Università degli Studi di Siena Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Corso di Laurea Specialistica in Biologia Sanitaria Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica In collaborazione con il Dipartimento di Patologia Clinica U.O. Chimico Cliniche e Microbiologiche Sezione semplice di Microbiologia Ospedale S. Donato - Arezzo Sorveglianza di Laboratorio delle Tossinfezioni Alimentari con particolare attenzione a Escherichia coli 0157: H7 Docente Relatore: Prof. Giuseppe Lungarella Docente Aziendale: Tesi di laurea di: Dott.ssa Irene A.Galanti Alessio Dini Anno accademico 2008-2009
45
Embed
Università degli Studi di Siena Facoltà di Scienze ... CERTA/ARTICOLI, TESI DI LAUREA... · Salmonella è un batterio Gram negativo di forma bastoncellare, appartenente alla famiglia
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Università degli Studi di Siena
Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Corso di Laurea Specialistica in Biologia Sanitaria
Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica
In collaborazione con il Dipartimento di Patologia Clinica U.O. Chimico Cliniche e Microbiologiche
Sezione semplice di Microbiologia Ospedale S. Donato - Arezzo
Sorveglianza di Laboratorio delle Tossinfezioni Alimentari con particolare attenzione a Escherichia coli
0157: H7
Docente Relatore: Prof. Giuseppe Lungarella
Docente Aziendale: Tesi di laurea di: Dott.ssa Irene A.Galanti Alessio Dini
Fimbrie). È una delle specie principali di batteri che vivono nella parte inferiore
dell'intestino di animali a sangue caldo (inclusi gli uccelli e i mammiferi), contribuendo alla
digestione corretta del cibo. La sua presenza nelle falde acquifere è un indicatore comune di
contaminazione da feci.
Dal punto di vista clinico sono 5 i gruppi importanti di E.coli:
-Enteropatogeni (EPEC “Entero-Pathogenic Escherichia Coli“), i primi ad essere associati
con la malattia diarroica. Negli EPEC la malattia è causata dal fatto che questi ceppi sono in
grado di aderire all'epitelio dell'intestino tenue e di interferire con l'assorbimento delle
sostanze; questo provoca la formazione di un ambiente iperosmolare nel lume dell'intestino
10
con conseguente richiamo d'acqua ed infine diarrea. Il quadro di adesione all'epitelio e
la distruzione dei microvilli giustifica la definizione di istopatologia
A/E (attachment/effacement).
-Enterotossigeni (ETEC “Entero-Toxigenic Escherichia Coli“), in grado di
provocare gastroenteriti molto gravi, soprattutto nei viaggiatori e nelle persone che hanno
ingerito cibi o liquidi contaminati da feci. Questi ceppi producono sia tossine labili al calore
(LT-1 e LT-2), sia tossine stabili al calore (StA e Stb). LT-1 è formata da una subunità A e da
cinque subunità B. Queste ultime si legano all’enterocita, il legame promuove
l'internalizzazione della subunità A, una proteina con attività ADP - ribosiltransferasica nei
confronti di una proteina G stimolatoria, in grado di attivare l'adenilato ciclasi. Gli elevati
livelli di amp-ciclico, portano ad un rapido rilascio dei soluti nel lume intestinale, questi
richiamano acqua e il quadro clinico connesso è la diarrea.
-Enteroinvasivi (EIEC “Entero-Invasive Escherichia Coli“), strettamente simili a Shigella,
sono in grado di provocare diarrea sanguinolenta crampi addominali e febbre. Una serie di
geni espressi in un plasmide, denominati pInv, codificano per una serie di proteine di
membrana in grado di promuovere la fagocitosi e la lisi intracellulare del vacuolo fagocitico,
con proliferazione del batterio all'interno del citoplasma degli enterociti dell'intestino crasso.
Questo comporta depolimerizzazione dell'actina, lisi cellulare ed emorragia.
-Enteroaderenti (EAEC “Entero-Adherent Escherichia Coli“), sono coinvolti in una diarrea
acquosa persistente nei viaggiatori e nei bambini dei paesi in via di sviluppo. Questi ceppi
esprimono sia pili formanti fasci che fimbrie di aderenza, fattori di adesione in grado di
promuovere la colonizzazione dell'intestino tenue, con stimolazione della produzione
di muco. Questo forma un biofilm in grado di isolare ed aggregare i batteri. In seguito
all'aggregazione si ha riduzione della lunghezza dei microvilli, infiltrazione mononucleata ed
emorragia.
-Enteroemorragici (EHEC “Entero-Hemorrhagic Escherichia Coli“), Questi ceppi causano
coliti emorragiche accompagnate da diarrea sanguinolenta e da forti dolori addominali.
