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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE FOLHAS DA ESPÉCIE VEGETAL
Xylopia ochrantha (Mart.)
RICARDO DIEGO DUARTE GALHARDO DE ALBUQUERQUE
NITERÓI
2013
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ii
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE FOLHAS DA ESPÉCIE VEGETAL
Xylopia ochrantha (Mart.)
RICARDO DIEGO DUARTE GALHARDO DE ALBUQUERQUE
Dissertação de mestado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde da
Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal Fluminense como requisito
parcial para obtenção do Grau de Mestre
na Área de Concentração: Pesquisa e
Desenvolvimento de Produtos para a
Saúde.
Orientadora: Profa Dr
a THELMA BARROS MACHADO
Niterói
2013
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Albuquerque, Ricardo Diego Duarte Galhardo de.
Estudo fitoquímico e biológico de folhas da espécie
vegetal Xylopia ochrantha (Mart.)/ Ricardo Diego Duarte
Galhardo de Albuquerque; orientadora: Thelma Barros
Machado. ____Niterói, 2013.
81f.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal
Fluminense, 2013.
1. Xylopia 2. Óleos essenciais 3. Planta medicinal 4.
Atividade antimicrobiana 5. Atividade antioxidante 6.
Atividade citotóxica 7. Esteroides 8. Flavonoides I.
Machado, Thelma Barros II. Título
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iv
RICARDO DIEGO DUARTE GALHARDO DE ALBUQUERQUE
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE FOLHAS DA ESPÉCIE VEGETAL
Xylopia ochrantha (Mart.)
Dissertação de mestado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde da
Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal Fluminense como requisito
parcial para obtenção do Grau de Mestre
em Área de Concentração: Pesquisa e
Desenvolvimento de Produtos para a
Saúde.
Aprovado por:
Prof ª. Dra. THELMA BARROS MACHADO - Orientadora
Universidade Federal Fluminense - UFF
Profª. Drª. SABRINA CALIL ELIAS
Universidade Federal Fluminense - UFF
Prof ª. Drª. NAOMI KATO SIMAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
Profª. Drª. ADRIANA PASSOS DE OLIVEIRA - Revisora
Universidade Estadual da Zona Oeste - UEZO
Niterói
2013
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v
Este trabalho foi
realizado sob a
orientação da Profª. Drª.
Thelma de Barros
Machado.
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vi
DEDICATÓRIA
“... à minha família, primeiramente, aos
amigos e a todos que contribuíram para o
alcance do meu sucesso e me deram forças
para seguir meu caminho...”
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vii
“... A amizade é um meio de nos isolarmos da
humanidade cultivando algumas pessoas...”
(Carlos Drummond de Andrade)
“... Os únicos limites do homem são: o tamanho
das suas ideias e o grau da sua dedicação...”
(Autor desconhecido)
“... O primeiro passo para a vitória é acreditar que
ela exista e que possamos ser os protagonistas em
conduzi-la, não importando o quão longínqua e
tortuosa esta venha a se mostrar...”
-
viii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela saúde, força e luz que tem me
dado durante todo o
percurso.
Aos meus pais e minha irmã pelo apoio e por acreditarem sempre
no meu sucesso.
Aos meus familiares, inclusive aqueles que infelizmente não
estão mais presentes neste
mundo, que sempre estiveram dispostos a me apoiar e torcendo
pelas minhas conquistas.
Aos meus amigos que fazem parte do LTPN pela força, incentivo,
companhia, acolhimento e
aprendizado profissional.
Aos meus demais amigos que me incentivaram e deram todo apoio
nos momentos de
necessidade.
À coordenação do PG-CAPS pelo suporte e apoio científico durante
todo o projeto.
À Faculdade de Farmácia e Universidade Federal Fluminense pela
oportunidade de iniciar
minha vida científica.
À CAPES pelo suporte e apoio científico.
À minha orientadora Profª Drª. Thelma Machado.
Ao Prof. Dr. Marcelo Guerra pelo conhecimento e apoio
científico.
À Profª Drª. Kátia Lima pelo suporte técnico e científico.
Ao saudoso Prof. Dr. Moacélio Silva-Filho e ao mestre Róber
Bachinski pela colaboração e
conhecimento.
Ao Arthur, Bruna e Profª Drª. Ivana Leal pela avaliação
antimicrobiana.
À Mariana e Suellen pela colaboração durante todo o projeto.
Aos técnicos Pedro Couteiro, Débora Eiriz e Aline Marques pelas
análises em CG-MS.
Ao Laboratório de Interações Celulares – UFRJ pela colaboração
com a avaliação citotóxica.
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ix
Ao Instituto de Tecnologia de Fármacos (FIOCRUZ) pelas análises
em LC-DAD-MS.
Ao Laboratório de Epidemiologia Molecular e Biotecnologia
(Faculdade de Farmácia – UFF)
e Laboratório de Infecção Hospitalar (UFRJ) pela colaboração com
a avaliação
antimicrobiana.
Aos Profs. Dr. Ciro Pregnolatto e Drª. Maria Abadia Vera pelo
apoio e conhecimento.
À Profª Drª. Adriana Passos pelo apoio científico e revisão do
projeto.
À Profª Drª. Deborah Quintanilha pelas sugestões de modificação
durante a defesa do projeto.
Às Professoras Drª. Sabrina Calil e Drª. Naomi Kato pela
participação na banca de avaliação.
-
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Árvore de Xylopia ochrantha (p.3)
Figura 2 – Folhas e fruto de Xylopia ochrantha (p.5)
Figura 3 - Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Carapebus
- RJ) (p.10)
Figura 4 - Fruto de Xylopia aethiopica (p.11)
Figura 5 - Folhas e flores de Xylopia parviflora (p.11)
Figura 6 - Frutos de Xylopia aromática (p.12)
Figura 7 - Árvore de Xylopia brasiliensis (p.12)
Figura 8 – Espatulenol (X.laevigata e X.brasiliensis) (p.15)
Figura 9 – Estrutura química do ácido kovalênico (X.aethiopica)
(p.15)
Figura 10 – Estrutura química do ácido ent-kaur-16-en-19-óico
(X.aethiopica) (p.15)
Figura 11 – Estrutura química do ácido traquiloban-19-óico
(X.aethiopica) (p.15)
Figura 12 - Estrutura química do ácido ent-kaur-16-en-19-óico
(X.cayennensis) (p.15)
Figura 13 - Estrutura química do ent-kaur-16-en-19-ol
(X.cayennensis) (p.15)
Figura 14 – Estrutura química da emarginatina 1 (X.emarginata)
(p.15)
Figura 15 – Estrutura química da emarginatina 2 (X.emarginata)
(p.15)
Figura 16 - Estrutura química do ácido
ent-3-beta-hidroxi-16-caruren-19-óico (X.laevigata)
Figura 17 - Estrutura química do ácido ent-16-cauren-19-óico (X.
laevigata) (p.15)
Figura 18 - ent-atisano-7alfa-acetoxi-16alfa-ol
(X.langsdorffiana) (p.15)
Figura 19 - ent-atisano-7-oxo-16alfa-ol (X.langsdorffiana)
(p.15)
Figura 20 - Estrutura química do α-pineno (1) , terpin-4-ol (2)
, β-pineno (3) e Δ-3-careno (4)
(X.aromatica e X.aethiopica) (p.16)
Figura 21 – Quercetina-3-α-raminosídeo (X. emarginata e X.
langsdorffiana) (p.17)
Figura 22 – Dicentrinona (X. championii) (p.19)
Figura 23 – Buxifolina (X buxifolia) (p.19)
Figura 24 – Nornantenina (X. danguyella) (p.19)
Figura 25 – Danguielina (X. danguyella) (p.19)
-
xi
Figura 26 – o-metilmoscatolina (X. Championii) (p.19)
Figura 27 - Cromatografia em Camada Delgada das frações obtidas
do extrato hexânico. Fase
estacionária: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY –
NAGEL). Eluente:
Acetato de Etila: Hexano (50%). Revelador: NP/PEG em UV 365nm.
(p.28)
Figura 28 – Cromatograma da fração H27 obtido por CG-EM.
(p.29)
Figura 29 – Espectro de massas da substância 1. (p.30)
Figura 30 – Espectro de massas da substância 2. (p.31)
Figura 31 – Espectro de massas da substância 3. (p.31)
Figura 32 – Campesterol (p.33)
Figura 33 – Estigmaesterol (p.34)
Figura 34 - γ-sitoesterol (p.35)
Figura 35 - Cromatograma obtido por LC-MS da partição em acetato
das folhas de Xylopia
ochrantha. (p.37)
Figura 36 – Identificação dos íons moleculares [M-H] 447 e 593 e
cromatograma LC-MS do
extrato etanólico bruto foliar de Xylopia ochrantha. (p.37)
Figura 37 – Análise SIM do íon molecular [M-H] 447, relacionado
à estrutura da quercitrina.
Figura 38 - Análise SIM do íon molecular [M-H] 593, relacionado
à estrutura da luteolina-7-
O-rutinosídeo. (p.38)
Figura 39 – Espectro de absorção na região de UV-Vis do
flavonoide majoritário presente na
partição acetato foliar de Xylopia ochrantha em LC-DAD.
(p.39)
Figura 40 – Espectro de absorção na região de UV-Vis do
flavonoide presente no extrato
etanólico bruto foliar de Xylopia ochrantha em LC-DAD.
