UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE ZORAIDE NASCIMENTO DA SILVA EFEITO DA DIETA DA PROTEÍNA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS WISTAR ADULTAS Orientadora: Profª. Drª. Vilma Blondet de Azeredo Co-Orientador: Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura Niterói 2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS
PARA SAÚDE
ZORAIDE NASCIMENTO DA SILVA
EFEITO DA DIETA DA PROTEÍNA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS
WISTAR ADULTAS
Orientadora: Profª. Drª. Vilma Blondet de Azeredo Co-Orientador: Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura
Niterói 2013
ZORAIDE NASCIMENTO DA SILVA
EFEITO DA DIETA DA PROTEÍNA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS
WISTAR ADULTAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação Strictu Sensu da Universidade Federal Fluminense, como pré- requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde. Orientadora: Profª. Drª Vilma Blondet de Azeredo Co-orientador: Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura
Niterói
2013
FICHA CATALOGRÁFICA
S 586 Silva, Zoraide Nascimento da
Efeito da Dieta da Proteína no metabolismo ósseo em ratas Wistar
Adultas / Zoraide Nascimento da Silva; orientador : Vilma Blondet de
Azeredo. – Niterói, 2013.
92 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2013.
1. Dieta 2. Proteína na dieta 3. Densidade óssea 4. Hormônio
I. Azeredo, Vilma Blondet de II. Título
CDD 613.25
ZORAIDE NASCIMENTO DA SILVA
EFEITO DA DIETA DA PROTEINA NO METABOLISMO ÓSSEO EM RATAS
WISTAR ADULTAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação Strictu Sensu, Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como pré-requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________________________________________ Profª. Drª. Vilma Blondet de Azeredo (Orientadora e Presidente da banca), UFF
__________________________________________________________________ Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura (Co-orientador – UFF) __________________________________________________________________ Profª. Drª. Glorimar Rosa ( Titular - UFRJ) __________________________________________________________________ Profª. Drª. Gabrielle de Souza Rocha (Titular – UFF)
Aprovado em: ______ / ________ / _______
DEDICATÓRIA
Ao meu filho Yuri, por tantos momentos
ausente e a minha mãe pela atenção e ajuda
nesses momentos difíceis.
AGRADECIMENTOS
A Deus, sempre presente em minha vida;
À minha amiga querida Solange Augusta pelo apoio e ajuda para realização deste
trabalho e também pela amizade, carinho e confiança;
Aos meus amigos do LabNE Fernanda, Arindo e Clésio pela ajuda no preparo da
ração, cuidado dos animais, realização de análises e pelos momentos em que
ficavam me escutando falar sobre o trabalho;
Às amigas Vânia Matoso e Vanessa Jesuz pela enorme ajuda na realização do
experimento e pelos vários momentos em que ficávamos discutindo os resultados,
aprendi muito com vocês;
Ao Professor Dr. Carlos Alberto Costa pela participação na construção do artigo
científico e pela mega ajuda e atenção;
Ao estudante da Iniciação Científica Eduardo de Salvo Castro pela contribuição no
cuidado dos animais e no momento da dissecação;
Às mestrandas do LabNE Sheila, Thaís e ao doutorando André pela ajuda nos vários
momentos em que precisei tirar dúvidas;
Aos professores do LANUFF Luiz Antônio dos Anjos e Vivian Wahrlich e a técnica
Ana Paula Souza Santos pelo apoio e realização da densitometria óssea;
À secretária do curso de Pós Graduação em Ciências Aplicada a Produtos para
Saúde Adelina Iorio, sempre atenciosa e pronta para ajudar;
A todos os professores do curso de PGCAPS, com os quais aprendi muito;
Aos meus orientadores professora Vilma Blondet e professor Gilson Teles, pela
orientação, oportunidade, paciência e pelos ensinamentos fornecidos. Minha mais
profunda e eterna gratidão;
Aos meus pais e a minha irmã pelo apoio para que eu concluísse mais um projeto
em minha vida.
A alegria não chega apenas no encontro
do achado, mas faz parte do processo da
busca. E ensinar e aprender não pode
dar-se fora da procura, fora da boniteza e
da alegria.
Paulo Freire
RESUMO
Uma das dietas mais procuradas para perda de peso é a dieta Atkins, caracterizada
como hiperproteica, hiperlipídica e hipoglicídica. O consumo em excesso de
proteínas leva a produção de ácidos provenientes do metabolismo protéico e para
manter a homeostase sanguínea são recrutados íons, principalmente o cálcio
proveniente do osso, levando ao comprometimento deste tecido. Este trabalho teve
como objetivo avaliar o efeito da dieta hiperproteica no tecido ósseo em ratas Wistar.
O estudo teve duração de 60 dias. Animais com 90 dias de idade foram divididas em
4 grupos (n=7); Grupo controle Caseína 1 (C1) e Caseína 2 (C2), Grupo
Hiperproteico 1 (HP1) e Hiperproteico 2 (HP 2). O grupo C2 e HP2 foram submetidos
a 30% de restrição alimentar. O experimento teve a duração de 60 dias. O peso e a
ingestão hídrica eram verificados uma vez por semana. Utilizando absorciometria por
dupla emissão de raios X (DXA) foi avaliada a densidade mineral óssea (DMO
g/cm2), o conteúdo mineral ósseo (CMO g), a Área (cm2), tecido gordo total e do
tronco. A análise densitométrica foi realizada no início e ao final do experimento com
o animal anestesiado. Após o sacrifício foram coletadas amostras de sangue e o
fêmur direito. No fêmur foi realizado densitometria óssea, biometria e com as cinzas
ósseas análises de cálcio, magnésio e fósforo. Do sangue coletado foi obtido o soro
e analisados cálcio, magnésio, fósforo, insulina, osteocalcina e paratormônio. Os
resultados são apresentados com média e erro padrão. Os animais com alimentação
em livre demanda apresentaram maior ganho de massa corporal do que os animais
com restrição calórica. Os grupos hiperproteicos apresentaram maior ingestão
hídrica, quando comparados com o grupo C1 (P<0,05). Na ingestão alimentar, os
grupos experimentais consumiram quantidades similares e menor em comparação
com o Controle 1 (P<0,05). As concentrações de cálcio sérico foram menores entre
os grupos experimentais e C2 (P<0,05). Os valores da osteocalcina sérica foram
menores nos grupos hiperproteicos (P<0,05). A insulina foi significativamente menor
no grupo HP2 (P<0,05), e sem diferença significativa entre os grupos controles e
HP1, sendo que o grupo C2 apresentou redução de mais de 50% em relação ao
grupo C1. Houve redução da largura do ponto médio da diáfise do fêmur nos grupos
experimentais quando comparados com seus respectivos grupos controle. As
concentrações de cálcio ósseo foram menores nos grupos hiperproteicos (P<0,05).
No geral, os resultados densitométricos ósseos total, da pelve e da coluna vertebral
foram semelhantes entre os grupos com consumo em livre demanda e entre os
grupos com restrição alimentar. A DMO do fêmur do grupo HP2 foi menor (P<0,05).
O tecido gordo do tronco nos grupos com consumo em livre demanda foi maior e o
tecido magro total desses grupos foram similares. A dieta da proteína não promoveu
maior perda de peso que a dieta controle. Os grupos hiperproteicos apresentaram
redução da largura do ponto médio da diáfise do fêmur, diminuição do cálcio ósseo e
sérico e da osteocalcina, sendo que o grupo HP2 apresentou também diminuição na
concentração sérica de insulina.
Palavras chave: Dieta Atkins. Dieta hiperproteica. Densidade mineral óssea.
Remodelagem óssea. Hormônios.
ABSTRACT
One of the most sought diet for weight loss is the Atkins’, characterized as a high
protein, lipid and low glycemic diet. The excessive intake of proteins leads to the
production of acids from it’s metabolism. In order to maintain homeostasis, blood ions
are recruited, mainly calcium from the bone, leading to impairment of the tissue. The
objective of the present study was to evaluate the effect of a high protein diet on the
bone tissue in Wistar rats. 90-day-old animals were divided into 4 groups (n = 7):
Casein 1 group control (C1), Casein 2 (C2), High Protein 1 (HP1) and High Protein 2
(HP 2). Groups C2 and HP2 were subjected to 30% of food restriction ( 60 days).
