga.
-
39
5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF-
IL-6
Ada beberapa prasyarat parametrik yang harus terpenuhi
sebelum
sebuah data dapat dianalisa menggunakan One Way ANOVA.
Diantaranya
adalah uji normalitas (Saphiro-Wilk) dan homogenitas (Levene).
Pengujian
asumsi normalaitas dan homogenitas untuk kadar TNF- -6 tidak
terpenuhi (Lampiran 12). Oleh karena itu proses pengujian
dilakukan
secara non parametrik dengan Kruskal-Wallis yang dilanjutkan
dengan uji
|Ri-Rj|. Pengujian tidak dilakukan dengan Mann-Whitney karena
akan
muncul permasalahan mendasar berupa penolakan terhadap hipotesis
nol
yang benar (Daniel, 1989).
5.1.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar
TNF-
dengan Uji Kruskal-Wallis
Tumor Necrosis Factor Alpha dalam keadaan normal berperan
dalam proses apoptosis (Thomas, 2001). Hal inilah yang
menyebabkan
TNF-
adalah mekanisme kematian sel terprogram yang penting dalam
berbagai
proses biologi. Ketika terjadi inflamasi, makrofag akan
bekerjadanakan
memacu produksi sitokin. Seperti yang tampak pada kontrol
positif, kadar
dari TNF- Hasil penelitian menunjukkan
bahwa pemberian ekstrak propolis yang mengandung zat aktif
berupa
flavonoid dan tanin memberikan efek antiinflamasi dan
antioksidan yang
ditandai dengan adanya rata-rata penurunan persentase TNF-
pada
-
40
konsentrasi 25 µg/ml, 50 µg/ml, dan 100 µg/ml.Berdasarkan
rata-rata pada
perlakuan 1 dengan konsentrasi preventif25 µg/ml, perlakuan
2dengan
konsentrasi preventif50 µg/ml, danperlakuan 3 dengan
konsentrasi
preventif100 µg/ml terjadi penurunan produksi TNF- makrofag.
Namun, rata-rata penurunan produksi TNF- (P2) lebih
mendekati
nilai persentase kontrol negatif.
Rata-rata kadarTNF- kelompok kontrol dan perlakuan secara
lengkap ditunjukkan dalam histogram berikut :
Gambar 5.4 HistogramRata-Rata KadarTNF- Keterangan : K (-)
adalah kontrol negatif (kultur makrofag tanpa preventif
dengan propolis dan tanpa induksi virus ND); K (+) adalah
kontrol positif (kultur makrofag yang diinduksi virus ND); P (1)
adalah perlakuan 1 (kultur makrofag dengan preventif propolis
konsentrasi 25 µg/ml dan diinduksi virus ND); P (2) adalah
perlakuan 2 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi
50 µg/ml dan diinduksi virus ND); dan P (3) adalah perlakuan 3
(kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 100 µg/ml
dan diinduksi virus ND).
-
41
Pada Gambar 5.4 ditunjukkan histogram rata-ratakadar TNF-
pada semua kelompok kontrol dan perlakuan. Dimulai dari kelompok
K+,
terlihat bahwa rata-rata kadarTNF- menurun pada semua
kelompok
perlakuan pemberian ekstrak propolis. Namun secara statistik,
penurunan
tersebut tampak tidak signifikan.
Menurut data yang diperoleh, terdapat peningkatan produksi
TNF-
secara signifikan (p
-
42
Semakin berat infeksi, TNF- yang diproduksi juga akan semakin
besar.
Pada kadar rendah TNF-
menginduksi inflamasi akut. Pada kadar sedang, TNF-
inflamasi sistemik. Sedangkan pada kadar tinggi, TNF-
peradangan, penyembuhan luka, remodelling jaringan dan dapat
menginduksi syok septik dan cachexia. Semakin meningkat jumlah
TNF-
akan memicu terjadinya reaksi inflamasi sistemik yang
berat.Aktivitas
makrofag secara berlebihan dalam proses inflamasi dapat
mengakibatkan
produksi sitokin meningkat (Popa et al, 2007).
Ekstrak propolis memiliki kandungan aktif seperti flavonoid,
tannin atau polifenol, dan saponin. Flavonoid merupakan
antioksidan dan
antiinflamasi. Mekanisme hambatan yang dilakukan oleh
flavonoid
sebagai antioksidan bisa terjadi secara langsung yaitu
dengan
mendonorkan ion hidrogen sehingga ion-ion yang mengalami
radikal
bebas berubah menjadi stabil. Keadaan ion yang telah stabil
menyebabkan
menurunnya keadaan stres oksidatif. Flavonoid juga akan
mengurangi
pelepasan dari peroksidase, yang menghambat produksi reactive
oxygen
species (Rachmadian, 2011).