(p.39)
Figura 41 – Cromatograma obtido por CG-MS do óleo essencial de
frutos de Xylopia
ochrantha (Mart.) (p.41)
Figura 42 – Cromatograma obtido por CG-MS do óleo essencial das
folhas de Xylopia
ochrantha (Mart.). (p.41)
Figura 43 – Estrutura química do alfa-bergamoteno (p.44)
Figura 44 - Estrutura química do alfa-bisaboleno (p.44)
Figura 45 - Estrutura química do alfa-copaeno (p.44)
-
xii
Figura 46 - Estrutura química do alfa-felandreno (p.44)
Figura 47 - Estrutura química do alfa-humuleno (p.44)
Figura 48 - Estrutura química do alfa-pineno (p.44)
Figura 49 - Estrutura química do alfa-terpineno (p.44)
Figura 50 - Estrutura química do alfa-terpineol (p.44)
Figura 51 – Estrutura química do alfa-tujeno (p.44)
Figura 52 - Estrutura química do beta-bisaboleno (p.44)
Figura 53 - Estrutura química do beta-cubebeno (p.44)
Figura 54 – Estrutura química do beta-elemeno (p.44)
Figura 55 – Estrutura química do beta-felandreno (p.45)
Figura 56 – Estrutura química do beta-ocimeno (E) (p.44)
Figura 57 – Estrutura química do beta-ocimeno (Z) (p.45)
Figura 58 – Estrutura química do beta-pineno (p.45)
Figura 59 – Estrutura química do biciclogermano (p.45)
Figura 60 - Estrutura química do cariofileno (p.45)
Figura 61 – Estrutura química do cipereno (p.45)
Figura 62 – Estrutura química do delta-elemeno (p.45)
Figura 63 – Estrutura química do delta-elemeno (p.45)
Figura 64 – Estrutura química do espatulenol (p.45)
Figura 65 – Estrutura química do eucaliptol (p.45)
Figura 66 - Estrutura química do gama-muuroleno (p.45)
Figura 67 - Estrutura química do gama-terpineno (p.45)
Figura 68 - Estrutura química do germacreno b (p.45)
Figura 69 - Estrutura química do germacreno d (p.45)
Figura 70 – Estrutura química do linalool (p.45)
Figura 71 - Estrutura química do mirceno (p.45)
Figura 72 - Estrutura química do orto-cimeno (p.46)
-
xiii
Figura 73 - Estrutura química do óxido de cariofileno (p.46)
Figura 74 - Estrutura química do sabineno (p.46)
Figura 75 – Estrutura química do sesquisabineno (p.46)
Figura 76 – Estrutura química do silvestreno (p.46)
Figura 77 - Estrutura química do terpinoleno (p.46)
Figura 78 - Estrutura química do terpinen-4-ol (p.46)
Figura 79 – Curva Padrão de Ácido Gálico preparada para o método
de doseamento de
fenólicos totais. (p.49)
Figura 80 - Avaliação da viabilidade e proliferação celular de
células AtT20 na presença do
extrato etanólico de Xylopia ochrantha. (p.51)
Figura 81 – Avaliação da viabilidade e proliferação celular de
células AtT20 na presença do
óleo essencial das folhas de Xylopia ochrantha. (p.51)
-
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Fragmentos, intensidades relativas e íon molecular
dos fitoesteróis encontrados
em Xylopia ochrantha. (p.32)
Tabela 2 - Constituintes químicos do óleo essencial de frutos de
Xylopia ochrantha (Mart.)
(p.42)
Tabela 3 - Constituintes químicos do óleo essencial das folhas
de Xylopia ochrantha (Mart.).
(p.43)
Tabela 4 - Rendimento do óleo essencial foliar em diversas
espécies do gênero Xylopia.
(p.43)
Tabela 5 – Resultado da Avaliação Antimicrobiana do Óléo
Essencial e Extratos de Xylopia
ochrantha frente S.aureus. As lacunas em amarelo indicam
inibição do crescimento
bacteriano. Controle positivo: Vancomicina. A análise foi
realizada em duplicata (colunas 1 a
5 e 7 a 11). (p.47)
Tabela 6 - Espécies e cepas bacterianas testadas pelo método de
diluição em placa e seus
resultados. Extrato diclorometânico (DCM), extrato em acetato de
etila (AE) e óleo essencial
(OE) demonstraram atividade. (p.48)
Tabela 7 - Valor ORAC de extratos e óleo essencial das folhas de
Xylopia ochrantha (Mart.).
(p.49)
-
xv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AI - Índice Aritmético
ATCC – American Type Culture Colection
AtT20 – Linhagem de Tumor Hipofisário Murino
µL – microlitro
CCF - Cromatografia em Camada Fina
CG - Cromatógrafo em Fase Gasosa
CG-DIC – Cromatógrafo a Gás acoplado a Detector por Ionização em
Chama
CG-EM – Cromatografia com Fase Gasosa acoplada a Espectrometria
de Massas
CLAE-DAD-EM – Cromatografia com Fase Líquida de Alta Performance
acoplada a Diodo
de Arranjo Eletrônico e Espectrometria de Massas
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO – Dimetilsulfóxido
ELISA – Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EM - Espectrometria de Massas
eV- elétron volt
mg- miligrama
min. - minuto
mL - mililitro
m/z - massa/carga
-
xvi
NIST- National Institute of Standards and Technology
nm – nanômetro
NP/PEG – difenilborioxetilamina/polietilenoglicol
PBS – Phosphate Buffer Saline
Rf - Fator de Retenção
TE- Trolox Equivalent
Trolox – ácido
6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico
UV- Ultravioleta
-
xvii
RESUMO
ALBUQUERQUE, Ricardo Diego Duarte Galhardo de. Estudo
fitoquímico e biológico de
folhas da espécie vegetal Xylopia ochrantha (Mart.). Niterói,
2013. Dissertação de
Mestrado (Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde),
Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal Fluminense.
Xylopia ochrantha (Mart.) é uma espécie endêmica do Brasil,
ocorrendo principalmente na
Floresta de Restinga localizada ao longo da costa brasileira. Os
estudos químico e biológico
presentes neste trabalho são os primeiros relacionados a esta
espécie. No estudo fitoquímico,
os óleos essenciais das folhas e frutos foram obtidos através de
extração por hidrodestilação e
analisados por GC-MS e GC-FID. No total, foram identificadas 36
substâncias, das quais,
germacreno D, biciclogermacreno e silvestreno (folhas),
α-felandreno, β-felandreno e
sabineno (frutos) foram os principais componentes identificados.
Os fitoesterois campesterol,
estigmaesterol e gama-sitosterol, provenientes do extrato
hexânico foliar, além dos
flavonoides majoritários quercitrina e
luteolina-7-O-rutinosídeo, encontrados no extrato de
acetato de etila foliar, foram identificados através de análises
em CG-EM e CLAE-DAD-EM.
Análises realizadas em CCF demonstraram a presença de terpenos,
alcaloides e cumarinas,
sendo estas, portanto, classes de substâncias representativas da
espécie. A atividade
antioxidante do óleo essencial e seis extratos das folhas de
Xylopia ochrantha foram avaliadas
utilizando o método ORAC, com valores na faixa entre 0,42 ± 0,01
e 1,85 ± 0,03 mmolTE / g.
A atividade antimicrobiana do óleo essencial e extratos de
Xylopia ochrantha também
puderam ser analizados através dos métodos de diluição em placas
e microdiluição em caldo.
O óleo essencial e as partições diclorometânica e de acetato de
etila das folhas de Xylopia
ochrantha apresentaram atividade contra diferentes cepas de
Staphylococcus aureus, além de
serem ativos também contra Enterococcus faecalis, Staphylococcus
haemolyticcus,
Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli, Staphylococcus
capitis e Staphylococcus hominis. O extrato diclorometâncio
apresentou um MIC de 128
mcg/mL contra ORSA sanguíneo. Nas demais análises, os extratos
ativos apresentaram MIC
de 512 mcg/mL. O extrato etanólico demonstrou atividade
citotóxica contra células de tumor
hipofisiário (AtT20), sendo possível observar uma diminuição
significativa da proliferação e
viabilidade celular dentro de 24 horas.
Palavras-chave: Xylopia ochrantha, óleo essencial, fitoesteróis,
flavonoides, antioxidante,
antimicrobiano, Staphylococcus aureus, citotoxidade.
-
xviii
ABSTRACT
ALBUQUERQUE, Ricardo Diego Duarte Galhardo de. Phytochemical and
Biological studies of
leaves from vegetal species Xylopia ochrantha (Mart.). Niterói,
2013. Master’s dissertation (Master
in Applied Sciences to Health Products), School of Pharmacy,
Fluminense Federal University.
Xylopia ochrantha (Mart.) is a endemic species from Brazil,
occurring mainly in the Restinga
Forest located along the Brazilian coast. The chemical and
biological studies in this work are
the first related to this species. In phytochemical study, the
extraction of essential oils from
leaves and fruits of this species was performed by
hydrodistillation and analyzed by GC-
MS/GC-FID. In total, 36 compounds were identified, of which
germacrene D,
bicyclogermacrene, silvestrene (leaves), α-phellandrene,
β-phellandrene and sabinene (fruits)
were the main components. The phytosterols campesterol,
stigmasterol and gamma-sitosterol,
from the foliar hexane extract, besides the majority flavonoids
quercitrin and luteolin-7-O-
rutinoside, found in the foliar ethyl acetate extract, were
identified through analysis on GC-
MS and HPLC-DAD-MS. Analyzes made in TLC showed the presence of
terpenes, alkaloids
and coumarins, which are also representative substances of the
species. Regarding the study
of biological species, the antioxidant activity was held to six
extracts and essential oil from
the leaves of Xylopia ochrantha using the ORAC method, with
values in the range between
0.42 ± 0.01 and 1.85 ± 0.03 mmolTE / g. The antimicrobial
activity of essential oil and
extracts of Xylopia ochrantha could be analyzed by plate
dilution and broth microdilution
methods. The essential oil and extracts of dichloromethane and
ethyl acetate from leaves of
Xylopia ochrantha showed activity against different strains of
Staphylococcus aureus, and
were also active against Enterococcus faecalis, Staphylococcus
haemolyticcus,
Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli, Staphylococcus
capitis and Staphylococcus hominis. Dichloromethane extract
showed a MIC of 128 mcg / mL
against ORSA blood. In other analysis, active extracts showed
MIC of 512 mcg / mL. Ethanol
extract showed cytotoxic activity against tumor cells of the
pituitary (AtT20), where was
possible to observe a significant decrease in cell viability and
proliferation within 24 hours.
Keywords: Xylopia ochrantha, essential oil, phytosterols,
flavonoids, antioxidant,
antimicrobial, Staphylococcus aureus, cytotoxicity.