Weight and water intake were checked once a week. Bone mineral density (BMD
g/cm2), bone mineral content (BMC g), total fat tissue and area (cm2) of the thorax
were determined by Dual Emission X-rays (DXA). Anesthetized animals were
subjected to densitometric analysis at the beginning and at the end of the experiment
with anesthetized animals. Then the animals were terminated, and the blood and
right femur collected. Femur densitometry and biometrics were made. Calcium,
magnesium and phosphorus were determined from bone ashes. Serum calcium,
magnesium, phosphorus, insulin, PTH and osteocalcin were measured. Results are
presented as mean and standard error. Animals fed ad libitum gained more body
weight than the animals on restricted diet. High protein groups had higher (P <0.05)
water intake when compared with C1. Food intake in experimental groups was similar
and lower (P <0.05) when compared with C1. Serum calcium concentration were
lower (P <0.05) between the high protein groups and C2. Values of serum
osteocalcin were low (P <0.05) in high protein groups. Insulin was significantly low
(P <0.05) in group HP2. C2 group insulin was reduced by over 50% compared to C1.
Groups HP1 and control were statistically similar. High protein groups showed a
width at the midpoint of the diaphysis when compared with their respective control
groups. Bone calcium concentrations were low (P <0.05) in high protein groups.
Overall, the results of bone, pelvis and spine densitometries were similar between
groups ad libitum and with restricted diets. HP2 group femurs exhibited reduced bone
mass density (BMD). Trunk fat and lean tissues in ad libitum groups were higher
(P<0.05) and similar, respectively. The protein diet did not promote greater weight
loss than the restricted diet. High protein groups showed a width reduction at the
midpoint of the diaphysis, decreased bone and serum calcium and osteocalcin. HP2
group also showed lower serum insulin.
Keywords: Atkins Diet. High protein diet. Bone mineral density. Bone remodeling.
Hormones.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1- Comparação entre a dieta da proteína e as 21
Recomendações da American Heart Association
(AHA) e da National Cholesterol
Education Program (NCEP)
Figura 1 - Produção de corpos cetônicos no fígado 24
Figura 2 - Representação esquemática da parte interna de um osso 26
longo
Figura 3 - A: osso cortical, B: osso trabecular 26
Figura 4 - Remodelagem óssea (adaptado) 28
Figura 5 - Gaiolas com os ratos utilizados no experimento 37
Quadro 2 - Formulação das rações Controle e Experimental (g/100g de 38
ração)
Quadro 3 - Composição da dieta controle utilizada no experimento 39
(g/100g de ração)
Quadro 4 - Composição da dieta Experimental utilizada no experimento40
(g/100g de ração)
Figura 6 - Método para realização do lavado vaginal em ratas 42
Figura 7 - Visualização das lâminas a fresco ou coradas e caracterização 42
das fases do ciclo estral
Figura 8 - Fotomicrografia do esfregaço vaginal corado com o início 42
da fase Estro
Figura 9- Fêmur dissecado, ao lado paquímetro utilizado para 43
a medição
Figura 10- A: Equipamento Lunar iDXA GE, utilizado para mensuração 48
da densidade mineral óssea, B: Animal pronto para realização
da análise, C: Imagem do corpo do animal utilizando o aparelho
densitométrico
Gráfico 1- Evolução do peso corporal 49
Gráfico 2- Ingestão hídrica 50
Gráfico 3- Consumo alimentar 50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Concentrações séricas de minerais e hormônios estudados 51
Tabela 2- Parâmetros biométricos e conteúdo mineral ósseo 52
do fêmur direito das ratas ao final do experimento
Tabela 3- Composição óssea, avaliada com auxílio do DXA 55
Tabela 4- Quantidade de tecido gordo corporal total e no tronco 58
Tabela 5- Quantidade de tecido magro corporal total e no tronco 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Acetil-Coa – Acetil coenzima A
AG – Ácido graxo
AHA- American Heart Association
CCK - colecistoquinina
cm2 - Centímetro quadrado
CMO – Conteúdo Mineral Ósseo
DBP – Proteína de Ligação ao DNA ( Binding Protein)
DXA - Dual Energy X-Ray Absorptiometry
DMO – Densidade Mineral Ósseo
ECM – Matriz extracelular
ELISA – Imunoabsorção Ligado a Enzimas
EPM – Erro Padrão da Média
FAO- Food and Agriculture Organization
g – Grama
g/cm2 - Grama por centímetro quadrado
GH – Growth Hormone
HP - Hiperprotéico
IAA – Anticorpo Anti-Insulina
IGF – Fator de Crescimento Semelhante à Insulina
IGFBP – Insulin-like growth factor binding protein
IL-6 - Interleucina- 6
Kcal – Quilocalorias
mEq – Miliequivalente
mg – Miligrama
ml – Mililitro
NCEP – National Cholesterol Education Program
NHANES – National Health and Nutrition Examination Survey
ng - Nanograma
nm – Nanômetro
OMS – Organização Mundial da Saúde
Pi – Fosfato inorgânico
pg – Picograma
POF – Pesquisa de Orçamento Familiar
PTH – Hormônio Paratireóide ou Partormônio
Run X2 – Runt-related Transcription factor 2
TNF- - Fator de necrose tumoral alfa
VDR – Receptor de Vitamina D
WHO – World Health Organization
μl - Microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
2 REVISÃO DE LITERATURA 19
2.1 Obesidade - Um problema mundial 19
2.2 Dietas da Moda 20
2.3 A “Dieta da proteína” do doutor Atkins 20
2.3.1 Dieta da proteína e perda de peso 22
2.3.2 Dieta da proteína e cetoacidose 23
2.4 O tecido ósseo 25
2.4.1 Manutenção do tecido ósseo 29
2.5 Efeito da Dieta Atkins no tecido ósseo 31
3 JUSTIFICATIVA 34
4 OBJETIVOS 35
4.1 Objetivo geral 35
4.2 Objetivos específicos 35
5 METODOLOGIA 36
5.1 Animais 36
5.2 Comitê de ética 36
5.3 Formação dos grupos 36
5.4 Preparo da ração 37
5.5 Coleta de dados 40
5.5.1 Peso corporal 40
5.5.2 Consumo de ração 41
5.5.3 Ingestão hídrica 41
5.6 Determinação do ciclo estral das ratas 41
5.7 Sacrifício e coleta de sangue e fêmur 43
5.8 Processamento das amostras 44
5.8.1 Determinação da concentração sérica de cálcio, 44
magnésio e fósforo
5.8.2 Determinação da concentração de insulina, 44
osteocalcina e paratormônio
5.8.3 Conteúdo mineral ósseo do fêmur 46
5.8.4 Densitometria óssea 47
5.9 Análise Estatística 48
6 RESULTADOS 49
7 DISCUSSÃO 60
8 CONCLUSÃO 65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66
APÊNDICE A – Produção Científica 74
APÊNDICE B – Publicação em Periódico 75
ANEXO Aprovação do Comitê de Ética 92
17
1 INTRODUÇÃO
A obesidade tem sido amplamente reconhecida como um dos principais
problemas de saúde pública, que leva a inflamação, que parece estar diretamente
envolvida na patogênese do diabetes tipo 2, hipertensão, dislipidemia, aterosclerose,
osteoartrite, apneia do sono, problemas respiratórios e algumas formas de câncer
(YE & KELLER, 2010).
A restrição da ingestão alimentar e realização de atividade física tem sido
sugeridas como a chave para alcançar o objetivo da manutenção de peso corporal
adequado (SONG et al., 2010). Entretanto, a indústria do emagrecimento é um
próspero e lucrativo negócio em muitos países. Muitas pessoas fazem dieta e se
preocupam com a forma física porque são influenciadas pela mídia que impõe certos
padrões de beleza, associado a uma sociedade que almeja um corpo magro como o
ideal. Entretanto, não se preocupam com a qualidade e o impacto dessas dietas na
saúde (DERENE & BERESIN, 2006; TRUBY et al., 2008).
Devido ao crescente aumento epidêmico da obesidade, suportado por um
ambiente rico em alimentos gordurosos, muitos pacientes e profissionais de saúde
estão interessados em dietas populares como estratégia individualizada para
redução de peso e prevenção de doenças (DANSINGER et al., 2005).
Assim, acompanhando a “epidemia da obesidade”, está aumentando o
interesse em dietas populares, que variam enormemente na quantidade de proteínas
e carboidratos. A dieta do Dr. Atkins é uma das dietas hiperproteicas mais
conhecidas e uma das mais extremas em promover a ingestão de elevada
quantidade de proteínas e gorduras e pequena quantidade de carboidratos. É uma
das mais controvertidas para a saúde por ter alto teor de gordura saturada e
colesterol e poucas fibras, antioxidantes e micronutrientes.