Negli animali gli EHEC colonizzano il tratto terminale dell’ileo, il cieco ed il colon e
posseggono la capacità di aderire alla mucosa intestinale causando una peculiare lesione
istopatologica ultrastrutturale definita attacco ed eliminazione “attaching and effacing”,
simile a quella indotta dagli EPEC, caratterizzata dalla distruzione dei microvilli e da uno
stretto contatto del batterio con la membrana cellulare. Questa capacità adesiva è governata da
numerosi geni associati in un locus definito LEE (locus of enterocyte effacement).
11
All’interno del locus LEE è presente anche il gene eae che codifica per l’intimina che è una
adesina batterica. Il gene eae coincide all’86% col gene eaeA dei ceppi EPEC.
La patogenicità dei ceppi EHEC è legata soprattutto alla produzione di due tossine Shiga-
simili (SLT-1 ed SLT-2), chiamate così perchè molto simili strutturalmente alla tossina
prodotta da Shigella dysenteriae tipo 1, dette anche verocitossine VT1 e VT2, da cui la sigla
VTEC usata in Italia per questo ceppo.
Tuttavia non si può affermare con sicurezza che tutti i ceppi EHEC dispongano della capacità
di elaborare Verocitossine per cui nell’ambito degli EHEC è distinto un sottogruppo,
denominato VTEC, che comprende i ceppi E. coli produttori di Verocitossina. I VTEC sono considerati tra i più temibili agenti patogeni alimentari ed il loro capostipite è
sicuramente l’E.coli O157 H:7; altri sierotipi clinicamente importanti sono lo O26, lo O113,
lo O111 e lo O145.
ESCHERICHIA COLI O157: H7
E. coli O157 è stato incluso nella lista dei patogeni emergenti dall’Organizzazione Mondiale
della Sanità (WHO) e rappresenta un grave problema di sanità pubblica. Fu identificato per la prima volta come patogeno in U.S.A. e Canada nell’anno 1982 a seguito
di un’ epidemia di diarrea emorragica associata al consumo di hamburger nei fast food. Altre
epidemie sono state poi registrate in Canada (1991, 22casi di SEU e 2 morti), Australia (1995,
22 casi di SEU e 0 morti), Svezia (1995, 29 casi di SEU e 0 morti), Giappone (estate 1996,
106 casi di SEU e 4 morti) e Scozia (dicembre 1996, 6 morti).
I caratteri distintivi di E. coli O157:H7 sono la mancata capacità di fermentare il sorbitolo, la
negatività alla prova d’idrolisi del MUG (4- metilumbelliferil-beta-D-glucuronide) e la
sensibilità al blu di bromotimolo ad alte temperature (44-45°C). Queste caratteristiche sono
sfruttate ai fini diagnostici nella routine di laboratorio per l’identificazione microbiologica del
microrganismo. Peculiarità di E. coli O157:H7 è la resistenza alle basse temperature, infatti
può resistere per nove mesi alla temperatura di -80°C, con successivo stoccaggio a -20°C.
Una importante caratteristica, che può incidere sulla capacità di colonizzare l’intestino umano
è la resistenza all’acidità dello stomaco. È noto che l’esposizione di batteri enterici ad un pH
basso induce una risposta acido-tollerante e ciò incrementa la sopravvivenza di E. coli
O157:H7 in alimenti moderatamente acidi.
Tale patogeno, oltre che dalla produzione di VT, è caratterizzato anche dalla presenza di un
plasmide di 60 MDa, che codifica per fattori di virulenza quali fimbrie ed enteroemolisine.
12
Pertanto tale plasmide influenza notevolmente la patogenicità del batterio, controllando
l’espressione dell’adesività e della sintesi di enterotossine.
L’antigene flagellare H7, codificato da una porzione del gene flic, aumenta la virulenza del
sierotipo O157 attraverso vari meccanismi; Esso facilita, infatti, il superamento dello strato di
muco che riveste le mucose e, di conseguenza, aiuta l’adesione e la colonizzazione.
E. coli O157:H7 presenta pili di adesione tramite i quali realizza l’attacco alle cellule
intestinali. Tale patogeno è caratterizzato da una manifestazione clinica molto grave, da una dose
infettante molto bassa, da epidemie nella comunità molto estese e da una origine zoonosica.
E.coli O157
È un batterio che colonizza frequentemente gli allevamenti animali, e trova nei ruminanti,
soprattutto nei bovini, il suo reservoir naturale; normalmente infetta gli esseri umani
attraverso la contaminazione di cibo e acqua con residui fecali degli animali. La sua
sintomatologia è principalmente intestinale e può variare da una semplice infezione
asintomatica, ad una diarrea acquosa, fino ad una diarrea sanguinolenta con crampi
addominali (colite emorragica).
