iversität Bielefeld FB 613 Hartmut Niemann 1 , und Joachim Heberle 2 1 Strukturbiochemie (BC-IV), Fakultät für Chemie 2 Biophysikalische Chemie (PC-III), Fakultät für Chemie Untersuchung des Anionentransports durch Halorhodopsin mittels zeitaufgelöster Proteinkristallographie Publikationen [1] W. Gmelin, K. Zeth, R. Efremov, J. Heberle, J. Tittor, and D. Oesterhelt (2007), The crystal structure of the L1 intermediate of halorhodopsin at 1.9 Å resolution. Photochem. Photobiol. 83, 369-77. [2] J. Heberle, G. Büldt, E. Koglin, J.P. Rosenbusch, and E.M. Landau (1998), Assessing the Functionality of a Membrane Protein in a Three-Dimensional Crystal . J. Mol. Biol. 281, 587-592. Abb. 1: Photozyklus von Halorhodopsin Ziel Das integrale Membranprotein Halorhodopsin ist eine lichtgetriebene Anionenpumpe, die Cl - ins Zellinnere von Halobakterien transportiert. In allen bisher bekannten Röntgenstrukturen befindet sich das Anion aber noch auf der extrazellulären Seite. Um den Reaktionsmechanimus zu verstehen, wollen wir spätere Reaktionsintermediate, bei denen sich das Anion bereits auf der cytoplasmatischen Seite befindet, stabilisieren und ihre Struktur aufklären. Da Halorhodopsin die kristallographisch gut nachweisbaren Ionen Br - und I - transportiert, eignet es sich hervorragend für die Untersuchung niedrig besetzter Zwischenzustände bzw. für zeitaufgelöste Studien. Damit besteht erstmals die Möglichkeit, den aktiven Ionentransport durch ein Membranprotein zeitlich und räumlich hochauflösend zu verfolgen. Arbeitsplan • Expression und Reinigung von Halorhodopsin • Kristallisation in der kubischen Lipidphase • Mikrospektroskopie an Kristallen • Stabilisierung von Intermediaten im Kristall • Statische Kristallographie an stabilisierten Zwischenzuständen • Zeitaufgelöste Kristallographie (Laue) Stand der Forschung Während eines Photozyklus wird ein Cl - Ion über die Membran gepumpt. Ein Modell für den Photozyklus ist etabliert (Abb.1). Die Strukturen der Zustände HR und L 1 sind bekannt. In L 1 liegt 13-cis Retinal vor, allerdings hat sich das Cl - nicht (signifikant) bewegt (Abb. 2). D11 Vorhaben • Strukturbestimmung später Intermediate des Photozyklus • Charakterisierung der durch FT-IR vorhergesagten Strukturänderungen des Proteinrückgrats • Lokalisation des gepumpten Anions auf der cytoplasmatischen Seite • Beschreibung der zweiten Bindungstasche und der molekularen Erkennung • Zuverlässige Lokalisation bei niedrig besetzten Zwischenzuständen dank der hohen Ordnungszahl von I - und des anomalen Signals von Br - • Kombination von Spektroskopie (UV/Vis und FT-IR) und Kristallographie • Thermisches Einfangen von Zwischenzuständen (v.a. L 2 ) und Strukturbestimmung mittels statischer Kristallographie • Etablierung von geeigneten Bedingungen für zeitaufgelöste Kristallographie • Laue-Kristallographie für hohe zeitliche Auflösung (hohe Ordnungszahl der gepumpten Ionen wiederum von Vorteil) Abb. 2: Kristallstruktur von Halorhodopsin. T203V Mutante im Grundzustand (grau) und im L 1 Zustand (farbig). An der Cl - Bindung beteiligte Seitenketten und Cl - sind als Stäbchen und Kugeln gezeigt [1]. Beantragte Mittel • 2 Doktorandenstellen • Investition: Chromatographie- Anlage 45.000 € Vernetzung im SFB • A2 (Schmid): Simulationen von Membranen • A5 (Seidel, Sauer, Dietz): Membranproteine • D4 (Heinzmann, Pfeiffer, Mattay): Ultraschnelle Laserspektroskopie • K2 (Sewald, Anselmetti): AFM, SPR • K8 (Heberle, Sauer): Membranproteine Schlussfolgerung Da Halorhodopsin auch die elektronenreichen Ionen Br - und I - transportiert, ist es ein ideales System, um das Anion während des Transports mittels Röntgenkristallographie zu verfolgen bzw. in niedrig besetzten Zuständen zu lokalisieren. Mikrospektroskopie ist zur Charakterisierung ein-gefangener Intermediate (Cryo-Trapping) und der Reaktionskinetik (zeitaufgelöste Laue- diffraktion) notwendig, womit eine eindeutige Korrelation der Strukturänderungen zu den spektroskopisch beo-bachteten Reaktionsintermediaten ermöglicht wird.