Alguns estudos mostram que os efeitos benéficos deste tipo de dieta sobre os
níveis lipêmicos e resistência a insulina ocorrem pela diminuição do peso corporal e
não devido às mudanças severas na distribuição da energia provenientes dos
lipídios, carboidratos e proteínas. Portanto, as dietas hiperproteicas não devem ser
recomendadas, pois elas são deficientes em uma variedade de nutrientes essenciais
necessários à nutrição adequada, o que pode predispor o organismo ao
desenvolvimento de inúmeras doenças crônicas não transmissíveis, inclusive a
18
osteoporose (ST JEOR et al., 2001; JOHNSTON et al., 2004; CARAPETIS &
PHILIPS, 2006).
O problema da obesidade tem resultado em várias estratégias dietéticas para
perda de peso. No entanto, o efeito específico destas dietas na saúde cardiovascular
e óssea carecem de mais estudos.
Alguns estudos mostraram diminuição do risco de fratura com maior ingestão
de proteínas, enquanto outros encontraram tendência oposta, em particular com as
proteínas de origem animal (DARGENT-MOLINA et al., 2008). A densidade mineral
óssea é muito afetada quando há carência principalmente de cálcio e vitamina D na
dieta, carência esta que pode ocorrer não por deficiente ingestão, mas sim devido a
fatores deste tipo de dieta, como o excesso de proteína e gordura, que podem
reduzir sua absorção e aumentar sua eliminação renal, o que pode predispor os
indivíduos ao desenvolvimento da osteoporose. A consequencia futura é a
predisposição a fratura devido à fragilidade óssea, que contribuem para aumentar a
mortalidade, com a baixa qualidade de vida, bem como um substancial custo direto e
indireto para o setor público (MEDEIROS et al., 2002; LANGSETMO et al., 2010).
Os efeitos de dietas hiperproteicas sobre a estrutura óssea e o provável
desenvolvimento de osteopenia e/ou osteoporose ainda necessita de mais estudos.
Este estudo torna-se relevante à medida que se propõe a investigar os efeitos da
“dieta da proteína” sobre o metabolismo ósseo, contribuindo para um melhor
entendimento do efeito desta dieta neste tecido.
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Obesidade – Um problema mundial
A obesidade é uma desordem metabólica caracterizada por excesso de
armazenamento de gordura e reflete o desequilíbrio entre ingestão e gasto de
energia (PAULA & ROSEN, 2010).
A obesidade atingiu níveis epidêmicos em todo o mundo (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 2012B). Desde 1980, o número de indivíduos obesos no mundo
mais que duplicou e estima-se que 2,8 bilhões de pessoas morram anualmente
decorrente de estarem obesas ou com sobrepeso (WHO, 2012A). Dados da
Pesquisa de Orçamento Familiar (IBGE, 2009) revelaram que 12,4% dos homens
brasileiros estão obesos e 16,9% da população feminina encontram-se na mesma
condição.
O aumento da população obesa eleva o custo da saúde e a perda de peso é
benéfica para manter um corpo saudável (GARDNER et al., 2007). Indivíduos
obesos apresentam maior risco de desenvolver doenças crônicas não transmissíveis
como hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, diabetes mellitus,
dislipidemias, osteoartrites, entre outras enfermidades, levando a diminuição da
qualidade e expectativa de vida. O desenvolvimento do excesso de peso e
obesidade envolve múltiplos fatores observados, principalmente com as mudanças
comportamentais do século XX, tais como hábitos de vida, consumo alimentar,
características socioambientais, susceptibilidade genética e biológica (LINO et al.,
2011; NOAKES et al., 2005).
O problema da obesidade tem resultado em várias estratégias dietéticas para
perda de peso, e a adesão a dietas da moda tem se tornado cada vez mais
frequentes e controversas. Vários livros sobre dietas estão disponíveis e também
são notícias em revistas e debates televisivos. Muitas dietas da moda para perda de
peso focam na redução ou exclusão de determinados macronutrientes. Existem
poucos dados sobre o conteúdo de micronutrientes e adequação dessas dietas.
Autoridades médicas tem demonstrado interesse e preocupação sobre o efeito
específico destas dietas na saúde cardiovascular e óssea e na eficácia e segurança
20
de tais dietas e mais estudos são necessários (DANSINGER et al., 2005; GARDNER
et al., 2010).
2.2 Dietas da Moda
Dietas populares tem se tornado cada vez mais prevalentes e controversas.
Guias dietéticos para perda de peso (restrição energética, pobre em gordura, rico
em carboidrato) têm sido contestados, particularmente por proponentes de dietas
com pouco carboidrato. No entanto, há poucos estudos para avaliar efetivamente
essas dietas (GARDNER et al., 2007).
Uma variedade de planos dietéticos é conhecida. Alguns planos minimizam a
ingestão de carboidratos sem restrição de gordura e proteínas (dieta Atkins)
(ATKINS, 1981), muitos modulam o balanço de macronutrientes e carga glicêmica,
dieta Zone (CHEUVRONT, 2003) e outras impõem a restrição de gordura (dieta
Ornish) (ALMEIDA et al., 2009).
2.3 A “dieta da proteína” do doutor Atkins
Dentre os vários tipos de plano alimentar a mais popular é a dieta do doutor
Atkins (dieta da proteína). Provavelmente a popularidade desta dieta se deve a
preocupação cada vez maior da sociedade com a imagem de um corpo magro; e a
“dieta da proteína” do doutor Atkins promove rápida perda de peso (GARDNER et
al., 2010). Pesquisadores justificam sua utilização devido ao fato de que a alta
ingestão de carboidrato refinado, especialmente açúcar branco, causa
hiperestimulação de insulina e o resultado é uma fome incontrolável, além de
favorecer a lipogênese e consequentemente a estocagem de gordura (RILEY &
COVENEY, 2004). O Dr. Atkins afirma que a dieta é eficaz na promoção de perda de
peso, apesar do livre consumo de carnes com gorduras, manteiga e outros produtos
com alto teor de gorduras, restringindo apenas a ingestão de carboidratos para
menos de 30 g por dia (ASTRUP et al., 2004).
A dieta do Dr. Atkins ou “dieta da proteína” é uma das dietas hiperproteicas
mais conhecidas pela sociedade, promovendo o aumento extremo do consumo de
proteínas (25-30%) e lipídeos (55-65%) e minimizando a ingestão de carboidratos (<
21
5%). Em seu livro “A Revolucionária dieta do Doutor Atkins” (Atkins, 1981), Robert
Atkins descreve que o objetivo da dieta é restringir quase que totalmente a ingestão
de carboidratos até o ponto em que a gordura corporal seja mobilizada e utilizada
como combustível energético. Tal dieta, pobre em micronutrientes e fibras, e com
altos teores protéicos e de lipídios está em total desacordo com o preconizado pela
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS AND
WORLD HEALTH ORGANIZATION (FAO/OMS, 2002) e pelo estudo do NATIONAL
HEALTH AND NUTRITION EXAMINATION SURVEY (NHANES III, CDC, 1988-
1994), onde os macronutrientes são distribuídos da seguinte forma: proteínas (10-
15%), carboidratos (55-75%) e lipídeos (15-30%), com baixo teor de gorduras trans
e saturadas. O quadro 1 mostra as recomendações da American Heart Association
(AHA) e da National Cholesterol Education Program (NCEP).
No entanto, alguns estudos observaram melhoras no perfil lipídico, melhor
composição corporal, melhor homeostase glicêmica, com melhora na sensibilidade
insulínica, ganho de massa magra e melhora na pressão arterial em indivíduos que
seguiram dieta com baixo teor de carboidratos (APARICIO et al., 2010; PÉREZ-
GUISADO, 2008; NOAKES et al., 2005).
Quadro 1- Comparação entre a dieta da proteína e as recomendações da American Heart Association (AHA) e da National Cholesterol Education Program (NCEP)
*%de proteína da caseína = 92,5% proteína/100 gramas de caseína
1 Mix de vitaminas (mg/Kg dieta): palmitato de retinol 2,4, colecalciferol 0,025, bissulfito sódico de
benadiona 0,8, biotina 0,22, cianocobalamina 0,01, riboflavina 6,6, hidrocloreto de tiamina 6,6 e acetato de tocoferol 100.