La colite emorragica ha carattere autolimitante anche se negli anziani determina un alto tasso
di mortalità. Questa sindrome si manifesta con la comparsa di improvvisi e dolorosi crampi
addominali, seguiti da diarrea, che compare entro 24 ore, inizialmente acquosa poi
emorragica, definita da alcuni autori anglosassoni “all blood and no stool” cioè tutto sangue e
niente feci.
13
I sintomi possono essere accompagnati da nausea e vomito, mentre la febbre è assente o lieve
e ciò permette di differenziare tale patologia da quelle causate da altri ceppi di E. coli, come
EIEC e da Shigella dysenteriae.
Il periodo di incubazione e la durata della malattia variano da tre a nove giorni.
Circa il 5% dei casi è complicato dalla Sindrome Emolitica-Uremica (SEU).
La sindrome emolitico uremica può presentarsi in forma primaria o come evoluzione della
colite emorragica. Viene trasmessa per via alimentare o profetale e sono colpiti
prevalentemente soggetti immunodepressi, bambini ed anziani, nei quali può avere un decorso
grave fino ad essere, talvolta, mortale. Generalmente i casi di SEU si presentano in forma
sporadica, mentre focolai epidemici possono manifestarsi sia in ambito familiare che in
comunità (asili nido, scuole, ecc.) e sono riconducibili all'esposizione a fonti comuni di
infezione da VTEC
Tale sindrome è caratterizzata da:
Anemia emolitica (microangiopatica)
Trombocitopenia
Insufficienza renale acuta (prima causa in pediatria)
Talvolta possono subentrare anche complicazioni a carico dell’apparato cardiovascolare o al
SNC con encefalopatie. L’esito della malattia è spesso letale e le lesioni renali sono
permanenti, infatti i soggetti colpiti da tale sindrome vengono sottoposti a dialisi e trasfusioni
di sangue.
Questa sindrome è talvolta diagnosticata come porpora trombotica trombocitopenica (PTT)
quando si verifica negli adulti.
I principali fattori di virulenza di E.coli O157 H:7 sono STX1 e STX2 (Shiga toxin 1 e 2),
definite così per la stretta somiglianza con la tossina prodotta da Shigella dysenteriae.
Entrambe le tossine sono composte da una subunità A e cinque subunità B che sono in grado
di legarsi al globotriaosilceramide (Gb3 o cd77); il legame con questo recettore promuove
l'internalizzazione della subunità A nell'enterocita dove si lega al frammento di RNA
ribosomiale 28s bloccando la sintesi proteica. La distruzione degli enterociti, accompagnata
da una diminuzione della capacità di assorbimento, comporta la presenza di una diarrea molto
liquida e sanguinolenta.
Successivamente, le Stx prodotte localmente dai batteri, dopo aver danneggiato le cellule
14
epiteliali dei villi vengono adsorbite in circolo. Nel sangue le tossine aderiscono alla
superficie dei neutrofili, ma non vengono internalizzate, perciò queste cellule circolanti sono
in grado di veicolare le tossine all'endotelio di alcuni organi ed in particolare del rene. Nelle
cellule endoteliali renali sono presenti recettori glicolipidici (globotriaosilceramide, Gb3 o
CD77) che hanno un'affinità per le Stx 100 volte superiore a quella dei recettori presenti sui
neutrofili. Perciò le Stx si legano alle cellule endoteliali e, dopo internalizzazione, sono in
grado di colpire i bersagli macromolecolari endocellulari, provocando lesioni alle cellule
endoteliali renali.
Meccanismo di azione delle tossine STX
La presenza di STX è strettamente correlata con l’evoluzione verso la SEU. I principali organi
bersaglio di STX sono i reni. Spesso le tossine sono prodotte in combinazione ma possono
essere prodotte anche singolarmente. STX2 è maggiormente associata con la severità della
malattia e l’evoluzione a SEU.
TERAPIA
La terapia nell’adulto come nel bambino è fondata sulla reidratazione e sulla la correzione di
alterazioni elettrolitiche, dell’equilibrio acido-base e delle eventuali perdite ematiche. La
terapia antibiotica (Fluorochinoloni nell’adulto, Cotrimoxazolo nel bambino) non è
raccomandata in quanto può aumentare il rilascio di tossina e aggravare le condizioni generali
dei pazienti ai quali è stata somministrata. I pazienti più critici richiedono un trattamento
intensivo basato su dialisi, trasfusioni di sangue fino ad arrivare al trapianto di reni.
15
EPIDEMIOLOGIA DI EHEC
I dati di seguito riportati, forniti dall’ENTERNET Italia (rete internazionale di sorveglianza
per le infezioni enteriche da Salmonella e da VTEC O157 coordinata dall‘Istituto Superiore di
Sanità ISS), mostrano le positività per VTEC riconosciute nel periodo che va dal 1988 al
2004.