Mekanisme antiinflamasi saponin adalah dengan mencegah
kerusakan biomolekul akibat radikal bebas karena saponin
mengandung
gugus antioksidan. Hal ini memungkinkan saponin untuk
menekan
aktivitas superoksida melalui pembentukan intermediate
hidroperoksida.
Selain flavonoid dan saponin, polifenol merupakan zat aktif dari
ekstrak
-
43
propolis yang memiliki peran mengurangi inflamasi. Polifenol
berperan
melindungi sel tubuh dari kerusakan akibat radikal bebas
sehingga
mencegah proses inflamasi dan peradangan (Rachmadian, 2011).
TNF-
akan meningkat saat makrofag teraktivasi. Penurunan kadar TNF-
terjadi
melalui penekanan kompleks antigen-antibodi dalam mekanisme
infiltrasi
sel inflamasi sehingga dapat menurunkan aktivitas radikal bebas
dan
enzim Matrix Metalloproteinase (MMP) sehingga reaksi inflamasi
dapat
menurun (Lehner, 2011).
Pengujian asumsi normalitas dan homogenitas untuk variabel
kadarTNF- tidak terpenuhi (lampiran 12). Oleh karena itu
dilakukan
pengujian untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak
propolis
terhadap kadarTNF-
Kruskal-Wallis. Berikut hasil pengujian pengaruh pemberian
ekstrak
propolisdengan beberapa level konsentrasi terhadap kadar TNF-
dengan
menggunakan uji Kruskal-Wallis.
Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap
KadarTNF-
dengan Uji Kruskal-Wallisdan |Ri-Rj| 5%
Perlakuan Mean ± SD p-value
K- 49.83 ± 11.87 a
0.022 K+ 68.04 ± 0.65 b P1 67.76 ± 0.94 b P2 61.45 ± 6.33 ab P3
63.29 ± 6.09 ab
Keterangan: Pada rata-rata ±sd jika memuat notasi yang berbeda
berarti ada perbedaan yangbermakna (p0.05).
-
44
Berdasarkan pada hasil analisis dengan menggunakan uji
Kruskal-
Wallis, didapatkan p-value sebesar 0.022, lebih kecil
daripada
(p
-
45
sd kelompok P2 dan P3 memuat notasi yang sama dengan
kelompok
kontrol negatif.Hal ini mengandung pengertian bahwa pemberian
ekstrak
propolisdengan konsentrasi 50 dan 100 µg/ml (P2 dan P3)
mampu
menurunkan kadarTNF- ultur makrofag kondisi
normal. Sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak propolis
mampu
berperan sebagai antioksidan tambahan dari luar yang berfungsi
untuk
menyeimbangkan sel yang mengalami radikal bebas sehingga
menjadi
stabil dan ROS dihasilkan lebih sedikit. Sedangkan pada
kelompok
pemberian ekstrak propolisdengan konsentrasi 25 µg/ml
berbeda
signifikan dengan kelompok kontrol negatif tapi memiliki notasi
sama
dengan kontrol positif. Hal ini membuktikan bahwa pemberian
ekstrak
propolis konsentrasi 25 µg/ml (P1) belum mampu menghasilkan
kadar
TNF-
5.1.2Pengujian Pengaruh Ekstrak PropolisTerhadap Kadar IL-6
dengan
Uji Kruskal-Wallis
Makrofag memiliki kemampuan menghasilkan sekresi sel yang
dikenal dengan interleukin seperti TNF- -1, IL-4, dan IL-6.
Sitokin
dihasilkan oleh sel dalam reaksi radang atau imunologik yang
berfungsi
sebagai isyarat antara sel-sel untuk berkomunikasi dalam respon
imun.
Sitokinproinflamasi IL-6 merupakan salah satu interleukin
yang
memegang peranan sangat penting pada reaksi inflamasi. Selain
itu IL-6
dapat meningkatkan respon antibodi terhadap patogen yang
mempercepat
-
46
pelenyapan patogen yang dicerna oleh makrofag. IL-6 juga
berperan dalam
proses apoptosis, sehingga IL-6 juga masih dihasilkan pada
kontrol negatif
(Titus et al, 1991).