-
xix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 1
2. OBJETIVOS 6
2.1 Objetivos gerais 6
2.2 Objetivos específicos 6
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 7
3.1. História dos produtos naturais 7
3.2. Floresta de Restinga e seus recursos vegetais 9
3.2.1. Restinga de Jurubatiba (RJ) 9
3.3. O gênero Xylopia 9
3.3.1. Xylopia aethiopica 10
3.3.2. Xylopia parviflora 11
3.3.3. Xylopia aromatica 12
3.3.4. Xylopia brasiliensis 12
3.3.5. Xylopia discreta 13
3.4. Principais grupos de metabólitos do gênero Xylopia 13
3.4.1. Metabólitos primários e secundários 13
3.4.2. Biossíntese de metabólitos secundários 13
3.4.3. Terpenoides 14
3.4.4. Flavonóides 16
3.4.5. Alcalóides 17
4. METODOLOGIA 20
4.1. Material vegetal 20
-
xx
4.2. Extratos e partições 20
4.3. Extração do óleo essencial 21
4.4. Determinação estrutural 21
4.5. Avaliação de atividade biológica 22
4.5.1. Atividade antimicrobiana 22
4.5.1.1. Método Qualitativo 23
4.5.1.2. Teste da Microdiluiçpão em caldo e Determinação da
concentração mínima inibitória
(CMI) 23
4.5.1.3. Método da diluição em placa 24
4.5.2. Atividade antioxidante 24
4.5.2.1. Capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC)
24
4.5.2.2. Doseamento dos fenolicos totais 25
4.5.3. Atividade citotóxica 25
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 27
5.1. Obtenção do extrato etanólico bruto, partições e resíduo
aquoso 27
5.2. Separação e identificação de substâncias majoritárias
27
5.2.1. Identificação de fitoesteróis por CG-EM 29
5.2.2 Análise do conteúdo flavonoídico por LC-MS e LC-DAD 36
5.3. Composição química dos óleos essencias de folhas e frutos
de X. ochrantha 40
5.4. Atividade antimicrobiana 46
5.5. Atividade antioxidante 48
5.6. Atividade citotóxica 51
6. CONCLUSÃO 53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54
ANEXO 1 – ARTIGO SUBMETIDO 72
-
1
1. INTRODUÇÃO
A necessidade da obtenção de produtos naturais com fins
farmacológicos remonta
desde o início da formação das civilizações, onde os primeiros
achados arqueológicos são
datados de mais de 60 mil anos, ainda na era dos neandertais. Ao
longo dos séculos, a
utilização de plantas medicinais para a obtenção de extratos,
elixires, óleos essenciais e outros
produtos, foi amplamente inserida na medicina popular de
diversos povos pelo mundo, ao
passo que, as técnicas utilizadas para a obtenção destes
produtos foram gradativamente
otimizadas. Com o advento do desenvolvimento da química, já no
século XIX, foram isoladas
as primeiras substâncias oriundas de produtos naturais, surgindo
então, uma revolução na
síntese de produtos farmacológicos. (Bevilacqua, 2010).
O avanço da química também permitiu o desenvolvimento da
produção de substâncias
químicas sintéticas, que rapidamente encontraram espaço no
mercado, levando a um
abandono gradual da utilização de produtos naturais, embora esta
jamais tenha deixado de ser
uma alternativa bastante usual em terapias medicamentosas e na
produção de fármacos,
principalmente medicamentos anticancerígenos e anti-infecciosos
(McChesney et. al., 2007).
Somadas a isso, as novas tendências globais de utilização de
fitoterápicos e aproveitamento da
biodiversidade, a necessidade da obtenção de novas drogas, e
ainda, o desenvolvimento de
novas técnicas químicas e biológicas - como a otimização de
metodologias de separação e
identificação de substâncias, além de plataformas de bioensaios
- a pesquisa no âmbito dos
produtos naturais, vem retomando uma posição proeminente no
desenvolvimento de fármacos
(Bevilacqua, 2010; McChesney et. al., 2007).
A utilização de produtos naturais no Brasil é documentada desde
a chegada dos
portugueses, sendo descrito o uso de plantas pelos habitantes
indígenas, com diversas
finalidades, desde a obtenção de corantes e venenos utilizados
para caça, até a utilização de
drogas vegetais para fins curativos ou paliativos. Devido à
riqueza de complexos vegetais ao
longo do território brasileiro, o país vem sendo alvo de
interesse científico para pesquisa de
novas substâncias de origem natural, visto que há um aumento
significante de publicações
recentes de pesquisas sobre espécies vegetais consideradas
nacionais (Bevilacqua, 2010).
Um importante exemplo desses ricos complexos vegetais são as
restingas, que situadas
entre a Mata Atlântica e o mar, ocupam os solos arenosos de
origem marinha ao longo do
-
2
litoral brasileiro. Estes solos foram formados através de uma
série de regressões e
transgressões marinhas ocorridas durante o período Quaternário,
onde cordões arenosos foram
depositados paralelos ao mar, delineando as planícies costeiras
(Rizzini et. al, 1997; Scarano
et. al, 2002; Suguio & Tessler 1984).
O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (PNRJ) está
localizado no litoral norte
do estado do Rio de Janeiro (Brasil), abrangendo os municípios
de Macaé, Quissamã e
Carapebus. Está disposto em uma planície arenosa com vegetação
distribuída em moitas, além
de apresentar mata periodicamente inundável (Araújo et al.
1998). Entre as principais famílias
botânicas presentes na restinga de Jurubatiba, podemos citar
Myrtaceae, Clusiaceae e
Rubiaceae, embora outras famílias também sejam encontradas
significativamente, como
Asteraceae, Bromeliaceae e Annonaceae (Santos et al. 2009).
Xylopia L. pertence a família Annonaceae e inclui cerca de 150
espécies entre árvores e
arvoretas aromáticas, das quais 40 espécies são encontradas na
América Tropical (Costa et al.,
2011). As espécies mais amplamente estudadas, tais como X.
aethiopica, X. parviflora e X.
brasiliensis, apresentam-se na literatura científica como
possuindo diversas classes de
substâncias, principalmente ácidos graxos, esteróides,
saponinas, taninos, glicosídeos
cianogênicos, além de sesquiterpenos e diterpenóides, alcalóides
e acetogeninas. Muitas
dessas substâncias demonstraram ser responsáveis por diferentes
atividades farmacológicas
encontradas nesse gênero, entre elas, propriedades analgésica,
antiinflamatória, antibacteriana,
antifúngica, sedativa, antiparasitária, antitumoral, entre
outras (Colman-Saizarbitoria et. al.
1994a; Colman-Saizarbitoria et. al. 1994b; Ezekwesili et. al.
2010; Nishiyama et. al. 2006).
Uma das representantes desta família na restinga de Jurubatiba é
a espécie Xylopia ochrantha
(Mart.), popularmente conhecida como “imbiú-prego”, sendo
utilizada pela população local
apenas para a fabricação de cabos de ferramentas (Figura 1 e 2).
Esta espécie vegetal é uma
arvoreta de cerca de 4 metros de altura e está presente nas
formações vegetais arbustivas
abertas de Clusia e na mata periodicamente inundada da Restinga
de Jurubatiba (Santos et.
al., 2009). Segundo um estudo botânico de espécies da família
Annonaceae de Restingas
Fluminenses, as demais características botânicas da espécie são
as seguintes: pecíolo marrom
com tamanho de 6 mm de comprimento, lâminas foliares de 6 x 10 a
2,5 x 4 cm, cartáceas a
subcoriáceas, elípticas, verdes discolores, glabras em ambas as
faces, brilhantes na adaxial,
base aguda, ápice acuminado, acúmem de 5 a 10 cm de comprimento,
nervura primária
impressa na face adaxial e proeminente na abaxial; flores em
inflorescência caulinares, botão
piramidal 1 a 2 x 1 cm, pedicelo com 2 a 5 mm de comprimento, 1
a 4 brácteas, sépalas e
-
3
pétalas densamente cobertas por tricomas ferrugíneos adpressos,
sépalas de 5 x 8 mm, pétalas
do ciclo externo de 17 – 20 x 20 mm, pétalas do ciclo interno de
15 x 7 mm, estames com 1 a
2 mm de comprimento; fruto apocárpico, carpídios, de 15 – 40 x 6
x 10 mm, deiscentes,
densamente cobertos por tricomas ferrugíneos adpressos, com 4 a
7 sementes (Lobão et al.,
2005).
Figura 1 – Árvore de Xylopia ochrantha
O potencial efeito antioxidante de substâncias encontradas no
reino vegetal, como é o
caso dos flavonoides e alguns terpenoides, vem sendo apontado
como um dos fatores
responsáveis no tratamento de diversas patologias que possuem
como origem a degradação de
estruturas celulares causada por agentes oxidantes. (Simões
& Spitzer, 2004; Zuanazzi &
Montanha, 2004). Alguns estudos toxicológicos demonstraram a
relação entre o mecanismo
de estresse oxidativo e o desenvolvimento de retinopatia
diabética, aterosclerose e patologias
neurodegenerativas, como o Mal de Alzheimer, responsáveis pela
diminuição progressiva da
qualidade de vida dos pacientes, e que são frequentemente fatais
em um curto período de
tempo. A avaliação da atividade antioxidante de produtos de
origem natural e estudos que
avaliam a sobrevida e proliferação de células neuroniais são de
grande importância para o
tratamento destas patologias, que atualmente encontram apenas
medidas paliativas, e não
curativas. (Vidya et. al., 2011; Al-Aly, 2011; Rojas et. al.,
2006; Citron, 2010). A presença
majoritária de flavonoides e terpenoides, substâncias
relacionadas com atividade antioxidante,
-
4
para diversas espécies do gênero Xylopia é um indicativo do
possível uso das mesmas no
tratamento de patologias relacionadas a efeitos oxidativos
(Costa et. al., 2011; Diderot et.
al.,2005; Andrade et. al., 2004; Moreira et. al., 2003a; idem,
2006; Santos et. al., 2011;
Moreira et. al., 2003b; Silva et. al.,2009).
A hipófise é uma glândula responsável pela secreção de hormônios
que regulam
funções de essencial importância em nosso organismo, como por
exemplo, o crescimento, o
ciclo menstrual e o controle diurético. O desenvolvimento de
adenomas hipofisários reflete no
desempenho destas funções, aumentando ou diminuindo-as, sendo
que vários mecanismos
contribuem no crescimento deste tipo de tumor, incluindo a
expressão do gene de
transformação de tumor hipofisário (PTTG) e angiogênese.
(Santos-Ortiga et. al., 2010). A
necessidade do tratamento para este tipo de tumor, visto que, os
medicamentos atualmente
existentes para este fim causam efeitos colaterais indesejados,
ou ainda, sendo necessária a
realização de procedimento cirúrgico em diversos casos, implica
na continuação da busca por
alternativas que possam tratar a patologia sem que haja uma
perda significativa da qualidade
de vida dos pacientes. (Merza, 2003; Katznelson, 2003; Wand,
2003). Algumas espécies do
gênero Xylopia demonstraram possuir atividade contra células
tumorais, sendo este fato
frequentemente relacionado com a presença de acetogeninas,
abundantes na família
Annonaceae (Colman-Saizabitorria et .al., 1994a; idem, 1995;
Alfonso et. al., 1996).
O sucesso do tratamento de infecções bacterianas por
antibióticos desde a descoberta
da penicilina por Fleming, em 1928, vem sofrendo um declínio no
que se concerne à eficácia
destes medicamentos, devido ao uso indiscriminado e surgimento
de novas cepas resistentes
aos antibióticos comumente utilizados. Algumas espécies
bacterianas causadoras de
conhecidas patologias em seres humanos, tais como Staphylococcus
aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Enterococcus faecalis, entre outras, apresentam
cepas com inúmeros fatores de
resistência contra antimicrobianos, responsáveis pelo surgimento
de infecções hospitalares,
ocorrência de infecções generalizadas, frequentemente levando ao
óbito de pacientes
internados. Deste modo, a busca por novas alternativas
medicamentosas para o tratamento
destas doenças é algo estritamente necessário nos dias atuais,
visando contornar um grande
problema de saúde pública, que por sinal, existe em âmbito
mundial (Sangappa & Padma,
2012; Remy et al., 2012; Master et al., 2012; Huo et al., 2010).