In questo periodo sono stati notificati 344 casi di infezione da VTEC, si tratta per lo più di
infezioni sporadiche anche se sono presenti anche alcuni episodi epidemici, identificati
attraverso la registrazione di cluster di casi di SEU.
Le informazioni relative alla sintomatologia clinica delle infezioni da VTEC riflettono il fatto
che la maggior parte delle notifiche proviene dal sistema di sorveglianza della SEU pediatrica
che contribuisce con il 73% dei casi (252).
La sintomatologia osservata negli altri casi è stata la seguente:
• Diarrea: 38 casi (11,0%)
• Diarrea con sangue: 30 casi (8,7%)
• Nessun sintomo: 19 casi (5,5%)
• Sconosciuto: 3 casi (0,87%)
• Altro: 2 casi (0,58%)
La determinazione del sierogruppo del ceppo VTEC infettante è stata possibile solo nell’87%
dei casi identificati.
16
Nella tabella sono elencati i sierogruppi VTEC, con la rispettiva frequenza di isolamento.
SIEROGRUPPO FREQUENZA DI
IDENTIFICAZIONE
PERCENTUALE
O157 121 39,3%
O26 65 21,1%
O145 37 12,0%
O111 27 8,8%
O103 16 5,2%
O118 5 1,6%
O128 5 1,6%
O13 4 1,3%
O121 3 1,0%
O186 3 1,0%
Secondo i dati forniti dal sistema di sorveglianza nazionale della SEU in età pediatrica, in
Italia l’incidenza della SEU è di circa 0,3 casi per 100.000 abitanti nella fascia tra 0-14 anni,
più bassa rispetto ad altri Paesi europei. Nell’arco di tempo che va dal 1988 al 2005 sono stati
registrati 481 casi di SEU pediatrica. Dal 2005 si è costituito il Registro Italiano della SEU
pediatrica (la sorveglianza della SEU coinvolge i principali centri ospedalieri di nefrologia
pediatrica e l’Istituto Superiore di Sanità) e tra il 2005 ed il 2008, 17 centri hanno segnalato
158 casi di SEU, con evidenze di infezione da VTEC in 96 di essi. I pazienti provenivano da
18 regioni, prevalentemente Veneto, Lombardia, Campania e Piemonte; in alcuni casi la SEU
conseguiva a un soggiorno all’estero. La maggior parte dei casi aveva presentato diarrea
prodromica, acquosa o emorragica. Sono risultati implicati otto diversi sierogruppi VTEC, i
più frequenti dei quali erano nell’ordine O26, O157, O111, O103, O145 nel periodo
complessivo 2005-2008, mentre nel 2007 e 2008 il sierogruppo più frequente è risultato
17
O157.
La maggior parte delle infezioni da E. coli O157 è legata al consumo di alimenti contaminati;
in particolare sono stati implicati in casi umani alimenti di origine bovina, a seguito di
contaminazione fecale all’origine (macellazione, mungitura) e non sottoposti ad adeguato
trattamento termico, quali hamburger poco cotti, latte crudo non pastorizzato e prodotti
caseari derivati. Più recentemente e con crescente frequenza sono stati coinvolti anche
vegetali (lattuga, spinaci, germogli, ecc.). E’ possibile anche la cross-contaminazione tra
alimenti.
E. coli O157 è in grado di persistere e moltiplicarsi nelle deiezioni dei ruminanti per cui, se
esse vengono impiegate a fini agronomici senza adeguati processi di maturazione, possono
contribuire alla contaminazione di suolo, acque, vegetali. A livello internazionale sono stati
segnalati focolai di origine idrica, considerando sia l’acqua potabile che quella usata a fini
ricreazionali. Il contatto diretto con gli animali infetti rappresenta una modalità non
infrequente di trasmissione, con casi sporadici ma anche eventi epidemici (descritti in fattorie
didattiche, petting-zoo). L’infezione può essere assunta anche per contatto persona-persona,
soprattutto in ambito familiare e di comunità (asili, case di riposo, ecc).
In Toscana, come in poche altre regioni italiane, esiste un sistema di sorveglianza speciale
sulle tossinfezioni alimentari, definito Ce.R.R.T.A (Centro di Riferimento Regionale sulle
Tossinfezioni Alimentari). Il Ce.R.R.T.A, istituito a fine 1999, si propone principalmente
l’obiettivo di diffondere le conoscenze scientifiche e culturali in merito alle tossinfezioni
alimentari e alle metodologie epidemiologiche di approccio, e di promuovere le attività di
notifica e di indagine degli episodi isolati ed epidemici. Il Centro raccoglie, vaglia e studia le
denunce di caso isolato e focolaio epidemico di tossinfezione alimentare provenienti dai
dipartimenti della prevenzione delle singole Aziende USL. Il Centro si compone di due
articolazioni di riferimento sub-regionali che hanno lo scopo di raccordare le attività delle
singole Aziende USL con il Centro Regionale.