Semakin meningkat aktivitas patogen akan menyebabkan adanya
infiltrasi sel inflamasi yang mengakibatkan IL-6 juga meningkat
seperti
yang terdapat pada kontrol positif. Peningkatan kadar IL-6
berkolerasi
dengan kerusakan sel dan inflamasi. Makrofag berperan sebagai
salah satu
sel dalam sistem pertahanan tubuh melawan invasi virus dengan
cara
fagositosis. Sitokin IL-6 ini dapat memediatori makrofag
mensintesis
reaksi inflamasi untuk melindungi terhadap virus. Menurut
pendapat Silva
et al (2007), sitokin merupakan sinyal penting yang dihasilkan
oleh sel-sel
tubuh untuk mengaktifkan kerja sel lain, sehingga jenis dari
sitokin yang
disekresikan oleh sel akan memberikan efek pada sel target.
Sitokin dapat
beraksi secara autocrine yaitu mempengaruhi lingkungan pada sel
yang
melepaskannya, paracrine yaitu berpengaruh terhadap sel lain
di
sekitarnya, dan endocrine yaitu berpengaruh terhadap lingkungan
sel
sekitarnya.
Secara statistik diperoleh hasil bahwa kelompok perlakuan P
(2)
dengan konsentrasi 50 µg/ml memiliki perbedaan yang
signifikan
dibandingkan kelompok kontrol positif (
-
47
sebagai antiinflamasi dan antioksidan.Flavonoid sebagai
antioksidan
melindungi tubuh terhadap efek radikal bebas dengan cara
mentransfer
sebuah elektron ke senyawa radikal bebas sehingga menjadi stabil
dan sel
terlindungi dari adanya peroksidasi lipid.
Fungsi tanin atau polifenol sebagai antiinflamasi bekerja
dengan
cara menghambat pelepasan mediator inflamasi sedangkan
sebagai
antioksidan, tanin memiliki kemampuan dalam menghentikan reaksi
rantai
radikal bebas secara efisien (Pazil, 2009).Mekanisme
antiinflamasi
saponin yaitu dengan mencegah kerusakan biomolekul akibat
radikal
bebas karena saponin mengandung gugus antioksidan. Hal ini
memungkinkan saponin untuk merusak superoksida melalui
pembentukan
intermediate hidroperoksida (Fitriyani et al, 2011).
Pada Gambar 5.5ditunjukkan histogram rata-ratakadar
IL-6semua
kelompok kontrol dan perlakuan. Dimulai dari kelompok K+,
terlihat
bahwa rata-rata kadar IL-6menurun pada semua kelompok
perlakuan
pemberian ekstrak Propolis. Secara statistik ditunjukkan bahwa
pemberian
ekstrak propolis dengan konsentrasi 50 µg/ml (P2) dan 100 µg/ml
(P3)
terbukti mampu menurunkan kadar IL-6 pada kultur makrofag
yang
diinduksi virus ND secara signifikan.
-
48
Rata-rata kadar IL-6 kelompok kontrol dan perlakuan secara
lengkap ditunjukkan dalam histogram berikut :
Gambar 5.5HistogramRata-Rata Kadar IL-6 Keterangan : K (-)
adalah kontrol negatif (kultur makrofag tanpa preventif
dengan propolis dan tanpa induksi virus ND); K (+) adalah
kontrol positif (kultur makrofag yang diinduksi virus ND); P (1)
adalah perlakuan 1 (kultur makrofag dengan preventif propolis
konsentrasi 25 µg/ml dan diinduksi virus ND); P (2) adalah
perlakuan 2 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi
50 µg/ml dan diinduksi virus ND); dan P (3) adalah perlakuan 3
(kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 100 µg/ml
dan diinduksi virus ND). Jumlah IL-6 pada kelompok perlakuan 2
(konsentrasi preventif 50
µg/ml)mengalami penurunan dibandingkan kelompok kontrol
positif.
Kelompok P (2) yang diberi preventif ekstrak propolis dengan
konsentrasi
50 µg/ml menunjukkan bahwa konsentrasi ini merupakan konsentrasi
yang
paling baik untuk menurunkan produksi IL-6.
-
49
Berikut hasil pengujian pengaruh pemberian ekstrak
propolisdengan beberapa level konsentrasi terhadap kadar
IL-6dengan
menggunakan uji Kruskal-Wallis.
Tabel 5.2 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar
IL-6
dengan Uji Kruskal-Wallis dan |Ri-Rj| 5%
Perlakuan Mean ± SD p-value K- 42.38 ± 0.33 a
0.002 K+ 60.51 ± 7.35 c P1 54.34 ± 0.63 bc P2 50.3 ± 2.29 ab P3
51.18 ± 2.71 ab
Keterangan: Pada rata-rata ± sd jika memuat notasi yang berbeda
berarti ada perbedaan yangbermakna (p0.05).