Em estudos envolvendo
avaliação de atividade antimicrobiana com espécies do gênero
Xylopia foi relatado o poder
inibitório contra diversas espécies bacterianas como
Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Kleibsiella pneumoniae e Bacillus subtilis (Oloyede
& Aduramigba-Modupe,
-
5
2011; Fleischer et al., 2008; Ilusanya et al., 2012).
Figura 2 – Folhas e fruto de Xylopia ochrantha
A identificação e quantificação de substâncias vegetais nos dias
atuais estão cada vez
mais relacionadas ao uso de técnicas cromatográficas hifenadas
como é o caso da
cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS)
e da cromatografia gasosa
acoplada a espectrometria de massa (CG-EM), esta última
especialmente utilizada para a
detecção de componentes com característica apolar como derivados
do extrato hexânico ou
componentes de óleos voláteis. Para a detecção de componentes de
característica polar, como
os flavonoides, o LC-MS é uma poderosa ferramenta analítica que
explora a capacidade
elevada de resolução da cromatografia líquida juntamente com a
confiabilidade e acurácia da
identificação de moléculas por espectrometria de massa. A
utilização desta técnica é
compatível ainda com outras áreas da ciência como a química
orgânica e analítica,
bioquímica, toxicologia e ciências forenses (Colegate &
Molyneux, 2008).
-
6
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Realizar o estudo fitoquímico e avaliação do potencial biológico
das folhas da espécie
vegetal Xylopia ochrantha (Mart.).
2.2 Objetivos específicos
- Identificar a estrutura química dos constituintes químicos das
folhas de Xylopia
ochrantha através de diferentes técnicas cromatográficas e
espectroscópicas;
- Avaliar as atividades antimicrobiana, antioxidante e
citotóxica dos extratos e óleo
essencial obtido das folhas de Xylopia ochrantha
- Submeter, ao menos, um manuscrito para revista com conceito
mínimo B1 CAPES
Interdisciplinar, abrangendo conteúdo relacionado ao trabalho
realizado nesta dissertação.
-
7
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. História dos produtos naturais
A utilização de plantas no tratamento de doenças é considerada
tão antiga quanto a
própria humanidade, sendo este costume presente em todas as
civilizações existentes. Além
de outras utilidades, como o uso para fabricação de ferramentas,
confecção de roupas, armas
de caça, e ainda, o uso alimentício, o ser humano percebeu a
capacidade de cura através de
vegetais, bem como o poder nocivo, ou de produzir alucinações,
causados por algumas
espécies (Bevilacqua, 2010).
A relação do homem com o poder curativo das plantas foi por um
grande período
baseado em observações, e quase sempre, associada a mecanismos
espirituais. A produção de
elixires, tinturas e outros derivados do processo de destilação,
já era desenvolvida desde o
século XI, inicialmente pelos egípcios, sendo que estes produtos
eram frequentemente
relacionados com propriedades espirituais das plantas de onde
foram extraídos. Com a
revolução da ciência na era renascentista, os estudos com
produtos naturais passaram a tomar
uma diretriz mais baseada em experimentações e investigações
médicas (Beltran, 1996).
As primeiras descobertas arqueológicas mostram o uso de diversas
plantas pelos
neandertais, entre elas, a alteia (Althaea officinalis), há mais
de 60 mil anos, na região onde
hoje se situa o Iraque. Mais tardiamente, por volta do ano 4000
a.C., os sumérios e babilônios
utilizavam espécies como o tomilho, mostarda, canela, alho e
folhas de sene para fins
farmacológicos. No Antigo Egito, no século XVI a.C., já eram
utilizadas cerca de 700 drogas,
incluindo a babosa, o absinto, a hortelã, a mirra e o cânhamo
(Bevilacqua, 2010). Na China,
Índia e Grécia antigas, também existem relatos da utilização de
compêndios que descrevem
diversas plantas e suas respectivas finalidades curativas
(Beltran, 1996).
No século II a.C., o médico grego Galeno, foi o pioneiro em
experimentos com
animais, desenvolvendo as primeiras teorias médicas baseadas em
experimentações
científicas, revolucionando o estudo da medicina, e sendo
importante posteriormente para a
compreensão da atuação dos medicamentos no organismo humano.
Após uma relativa
paralisação no desenvolvimento de estudos médicos e sobre
plantas medicinais, devido ao
controle do conhecimento médico pela Igreja, o Renascimento
proporcionou um avanço no
-
8
que se refere a estudos científicos, se iniciando os primeiros
estudos feitos com o corpo
humano, onde se descrevia com precisão a anatomia humana. Nesta
época também se
destacou a figura de Paracelso, que foi o primeiro a defender a
importância da química na
preparação de medicamentos, além de ser considerado o primeiro a
propor a cura através de
princípios homeopáticos (Bevilacqua, 2010).
No Brasil, a utilização de produtos naturais pelos índios foi
descrita desde a vinda dos
portugueses em 1500, onde diversas espécies vegetais eram
citadas, como é o exemplo da
Bixa orellana (urucum), Carapa guianensis (andiroba) e
Chlorophora tinctoria (tatajuba),
utilizadas como produtoras de corantes, sendo que a última
produz a substância morina, ainda
hoje, largamente utilizada como reveladora de açucares em
cromatografia de camada delgada.
Outras espécies, como é o caso da Hymeneae coubaril (jatobá),
produtora de resina, e
Strychnos guianensis, que dá origem ao curare, também foram
bastante procuradas por
exploradores europeus, ainda antes do século XVIII (Pinto,
1995).
No início do século XIX, com o desenvolvimento da química, foram
isoladas as
primeiras substâncias ativas oriundas de produtos naturais,
entre elas, a morfina, um alcaloide
proveniente da papoula (Papaver somniferum), considerada uma
planta com propriedades
anestésicas e soníferas. O avanço do conhecimento químico e de
técnicas laboratoriais
permitiu o surgimento das indústrias farmacêuticas, que
utilizavam os constituintes básicos
das drogas naturais como matéria-prima para a produção de
medicamentos, ou como
precursores de medicamentos mais potentes.
O desenvolvimento da química orgânica contribuiu para o aumento
da produção de
medicamentos baseados em substâncias sintéticas, que
gradativamente, ocuparam o lugar dos
medicamentos de origem natural, devido à diminuição do custo e
de quantidade de matéria-
prima utilizada para os testes e atendimento da demanda
(Bevilacqua, 2010). No entanto,
muitos medicamentos anticancerígenos e antiinfecciosos têm sua
origem em substâncias
obtidas de produtos naturais, como é o caso do paclitaxel, um
agente anticancerígeno oriundo
da espécie Taxus brevifolia (McChesney et. al., 2007).
Com o aumento da procura de novos medicamentos para atender a
demanda
mercadológica, e outros fatores como a valorização da
biodiversidade e desenvolvimento de
metodologias químicas e de testes biológicos, os investimentos
em pesquisas para obtenção
de medicamentos baseados em produtos naturais estão atualmente
em ascensão, e cada vez
-
9
mais, sendo necessários para o desenvolvimento da indústria
farmacêutica (Bevilacqua,
2010).
3.2. Floresta de Restinga e seus recursos vegetais
Os sistemas de classificação dos diversos tipos de vegetação
presentes no Brasil
variam de acordo com a abordagem de cada autor, e na tentativa
da realização de uma
classificação universal, reunindo pontos de concordância entre
os autores, podemos dividir os
tipos de vegetação em seis sistemas de classificação:
fisionômico-ecológico, formações
pioneiras, de transição, relíquias, vegetação disjunta e
vegetação secundária (IBGE, 1992).
As restingas, classificadas como formações pioneiras, abrangem
comunidades
vegetais em contato direto com águas marinhas, como é o caso dos
gêneros Remirea e
Salicornia, bem como comunidades presentes em dunas, tendo como
exemplo de espécie
nativa o Schinus terebinthifolius, e também presentes em pontais
rochosos, caso de várias
espécies da família Bromeliaceae. As formações vegetais podem
ser classificadas em:
arbustivas abertas de Clusia, mata periodicamente inundada, mata
permanentemente
inundada, arbustiva aberta de Ericaceae, arbustiva de pós-praia,
arbustiva aberta de Palmae,
vegetação aquática, herbácea brejosa, mata de cordão arenoso,
halófila/psamófila reptante e
vegetação alterada (IBGE, 1992).
3.2.1. Restinga de Jurubatiba (RJ)
A restinga de Jurubatiba (Figura 3) abrange os municípios
fluminenses de Macaé,
Carapebus e Quissamã (Araújo et. al, 1998), onde segundo a
informação de um especialista
local, existe a ocorrência de 119 espécies utilizadas para
diversos fins, distribuídas em 100
gêneros e 49 famílias (Santos et al, 2009), embora existam de
maneira total, o registro de 618
espécies vasculares para o Parque Nacional da Restinga de
Jurubatiba (Araújo et. al, 2001).
As famílias mais representativas em número de espécies são a
Myrtaceae, Clusiaceae e
Rubiaceae, no entanto, algumas famílias também foram
consideradas muito importantes do
ponto de vista florístico e etnobotânico, como a Asteraceae,
Bromeliaceae e Fabiaceae. O uso
medicinal predominou em 45 espécies, sendo 29 destas utilizadas
exclusivamente com
-
10
propósitos medicinais. Em relação às formações vegetais da
restinga de Jurubatiba, as que
apresentaram maior número de espécies utilizadas medicinalmente
foram a arbustiva aberta
de Clusia e mata periodicamente inundada - formações onde é
encontrada a espécie Xylopia
ochrantha - além das formações arbustivas abertas de Ericaceae e
mata permanentemente
inundada (Santos et. al, 2009).
Figura 3 - Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Carapebus
- RJ)
3.3. O gênero Xylopia
Diversas espécies do gênero Xylopia tiveram sua composição
química e atividade
biológica investigadas por pesquisadores em várias regiões do
mundo, sendo que algumas
foram mais extensivamente estudadas, obtendo-se informações mais
detalhadas a respeito da
sua natureza química e ação farmacológica.