2 Mix de minerais (g/Kg dieta): sulfato de cobre 0,1, molibdato de amônio 0,026, iodato de sódio
0,0003, cromato de potássio 0,028, sulfato de zinco 0,091, hidrogenofosfato de cálcio 0,145, sulfato de ferro amoniacado 2,338, sulfato de magnésio 3,37, sulfato de manganês 1,125, cloreto de sódio 4, carbonato de cálcio 9,89 e diidrogenofosfato de potássio 14,75.
40
Quadro 4– Composição da ração hiperproteica utilizada no experimento (g/100g de ração).
1 Mix de vitaminas (mg/Kg dieta): palmitato de retinol 2,4, colecalciferol 0,025, bissulfito sódico de
benadiona 0,8, biotina 0,22, cianocobalamina 0,01, riboflavina 6,6, hidrocloreto de tiamina 6,6 e acetato de tocoferol 100.
2 Mix de minerais (g/Kg dieta): sulfato de cobre 0,1, molibdato de amônio 0,026, iodato de sódio
0,0003, cromato de potássio 0,028, sulfato de zinco 0,091, hidrogenofosfato de cálcio 0,145, sulfato de ferro amoníacado 2,338, sulfato de magnésio 3,37, sulfato de manganês 1,125, cloreto de sódio 4, carbonato de cálcio 9,89 e diidrogenofosfato de potássio 14,75.
5.5 Coleta de dados
5.5.1 Peso corporal
O ensaio biológico teve a duração de 60 dias. Durante a experimentação os
animais foram pesados em balança eletrônica da marca BioPrecisa®, uma vez por
semana, para obtenção da variação do peso corporal, em gramas.
41
5.5.2 Consumo de ração
O controle da ração foi realizado da seguinte forma: para os grupos C1 e HP1
a ração foi ofertada em livre demanda, ou seja, consumiam à vontade. A partir do
consumo destes grupos foi estipulado a quantidade de ração a ser ofertada para os
grupos C2 e HP2 que receberam 70% do consumo, totalizando restrição alimentar
de 30%, sendo que a oferta de ração para estes grupos era realizada diariamente.
5.5.3 Ingestão hídrica
O controle da oferta de água foi realizado uma vez por semana para todos os
grupos. Tanto a oferta quanto a sobra de ração (g) e água (mL) foram controladas
para serem determinadas as quantidades ingeridas. Para pesagem da sobra de
ração foi utilizada balança eletrônica da marca BioPrecisa® e para mensuração da
sobra de água foi utilizada proveta graduada da marca LaborGlas® (expressa em
ml).
5.6 Determinação do ciclo estral das ratas
Devido à atuação dos hormônios sexuais femininos sobre a fisiologia e
metabolismo do organismo, determinou-se realizar o sacrifício dos animais que
estivessem em uma fase específica (estro). Assim, foi verificado antes do sacrifício,
o ciclo estral das ratas. Para tal foi realizado um lavado vaginal com soro fisiológico,
usando pipeta automática de volume fixo (100 μL) (Figura 6). A secreção coletada foi
colocada em lâminas de vidro para observação das células predominantes. As
células da secreção vaginal foram observadas a fresco, em microscópio óptico em
objetiva com aumento de 40X (Figuras 7 e 8). Somente os animais na fase estro
eram sacrificados (AZEREDO, 2012).
42
Figura 6 - Método para realização do lavado vaginal em ratas. Manipulação do animal e coleta
da secreção vaginal. Técnica realizada no LabNE da Faculdade de Nutrição da UFF.
Figura 7- Visualização das lâminas a fresco ou coradas e caracterização das fases do ciclo
estral.
Figura 8 - Fotomicrografia do esfregaço vaginal corado com o início da fase Estro.
Representado pelo aumento do número e predominância de células
queratinizadas. Técnica realizada no LabNE da Faculdade de Nutrição da UFF.
43
5.7 Sacrifício e coleta de sangue e fêmur
Após 60 dias de experimento, os animais foram anestesiados com injeção
intraperitoneal de cloridrato de xilazina associado a ketamina na proporção de 1:1,
na dosagem de 0,1 ml/200g de peso corporal. Em seguida foi realizada coleta de
sangue por punção cardíaca. Os animais que não vinham a óbito durante esta
punção foram sacrificados em câmara de CO2. O sangue foi colocado em tubos
Vaccutainer sem anticoagulante e após a retração do coágulo foi centrifugado a
3000 rpm, durante 20 minutos, para obtenção do soro. E em seguida alíquotas
foram separadas e congeladas a
-80ºC ± 2°C para análises posteriores.
O fêmur direito foi retirado logo após o sacrifício do animal e dissecado. Em
seguida pesado em balança eletrônica da marca BioPrecisa® com precisão de
0,01g. O peso foi expresso em gramas (g). As medidas da distância entre as epífises
e a largura do ponto médio da diáfise foram realizadas com paquímetro modelo LEE
TOOLS (precisão 0,05mm) (Figura 9). Após a medição, foi utilizado para análise do
conteúdo mineral ósseo e para análise densitométrica.
Figura 9- Fêmur dissecado, ao lado paquímetro utilizado para a medição.
As carcaças dos animais foram embaladas em saco plástico e congeladas até
o seu recolhimento pela empresa especializada em retirada de material hospitalar.
44
5.8 Processamento das amostras
5.8.1 Determinação da concentração sérica de cálcio, magnésio e fósforo
As concentrações de cálcio, magnésio e fósforo sérico foram determinadas
por método colorimétrico, utilizando kits comerciais BioClin, específicos para cada
mineral. A leitura das reações obtidas foi realizada por absorbância em
espectrofotômetro modelo SP Biospectro, utilizando comprimentos de onda
específicos para cada analito: cálcio (510nm), fósforo (650nm) e magnésio (500nm).
Após a leitura da absorbância foi realizado o cálculo segundo a fórmula contida na
bula de cada kit, obtendo assim a quantificação final do analito, sendo expresso em
mg/dL.
5.8.2 Determinação da concentração de insulina, osteocalcina e paratormônio
As concentrações séricas de insulina, osteocalcina e paratormônio foram
determinadas por Imunoabsorção Ligado a Enzimas, utilizando o kit para rato da
marca UScn Life Science Inc.
Na determinação da insulina o ensaio emprega a técnica de inibição
competitiva enzimática. Nesta técnica ocorre uma correlação inversa entre a
concentração de insulina na amostra e a intensidade do sinal. A placa de
microtitulação fornecidas no kit era revestido com um anticorpo monoclonal
específico de insulina para rato (IAA). As amostras e os padrões foram adicionados
nos poços da placa. Uma reação de inibição era iniciada entre a insulina de rato
marcada com biotina e a insulina de rato não marcada (amostra ou padrões) com o
anticorpo específico revestido de insulina para rato. Após a incubação o conjugado
não ligado é lavado. Em seguida, avidina conjugada com peroxidase de rábano
silvestre foi adicionado em cada placa e incubada. A quantidade de conjugado ligado
com a peroxidase de rábano era inversamente proporcional a concentração de
insulina na amostra. A mudança de cor foi medida espectrofotometricamente no
leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A
45
concentração de IAA na amostra foi determinada comparando a densidade ótica das
amostras com a curva padrão e os resultados expressos em pg/mL.
Para a concentração sérica de osteocalcina foram utilizadas placas de
microtitulação fornecidos no kit e pré-revestido com um anticorpo específico para
osteocalcina. As amostras, os padrões e a preparação de anticorpo específico para
osteocalcina conjugada com biotina foram adicionadas na microplaca. Após, avidina
conjugada com peroxidase de rábano silvestre foi adicionada em cada poço e
incubado. Em seguida foi adicionada solução de substrato. Somente os poços que
continham osteocalcina, anticorpo conjugado com biotina e avidina conjugada com
enzima exibiam uma mudança na cor. A reação enzima-substrato era terminada pela
adição da solução de ácido sulfúrico e a mudança na cor medida
espectrofotometricamente no leitor de ELISA Thermo plate Read, em comprimento
de onda de 450 nm. A concentração de osteocalcina nas amostras foi então
determinada através da comparação da densidade ótica das amostras com a curva
padrão. A curva foi constituída por análise de regressão e os resultados expressos
em ng/mL.