Le articolazioni sub-regionali sono collocate nelle Aziende USL 3 di Pistoia e 8 di Arezzo,
presso le rispettive U.F. di Igiene degli Alimenti e Nutrizione.
18
SCOPO DELLA TESI
Nel 2009 è stata richiesta dal Dipartimento di Prevenzione (U.F. di Igiene degli Alimenti e
Nutrizione) della A.S.L.8 di Arezzo, la collaborazione del Laboratorio di Microbiologia
Clinica Ospedaliera della A.S.L.8, per la trasmissione dei dati epidemiologici riguardanti gli
isolamenti di patogeni intestinali (batteri e virus).
Al fine di poter verificare l’effettiva incidenza di alcune patologie nella popolazione del
territorio ho effettuato un’indagine epidemiologica retrospettiva della durata di un anno
(gennaio/dicembre 2009), prendendo in analisi tutti i campioni di feci per coprocoltura
pervenuti al laboratorio di Microbiologia dell’A.S.L.8 di Arezzo.
Inoltre, è stato richiesto dal Dipartimento di Prevenzione di inserire per un breve periodo nella
routine diagnostica delle coprocolture, la ricerca di E.coli O157, i cui dati epidemiologici
sono scarsi.
A tale scopo ho effettuato uno studio sperimentale della durata di 6 mesi (2° semestre 2009),
includendo nelle batterie degli esami standard di circa 300 coprocolture la ricerca del
patogeno E.coli O157. I campioni arruolati in tale studio sono feci non formate,
diarroiche/ematiche di bambini ed adulti, ricoverati e non, presso l’Azienda U.S.L.8 di
Arezzo.
19
MATERIALI E METODI
COPROCOLTURA
La coprocoltura “standard” eseguita nel laboratorio prevede la ricerca colturale, su terreni
solidi selettivi, dei patogeni Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolitica, Campylobacter e,
ove richiesto, con metodi non colturali, la ricerca di virus enterici Rotavirus e Adenovirus.
RACCOLTA DEL CAMPIONE DI FECI PER COPROCOLTURA
Nei giorni che precedono la coprocoltura non utilizzare lassativi, purghe o supposte per
evacuare. E' inoltre necessario sospendere, secondo quanto prescritto dal proprio medico,
eventuali terapie antibiotiche.
1. Munirsi di un recipiente pulito per la raccolta delle feci munito di un cucchiaino interno
2. Deporre le feci in un recipiente idoneo pulito e lavato accuratamente ed in seguito,
sciacquato con acqua distillata.
3. In alternativa è possibile foderare il water di carta igienica e raccogliere immediatamente
un campione di feci appena emesse
4. Evitare di mescolare le feci con le urine.
5. Raccogliere con il cucchiaino del vasetto più campioni sulla superficie delle feci emesse ed
in punti diversi (3 o 4) sino a riempire metà circa del recipiente
6. Portare in Laboratorio immediatamente oppure entro 24 h dalla raccolta avendolo
conservato in frigo
7. I campioni devono essere sottoposti a coltura il prima possibile, poiché alcune specie
batteriche, in particolar modo Shigella, non sopravvivono al cambiamento di pH
(acidificazione) che si realizza con la caduta della temperatura delle feci dopo l‘emissione. In
caso contrario è necessario l’utilizzo di un terreno di trasporto.
Soltanto in casi selezionati, come la difficoltà ad ottenere feci nell'infanzia, il campione fecale
può essere raccolto attraverso un tampone rettale.
Il materiale andrebbe preferibilmente raccolto nel momento acuto del processo infettivo.
Per aumentare le possibilità di isolamento dei patogeni può essere richiesto di inviare al
laboratorio tre campioni raccolti in giorni diversi.
20
Esempio di contenitore per coprocoltura
TECNICA DI ISOLAMENTO SU TERRENO AGARIZZATO
La semina del materiale deve avvenire in condizioni di sterilità. Importante quindi l’utilizzo di
cappe di aspirazione e dei dispositivi di protezione individuale (D.P.I.).
Il terreno dovrebbe essere sempre controllato prima dell’uso (data di scadenza o eventuale
contaminazione).
Con l’ansa procediamo a prelevare una piccola quantità di feci dal contenitore del campione,
l’area iniziale di semina deve ricoprire una superficie di circa un terzo dell’area complessiva
dell’agar utilizzato.
Le anse metalliche devono essere flambate dopo la semina, le monouso devono essere
sostituite.