3.3.1. Xylopia aethiopica
A espécie X. aethiopica (Figura 4) é a mais amplamente estudada
e ocorre
principalmente na África subsaariana. A espécie demonstrou
variadas atividades biológicas,
dentre elas, reguladora de desordens inflamatórias e ação
analgésica. Seus extratos
apresentaram principalmente ácidos graxos, carboidratos,
glicosídeos cianogenéticos,
acetogeninas, taninos, saponinas e flavonoides (Ezekwesili et.
al., 2010; Colman-Saizabitorria
-
11
et. al., 1994b). Além disso, identificou-se nessa espécie a
atividade hipotensiva e
vasodilatadora relacionada aos diterpenóides caurênicos, que
atuam pela antagonização do
cálcio (Somova et. al., 2001). A ação antioxidante também foi
verificada experimentalmente,
por ação de monoterpenos presentes no óleo essencial de folhas,
frutos, caule e raiz, tendo
como um dos componentes principais o germacreno-D (Karioti
et.al., 2004). Outras
atividades interessantes também foram encontradas para esta
espécie, tais como, atividade
citotóxica, demonstrada pela ação de dois alcalóides
oxoaporfínicos - a oxofebina e a
liriodenina - além da inibição da trombina e prolil
endopeptidase, por ação de diterpenóides
como o ácido colavênico e ácido traquiloban-19-óico, sugerindo
que esses últimos podem ser
úteis no tratamento da trombose e da demência (Harrigan et. al.,
1994; Diderot et. al.,2005) e
atividade contra diversas espécies bacterianas (Oloyede &
Aduramigba-Modupe, 2011;
Fleischer et al., 2008; Ilusanya et al., 2012).
Figura 4 - Fruto de Xylopia aethiopica
3.3.2. Xylopia parviflora
A espécie X. parviflora (Figura 5) é originária do leste da
África e o decocto de suas
raízes é muito utilizado pelos povos da região para desordens
gástricas, cólicas menstruais e
enxaquecas. Os alcalóides oriundos do extrato metanólico da
casca demonstraram possuir
efeito nociceptivo, enquanto que, mais especificamente,
alcalóides do tipo isoquinolínico
presentes nas raízes e também nas cascas da árvore, demonstraram
atividade analgésica e
antiespasmódica. (Nishiyama et. al., 2006).
Figura 5 - Folhas e flores de Xylopia parviflora
-
12
3.3.3. Xylopia aromatica
O óleo essencial obtido de frutos da espécie Xylopia aromatica
(Figura 6) ao ter sua
composição investigada, mostrou a presença de β-felandreno,
p-cineno, β-mirceno,
majoritariamente, dentre outros compostos voláteis (Stashenko et
al., 2004). As acetogeninas
oriundas do extrato etanólico de cascas do caule demonstraram
atividade citotóxicas frente a
diversos tipos de células tumorais, principalmente pela inibição
da NADH-ubiquinase óxido-
redutase e da enzima NADH oxidase, sendo que algumas substâncias
ativas desta classe já
foram isoladas, como é o caso da venezenina, xilopeína, aromina
e aromacina. (Colman-
Saizabitorria et .al., 1994a; idem, 1995; Alfonso et. al.,
1996).
Figura 6 - Frutos de Xylopia aromática
3.3.4. Xylopia brasiliensis
Estudos realizados com a espécie Xylopia brasiliensis
demonstraram a atividade
antifúngica proveniente de terpenoides presentes no óleo volátil
oriundo das folhas, entre eles,
o espatulenol (Figura 7), sendo que outros compostos como
esteroides e alcaloides aporfíricos
também se encontram presentes em frutos e nas cascas do caule,
podendo estar relacionados
com atividade sedativa e analgésica, propriedades que são
descritas para a espécie na
medicina popular. (Moreira et. al., 2003, idem, 2005a)
Figura 7 - Árvore de Xylopia brasiliensis
-
13
3.3.5. Xylopia discreta
O óleo essencial e extratos obtidos de folhas e sementes de
Xylopia discreta
demonstraram atividades anti-leishmania e imunomodulatória.
Estas atividades foram
relacionadas ao aumento da atividade de macrófagos e indução da
produção de MCP-1,
possivelmente levando à diminuição da carga do parasita no
hospedeiro através do aumento
da produção de quimiocinas pró-inflamatórias (Lopes et. al.,
2009).
3.4. Principais grupos de metabólitos do gênero Xylopia
3.4.1. Metabólitos primários e secundários
Dá se o nome de metabolismo ao conjunto de reações químicas que
continuamente
ocorrem em uma célula, classificando-se como metabolismo
primário o conjunto de reações
participantes de processos essenciais à vida, sendo comuns aos
seres vivos, como é o exemplo
da glicólise e síntese de aminoácidos. O metabolismo secundário,
mais presente em vegetais e
microorganismos, embora também seja encontrado em vida animal, é
capaz de produzir,
transformar e acumular inúmeras substâncias não necessariamente
relacionadas de forma
direta à manutenção da vida do organismo produtor. Os
metabólitos secundários já foram
considerados por diversos autores como simplesmente produtos de
excreção vegetal,
entretanto, atualmente, sabe-se que muitas destas substâncias
estão diretamente envolvidas
com a adequação do seu produtor ao meio, como por exemplo, a
defesa contra herbívoros e
microorganismos, proteção contra raios UV, atração de
polinizadores ou animais dispersores
de sementes, entre outras. Alguns autores também citam o termo
metabolismo intermediário,
que descreve as várias reações químicas envolvidas na
transformação de moléculas de
nutrientes nas unidades constitutivas essenciais da célula.
(Santos, 2004).
3.4.2. Biossíntese de metabólitos secundários
Muitos metabólitos secundários demonstraram ter interessantes
atividades biológicas,
sendo já há algum tempo, objeto de estudo para descoberta de
novos fármacos. As vias do
-
14
metabolismo secundário se originam na via glicolítica, que
produz dois intermediários
principais: o ácido chiquímico e o acetato. A partir do ácido
chiquímico tem-se a formação
dos aminoácidos aromáticos, precursores da maioria dos
metabólitos secundários aromáticos,
sendo esta etapa conhecida como via do chiquimato. Os derivados
do acetato podem ser
classificados, segundo a via metabólica, como: provenientes da
via cíclica do ácido cítrico;
oriundos da via mevalonato; e produtos da condensação do
acetato, tendo como exemplo, os
glicosídeos cianogenéticos, saponinas e heterosídeos
cardiotônicos. Outros metabólitos
secundários são derivados da combinação de uma unidade de ácido
chiquímico e uma ou mais
unidades de acetato ou derivados deste, como é o caso das
antraquinonas, dos flavonoides e
dos taninos condensados (Santos, 2004).
3.4.3. Terpenoides
Os terpenoides constituem uma classe de substâncias cuja origem
biossintética deriva
de unidades de isopreno, que por sua vez, são originadas a
partir do ácido mevalônico. De
acordo com a quantidade de unidades isoprênicas, os terpenos
podem ser classificados em
isopreno (1 unidade), monoterpenoides (2), sesquiterpenoides
(3), diterpenoides (4),
sesterpenoides (5), triterpenoides (6), tetraterpenoides (8) ou
polisoprenoides (maior que 8
unidades). Esta classe de substância pode ser encontrada
preferencialmente como principal
constituinte de óleos voláteis e em extratos apolares, como o
hexânico ou diclorometânico.
(Simões & Spitzer, 2004). A identificação de óleos voláteis
pode ser feita através de
diferentes métodos, desde métodos cromatográficos de análise,
ressonância magnética
nuclear, até a análise por testes organolépticos, visto que os
óleos voláteis apresentam com
uma das mais evidentes características o odor.
Exemplos de terpenoides são o mirceno, linalol, geraniol,
cânfora, mentona, limoneno,
e mais especificamente dentro do gênero Xylopia (Figuras 8 a
19), o espatulenol (X. laevigata
e X. brasiliensis), os ácidos kovalênico, ent-kaur-16-em-19-óico
e traquiloban-19-óico (X.
aethiopica), o ent-kaur-16-en-19-ol e o ácido
ent-kaur-16-en-19-óico (X. cayennensis), as
emarginatinas 1 e 2 (X. emarginata), e o
ent-atisano-7-oxo-16-alfa-ol (X. langsdorffiana)
(Costa et. al., 2011; Diderot et. al.,2005; Andrade et. al.,
2004; Moreira et. al., 2003; idem,
2006; Santos et. al., 2011).
-
15
Figura 8 – Espatulenol (X.laevigata e X.brasiliensis) Figura 9 –
Ácido kovalênico (X.aethiopica)
Figura 10 – Ácido ent-kaur-16-en-19-óico (X.aethiopica) Figura
11 – Ácido traquiloban-19-óico (X.aethiopica)
Figura 12 - Ácido ent-kaur-16-en-19-óico (X.cayennensis) Figura
13 - ent-kaur-16-en-19-ol (X.cayennensis)
Figura 14 – Emarginatina 1 (X.emarginata) Figura 15 –
Emarginatina 2 (X.emarginata)
Figura 16 – Ácido ent-3-beta-hidroxi-16-caruren-19-óico
(X.laevigata) Figura 17 – Ácido ent-16-cauren-19-óico (X.
laevigata)
Figura 18 – ent-atisano-7alfa-acetoxi, 16alfa-ol
(X.langsdorffiana) Figura 19 – ent-atisano-7-oxo-16alfa-ol
(X.langsdorffiana)
-
16
Quanto a importância farmacológica, muitas propriedades são
estabelecidas a respeito
dos terpenoides, entre elas, ação carminativa, antiespasmódica,
ação estimulante gastro-
intestinal, secretolítica, estimulante do SNC, anestesia local,
atividade anti-inflamatória e anti-
séptica. (Simões & Spitzer, 2004). Algumas espécies do
gênero Xylopia são conhecidas como
produtoras de óleos voláteis de importância farmacológica, tendo
como alguns exemplos, a X.
aromatica e a X. aethiopica, que apresentam em seus óleos,
terpenoides como o 1,8-cineol,
terpinen-4-ol, β-felandreno, Δ-3-careno, α-pineno, β-pineno e
β-mirceno (Nguemtchouin et.
al., 2009; Kouninki et. al., 2007; Lago et. al., 2003).
1 2 3 4
Figura 20 - α-pineno (1) , terpin-4-ol (2) , β-pineno (3) e
Δ-3-careno (4) (X.aromatica e X.aethiopica)
3.4.4. Flavonoides
Os flavonoides constituem uma importante classe de polifenóis,
presentes em relativa
abundância entre os metabólitos secundários de vegetais, sendo
divididos em várias
subclasses: flavonas, flavonóis, antocianos e antocianinas,
chalconas, auronas, di-
hidroflavonoides, isoflavonoides, flavanas, leucoantocianidinas
e proantocianidinas,
neoflavonoides e biflavonoides. Também podem ser classificados
como agliconas ou
heterosídeos. As agliconas aparecem geralmente sob a forma de
cristais amarelos, sendo
normalmente solúveis em solventes orgânicos apolares, e por
possuírem caráter fenólico, em
soluções aquosas alcalinas, enquanto que os heterosídeos são
geralmente solúveis em água,
em álcool diluído, mas insolúveis nos solventes orgânicos
habituais. A caracterização pode
ser realizada diretamente no farmacógeno (histoquímica), ou em
extratos vegetais, por ensaios
cromáticos, cromatográficos, espectroscópicos ou fotométricos.