Para a concentração sérica de paratormônio (PTH) empregou-se a técnica da
inibição competitiva enzimática. Um anticorpo monoclonal específico para PTH de
rato foi pré-revestido na microplaca. Uma reação de inibição competitiva foi iniciada
entre o PTH de rato marcado com biotina e PTH de rato não marcado (padrões e
amostras) com o anticorpo específico para PTH de rato pré-revestido. Após
incubação o conjugado não-ligado foi lavado, em seguida avidina conjugada com
peroxidase de rábano foi adicionada em cada poço da microplaca e incubada. A
quantidade de peroxidase de rábano ligado é inversamente proporcional a
concentração de PTH na amostra. Após adição da solução de substrato, a
intensidade da cor desenvolvida é reversamente proporcional a concentração de
PTH na amostra. A mudança de cor foi medida espectrofotometricamente no leitor
de ELISA Thermo plate Read, em comprimento de onda de 450 nm. A concentração
de PTH na amostra foi determinada através da comparação da densidade ótica das
amostras com a curva padrão. Os resultados foram expressos pg/mL.
46
5.8.3 Conteúdo mineral ósseo do fêmur
Antes da análise, todo o material utilizado foi previamente lavado por imersão
em ácido nítrico diluído (1:4), posteriormente, cuidadosamente enxaguado com água
deionizada e, por fim, colocado em estufa à 105º C para a secagem. Os materiais
foram resfriados no dessecador e depois colocados por 3 horas na mufla para
posterior resfriamento e pesagem em balança analítica.
Primeiramente foi determinada a umidade, realizada por meio da técnica
gravimétrica com emprego de calor (105º C) (CECCHI,1999).
Para obtenção das cinzas, o fêmur direito de cada animal foi colocado no
cadinho, identificados individualmente, aquecidos em mufla (Quimis) a 550º C por 3
horas (até a queima total de matéria orgânica) e resfriados em dessecador até a
temperatura ambiente, para posterior pesagem em balança analítica. Novas
pesagens foram realizadas até as amostras adquirirem peso constante (CECCHI,
1999). Os resultados foram expressos em gramas. Com os resultados de umidade e
cinzas foi possível determinar o resíduo mineral fixo de cada amostra.
Após produzidas as cinzas, estas em seus respectivos cadinhos foram
acidificadas com 3 ml de ácido nítrico (65%), colocadas em placa aquecida à 80º C
por 30 minutos. Depois de resfriados, os cadinhos foram lavados com 10 ml de água
deionizada e foram recuperados 5 ml de amostra com uma seringa. A solução foi
filtrada com filtro Jet BioFil (Innovative unique) acoplado a seringa. Essa solução foi
transferida para tubos lavados em ácidos para que assim pudessem ser realizadas
as análises de minerais.
As análises de minerais foram realizadas a partir dos kits comerciais (Bioclin).
A leitura das reações obtidas foi realizada em espectrofotômetro modelo SP
Biospectro, utilizando comprimentos de onda específicos para cada analito: cálcio
(510nm), magnésio (500nm) e fósforo (650nm). Após a leitura da absorbância foi
realizado o cálculo segundo a fórmula contida na bula de cada kit, considerando a
diluição da amostra, obtendo assim a quantificação final do analito, sendo o
resultado expresso em mg/dL.
47
5.8.4 Densitometria óssea
A densitometria óssea foi realizada no Laboratório de Avaliação Nutricional e
Funcional – (LANUFF) da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro da UFF.
A massa óssea e a composição corporal foram avaliadas por absorciometria com
dupla emissão de raios-X, utilizando o densitômetro LUNAR – IDXA (GE-Healthcare,
Madison, WI), com software encore versão 13.40 (Figura 10), utilizou-se um
programa para análises densitométricas em pequenos animais (TSUJIO et al., 2009;
GLICKMAN et al., 2004).
Analisamos parâmetros densitométricos de todos os animais utilizando o
sistema Dual Energy X-Ray Absorptiometry (DXA). Este é um método com grande
precisão e acurácia para medidas do conteúdo mineral ósseo (CMO), que utiliza
baixa quantidade de radiação. É um método preciso também para medir tanto a
massa óssea quanto os componentes corporais de gordura e massa magra
(HERMSDORFF & MONTEIRO, 2004).
Baseia-se na atenuação sofrida pelos raios X ao atravessarem os diferentes
tipos de tecidos de um corpo. Os dois tipos de energia padronizado nesses raios X
possibilitam a diferenciação entre os vários tecidos corporais, dividindo o organismo
em conteúdo mineral, massa gorda e massa magra (isenta de gordura). No
compartimento ósseo, o método é capaz de determinar a quantidade de minerais
em gramas (conteúdo mineral ósseo) contida em uma determinada projeção do
osso. Dividindo-se esse conteúdo mineral pela área óssea do local, obtém-se o que
se convencionou chamar de Densidade Mineral Óssea (DMO), embora se trate de
uma medida de g/cm2 (LAZARETTI-CASTRO, 2004).
As análises densitométricas, Densidade Mineral Óssea (DMO,g/cm2),
Conteúdo Mineral Ósseo (CMO,g) e a Área óssea (cm2) foram realizadas,
individualmente, no início do experimento (com o animal anestesiado) para garantir
que todos os animais tinham os mesmos parâmetros densitométricos. Nova análise
foi realizada ao final do experimento, momentos antes do sacrifício, com o animal já
anestesiado. Embora tenha sido realizado a densitometria óssea do corpo inteiro do
animal apenas os seguintes sítios foram analisados: a densitometria óssea total, a
pelve, a coluna, o tecido gordo e magro do tronco e tecido gordo e magro total.
48
O mesmo procedimento foi realizado com o fêmur direito. A densitometria
óssea foi realizada nas peças colocadas (uma de cada vez) em recipiente com arroz
para simular os tecidos moles (COSTA et al., 2012).
Figura 10 a Figura 10 b Figura 10 c
Figura 10 a – Equipamento Lunar iDXA GE, utilizado para mensuração da densidade mineral óssea. Figura 10 b - animal pronto para realização da análise. Figura 10 c - imagem do corpo do animal utilizando o aparelho densitométrico.
5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados são apresentados a partir de estatística descritiva como média
e erro padrão da média (EPM). Análises de comparação de médias dentro do
próprio grupo (antes e depois) foram realizadas a partir da utilização do teste de
hipóteses pareado (t-pareado) para os parâmetros densitométricos (DMO, CMO e
Área óssea) e para análises de comparação de média entre os grupos utilizamos
ANOVA com medidas de repetição, e Duncan como pós-teste. Para análise da
evolução da massa corporal (g), foi utilizada ANOVA bi-variada. Trabalhamos com
um nível de significância de 5%. Para estas análises foi utilizado o software
GraphPad inStat versão 3.1 para Win/95 NT.
49
6 RESULTADOS
6.1 Peso corporal, ingestão hídrica e consumo de ração
Ao final do experimento o grupo HP1 e C1 apresentaram aumento do peso
corporal (HP1: 277,3 ± 17,35 g; C1: 269,0 ± 6,48 g) quando comparados aos grupos
HP2: 187,0 ± 11,47 g e C2: 177,6 ± 1,76 g) (P<0,05). A diferença significativa dos
grupos HP2 e C2 começou a ser observada a partir da quarta e sexta semana,
respectivamente (Gráfico 1).
Quanto à ingestão hídrica, os grupos hiperproteicos apresentaram maior
consumo (HP1: 11,46 ± 10,33 e HP2: 14,46 ± 12,08, ml/dia/100g PC), quando
comparados ao grupo C1 (7,84 ± 0,61 ml/dia/100gPC) (P<0,05). O grupo C2 ingeriu
10,4 ± 7,97, ml/dia/100gPC e apresentou ingestão hídrica semelhante aos grupos C1
e HP1 (Gráfico 2).
O consumo de ração em g/dia foi maior nos grupos com ingestão em livre
demanda, que consumiram quantidades similares entre si, o mesmo ocorreu entre
os grupos com restrição alimentar, porém com quantidade inferior aos grupos com
Gráfico 1- Evolução do peso corporal (g, ANOVA bi-variada, P<0,05); Grupos controles (●, C1; ■, C2), Grupos Hiperproteicos (▲, HP1; ▼, HP2). Diferentes letras denotam dieferença estatística (P<0,05), a – HP1 significativamente diferente de HP2; b – C1 significativamente diferente de C2.
50
C1 HP1 C2 HP20
5
10
15
20
a
b,ca,b
cL
íqu
ido
In
geri
do
dia
(m
L/1
00g
PC
)
Gráfico 2- Ingestão hídrica (mL/100g de peso corporal/dia); ANOVA uni-variada, (P<0,05). Grupo controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2 e HP2. a,b,c
Valores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes (P<0,05).
C1 HP1 C2 HP2
0
5
10
15
20
aa
b
b
Co
nsu
mo
Ali
men
tar
(g/d
ia)
Gráfico 3- Consumo alimentar (g/dia); ANOVA uni-variada, (P<0,05); Grupo Controle (C 1); Grupo
Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30 % de restrição alimentar C2 e HP2. a,b
Valores médios
com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes (P<0,05).
51
6.2 Concentrações séricas de minerais e hormônios estudados
As análises bioquímicas do sangue evidenciaram que os grupos
Grupo Controle 1 (C 1); Grupo Hiperproteico 1 (HP1); Grupo Controle 2 (C2), Grupo Hiperproteico 2 (HP2).
a,b,cValores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes
(ANOVA uni-variada, P<0,05). * Diferença significativa ao final do experimento em relação ao início.
* * Diferença significativa entre os grupos ao final do experimento.
6.4.1 Quantidade de tecido gordo e magro corporal no tronco e total
O tecido gordo no tronco e o total bem como seus respectivos incrementos
foram maiores nos grupos HP1 e C1(P<0,05). Ressalta-se que na análise por grupo
58
esses ganharam tecido gordo, enquanto os grupos com restrição perderam gordura
ao final do experimento. Quando comparamos por grupo, o tecido gordo total,
observamos que apenas o grupo HP1 não apresentou diferença significativa ao final
do experimento em comparação com o início (Tecido gordo no tronco- Início i, Final
F, Incremento I (g), C1 i 38,0 ± 5,21, F 82,6 ± 9,97, I 37,7 ± 7,16; HP1 i 37,4 ± 4,30,
F 63,8 ± 2,63, I 26,4 ± 3,83; C2 i 37,2 ± 1,82, F 26,8 ± 1,68, I -10,4 ± 2,52; HP2 i
39,8 ± 2,82, F 24,4 ± 1,77, I -15,4 ± 2,94. Tecido gordo total- C1 i 44,5 ± 5,95, F
96,2 ± 11,3, I 43,5 ± 7,36, HP1 i 50,8 ± 7,51, F 69,8 ± 7,86, I 19,0 ± 13,8, C2 i 43,2 ±
2,06, F 33,8 ± 1,80, I -9,4 ± 2,6, HP2 i 45,2 ± 3,04, F 31,4 ± 2,48, I -13,8 ± 3,51)
(Tabela 4).
Tabela 4 - Quantidade de tecido gordo no tronco e total
Grupo Controle 1 (C 1); Grupo Hiperproteico 1 (HP1); Grupo Controle 2 (C2);Grupo Hiperproteico 2 (HP2).
a,b,cValores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes
(ANOVA uni-variada, P<0,05). * Diferença significativa ao final do experimento em comparação ao início.
Os valores do tecido magro do tronco foram similares entre os grupos
hiperproteicos e o grupo C1, sendo que o resultado do grupo HP2 foi similar ao do
grupo C2. Apenas o grupo HP2 apresentou perda significativa de tecido magro no
tronco ao final do experimento quando comparamos com o início (P<0,05). O valor
do incremento de tecido magro no tronco foi similar entre os grupos hiperproteicos e
o grupo C1, tendo o grupo C2 apresentado valor significativamente menor dos
Tecido gordo (g) C1 HP1 C2 HP2
Tronco
Início
Final
Incremento
Total
Início
Final
Incremento
38,0 ± 5,21*
82,6 ± 9,97a
37,7 ± 7,16 a
44,5 ± 5,95*
96,2 ± 11,3 a
43,5 ± 7,36 a
37,4 ± 4,30*
63,8 ± 2,63a
26,4 ± 3,83 a
50,8 ± 7,51
69,8 ± 7,86 a
19,0 ± 13,8a,c
37,2 ± 1,82*
26,8 ± 1,68b
-10,4 ± 2,52b
43,2 ± 2,06*
33,8 ± 1,80b
-9,4 ± 2,6b,c
39,8 ± 2,82*
24,4 ± 1,77b
-15,4 ± 2,94b
45,2 ± 3,04*
31,4 ± 2,48a
-13,8 ± 3,51b
59
outros grupos (P<0,05). O tecido magro total do grupo HP1 apresentou valor similar
ao do grupo C1, o mesmo aconteceu entre os grupos HP2 e C1 e entre os grupos
com restrição. O incremento do tecido magro total apresentou valores semelhantes
entre os grupos hiperproteicos e o grupo C1 e entre si. Quando se analisa por grupo
verifica-se que apenas o grupo C2 apresentou perda significativa (P<0,05) ao final
do experimento em comparação com o início (Tecido magro no tronco- Início i, Final
F, Incremento I (g), C1 i 153,7 ± 7,47, F 137 ± 9,6, I -7,5 ± 4,42; HP1 i 160 ± 8,3, F
154,07 ± 3,4, I -6,0 ± 6,35; C2 i 155,2 ± 8,0, F 106,2 ± 3,5, I -49 ± 5,17, HP2 i
153,4 ± 4,27, F 118 ± 4,1, I -35,4 ± 7,10. Tecido magro total- C1 i 173,5 ± 8,2, F
158 ± 10,2, I -6,0 ± 3,5; HP1 i 185,2 ± 10,6, F 180 ± 3,78, I -5,2 ± 8,6; C2 i 174 ± 8,1,
F 127 ± 3,8, I -46,8 ± 5,0, HP2 i 171,4 ± 4,7, F 142 ± 4,0, I -29 ± 7,1) (tabela 5).
Tabela 5 - Quantidade de tecido magro corporal no tronco e total
Grupo Controle 1 (C 1); Grupo Hiperproteico 1 (HP1); Grupo Controle 2 (C2);Grupo Hiperproteico 2 (HP2).
a,b,cValores médios com letras diferentes sobrescritas são significativamente diferentes
(ANOVA uni-variada, P<0,05). * Diferença significativa ao final do experimento em comparação ao início.
Tecido magro (g) C1 HP1 C2 HP2
Tronco
Início
Final
Incremento
Total
Início
Final
Incremento
153,7 ± 7,47
137,0 ± 9,6a
-7,5 ± 4,42 a
173,5 ± 8,2
158,0 ± 10,2a,c
-6,0 ± 3,5a
160,0 ± 8,3
154,07 ± 3,4a
-6,0 ± 6,35 a
185,2 ± 10,6
180,0 ± 3,78a
-5,2,0 ± 8,6a
155,2 ± 8,0
106,2 ± 3,5b
-49,0 ± 5,17b
174,0 ± 8,1*
127,0 ± 3,8b
-46,8 ± 5,0b
153,4 ± 4,27*
118,0 ± 4,1a,b
-35,4 ± 7,10 a
171,4 ± 4,7
142,0 ± 4,0b,c
-29,0 ± 7,1a,b
60
7 Discussão
As dietas ricas em proteínas são as mais procuradas para perda de peso. São
consideradas mais eficazes na redução e manutenção da massa corporal do que
outras dietas com maior proporção de carboidratos ou gorduras devido ao seu efeito
saciogênico que leva o indivíduo a ingerir quantidade menor de alimento. No entanto
ainda há questionamentos sobre o efeito destas dietas no tecido ósseo.
O efeito das proteínas na saciedade pode estar associado às alterações
fisiológicas resultante da ingestão desse macronutriente (MERO et al., 2010). Devido
a indução da cetose e aumento da concentração de aminoácidos na corrente
sanguínea, hormônios anorexígenos são liberados, agindo na saciedade. O aumento
da secreção de CCK, derivado do aumento de aminoácidos após o processo
digestivo, também atua neste processo (JOHNSTONE et al., 2008; PAIVA et al.,
2007). Encontramos menor consumo de ração nos grupos hiperproteicos, o que já
era esperado devido ao efeito saciogênico das proteínas como já relatado.
Outro fator envolvido na perda de peso é que dietas hiperpoteicas induz a
gliconeogênese (KELLER, 2011), que leva a maior perda de água e consequente
perda de peso. Entretanto, mesmo não medindo o volume urinário, observamos que
os grupos hiperproteicos excretaram maior volume urinário e ingeriram maior
quantidade de líquido em comparação ao grupo C1, porém, ao final do experimento
o grupo HP2 apresentou peso similar ao grupo C2 assim como o grupo HP1
apresentou peso similar ao grupo C1. Associamos o menor peso dos grupos com
restrição alimentar ao menor consumo, ou seja, o que influenciou a perda de peso
foi a quantidade de ração ingerida e não a qualidade da dieta.