Lo scopo della semina su piastra è quello di ottenere delle colonie batteriche ben isolate su cui
sia possibile effettuare una identificazione, per fare questo dobbiamo cercare di sfruttare al
meglio tutta la superficie della piastra. La tecnica più utilizzata è quella della semina a 4
quadranti.
Dopo la semina i terreni devono essere posti in incubazione il prima possibile.
21
Metodo di semina a 4 quadranti
RICERCA DI SALMONELLA E SHIGELLA SU HEKTOEN ENTERIC AGAR
(BioMerieux)
Hektoen Enteric Agar è un terreno selettivo per l’isolamento e la differenziazione della flora
intestinale Gram-negativa. Il terreno contiene, oltre ad una miscela di peptoni:
- carboidrati: lattosio, saccarosio e salicina;
- indicatori di pH: blu di bromotimolo e fucsina acida;
- agenti selettivi: sali biliari n° 3
- indicatori di H2S: sodio tiosolfato e ferro (ico) ammonio citrato.
I sali biliari rendono il terreno selettivo, inibendo gli organismi Gram-positivi e riducendo la
crescita di alcuni organismi Gram-negativi, a parte Salmonella e Shigella. Lattosio, saccarosio
e salicina vengono aggiunti per favorire la differenziazione in quanto colorano le colonie e il
terreno adiacente. Salmonella e Shigella non fermentano questi composti di carbonio e quindi
non modificano il colore degli indicatori di pH, mentre gli organismi che fermentano questi
composti in acidi, ad es. E. coli, modificano il colore in giallo o arancione. Il citrato di
ammonio ferrico e il tiosolfato di sodio nel terreno consentono di rilevare il solfuro di
idrogeno prodotto dalla Salmonella. Il sistema di indicatori del pH è costituito dalla fucsina
acida e dal blu di bromotimolo.
Con l’impiego dell’Hektoen enteric agar è possibile anche una presuntiva differenziazione, a
livello colturale, tra Salmonella e Shigella.
Dopo incubazione a 37°C per 24-48 ore i microrganismi si presentano su Hektoen Enteric
Agar con le seguenti caratteristiche:
Salmonella spp. colonie verde blu con o senza centro nero
Salmonella typhi colonie verde blu senza centro nero
22
Shigella spp. colonie verde chiaro, il terreno non vira al blu
E.coli crescita scarsa, colonie rosso salmone
Enterobacter spp. colonie rosso salmone
Klebsiella spp. colonie rosso salmone
Pseudomonas spp colonie incolori tendenti al verde
Proteus spp. saccarosio/salicina non fermentanti colonie verde blu con o senza centro nero
Batteri Gram positivi crescita inibita
Sulle colonie sospette di Salmonella si esegue Mucap test (Biolife), reattivo sensibile e
specifico per l’identificazione di Salmonella spp. che contiene un estere a otto atomi di
carbonio coniugato con il metilumbelliferone, (4-metil umbelliferil caprilato) in solvente
organico (eptano). Tale composto è idrolizzato dall’enzima C8 esterasi con liberazione di
metilumbelliferone, fortemente fluorescente se osservato sotto lampada di Wood con
emissione a 366nm.
Per conferma si utilizza l'identificazione biochimica con card GN Vitek2 (BioMerieux), e
immunologica con antisieri anti-salmonella (DID).
Per Shigella l’identificazione è biochimica con card GN Vitek2 (BioMerieux), e
immunologica con antisieri anti-Shigella.
Piastra di Hektoen enteric agar positiva per Salmonella
23
RICERCA DI YERSINIA ENTEROCOLITICA SU CIN AGAR (BioMerieux)
Il terreno Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin (C.I.N.) Agar è preparato addizionando al CIN agar
base il supplemento selettivo con cefsulodina e novobiocina; è un terreno altamente selettivo
per l’isolamento di Yersinia enterocolitica da campioni clinici e da alimenti. I batteri Gram
positivi e parte di quelli Gram negativi sono inibiti dagli agenti selettivi presenti nel terreno di
base: sodio desossicolato, cristall violetto, Irgasan; gli antibiotici inibiscono la crescita degli
enterobatteri. Il mannitolo è presente quale carboidrato fermentabile: i batteri in grado di
fermentarlo inducono un’acidificazione del terreno con precipitazione del sodio desossicolato
e assorbimento del rosso neutro. Dopo incubazione a 37°C per 24-48 ore Yersinia
enterocolitica cresce su CIN Agar con colonie rosso-porpora, circondate da un bordo
trasparente (caratteristico aspetto delle colonie ad “occhio di bue”). Il diametro delle colonie
varia da ceppo a ceppo ma rimane costante per ceppi del medesimo sierotipo.
L’identificazione finale è biochimica tramite card GN Vitek2 (BioMerieux).