As antocianinas são
facilmente caracterizadas devido a sua coloração,
particularmente em flores e folhas
(Zuanazzi & Montanha, 2004).
-
17
Esta classe de substância possui inúmeras atividades biológicas,
incluindo atividade
antiviral, antioxidante, anti-inflamatória, antitumoral,
atividade sobre a permeabilidade capilar
e atividade hormonal (Zuanazzi & Montanha, 2004). As
espécies Xylopia emarginata e
Xylopia langsdorffiana são produtoras do flavonóide glicosilado
denominado quercetina-3-α-
ramnopiranosídeo (Figura 21) (Moreira et. al., 2003b; Silva et.
al.,2009).
Figura 21 – Quercetina-3-α-raminosídeo (X. emarginata e X.
langsdorffiana)
3.4.5. Alcaloides
Os alcaloides são definidos como compostos nitrogenados
farmacologicamente ativos
e são encontrados predominantemente nas Angiospermas. Em sua
maioria, possuem caráter
básico, tendo exceções como colchicina, piperina, oximas e
alguns sais quaternários. A
denominação alcaloide exclui compostos nitrogenados como aminas
simples, aminoácidos,
peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, porfirinas
e compostos com grupos nitro
e nitroso. Também pode-se utilizar a denominação alcaloides
verdadeiros, para alcaloides
contendo um átomo de nitrogênio em um anel heterocíclico,
protoalcaloides, para alcaloides
com átomo de nitrogênio não pertencente ao anel, e ainda,
pseudoalcaloides, para alcaloides
sem anéis e não-derivados de aminoácidos. Possuem grande
variedade estrutural, tal como no
caso dos terpenoides, sendo classificados de acordo com o
precursor biogenético:
a) Derivados da L-ornitina: pirrolidínicos, tropânicos,
pirrolizidínicos e
fenantroindolizidínicos.
b) Derivados da L-lisina: piperidínicos, quinolizidínicos e
indolizidínicos.
c) Derivados do ácido nicotínico: piridínicos.
d) Derivados dos policetídeos: piperidínicos e lactamas
policetídicas.
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18
e) Derivados do isopreno: monoterpênicos, sesquiterpênicos,
diterpênicos e triterpênicos.
f) Derivados do ácido antranílico: quinolínicos e
quinazolínicos.
g) Derivados do ácido antranílico: acridínicos.
h) Derivados do L-triptofano: indóis simples, beta-carbolinas,
indol-monoterpênicos,
quinolínicos, pirroloindólicos e ergolinas.
i) Derivados da L-fenilalanina: feniletilaminas.
j) Derivados da L-tirosina: feniletilaminas,
tetraidroisoquinolínicos,
benzilisoquinolínicos, aporfínicos, aristolactamas, morfinanos,
bisbenzilisoquinolínicos,
protoberberinas, isoquinoleínicos-monoterpênicos, betalaínas,
benzilisoquinolinas e
fenetilisoquinolinas.
k) Derivados da L-histidina: imidazólicos.
l) Derivados de vários aminoácidos: ciclopeptídeos.
m) Derivados da purina: xantinas.
Devido a variedade estrutural dos alcaloides, são utilizados
diversos métodos de
detecção específicos, sendo que de maneira geral, com exceção
dos alcaloides contendo
nitrogênio quaternário, são extraídos através de reações
ácido-base.
A função dos alcaloides nos vegetais ainda é objeto de estudo,
sendo que algumas
hipóteses foram formuladas, como proteção contra predadores, por
causa do sabor amargo,
reserva de nitrogênio, hormônios reguladores de crescimento, e
proteção contra raios UV,
devido a presença de núcleos aromáticos.
Várias espécies do gênero Xylopia são produtoras de diversos
grupos de alcaloides
(Figuras 22 a 26), entre eles, o-metilmoscatolina e dicentrinona
(X. championii), discretamina
(X. langsdorffiana), buxifolina (X. buxifolia), nornantenina (X.
danguyella), deidroxilopina e
deidroaporfina, alcalóides isoquinolínicos (X. vieillardi), e a
danguielina, um alcalóide
aporfínico isolado de X. danguyella (Wueratine et. al., 1996;
Silva et. al., 2009; Jossang et.
al., 1991; Hocquemiller et. al., 1981).
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19
A variedade estrutural dos alcaloides implica na diversidade de
atividades
farmacológicas inerentes a esta classe, entre elas, ação
repelente de herbívoros (alcaloides
pirrolizidínicos), atividade emética (emetina),
anti-hipertensiva (reserpina), antimalárica
(quinina), antitussígena (codeína), estimulante do SNC
(cafeína), miorrelaxante (tubocurarina)
anticolinérgicos (atropina), entre outros (Henriques et. al.,
2004).
Figura 22 – Dicentrinona (X. championii) Figura 23 – Buxifolina
(X buxifolia) Figura 24 – Nornantenina (X. danguyella)
Figura 25 – Danguielina (X. danguyella) Figura 26 –
o-metilmoscatolina (X. championii)
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20
4. METODOLOGIA
4.1. Material Vegetal
Folhas (3600 g) e frutos (200 g) de X. ochrantha foram coletados
na Restinga de
Jurubatiba, localizada no município de Carapebus (22º13’5,08”S -
41º35’10,24”W), RJ,
Brasil nos dias 27 de outubro de 2010, 14 de julho de 2011
(folhas) e 3 de agosto de 2012
(frutos). A identificação da espécie vegetal foi realizada pelo
Prof. Dr. Marcelo Guerra Santos
da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. A herborização do
material vegetal foi realizada
e a exsicata foi depositada no Herbário da Faculdade de Formação
de Professores da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro, sob o registro de nº
14.500. As folhas foram
submetidas ao processo de secagem em estufa com ventilação
forçada, com temperatura de
aproximadamente 35°C durante o período de 48 horas.
4.2. Extratos e Partições
460 g de folhas secas foram moídas em moinho de facas e em
seguida submetidas à
extração por maceração a frio, em etanol 96%, durante um período
de 15 dias com agitação
diária. Após este período, o macerado foi filtrado e concentrado
em evaporador rotatório,
obtendo assim o extrato hidroetanólico das folhas, após
ressuspensão em etanol 90%. Em
seguida, este extrato foi submetido ao particionamento com
solventes de polaridade crescente
(hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol),
utilizando volume de 250 mL. As
partições hexânica, diclorometânica e de acetato de etila foram
submetidas aos processos de
purificação e identificação dos componentes majoritários através
de métodos cromatográficos
usuais com prévia revelação das principais classes de
substâncias em cromatofolhas utilizando
reagentes específicos.
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21
4.3. Extração do óleo essencial
Folhas e frutos frescos de X.ochrantha (1237 g e 200 g,
respectivamente) foram
colocados separadamente em um balão de 5L sob uma manta térmica,
e então, submetidas à
hidrodestilação durante 4 horas em um aparato do tipo Clevenger.
Ao final da extração, os
óleos essenciais foram coletados e acondicionados em geladeira
para posteriores análises
químicas e verificação de atividade biológica (antioxidante,
antimicrobiana e citotóxica).
4.4. Determinação Estrutural
As metodologias utilizadas na determinação estrutural de
substâncias foram realizadas
na Faculdade de Farmácia-UFF e Instituto de Tecnologia de
Fármacos – FIOCRUZ.
O óleo essencial e os esteroides foram analisados por
cromatografia acoplada a
espectrometria de massa (CG-EM), onde os espectros de massas
foram obtidos em um
aparelho Shimadzu QP 5000 utilizando ionização por impacto de
elétrons (70 eV; 1 scan/s)
sob as seguintes condições: temperatura do injetor: 260ºC (para
o óleo essencial) e 200ºC
(para fração hexânica); temperatura do detector: 290ºC (para
ambos); fase móvel: hélio; fluxo
médio de 1 mL/min (para ambos); injeção no modo split (1:40);
temperatura inicial do forno:
60ºC (o.e.) e 40ºC (fr.hex.); rampa de aquecimento: 3ºC/min até
290ºC (o.e.); 3ºC/min até
110ºC e 2ºC/min até 280ºC (fr.hex.); concentração inicial da
amostra: 1:100 mg/uL (o.e em
diclorometano.) e 1:500 mg/uL (fr.hex. em diclorometano);
quantidade para injeção: 1 uL
(para ambos). As amostras foram injetadas em coluna RTX-5 (0,25
mm X 30 m X 0,25 µm).
A composição percentual dos óleos foi calculada pelo método de
normalização das
áreas de pico CG-DIC. A identificação das substâncias foi
realizada comparação do índice
aritmético (AI), determinado em relação ao tempo de retenção de
uma série de n-alcanos (C7-
C40 – Sigma Aldrich Corp.), com dados de referência
correspondente (Adams, 2007) e o
padrão de fragmentação do espectro de massas foi comparado com
bibliotecas de espectro de
massas NIST.
A elucidação estrutural dos esteroides foi feita de acordo com o
padrão de
fragmentação, os valores dos íons e as respectivas intensidades
relativas que foram
comparadas com os descritos na literatura para a respectiva
classe química (Jain & Bari, 2010;
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22
Moreira et al., 2005; Silva et al., 2012; Balamurugan et al.,
2011; Manoharan et al., 2005;
Sales, 2007).
Para a análise da composição flavonoídica primeiramente, foi
utilizada a técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) integrada a um
detector de feixe de diodos
(DAD - Shimadzu SPD-M10Avp) na região de 200 a 600 nm e fluxo de
1 mL/min. Todas as
análises em CLAE foram efetuadas em coluna de fase inversa
Symmetry (4,6mm x 15 cm),
utilizando partículas de 5µm (analítica). Os solventes
utilizados foram metanol e acetonitrila
grau CLAE/UV (TEDIA). A água foi obtida por destilação em
sistema Milli-Q e os solventes
previamente filtrados em filtro 0,45 µm (Millipore). Também foi
possível realizar a análise
dos componentes flavonoídicos através da técnica cromatografia
líquida de alta eficiência
acoplada a DAD e espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM)
utilizando ionização por
“eletrospray” em aparelho LC Micromass triplo – quadrupolo
Q-4000, no modo negativo. A
detecção dos íons moleculares foi feita através do monitoramento
selecionado de íons (SIM).