Berdasarkan pada hasil analisis dengan menggunakan uji
Kruskal-
Wallis, didapatkan p-value sebesar 0.002, lebih kecil
daripada
(p
-
50
Pada perbandingan antara kelompok kontrol positif (K+)
dengan
perlakuan, ditunjukkan bahwa penurunan kadar IL-6 secara
signifikan
ditunjukkan pada kelompok perlakuan pemberian ekstrak
propolis
konsentrasi50 dan 100µg/ml (P2 dan P3).Hal ini ditunjukkan dari
nilai
rata-rata ± sd kelompok perlakuan P2 dan P3 lebih rendah dan
memuat
notasi yang berbeda jika dibandingkan dengan kelompok kontrol
positif.
Pada perbandingan antara kelompok (K-) dengan perlakuan,
ditunjukkan bahwa pemberian ekstrak propolis konsentrasi50 µg/ml
(P2)
dan 100 µg/ml (P3) mampu menurunkan kadar IL-6 hingga
mendekati
kultur makrofag normal (K-). Hal ini ditunjukkan dari nilai
rata-rata ± sd
kelompokperlakuantersebut memuat notasi yang sama dengan
kelompok
kontrol negatif. Dapat diartikan bahwa pemberian ekstrak
propolisdengan
konsentrasi 50 dan 100 µg/ml (P2 dan P3) mampu menurunkan
kadarTNF-
dikatakan bahwa ekstrak propolis mampu berperan sebagai
antioksidan
tambahan dari luar yang berfungsi untuk menyeimbangkan sel
yang
menglami radikal bebas sehingga menjadi stabil dan ROS
dihasilkan lebih
sedikit. Sedangkan pada kelompok pemberian ekstrak
propolisdengan
konsentrasi 25 µg/ml berbeda signifikan dengan kelompok kontrol
negatif
tapi memiliki notasi sama dengan kontrol positif. Hal ini
membuktikan
bahwa pemberian ekstrak propolis konsentrasi 25 µg/ml (P1)
belum
mampu menghasilkan kadar TNF- kultur makrofag kondisi
normal.
-
35
BAB 6
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian
ini, yaitu :
1. Ekstrak propolis dapat digunakan sebagai tindakan preventif
pada kultur
makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease. Konsentrasi
ekstrak
propolis 50 µg/ml merupakan perlakuan terbaik yang memiliki
efek
paling besar untukmencegah peningkatan produksi kadar TNF-
(Tumor
Necrosis Factor Alpha).
2. Ekstrak propolis dapat digunakan sebagai tindakan preventif
pada kultur
makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease. Konsentrasi
ekstrak
propolis 50 µg/ml merupakan perlakuan terbaik yang memiliki
efek
paling besar untukmencegah peningkatan produksi kadar IL-6
(Interleukin
6).
6.2 Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai
variasi konsentrasi
ekstrak propolisuntuk mengetahui konsentrasi yang lebih efektif
dalam
menurunkan kadar sitokin proinflamasi (TNF- -6).
2. Perlu adanya penelitian lebih lanjut terhadap pengaplikasian
ekstrak
propolis untuk mengetahui efek klinis pada ayam sebagai
preventif
terjadinya penyakit Newcastle Disease.
-
36
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A. K., Lichtman, A. H., and Pillai, S. 2010.Selular and
Molecular Immunology, updated ed. 6 ed.Philadelphia. John E.
Kennedy Blvd Ste 1800.
Abbas, A. K., Litchman, A. H. 2003. Chapter 12 Cytokines.
Chapter 13 Effector
mechanism of cell-mediated immunity. Chapter 14 Effector
mechanism of humoral immunity. In:Celluler and molecular
Immunology. 21 ed. Philadelphia.
Adi, A. M., Astawa, N. M., Putra, K. S. A., Hayashi, Y.
Matsumoto, Y. 2010.
Isolation and Characterization of a Pathogenis Newcastle Disease
Virus From a Natural Case In Indonesia. J Vet Med Sci. 72 :
313-319.
Akrom, 2013. Mekanisme Kemopreventif MBJH pada Tikus Sprague
dawley (SD)
yang Diinduksi 7,12 Dimethylbenza(a) Antracene (DMBA). Disertasi
: Jogjakarta : Pasca Sarjana UGM.
Bouzari, M. and Spardbrow, P. 2006. Early Events Following
Oral
Administration of Newcastle Disease Virus Strain V4. Journal
Poult. Sci. 43 : 408-414.