Halton e Hu (2004), em um estudo de revisão observaram que dentre os
quinze trabalhos analisados, sete encontraram diferença estatística na diminuição do
peso corporal com o uso da dieta rica em proteína, sendo que destes, três estavam
associados a uma restrição energética.
Apesar de todos os animais terem consumo adequado de cálcio, os grupos
experimentais apresentaram redução das concentrações de cálcio sérico e ósseo
(porém, dentro da faixa de normalidade), possivelmente devido ao maior
requerimento deste íon para regularizar a acidose provocada pelo metabolismo
protéico (RYLANDER et al., 2006). Não houve diferença estatística nas dosagens de
61
fósforo, magnésio e PTH entre os grupos analisados, o que mostra que a dieta
hiperproteica não interferiu na concentração desses analitos. Em um estudo com
camundongos Hamrick et al. (2008), também encontraram níveis similares de PTH
entre os grupos com restrição e os grupos que receberam alimentação em livre
demanda com dieta a base de caseína.
Dietas pobres em carboidratos (como as dietas hiperproteicas) levam a menor
liberação de insulina. Estudos recentes mostram que os osteoblastos possuem
receptores para insulina e respondem à insulina exógena, aumentando os
marcadores anabolizantes ósseos, incluindo a síntese de colágeno, produção de
fosfatase alcalina e a captação de glicose (FULZELE & CLEMENS, 2012).
Observamos que apenas o grupo HP2 apresentou concentração sérica de insulina
significativamente menor quando comparados aos outros grupos, o que já era
esperado devido a condição de restrição imposta. O grupo C2 apresentou uma
redução de 55% em relação ao grupo C1, embora sem diferença significativa.
Mesmo consumindo uma dieta pobre em carboidratos o grupo HP1 apresentou
concentração sérica de insulina similar ao grupo C1, ou seja, a diminuição da
insulina foi dependente da quantidade de carboidratos na dieta e da quantidade de
ração ingerida.
É relatado na literatura que o consumo em excesso de proteínas parece
exercer efeito negativo sobre o osso, apenas, em condições de baixa ingestão de
cálcio, o que pode confirmar os efeitos negativos observados no grupo que recebeu
a dieta da proteína com restrição alimentar. Os ajustes fisiológicos que podem estar
associados a isto são a hipercalciúria, devido à redução da reabsorção tubular de
cálcio em função da acidose, aumento na reabsorção óssea e, consequentemente,
desmineralização deste tecido (DARGENT-MOLINA et al., 2008). A gordura de
origem animal também influencia negativamente o metabolismo ósseo devido à
reabsorção de citocinas ósseas, a reabsorção óssea pelos osteoclastos e inibição da
síntese de colágeno pelos osteoblastos (HALADE et al., 2009, AMANZADEH et al.,
2003). Trabalhos de Parhami et al. (2001) encontraram uma redução de 35% da
expressão da osteocalcina em ratos alimentados com dieta hiperlipídica,
possivelmente devido a alterações metabólicas. A restrição alimentar também
influenciou o tecido ósseo nos estudos realizados por Ndiaye et al. (1995), em que
encontraram concentração sérica de osteocalcina diminuída em ratos submetidos a
restrição energética, atribuindo este achado com a redução de síntese e não a uma
62
alteração no metabolismo. Nossos resultados estão de acordo com o que é descrito
na literatura. Nesse experimento a concentração sérica de osteocalcina dos grupos
hiperproteicos foram menores quando comparados ao grupo C1, sendo que o grupo
C2 também obteve redução na concentração desse hormônio, o que mostra que
tanto a composição da dieta como a quantidade ingerida estão envolvidos na
expressão da osteocalcina.
Na maior parte das análises densitométricas o grupo HP1 apresentou valores
semelhantes ao C1 o que parece estar associado ao consumo em livre demanda,
visto que os grupos com ingestão alimentar restrita também apresentaram
resultados similares. Entretanto, quando analisamos o conteúdo mineral ósseo
quantitativo, realizado no fêmur, vemos diferenças da concentração de minerais
entre os grupos controle e hiperproteico. Ou seja, a maior concentração de
magnésio ósseo encontrado nos grupos hiperproteicos parece ter compensado a
menor concentração de cálcio encontrado nesses grupos. Esse dado é relevante
porque embora o DXA revele o CMO, ele não quantifica os minerais. A concentração
diminuída de cálcio encontrado nos grupos hiperproteicos está de acordo com o que
se conhece de dietas cetogênicas, como a dieta da proteína. Assim, o maior
recrutamento de cálcio para o tamponamento sanguíneo contribuiu para um
comprometimento ósseo não revelado pelo DXA, porém, demonstrado pela análise
do conteúdo mineral ósseo.
A DMO do fêmur do grupo HP2 foi significativamente menor quando
comparado aos outros grupos e atribuímos esse achado à dieta e à restrição
alimentar. No entanto, embora o grupo HP1 não tenha apresentado redução da
DMO do fêmur, acreditamos que a dieta influenciou seu metabolismo ósseo. A
diminuição da largura do ponto médio das diáfises nos grupos experimentais
evidencia o comprometimento ósseo. Ressalta-se que esses animais já estavam na
fase adulta e não era de se esperar aumento no comprimento do fêmur.
Trabalhos encontrados na literatura científica relacionam o aumento do
consumo de proteínas com uma melhora nos parâmetros densitométricos. Maior
ingestão de proteína foi associada com uma mudança favorável da densidade
mineral óssea do corpo total (CAO et al., 2011; JESUDASON & CLIFTON, 2010;
DAWSON-HUGHES, 2003) e aumento no balanço de cálcio, resultando na
preservação do conteúdo mineral ósseo (KELLER, 2011).
63
Em estudo de revisão de vários artigos científicos que trata da ingestão de
proteínas e saúde óssea Jesudason e Clifton (2010), citam que em mulheres jovens
e na pré-menopausa, o aumento da proteína dietética parece ser positivamente
correlacionada com a maior densidade óssea, pelo menos em alguns locais,
principalmente o rádio. Os melhores resultados foram obtidos naquelas em que além
do consumo elevado de proteínas receberam uma suplementação de cálcio mais
elevado. Este estudo de revisão concluiu que a proteína dietética, por si só parece
ter um efeito anabólico no osso e tem demonstrado efeitos variáveis sobre
marcadores ósseos, incluindo IGF-I e densidade óssea.
Em um estudo prospectivo de mulheres francesas na pós-menopausa, não
houve associação significativa entre a ingestão de proteínas e risco de fraturas na
população que ingeriu grande quantidade de proteínas e cálcio. No entanto, um
elevado risco de fratura foi encontrado em mulheres com elevado consumo de
proteínas na presença de baixa ingestão de cálcio (< 400 mg/1000 Kcal)
(DARGENT-MOLINA et al., 2008). Estes resultados podem ser explicados pelo fato
de que o impacto da proteína sobre o esqueleto é dependente de outros
componentes da dieta. Tem sido sugerido que a maior absorção de cálcio pode
ajudar a compensar a perda urinária de cálcio induzida por alta ingestão de
proteínas. Assim, se a proteína exerce um efeito negativo sobre o osso, deve-se
apenas em condições de baixa ingestão de cálcio. A influência do cálcio dietético no
efeito da proteína não foi completamente investigada (DARGENT-MOLINA et al.,
2008).
Promislow et al. (2002), encontraram uma associação positiva entre consumo
de proteína animal, avaliada por questionários de frequência alimentar, e da DMO.
Observou-se aumento da DMO no quadril, colo do fêmur, coluna vertebral e corpo
total.
No estudo realizado com camundongos por Hamrick et al. (2008), não
encontrou-se diferenças na DMD e CMO nos grupos com restrição energética e
controle (alimentados com dieta à base de caseína). No entanto, houve uma
redução significativa desses parâmetros no fêmur dos alimentados com restrição
calórica quando comparados com camundongos alimentados com livre consumo.
O peso corporal está altamente correlacionado com a massa óssea e
densidade mineral óssea, mas o papel da composição corporal (músculo, massa
magra e massa gorda) na regulação da formação e reabsorção óssea é pouco clara.