Como solventes, foram utilizados ácido trifluoroacético 0,1% (A)
e acetonitrila (B). A
composição do gradiente de eluição foi a seguinte: 0–15min,
0–20% B em A (gradiente
linear); 15–35 min, 20–40% B em A (gradiente linear); 35 – 50
min, 40 – 100% B em A. As
condições utilizadas para o “eletrospray” foram: voltagem do
spray, 3.5 kV; velocidade do
fluxo de gás de revestimento, 40 unidades; velocidade do fluxo
de gás auxiliar, 15 unidades;
temperatura de dessolvatação, 300° C; voltagem do capilar, 10
V.
4.5. Avaliações de atividade biológica
4.5.1. Atividade antimicrobiana
Para a determinação da atividade bacteriana de extratos,
partições e óleo essencial
foliares de Xylopia ochrantha, foram realizados os métodos
qualitativo e quantitativo
(microdiluiçao em caldo e ensaio da diluição em placas). As
análises foram realizadas nos
Laboratórios de Epidemiologia Molecular e Biotecnologia
(Faculdade de Farmácia – UFF) e
Laboratório de Infecção Hospitalar (UFRJ).
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23
4.5.1.1. Método Qualitativo
Placas contendo meio cromogênico CPS semeadas com Staphylococcus
aureus ATCC
29213 foram utilizadas para verificação de atividade
antimicrobiana do extrato bruto,
partições e óleo essencial foliares de Xylopia ochrantha.
Pequenos discos de papel de filtro
Whatman nº1, com raio de 0,5 mm, inseridos em solução metanólica
das amostras (100
mg/mL), foram postos em contato com a placa semeada com a cepa
bacteriana (106
UFC/mL)
a ser analisada. Após incubação pelo período de 24 horas, a
leitura foi realizada visualmente.
A formação de halos em volta dos papéis de filtro demonstra a
existência de atividade
antimicrobiana.
4.5.1.2. Teste da Microdiluição em caldo e Determinação da
Concentração Mínima
Inibitória (CMI)
Oito tubos de 20 cm, com exceção do primeiro, foram preenchidos
com 2mL de caldo
Mueller-Hinton (MH) estéril. No primeiro tubo foram inseridos
3,8mL do caldo e 0,2 mL do
extrato, fração ou óleo essencial de Xylopia ochrantha a serem
testados, diluídos em dimetil
sulfóxido (DMSO), na concentração final de 500 µg/mL. Metade do
volume do primeiro tubo
foi transferida para o próximo tubo, repetindo-se o procedimento
para os tubos subsequentes,
obtendo-se assim um gradiente de concentração. Em seguida, foram
aplicados na microplaca
0,2 mL de cada diluição nos poços de uma fileira, em duplicata,
sendo que, como controle
negativo, duas colunas da placa foram preenchidas com 0,2 mL de
caldo MH sem a amostra.
Também foram utilizados poços para diluições contendo
vancomicina, o antibiótico de
referência. Logo após, 0,01mL da suspensão bacteriana de
Staphylococcus aureus ATCC
29213 (102 UFC/mL), previamente ajustada em salina estéril, foi
aplicada em cada poço. As
placas foram incubadas por 24 horas, a 35ºC, dentro de sacos
plásticos. Após o tempo de
incubação foram adicionados 30 µL do corante resazurina
(Sigma-Aldrich) e as placas
incubadas por mais 24 horas à 35ºC. Após este período, a leitura
foi feita visualmente
observando-se a coloração nos poços, e identificando-se a
presença ou não de células
bacterianas viáveis, pois a presença de células bacterianas
viáveis promove o descoramento da
resazurina. A CMI corresponde à primeira diluição na qual não
for observada coloração rosa
(CLSI, 2008).
-
24
4.5.1.3. Ensaio da diluição em placa
Suspensões bacterianas de diferentes cepas (Tabela 5) contendo
cerca de 1x106
UFC /
mL foram depositadas em cavidades de um replicador de Steers.
Posteriormente, foram
semeadas sobre a superfície de placas de Petri contendo ágar
Mueller-Hinton em quatro
concentrações seriadas 512 - 64 mcg / mL de extratos foliares de
Xylopia ochrantha diluídas
em ágar. Para analisar a atividade de óleo essencial da folha
foram dispensados 10 e 20 µL do
mesmo em placas contendo ágar Mueller-Hinton previamente
semeados com diferentes
espécies bacterianas (106 UFC/mL). As placas foram incubadas a
37 ° C durante 24 horas.
Após este período, a leitura foi realizada. A CMI corresponde à
concentração mais baixa na
qual ocorreu a inibição do crescimento bacteriano (Shadomy et
al., 1985).
4.5.2. Atividade antioxidante
Na determinação da atividade antioxidante foliar de Xylopia
ochrantha, foram
avaliadas a capacidade de absorção de radicais de oxigênio
(ORAC) e concentração de
fenólicos totais. Ambas as análises foram realizadas na
Faculdade de Farmácia – UFF.
4.5.2.1. Capacidade de absorção de radicais de oxigênio
(ORAC)
Este ensaio é baseado na determinação da atividade antioxidante
através da reação de
oxidação da fluoresceína, onde componentes geradores de radicais
livres inativam a proteína,
diminuindo sua fluorescência.
Neste método, 20 μL das partições, extrato bruto e óleo
essencial diluídos foram
inseridos em uma microplaca para fluorimetria com 96 poços. Logo
em seguida, 120 μL da
solução de fluoresceína foram adicionados em cada poço,
misturando bem a solução, e a placa
incubada por 10 minutos a 37ºC. Posteriormente, 60 μL do
iniciador de radicais livres foram
inseridos em cada poço, homogeneizando com auxílio de uma
pipeta, e imediatamente após,
as placas com a amostra e o padrão (Trolox) foram postos no
leitor de fluorescência, ajustado
o comprimento de onda excitatório em 480nm, e o comprimento de
onda de emissão em
530nm. A leitura foi feita em intervalos de 15 minutos, dentro
de um tempo total de 60
minutos.
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25
Para calcular os resultados do ensaio, foi construída a AUC para
cada amostra e para o
padrão usando os valores finais e a seguinte fórmula de
regressão linear:
AUC = 1 + RFU1/RFU0 + RFU2/RFU0 + RFUn/RFU0 + ... +
RFU60/RFU0
Onde,
RFU0 = valor de fluorescência relativa no tempo zero
RFUn = valor de fluorescência relativa em um determinado tempo
(minutos)
Finalmente, após o tratamento adequado da AUC, foram calculados
os equivalentes
em μmol das amostras em comparação com o padrão (Trolox
equivalent – TE). Os resultados
foram expressos em TE/g da amostra e realizados em triplcata.
(Cao et.al., 1993).
4.5.2.2. Determinação dos fenólicos totais
O conteúdo de compostos fenólicos totais foi determinado pelo
método de Folin-
Ciocalteau (Ebrahimzaded et al., 2008; Nabavi et al., 2008).
Diluições em triplicata de 1
mg/mL do extrato etanólico bruto de Xylopia ochrantha foram
misturadas com o reagente de
Folin-Ciocalteu (5 mL, 1:10 diluído com água destilada) durante
5 min, posteriormente
adicionando-se Na2CO3 aquoso (4 mL, 1 M). A mistura foi deixada
em repouso durante 15
minutos e os fenóis foram determinados por colorimetria a 765
nm. A curva padrão foi
preparada nas concentrações de 0,001, 0,01 e 0,1 mg/mL de ácido
gálico em metanol:água
(50:50, v/v). A concentração de polifenóis totais é expressa em
termos de equivalente de
ácido gálico (EAG) (mg/g de massa seca).
4.5.3. Atividade citotóxica
A avaliação da atividade citotóxica de folhas de Xylopia
ochrantha foi analisada na
presença de células de tumor hipofisário murino (linhagem
AtT20). Os ensaios foram
realizados no Laboratório de Interações Celulares – UFRJ.
As culturas das células AtT20 foram realizadas em meio de
cultura DMEM
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26
suplementado com 10% de soro fetal bovino e mantidas em estufa à
37ºC, com 5% de CO2.
Posteriormente, as células AtT20 foram transferidas para placas
de 24 poços (103
células/poço) e mantidas por 48 horas com DMEM acrescido de 10%
de soro fetal bovino. A
avaliação dos efeitos dos extratos e do óleo essencial foliar de
Xylopia ochrantha foi realizada
utilizando o MTT, para avaliação da viabilidade celular. Para
avaliação da proliferação
celular, foi utilizado o Cristal Violeta. Nesta avaliação,
apenas os extratos foram avaliados. O
tratamento com os extratos de Xylopia ochrantha foi realizado
nas concentrações de 10, 50 e
100 µg/mL, enquanto que para o óleo essencial, as concentrações
foram de 0,5, 1, 5, 10, 25,
50, 75, 100, 150 e 200 µg/mL. O controle foi realizado com o
meio de cultura sem soro e com
meio de cultura sem soro veiculado com etanol 0,5%.
No ensaio de viabilidade celular com MTT, o tratamento foi
retirado após o tempo
estimado (24 e 72 horas para o extrato bruto e 48 horas para o
óleo essencial) e adicionado
200 µL de MTT em cada poço. Após duas horas de incubação em
estufa à 37ºC, todo o MTT
foi retirado e adicionado 200 µL de DMSO em cada poço. Em
seguida, o conteúdo foi
retirado e transferido para uma placa de 96 poços
(100µL/poço).
No ensaio de proliferação com Cristal Violeta, o tratamento foi
retirado após o tempo
estimado (24 e 72 horas) e as células lavadas com solução PBS
0,05% e fixadas com 400 µL
de etanol P.A. Em seguida, o etanol foi retirado, adicionando-se
300 µL de Cristal Violeta em
cada um dos poços. Após 10 minutos, cada poço foi lavado com
água destilada até a
clarificação da água. Na sequência, foram adicionados 300 µL de
metanol em cada um dos
poços, e então, a placa foi incubada por 5 minutos à 37ºC. O
conteúdo foi passado para uma
placa de 96 poços (100µL/poço).
As leituras dos resultados foram feitas após 24 e 72 horas
(tempos intermediários). A
análise dos resultados foi realizada em leitor de ELISA, a 570
nm. (Mozman, 1983; Nicks &
Otto, 1990). Os ensaios foram realizados em triplicata.