Baratawidjaja, K. G. 2013. Imunologi Dasar. Edisi ke-10.Jakarta
: FKUI. Brown, C., King, D. J., and Seal, B. S. 1999. Pathogenesis
of Newcastle Disease
in Chickens experimentally Infected With Virusesof Different
Virulence. Vet. Pathol. 36 : 125-132.
Chang, A. and Dutch, R. E. 2012. Paramyxovirus Fusion and Entry:
Multiple
Paths to a Common End. USA : University of Kentucky. Courtney,
S.C., Susta, L., Gomez, D., Hines, N., Pearson, J.E., Brown,
C.C.,
Miller, P.J., Afonso, C.L., 2013. Highly divergent virulent
isolates of Newcastle disease virus from the Dominican Republic are
members of a new genotype that may have evolved unnoticed for over
two decades. J. Clin. Microbiol. 51, 508 517.
Daniel., W., W. 1989. Statistika Nonparametrik Terapan. Georgia
State
University. Jakarta : PT Gramedia. Edewor, T. I. 2016. A Review
: Immunological Potential of Bioactive Flavonoids
And Flavonoids Containing Fractions Isolated From Medical
Plants. Cibtech Journal of Bio-Protocol ISSN : 2319-3840 Vol. 5
(2). Ogbomoso : Ladoke Akintola University Of Technology.
-
37
Effendi, Z. 2003. Daya Fagositosis Makrofag Pada Jaringan
Longgar Tubuh. Medan : Bagian Histologi FKUSU.
Ferdous, F., Maurice, D. & Scott, T. 2008. Broiler chick
thrombocyte response to
lipopolysaccharide. Poultry Science, 87, 61_63. Ferreira, L.,
Villar, E. and Munoz-Barroso, I. 2004. Gangliosides and N-
glycoproteins function as Newcastle Disease Virus Reseptors.
Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 : 2344-2356.
Fitriyani, A., L. Winarti, S. Muslichah, dan Nuri. 2011. Uji
Antiinflamasi Ekstrak
Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) pada
Tikus Putih. Majalah Obat Tradisional, 16 (1), 34-42.
Hansson, G. K. 2011. Immune Mechanism in Artherosclerosis,
Artherosclerosis,
Thrombosis, and Vascular Biology. 21:1876. Hardyanto, J.,
Pratiwi, T., Winarso, D. 2013. Efek Perasan Daun dan Tangkai
Semanggi Air (Marsilea Crenata) Terhadap Penurunan Kadar Tumor
Necrosis Alpha Dan Interleukin 1 Beta Pada Tikus Putih (Rattus
norvegicus) Urolithiasis. Malang : Program Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya.
Harmita dan Maksum, R. 2008. Buku Ajar Analisis Hayati. Edisi
Ketiga. Jakarta:
ECG pp: 63-67. Hayter, R. B. and Besch, E. L. 1974. Airborn
Particle Deposition in the
Respiratory Tract of Chickens. Poult. Sci. 53, 1507-1511.
Herawati, I., Husin, U. A., Sudigdoadi, S. 2015. Pengaruh Ekstrak
Etanol
Propolis Terhadap Aktivitas & Kapasitas Fagositosis Pada
Kultur Makrofag Yang Diinfeksi Enteropathogenic Escherichia Coli
(EPEC). MKB Vol. 47 No. 2. Bandung : FK UNPAD.
Hoss, A., Zwarthoff, E. C., Zawatzky, R. 1989. Differential
Expression of
Interferon Alpha and Bata Induced with Newcastle Disease Virus
in Mouse Machrophage Cultures. J. gen Virol, 70. 575-589.
Heidelberg : Institute of Virus Reseach.
Iorio RM, Syddall RJ, Sheehan JP, Bratt MA, Glickman RL, dan
Riel AM. 2009.
Neutralization Map of the Hemagglutinin-Neuraminidase
Glycoprotein of Newcastle Disease Virus: Domains Recognized by
Monoclonal Antibodies That Prevent Receptor Recognition. Journal of
Virology. 65(9): 4999-5006.
-
38
Institute of Laboratory Animal Resources Commision an Life
Science. 2010. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
Eight Edition. Washington: The National Academies Press.
Ishartadiati, K. 2008. Peranan TNF, Il-1, dan IL-6 Pada Respon
Imun Terhadap
Protozoa. Surabaya : Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya
Kusuma Surabaya.
Jaya, F., Radiati, L. E., Awwaly, K. U., Kalsum, U. 2008.
Pengaruh Pemberian
Ekstrak Propolis Terhadap Sistem Kekebalan Seluler Pada Tikus
Putih (Rattus norvegicus) Strain Wistar. Malan