Piastra di Cin agar positiva per Yersinia
24
RICERCA DI CAMPYLOBACTER SU CAMPYOBACTER SELECTIVE AGAR
(BioMerieux)
Campylobacter selective agar è un terreno selettivo usato per l’isolamento di Campylobacter
spp. da campioni clinici. La presenza di supplemento antimicrobico con vancomicina,
polimixina B, trimetoprim e cefalotina, inibisce la normale flora intestinale; l’amfotericina B
inibisce la crescita dei funghi. Il terreno consente la crescita delle specie di Campylobacter
grazie al contenuto in peptoni, destrosio, estratto di lievito e sangue. I peptoni forniscono
composti azotati, carbonio, zolfo e tracce di altri elementi. L'estratto di lievito è una fonte di
vitamine B. Il sangue di montone fornisce ulteriori sostanze nutrienti.
Dopo 42 – 48 h di incubazione in atmosfera modificata (anaerobiosi) a 42°C, il
Campylobacter jejuni si presenta con colonie mucoidi di piccole o medie dimensioni, in
genere verdastre, piatte con bordi irregolari e non emolitiche. C. lari e C. coli producono
colonie simili. Un piccolo numero di ceppi può apparire di colore marrone chiaro o
lievemente rosato. Le colonie di C. jejuni tendono a diffondersi o sciamare, in particolare se
inizialmente sono state isolate da campioni recenti. tutti i ceppi sono ossidasi positivi.
L’identificazione definitiva dei Campylobacter viene effettuata con carte NH Vitek2
(BioMerieux).
Piastra di Campylobacter selective agar positiva per Campylobacter
25
RICERCA DI E.COLI O157
I campioni selezionati per la ricerca di E.coli O157 sono stati processati, addizionando alla
metodica standard della coprocoltura, un terreno selettivo per la ricerca di questo patogeno
(Mac Conkey Sorbitol Agar “SMAC”,BioMeriux). Le colonie identificate in tale terreno
come non fermentanti il sorbitolo (NSF) e quindi come sospette, sono state sottoposte a
identificazione con due diverse metodiche:
• Identificazione biochimica, tramite strumento “Vitek2” (BioMerieux)
• Identificazione immunologica, tramite “E.coli O157 Latex Kit” (Oxoid)
Sugli stessi campioni sono stati contemporaneamente eseguiti anche esami coprocolturali
tradizionali per la ricerca dei principali batteri patogeni (Salmonella, Shighella, Yersinia
enterocolitica e Campylobacter). Ove richiesta è stata effettuata anche la ricerca di antigeni
virali (Rotavirus ed Adenovirus).
RICERCA DI E. COLI O157 SU MAC CONKEY SORBITOL AGAR “SMAC”
(BioMerieux)
Mac Conkey Sorbitol Agar è impiegato per l’isolamento e l'identificazione presuntiva di
Escherichia coli O157. Il terreno Mac Conkey Sorbitol Agar differisce dal Mac Conkey Agar
perché ha come carboidrato fermentabile il sorbitolo al posto del lattosio . La selettività del
terreno è incrementata dall’aggiunta di cefixime e potassio tellurito. L’aggiunta di cefixime e
potassio tellurito al terreno SMAC sopprime efficacemente la crescita di alcuni generi
batterici Non Fermentanti il Sorbitolo (NSF), quali Proteus, Providencia, Aeromonas, E.coli
NSF non appartenenti al sierogruppo O157 e dei ceppi di E.coli fermentanti il sorbitolo. Zadik
e coll. riportano una inibizione del 67% dei ceppi di E.coli “non O157” saggiati e della
maggior parte degli stipiti NSF diversi da E.coli O157 .
Le colonie di E. coli O157:H7 si presentano incolori, ma per il resto possiedono le
caratteristiche tipiche di E. coli.
L’identificazione finale si ottiene tramite card GN Vitek2 (BioMerieux) per identificazione
biochimica o tramite E.coli O157 latex kit (Oxoid) per identificazione sierologica.
26
Piastra di Mac Conkey sorbitol agar positiva per E.coli O157
E.COLI O157 LATEX KIT
Kit per il test in agglutinazione rapido al lattice su vetrino, per la determinazione di E.coli
O157 da coltura. Tramite specifici anticorpi si dimostra la presenza in superficie dell’antigene
O 157.
Caratteristiche del kit:
RAPIDO: Consente la rapida identificazione delle colonie con anticorpo specifico anti E.coli
O157.
FACILE: L’agglutinazione è facilmente eseguibile su colonie coltivate su SMAC, senza
procedere ad ulteriori trapianti su terreni d’uso generale.
SENSIBILE: Il test può essere eseguito anche su 1 colonia.
SPECIFICO: Rimuove ogni cross-reattività di E.hermannii e di altri sierotipi simili O ed H.
Specificità 100%.