64
Sabe-se que o tecido adiposo produz estrógenos através da aromatização de
andrógenos e gordura e estes podem influenciar positivamente a massa óssea
(HAMRICK et al., 2008; WAJCHENBERG, 2000). No entanto, Halade et al. (2009)
relatam que dietas hiperproteicas também são ricas em gorduras, e estas podem
afetar negativamente o tecido ósseo. O tecido adiposo produz citocinas pró-
inflamatórias como interleucina-6 (IL-6) e Fator de necrose tumoral (TNF-α) que
estimulam a osteoclastogênese. Ao final do experimento verificamos que houve
ganho de tecido gordo no tronco nos grupos com consumo em livre demanda,
porém, apenas o grupo HP1 apresentou alteração óssea, o que leva a crer que a
dieta rica em proteína e gordura de origem animal levou ao maior comprometimento
ósseo. Porém, mesmo quando em condição de restrição alimentar, observamos o
mesmo efeito, como verificado no grupo HP2.
A dieta da proteína levou ao comprometimento ósseo observado nos grupos
experimentais, pelo maior recrutamento de cálcio para o tamponamento sanguíneo e
também devido à diminuição dos marcadores ósseos anabolizantes, sendo o grupo
experimental com restrição alimentar o mais afetado.
65
8 CONCLUSÃO
A partir dos resultados encontrados pode-se perceber que:
A dieta hiperproteica não promoveu maior perda de peso corporal do
que a dieta controle;
De um modo geral os grupos com restrição alimentar apresentaram
diminuição nos valores densitométricos, sendo o fêmur do grupo HP2
o mais afetado;
Os grupos que receberam dieta hiperproteica, tanto o grupo com
consumo em livre demanda como o grupo com restrição energética,
apresentaram comprometimento da formação óssea revelado pela
redução da largura do ponto médio da diáfise do fêmur, diminuição do
cálcio sérico e ósseo e da osteocalcina. O grupo HP2 apresentou
também diminuição na concentração sérica de insulina;
Houve maior comprometimento ósseo no grupo HP2, ou seja, tanto a
dieta como a quantidade ingerida influenciaram esse tecido.
66
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74
APÊNDICE A
Produção Científica relacionado à dissertação
Premiação classificada em 2º lugar no XXI Seminário de Iniciação Científica.
Prêmio UFF Vasconcellos Torres de Ciência e Tecnologia
Premiação classificada em 3º lugar No IV Encontro de Nutrição Clínica
Funcional e Medicina do Rio de Janeiro & II Simpósio de Nutrição Esportiva
Apresentação de trabalho no XXII Congresso Brasileiro de Nutrição
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APÊNDICE B
Publicação em Periódico
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EFEITO DA “DIETA DA PROTEÍNA” NO TECIDO ÓSSEO
EFFECT OF THE “PROTEIN DIET” ON BONE TISSUE
“DIETA DA PROTEÍNA” E TECIDO ÓSSEO / “PROTEIN DIET” AND BONE TISSUE
Zoraide Nascimento da Silva1; Vanessa Azevedo de jesuz2; Eduardo de Salvo Castro3;
Carlos Alberto Soares da Costa4; Gilson Teles Boaventura5; Vilma Blondet de Azeredo6
1- Bióloga, Técnica do Laboratório de Nutrição Experimental da Faculdade de Nutrição,
Mestranda do curso Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil. Telefone: 55 021 26299860.
2-Graduanda em Nutrição, Bolsista de Iniciação Científica do CNPq no Laboratório de
Nutrição Experimental da Faculdade de Nutrição da Universidade Federal Fluminense,
Niterói, RJ, Brasil.
3-Graduando em Medicina da Universidade do Grande Rio, Bolsista de Iniciação Científica
da FAPERJ no Laboratório de Nutrição Experimental da Faculdade de Nutrição da
Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.
4-Nutricionista Pós Doutorando Associado da Faculdade de Nutrição, Departamento de
Nutrição e Dietética da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.
5-Professor D.Sc. Associado da Faculdade de Nutrição, Departamento de Nutrição e
Dietética da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil.
6-Vilma Blondet de Azeredo*, D.Sc. Professor Adjunto da Faculdade de Nutrição,
Departamento de Nutrição e Dietética da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ,
Brasil. Phone: 55 XX 21 26299842 Fax: 55 XX 21 26299842 E-mail:
Grupo controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2
e HP2. Diferentes letras sobrescritas denotam diferença estatística (ANOVA, P<0,05). Niterói, 2011.
A análise de densitometria do corpo total mostra que os grupos C2 e HP2
apresentaram menor (P<0,05) DMO, CMO e área óssea quando comparados aos grupos C1
e HP1. Ao analisarmos regiões específicas como a região da pelve, observou-se que os
grupos C2 e HP2, também, apresentaram menor (P<0,05) DMO em relação aos grupos C1
e HP1, enquanto o CMO da pelve foi menor (P<0,05), apenas, no grupo C2. Para a região
da coluna vertebral, os grupos que sofreram restrição alimentar (C2 e HP2) apresentaram
menor (P<0,05) DMO e CMO em relação aos grupos com dieta em livre consumo (C1 e
HP1). No entanto, ao analisar a DMO e a CMO do fêmur do grupo HP2 observa-se que esta
foi inferior (P<0,05) a dos outros grupos (Tabela 2).
TABELA 2- Valores da densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, área total
corporal, da pélvis, coluna vertebral e do fêmur dos animais estudados.
(continua)
C1 HP1 C2 HP2
Total
DMO (g/cm2)
CMO (g)
ÁREA (cm2)
0,16 ± 0,01a
8,80 ± 0,36 a
52,40 ± 1,80a
0,15 ± 0,01 a
8,28 ± 0,14 a
52,60 ± 0,40 a
0,14 ± 0,01b
6,40 ± 0,15b
45,80 ± 0,91b
0,14 ± 0,01b
6,82 ± 0,03 b
46,60 ± 0,87 b
Pelve
DMO (g/cm2)
CMO (g)
Área (cm2)
0,16 ± 0,01a
2,34 ± 0,16a
14,80 ± 0,58
0,16 ± 0,01a
1,98 ± 0,11a
12,20 ± 0,37
0,13 ± 0,01b
1,70 ± 0,11b
13,20 ± 1,07
0,14 ± 0,01b
1,84 ± 0,11a
13,0 ± 0,83
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TABELA 2- Valores da densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, área total corporal, da pélvis, coluna vertebral e do fêmur dos animais estudados. (conclusão)
C1 HP1 C2 HP2
Coluna Vertebral
DMO (g/cm2)
CMO (g)
Área (cm2)
0,15 ± 0,01a
1,78 ± 0,20 a
12,00 ± 1,0
0,15 ± 0,01 a
1,74 ± 0,05 a
11,40 ± 0,50
0,12 ± 0,01 b
1,12 ± 0,13 b
9,40 ± 0,87
0,12 ± 0,01 b
1,12 ± 0,12 b
9,00 ± 0,83
Fêmur
DMO (g/cm2)
CMO (g)
Área (cm2)
0,156 ± 0,01a
0,400 ± 0,01 a
2,80 ± 0,1
0,146 ± 0,01a
0,380 ± 0,02 a
2,80 ± 0,1
0,145 ± 0,01a
0,370 ± 0,01 a
2,71 ± 0,1
0,132 ± 0,01b
0,360 ± 0,03 b
2,66 ± 0,2
Grupo controle (C1); Grupo Hiperproteico (HP1). Grupos submetidos a 30% de restrição alimentar C2
e HP2. Diferentes letras sobrescritas denotam diferença estatística (ANOVA, P<0,05). Niterói, 2011.
Ao analisar os parâmetros biométricos do fêmur pode-se observar que não houve
diferença significativa para as análises de peso e distância entre as epífises. No entanto,
observou-se redução (P<0,05) na largura do ponto médio da diáfise do fêmur nos grupos
que receberam a dieta da proteína (HP1 e HP2), quando comparados com os seus
respectivos grupos controle (C1e C2). Resultado semelhante foi encontrado quando
avaliada a composição mineral do fêmur, os grupos HP1 e HP2 apresentaram menor
(P<0,05) concentração de cálcio neste osso. Maior concentração (P<0,05) de magnésio foi
encontrada nos grupos que receberam a dieta da proteína, em relação aos grupos C1e C2
(Tabela 3).
TABELA 3- Parâmetros biométricos e concentração de minerais do fêmur dos animais