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27
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Obtenção do Extrato Etanólico , Partições e Resíduo
Aquoso
Na realização da primeira extração, o material vegetal foliar
(460 g) submetido à
extração por maceração à frio em etanol, e posteriormente
evaporado, apresentou massa de
24,58 g, com um rendimento final de 5,343%. Após o
particionamento do extrato etanólico
bruto em solventes de polaridade crescente (hexano,
diclorometano, acetato de etila e n-
butanol), a massa final obtida de cada partição, com seu
respectivo rendimento em relação ao
material foliar foi o seguinte:
a) Partição hexânica: 7,1 g. (1,54%)
b) Partição diclorometânica: 3,73 g (0,81%)
c) Partição de acetato de etila: 1,56 g (0,34%)
d) Partição n-butanólica: 3,64 g (0,79%)
Uma segunda extração foi realizada posteriormente para análise
da fração alcaloídica,
onde o extrato bruto etanólico apresentou uma massa total de 120
g obtidos a partir de 1250 g
de folhas (rendimento de 9,6%).
Os rendimentos das partições hexânica e diclorometânica das
folhas de Xylopia
ochrantha, de acordo com a literatura, são considerados
satisfatórios, visto que, na espécie
Xylopia aromatica, o rendimento da partição hexânica foi de
1,33% e da diclorometânica de
0,45%, enquanto que na espécie Xylopia emarginata, o rendimento
da partição hexânica foi
de 0,91% (Martins et al., 1998; Moreira et al., 2003b).
5.2. Separação e Identificação de Substâncias Majoritárias
As partições hexânica e diclorometânica foram submetidas à
separação cromatográfica
em coluna, utilizando Sílica Gel 60 e Sephadex, como fases
estacionárias, e gradiente de
hexano:acetato e acetato:metanol (100% hexano no início, 30%
metanol em acetato no final)
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28
como fase móvel. Posteriormente, suas frações foram recolhidas,
analisadas em cromatofolhas
e reveladas com o auxílio de reagentes colorimétricos e absorção
na região do UV em 254 e
365 nm. Após o fracionamento da partição hexânica, foram obtidas
101 frações denominadas
H1 a H101, que foram reveladas com Reagente de Kedde, NP/PEG e
ácido sulfúrico a 10%.
Após a revelação, foi observada nas placas de CCF a presença de
bandas com coloração
característica de ácidos graxos e esteroides, além de cumarinas,
visíveis em UV 365 nm
(Figura 27). Na separação da partição diclorometânica, os
procedimentos cromatográficos,
incluindo os gradientes de eluição, e os reveladores específicos
foram os mesmos utilizados
na análise da partição anterior, sendo obtidas 133 frações, nas
quais puderam ser observadas
principalmente cumarinas, terpenoides e flavonoides. As duas
últimas classes são descritas
amplamente na literatura para espécies do gênero Xylopia,
inclusive relacionando-as com
atividades farmacológicas.
Figura 27 – Identificação de cumarinas (em azul fluorescente).
Cromatografia em Camada Delgada de frações obtidas do extrato
hexânico
(H86-H100). Fase estacionária silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254
TLC (MACHEREY – NAGEL). Eluente: Acetato de Etila: Hexano
(50%). Revelador: NP/PEG em UV 365nm.
Também foi possível realizar a obtenção da fração total
alcaloídica (FTA) através do
método de extração ácido-base, partindo de 120 g de extrato
bruto, com um total de 331 mg
de FTA (0,028% de rendimento). Posteriormente, a fração obtida
foi cromatografada em
coluna de sílica-gel, utilizando um gradiente de diclorometano e
metanol como eluente (99%
de diclorometano no início e 70% no final), com proporção
constante de 1% de dietilamina.
Foram coletadas 25 frações. Após a análise qualitativa em CCF,
utilizando o Reagente de
Draggendorf como revelador e um sistema eluente de
tolueno:acetato de etila:dietilamina
(7:2:1), foi constatada, de acordo com as manchas
características em coloração amarela sob
fundo laranja, a presença de pelo menos três alcaloides
majoritários, apresentando Rf de 0,20,
0,35 e 0,45. Ambas as manchas não foram visíveis em 365 nm.
-
29
O rendimento da FTA, comparativamente com outros estudos
realizados com espécies
do gênero Xylopia, foi abaixo do esperado. As espécies X.
viellardi, X. buxifolia e X.
danguyella apresentaram um rendimento de 0,33%, 0,22% e 0,20%,
respectivamente (Jossang
et al., 1991; Hocquemiller et al., 1981).
5.2.1. Identificação de fitoesteróis por CG-EM
A fração H27 (17,5 mg), proveniente da separação cromatográfica
primária da partição
hexânica, apresentou-se como uma mistura de um sólido cristalino
em formato de agulha, um
sólido amorfo de coloração bege, além de um pó branco. Após
análise em CCF, utilizando
ácido sulfúrico a 10% como revelador e uma mistura de
hexano/acetato (7:3) como eluente, a
amostra apresentou uma mancha de coloração azul e outra
avermelhada, mais distendida, em
ordem crescente de Rf (Ratio of Front).
O cromatograma da fração H27 obtido por CG-EM obtido apresentou
três sinais
principais, conforme ilustrado na Figura 32.
Figura 28 – Cromatograma da fração H27 obtido por CG-EM.
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30
Substância 1 (Tabela 1 e Figura 35)
O sinal 1 do cromatograma (Figura 28) apresentou o tempo de
retenção de 30,2 min e
o respectivo espectro de massas com uma série de íons fragmentos
de m/z característicos de
núcleos esteroidais, ilustrados na figura 29. O íon molecular
[M+] apresentou m/z 400. Os
principais fragmentos e suas respectivas intensidades relativas
(em %) foram os seguintes: m/z
43 (63,49), 81 (86,11), 95 (81,05), 105 (85,33), 145 (100), 255
(46,71) e 273 (24,56), 315
(47,01), 367 (41,83) e 382 (35,61). O íon m/z 43 é referente ao
radical propila terminal da
ramificação ligada ao anel D, enquanto os íons m/z 81, 95 e 105,
145 são referentes às
clivagens na mesma ramificação. Os fragmentos de m/z 255 e 273
são inerentes à perda da
ramificação somada à perda da molécula de água. Além disso, o
íon m/z 315 corresponde à
clivagem da ramificação e formação de radical C6H13. Os
fragmentos de m/z 367 e 382 são
referentes à perda do íon metila (m/z = 15) e molécula de água
(m/z = 18) e o íon m/z 382,
referente à perda da molécula de água (m/z = 18) (Sales, 2007).
De acordo com estes dados
espectrais, foi possível caracterizar a molécula como sendo o
fitoesteroide campesterol (1)
(Jain & Bari, 2010; Sales, 2007), já identificado na espécie
Xylopia laevigata (Silva et al.,
2012).
Figura 29 – Espectro de massa da substância 1.
Substância 2 (Tabela 1 e Figura 36)
O sinal 2 do cromatograma (Figura 28) apresentou tempo de
retenção de 30,8 min e
íons fragmentos de m/z característicos de núcleos esteroidais,
ilustrados na figura 30. O íon
molecular (M+) apresentou m/z 412. Os principais fragmentos e
suas respectivas intensidades
relativas (em %) foram os seguintes: m/z 43 (24,86), 55 (99,03),
69 (68,77), 83 (100), 255
(55,09), 273 (7,73), 301 (4,76), 379 (12,50), 394 (11,05). O íon
m/z 43 é referente ao radical
propila terminal da ramificação ligada ao anel D. Enquanto, os
íons m/z 43, 55, 69 e 83 são
referentes à perda sucessiva de CH2 presentes na ramificação. Os
fragmentos m/z 255 e 273
ocorreram devido à perda da ramificação somada à perda da
molécula de água. O íon m/z 301
-
31
é devido ao rompimento de uma ligação simples adjacente a um dos
carbonos sp2
da
ramificação ligada ao anel D e consequente perda de fragmento
(m/z = 112). O fragmento
iônico m/z 379 é inerente à perda do íon metila e molécula de
água e o m/z 394 está
correlacionado com a perda de uma molécula de água (Sales,
2007). Desta forma, foi possível
a identificar da substância 2 como sendo o fitoesteroide
estigmaesterol (2) (Jain & Bari, 2010;
Sales, 2007), já identificado no gênero Xylopia (Moreira et al.,
2005; Silva et al., 2012)..
Figura 30 – Espectro de massa da substância 2.
Substância 3 (Tabela 1 e Figura 37)
O sinal 3 do cromatograma (Figura 28) apresentou tempo de
retenção de
aproximadamente 32 mins e íons fragmentos característico de
núcleos esteroidais, ilustrados
na figura 31. O íon molecular [M+] apresentou m/z = 414. Os
principais fragmentos (m/z) e
suas respectivas intensidades relativas (em %) foram os
seguintes: 43 (75,25), referente ao
radical propila terminal da ramificação ligada ao anel D, 57
(62,85), 81 (93,66), 93 (67,87) e
107 (94,53), 145 (100), referentes às clivagens da mesma
ramificação, 255 (55,76) e 273
(33,20), devido à perda da ramificação somada à perda da
molécula de água, além de 303
(43,81) e 329 (56,63), relacionados com a clivagem de ligações
entre carbonos sp3 presentes
na ramificação, 381 (45,24), relacionado à perda do íon metila e
molécula de água e 396
(46,40), referente à perda da molécula de água (Sales, 2007). De
acordo com os dados
espectrais de massa, foi possível identificar a substância como
o fitoesteroide γ-sitoesterol (3)
(Balamurugan et al., 2011; Manoharan et al., 2005).
Figura 31 – Espectro de massa da substância 3.
-
32
Os fragmentos e as respectivas intensidades relativas são
mostrados na Tabela 1. A
ilustração e origem de alguns íons fragmentos derivados destas
substâncias, de acordo com a
literatura (Sales, 2007), é mostrada nas Figuras 32, 33 e
34.
Tabela 1 – Fragmentos, intensidades relativas e íon molecular de
fitoesteróis encontrados em Xylopia ochrantha e dados encontrados
na
literatura.
Substância [M+] m/z (Intensidade relativa%) exp. m/z encontrados
na literatura
43 (63,49), 55 (59,75), 57 (50,79),
67 (45,40), 71 (43,25), 81 (86,11),
91 (65,38), 93 (65,31), 95 (81,05), 43, 55, 57, 67,
Campesterol 400 105 (85,33), 107 (82,33), 121 (61,95), 81, 91,
93, 95, 105, 107, 145,
(Jain & Bari, 2010; Sales, 2007) 131 (56,60), 133 (56,09),
145 (100), 147, 159, 163, 213, 255,
147 (66,62), 159 (65,15), 163 (50,37) 315, 367, 382
213 (74,64), 255 (46,71), 315 (47,01)
367 (41,43), 382 (35,61)
43 (24,86), 55 (99,03), 69 (68,