COMPLETO: Il kit comprende il reattivo con latice sensibilizzato, le card, gli stick, il
controllo positivo ed il controllo negativo.
METODICA D’USO DEL KIT
1. Prelevare 1 o più colonie tipiche dal terreno d’isolamento e risospenderle in circa 0,2 ml di
soluzione fisologica sterile.
2. Risospendere la sospensione di particelle di latice agitando delicatamente ed assicurarsi che
il reattivo abbia raggiunto la temperatura ambiente prima dell’uso.
3. Trasferire una goccia di sospensione batterica nella zona centrale della card delimitata da
un cerchio.
27
4. Trasferire una goccia della sospensione di particelle di latice sensibilizzate nella zona
centrale della card delimitata da un cerchio.
5. Mescolare le due gocce insieme usando uno stick fornito con il kit.
6. Ruotare delicatamente la card osservando per la presenza di agglutinazione in condizioni di
luce normali.
7. Qualsiasi grado di agglutinazione entro 2 minuti è da considerarsi risultato positivo per
E.coli O 157, se in concomitanza si ha un risultato negativo con il Controllo Negativo ed
agglutinazione con il Controllo Positivo.
E.coli O157 Latex Kit (Oxoid)
VITEK 2
Il VITEK 2 consente l’identificazione sulla base di test biochimici tradizionali di cocchi Gram
positivi, di bacilli Gram negativi e dei lieviti. I risultati di questi test sono disponibili
rispettivamente entro 2, 3, e 15 ore. La rapidità è assicurata da substrati fluorescenti inseriti
nella card. Il VITEK 2 è anche in grado di saggiare, con metodica della microdiluizione in
brodo, 32 antibiotici per i cocchi Gram positivi, inclusi Stafilococchi e Streptococchi, e 46
antibiotici per i bacilli Gram negativi. Per ogni antibiotico sono saggiate più concentrazioni
(break point) ed i risultati sono espressi in MIC (minima concentrazione inibente) e categoria
S, I, R (sensibile, intermedio, resistente). Può inoltre testare la B-lattamasi per Stafilococchi
ed Enterococchi, la meticilino resistenza e le ESBL (beta lattamasi a spettro esteso).
28
Stumentazione completa di analisi Vitek 2 (BioMerieux)
29
RISULTATI
Nel corso dell’anno 2009 al laboratorio di Microbiologia dell’USL8 Ospedale San Donato di
Arezzo sono pervenuti 3936 campioni di feci per esami microbiologici; su tutti i campioni
analizzati è stata eseguita la coprocoltura standard per Salmonella, Shigella, Yersinia,
Campylobacter (S,S,Y,C) secondo il protocollo in uso presso il laboratorio. Dietro richiesta
specifica su 111 campioni (2,8%) è stata eseguita, oltre alla coprocoltura standard, la ricerca
di Rotavirus e su 1318 campioni (33.5 %) la ricerca di Adenovirus oltre a tutti i precedenti.
N° di campioni % su 3936 campioni Microrganismi
ricercati
1318 33,5% S,S,Y,C Rotavirus Adenovirus
111 2,8% S,S,Y,C Rotavirus 2507 63,7% S,S,Y,C
Tabella 1
Possiamo dire quindi che su circa due terzi (63,7%) dei campioni è stata eseguita la ricerca dei
batteri S,S,Y,C, e su circa un terzo (36,3) tale ricerca è stata accompagnata da quella dei virus
enterici.
63,7%
36,3%
campioni di feci per esamimicrobiologici su cui è stataeseguita la ricerca dei batteri(2507)campioni di feci per esamimicrobiologici su cui è stataeseguita anche la ricerca deivirus enterici (1429)
Grafico 1 (riferito a tabella 1)
30
Dei campioni analizzati (3936), 294 (7.46%) sono risultati positivi per almeno un
microrganismo.
Percentuale di positività delle coprocolture
92,5%
7,5% campioni di feci per esamimicrobiologici risultati negativiper la ricerca di batteri e virus(3642)campioni di feci per esamimicrobiologici risultati positiviper la ricerca di batteri e virus(294)
Grafico 2
La positività dei vari microrganismi enterici risulta così distribuita nei 294 campioni:
Mettendo in relazione il totale dei campioni di feci per coprocoltura pervenuti al laboratorio di
Microbiologia dell’USL8 di Arezzo (3936), con quelli positivi per la ricerca dei singoli batteri
(149) otteniamo una percentuale di positività del 3,78%.
Frequenza di positività per batteri
96,2%
3,8% campioni di feci per esamimicrobiologici negativi perogni tipo di microrganismobatterico (3787)campioni di feci per esamimicrobiologici positivi peralmeno un microrganismobatterico (149)
Grafico 4
32
La positività dei batteri enterici risulta così distribuita nei 149 campioni: