UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO ANA CLÁUDIA TEIXEIRA MOREIRA ESTUDO DO POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DO EXTRATO DO BAGAÇO DA UVA MOSCATO CANELLI EM RATOS EXPOSTOS À DIETILNITROSAMINA PETROLINA-PE 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO …§ão... · ingredientes que, além das funções nutricionais básicas, produzem efeitos metabólicos e fisiológicos benéficos
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
ANA CLÁUDIA TEIXEIRA MOREIRA
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DO EXTRATO DO BAGAÇO
DA UVA MOSCATO CANELLI EM RATOS EXPOSTOS À DIETILNITROSAMINA
PETROLINA-PE
2014
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ANA CLÁUDIA TEIXEIRA MOREIRA
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DO EXTRATO DO BAGAÇO
DA UVA MOSCATO CANELLI EM RATOS EXPOSTOS À DIETILNITROSAMINA
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais do Semiárido.
Linha de pesquisa: Fisiologia e Farmacologia.
ORIENTADORA: DRA. CHEILA NATALY
GALINDO BEDOR
CO-ORIENTADOR: DR. RICARDO SANTANA
DE LIMA
PETROLINA-PE
2014
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ANA CLÁUDIA TEIXEIRA MOREIRA
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DO EXTRATO DO BAGAÇO
DA UVA MOSCATO CANELLI EM RATOS EXPOSTOS À DIETILNITROSAMINA
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais do Semiárido.
APROVADA EM: 10 de Janeiro de 2014.
_________________________________________________
Prof. Dra. Cheila Nataly Galindo Bedor - UNIVASF
(Orientadora)
_________________________________________________
Profa. Dra. Gabriela Lemos de Azevedo Maia - UNIVASF
(Examinadora Externa)
_________________________________________________
Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro - UNIVASF
(Examinador Interno)
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A minha mãe (Herlane), pelo
exemplo e apoio incondicional. E
ao meu noivo (Glauber), por estar
ao meu lado em todos os
momentos, acreditando em mim e
me conduzindo com muito amor ao
melhor caminho.
Dedico
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e a Nossa Senhora, que sempre me guarda
em seu Manto Materno.
À Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), através da
Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido, pela
oportunidade de realização do curso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão de Bolsa de Estudos.
À Professora Cheila Nataly Galindo Bedor pela orientação, paciência e colaboração
no trabalho desenvolvido.
Ao Professor Ricardo Santana de Lima, pela disponibilidade em orientar e pelos
ensinamentos indispensáveis à realização e ao aperfeiçoamento deste trabalho.
À Paula e aos amigos do curso de Pós-graduação, em especial Raquel, Stefânia e
Roniere, pela amizade, incentivo, colaboração e solidariedade no decorrer do curso.
À Vanúzia e à professora Maria Helena, do Laboratório de Histologia, pelo papel-
chave na confecção das lâminas deste estudo.
Ao professor Roberto Jeferson e sua aluna Luana Dias, pelo preparo e fornecimento
do extrato do bagaço da uva Moscato canelli, objeto de estudo desta pesquisa.
A minha família, pelo amor, que foi e sempre será fundamental na minha caminhada.
E por estarem sempre ao meu lado, dando-me forças para a realização dos meus
sonhos.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Localização da região vitivinícola do Vale do Submédio São Francisco, nos
Estados de Pernambuco e Bahia (Elaboração: Jorge Tonietto; Cartografia digital:
Naíssa Batista da Luz).................................................................................................15
Figura 2 - Cacho de ‘Moscato Canelli’ (Foto: Umberto Almeida Camargo).................22
Figura 3 - Material cortado e colocado no cassete para o processamento.................41
Figura 4 - Material em cassetes plásticos e mergulhados em formol a 10%...............41
Figura 5 - Bateria de álcool para desidratação............................................................42
Figura 6 - Bateria de frascos com xilol.........................................................................42
Figura 7 - Peças em fracos de vidro contendo parafina em estufa a 60º C.................43
Figura 8 - Material já incluído na parafina....................................................................43
Figura 9 - Corte do bloco em tiras de 6 micrômetros de espessura............................44
Figura 10 – a. Cortes do material prontos para serem distendidos em água aquecida.
b. Cortes sobre a água aquecida em "Banho-maria"...................................................44
Figura 11 – a. Corte sendo pescado sobre a lâmina de vidro. b. Lâminas de vidro com
os cortes já distendidos sobre a platina.......................................................................45
Figura 12 - Frascos de vidro com os principais corantes utilizados na confecção das
Figura 13 - Lâmina e lamínula limpas..........................................................................46
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Figura 14 - Análise histopatológica dos órgãos de ratos expostos a duas doses de
200mg/kg de DEN via intraperitoneal..........................................................................49
Figura 15 - Lesões macroscópicas em animal exposto ao DEN.................................50
Figura 16 – Análise histopatológica do fígado de ratos injetados com 100 ou
200mg/kg de DEN por via intraperitoneal....................................................................51
Figura 17 – Análise histopatológica dos órgãos de ratos injetados com DEN 200mg/kg
via intraperitoneal e tratados com EBU por 4 semanas...............................................55
Figura 18 – Análise histopatológica dos órgãos tratados com EBU por 4 semanas e
injetados com DEN 200mg/kg por via intraperitoneal..................................................57
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Quantidade de trabalhos experimentais sobre a atuação do extrato de uva
ou de seus subprodutos na carcinogenicidade, descritos na literatura até meados de
outubro do ano de 2012..............................................................................................59
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RESUMO
Os alimentos funcionais, como a uva e o vinho, destacam-se pela presença de ingredientes que, além das funções nutricionais básicas, produzem efeitos metabólicos e fisiológicos benéficos a saúde. Os subprodutos do suco de uva e da produção de vinho também são fontes de várias combinações de fenólicos que despertam interesse, dentre esses, o bagaço da uva vem sendo estudado devido a sua função antioxidante. Antioxidantes naturais inibem a formação de radicais livres, relacionados ao envelhecimento precoce e desenvolvimento de doenças como o câncer. Este estudo avaliou o potencial anticarcinogênico do extrato do bagaço da uva (EBU) em animais expostos a carcinógenos. O agente carcinogênico utilizado neste estudo foi o dietilnitrosamina (DEN). Como a principio também havia o objetivo de avaliar esse efeito em animais exposto ao carcinogéno associado a agrotóxico, também foi utilizado nos experimentos o organofosforado metamidofós. O estudo constituiu de três etapas. Na primeira delas, ratos machos Wistar foram expostos a diferentes doses do DEN, via intraperitoneal (i.p), para padronização do melhor método de promoção das lesões teciduais a ser aplicado nas etapas seguintes, após os resultados, foi padronizado à dose única de 200mg/kg. No segundo momento, três grupos de animais receberam diferentes doses do metamidofós (1,0, 4,5 e 6,0 mg/Kg, i.p). Ao final de 4 e 8 semanas os animais foram eutanasiados e avaliados quanto ao aparecimento de lesão carcinogênicas. Os resultados com metamidofós nas doses 4,5 e 6,0 mg/kg demonstraram toxicidade aguda dessa substância. Nenhum efeito carcinogênico foi encontrado nas análises histopatológicas de nenhum dos animais, apesar desse agrotóxico ser descrito na literatura como genotóxico e mutagênico em experimentos com exposição oral. Assim o metamidofós não foi utilizado nas etapas seguintes desse estudo. Na última etapa, ratos foram expostos à dose única de 200 mg/kg de DEN (i.p) e após 48 horas passaram a ser tratados com o EBU (200 mg/Kg) via gavagem durante 4 semanas, outro grupo de animais receberam apenas o extrato pelo mesmo período. Simultaneamente, um grupo de animais recebeu EBU por 4 semanas, anteriormente à exposição a 200 mg/kg de DEN (i.p). A partir dos resultados preliminares obtidos, verificou-se que o extrato do bagaço da uva pode ser capaz de conferir efeito protetor à carcinogênese quando suplementado após a inoculação do carcinógeno. Entretanto, não demonstrou ação protetora quando consumido antes da indução das lesões teciduais pelo DEN na dose testada. Os dados referentes ao tratamento com o extrato após indução da lesão corroboram com inúmeros estudos na literatura, reforçando o potencial quimioterápico da uva e seus subprodutos. Palavras chave: extrato do bagaço da uva, lesão pré-neoplásica, metamidofós, dietilnitrosamina.
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ABSTRACT
Functional foods such as grapes and wine, distinguished by the presence of ingredients that , beyond basic nutritional functions , produce beneficial metabolic and physiological health effects . The byproducts of grape juice and wine production are also sources of various combinations of phenolic that arouse interest, among these, the grape pomace has been studied because of its antioxidant function. Natural Antioxidants inhibit free radical formation, related to premature aging and the development of diseases like cancer. This study evaluated the potential anticarcinogenic of grape pomace extract (EBU) in animals exposed to carcinogens. The carcinogen used in this study was the diethylnitrosamine (DEN). As the principle also had to evaluate this effect in exposed to carcinogen associated with pesticides, animals used in the experiments was also the organophosphate methamidophos. The study consisted of three steps. In the first, male Wistar rats were exposed to different doses of DEN, intraperitoneally (ip) to standardize best method of promoting tissue damage to be applied in the following steps, after the results were standardized to a single dose of 200mg / kg. In the second instance, three groups of animals received varying doses of methamidophos (1.0, 4.5 and 6.0 mg / kg, ip). At the end of 4 and 8 weeks, the animals were euthanized and evaluated to detect the carcinogenic lesion. The results of Methamidophos in doses 4.5 and 6.0 mg / kg showed acute toxicity of this substance. No carcinogenic effects were found in histopathological analysis of any of the animals, although this pesticide be described in the literature as genotoxic and mutagenic in experimental oral exposure. So methamidophos was not used in the following steps of this study. In the last step, rats were exposed to a single dose of 200 mg/kg DEN (ip) and after 48 hours were treated with the EBU (200 mg/Kg) by gavage for 4 weeks , another group of animals received only the extract by period. Simultaneously, one group of animals received EBU for 4 weeks prior to exposure to 200 mg/kg DEN (ip). Based on preliminary obtained, it was found that the extract of grape pomace maybe of conferring a protective effect on carcinogenesis when supplemented after inoculation of the carcinogen. However, showed no protective effect when consumed before induction of tissue lesions by DEN at the dose tested. The data relating to treatment with the extract after lesion induction corroborate numerous studies in the literature, reinforcing the chemotherapeutic potential of the grape and its byproducts. Keywords: grape pomace extract, pre-neoplastic lesion, methamidophos, diethylnitrosamine.
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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................5
LISTA DE TABELAS.....................................................................................................7
Além disso, uma vez utilizando modelo sincronizado e bem estabelecido para
o estudo da quimioprevenção do câncer, também se objetivou fornecer informações a
respeito da ação desse extrato quando fornecido anteriormente à exposição ao
carcinógeno.
Considerando, ainda, as inúmeras pesquisas priorizando estudos com uvas
vermelhas, roxas e pretas; buscou-se aprofundamento sobre possíveis ações
farmacológicas de uma variedade de uva verde, baseando-se no seu alto valor
biológico-nutricional.
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4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
O objetivo geral deste estudo é avaliar o potencial anticarcinogênico do extrato
do bagaço da uva em lesões causadas pela dietilnitrosamina em ratos Wistar.
4.2 Objetivos específicos
• Determinar o possível papel anticarcinogênico do extrato do bagaço da uva;
• Determinar possíveis lesões causadas pelo metamidofós em ratos expostos
via intraperitoneal;
• Determinar o possível papel anticarcinogênico do extrato do bagaço da uva
frente à exposição ao agrotóxico metamidofós;
5 METODOLOGIA
5.1 Animais de experimentação
O estudo consistiu na análise anticarcinogênica do extrato do bagaço da uva
em ratos Wistar (Rattus novergicus)- total de 33 ratos -, de 90 dias de vida, pesando
em torno de 300g. Os animais foram fornecidos pelo Biotério da Universidade Federal
do Vale do São Francisco (UNIVASF), e ficaram alojados em gaiolas de polipropileno,
mantidas em sala com temperatura controlada (25 ± 1°C) e com ciclo de luz
controlado (12h claro/12h escuro). Esses animais foram submetidos a uma dieta
diária de ração balanceada e água filtrada, sem restrição nem interrupção. Esse
estudo seguiu os princípios éticos que regem estudos em animais tendo a aprovação
do Comitê de Ética de Humanos e Animais da Universidade Federal do Vale do São
Francisco (Protocolo nº 0002/261011).
5.2 Produtos químicos
Nos experimentos foram utilizados:
• Dietilnitrosamina (DEN). Indutor de hepatocarcinoma bem descrito na
literatura (DIAS et al., 2008; CHIARELLO et al., 2010; SCHMITZ et al., 2011) em dose
única (100 ou 200 mg/Kg) via intraperitoneal. O DEN utilizado nesta pesquisa foi o
comercializado pela empresa Sigma®.
• Organofosforado metamidofós. Optou-se por este agente pelo mesmo ser
largamente utilizado em uma grande variedade de culturas, mesmo sendo
considerado altamente tóxico (classe toxicológica II) (RAMOS, 2006), ser de ação
sistêmica e ter potencial carcinogênico e mutagênico (BEDOR et al, 2011). A DL50
desse agrotóxico é de 23 mg/Kg por via oral para ratos machos Wistar (GUO et al,
1986 apud IPCS, 2002). Tal produto foi adquirido da empresa Sigma®, na sua forma
isolada. A solução estoque e de uso foram preparadas em solução salina (NaCl
0,9%).
• Extrato do bagaço da uva Moscato canelli dissolvido em solução salina;
armazenado em frasco de vidro fechado, conservado sob refrigeração e protegido
contra luminosidade. O bagaço para a confecção do extrato foi fornecido pela
EMBRAPA Semiárido e o extrato cedido pelo Prof. Dr. Roberto Jefferson Bezerra do
Nascimento, docente da UNIVASF, sendo produzido como objeto da dissertação da
mestranda do Programa de Pós–Graduação em Ciências dos materiais da UNIVASF,
Luana Dias. Após ter sido recolhido, o material passou por um processo de secagem
em uma estufa de circulação de ar a 55°C. O material seco foi macerado em EtOH
puro absoluto, e a solução extrativa foi concentrada em evaporador rotatório sob
pressão reduzida a 60°C. Na análise do extrato, constatou-se um teor razoável de
fenólicos totais (10,413mg EAG/grama de extrato, sendo EAG – equivalência por
ácido gálico). Em consequência disso, o produto obtido apresentou atividade anti-
radicalar.
Na manipulação dos produtos químicos utilizados foram tomadas as medidas
para proteção do manipulador como o uso de luvas, óculos, máscaras, e de capela
para a diluição, uma vez que a manipulação do agrotóxico metamidofós oferece
riscos de intoxicação se for absorvido pelas vias digestiva, respiratória e dérmica
(IPCS, 1993); assim como o DEN.
5.3 Protocolo experimental
Os experimentos deste estudo foram divididos em três etapas.
5.3.1 Primeira etapa
A etapa inicial da pesquisa objetivou determinar as dosagens de DEN e
metamidofós que melhor induzissem as lesões teciduais e será explicado em três
momentos, os quais foram denominados protocolos:
Protocolo 1: O experimento foi realizado com 2 grupos de animais:
• Grupo 1.2A: ratos expostos a 200mg/kg de peso do animal de DEN, via i.p.
uma vez por semana, durante três semanas (n=5)
• Grupo 1.2B: controle - ratos expostos a 0.9% NaCl, via i.p (n=2)
Após 4 e 6 dias do recebimento da segunda dose do DEN (200 mg/kg), dois
animais do grupo 1.2.A morreram. Todos os animais sobreviventes (n=3) desses
grupos foram então eutanasiados após a 2º dose, através de deslocamento cervical,
previamente anestesiados; e avaliados segundo os critérios adotados neste estudo.
Protocolo 2: Outro experimento foi iniciado com 3 grupos de animais:
• Grupo 1.3A: rato exposto ao DEN, via i.p, em única dose de 100 mg/kg de
peso de animal (n=1)
• Grupo 1.3B: rato exposto ao DEN, via i.p, em dose única de 200 mg/kg de
DEN por peso de animal (n=1)
• Grupo 1.3C: controle - ratos expostos a 0.9% NaCl, via i.p. (n=2)
Após 24 horas, o animal exposto à dose de 100 mg/kg do DEN foi sacrificado,
bem como um dos animais que recebeu solução salina. Após 48 horas, o animal
exposto à dose de 200 mg/kg do DEN e o segundo animal exposto à solução salina
foram sacrificados e avaliados histopatologicamente.
Protocolo 3: O agrotóxico metamidofós foi testado em 14 animais distribuídos
três grupos.
• Grupo 1.4A: ratos expostos a dose de 1,0 mg/kg, por peso do animal, do
Metamidofós (n=3)
• Grupo 1.4.B: ratos expostos a dose de 4,5 mg/kg, por peso do animal, do
Metamidofós (n=3)
• Grupo 1.4C: 04 animais receberam a dose de 6,0 mg/kg, por peso do
animal, do Metamidofós (n=4)
• Grupo 1.4D: ratos expostos a 0.9% NaCl, via i.p. (n=4)
A aplicação do metamidofós foi feita semanalmente e as doses foram
administradas pela via intraperitoneal, uma vez por semana durante 4 e 8 semanas.
Um (01) animal de cada grupo foi eutanasiado após 4 semanas de exposição. Da
mesma forma, o restante dos animais foi sacrificado ao final de 8 semanas..
As doses foram determinadas a partir de pesquisas realizadas na literatura e
optou-se por distribuir um número maior de animais recebendo a maior dose do
metamidofós (6 mg/kg) devido à toxicidade e os possíveis efeitos desse agrotóxico.
5.3.2 Segunda etapa
Na segunda etapa da pesquisa, ocorreram os experimentos para identificação
do efeito do extrato do bagaço da uva (EBU) em animais previamente expostos ao
agente carcinogênico.
Primeiramente, 5 animais foram expostos ao DEN, via i.p, em dose única de
200 mg/kg, por peso do animal. Após 48 horas esses animais passaram a ser
tratados com 200 mg/Kg, por peso do animal, de EBU, por gavagem, durante 4
semanas. Os animais receberam um total de 20 (vinte) doses de EBU, divididas em 5
doses por semana. Um animal recebeu apenas EBU nas mesmas condições do grupo
que recebeu o extrato.
Os animais foram eutanasiados após 48 horas da vigésima dose do tratamento
com o EBU por meio de dose supra-anestésica letal e deslocamento cervical, e
avaliados quanto ao surgimento de lesões teciduais através da análise
histopatológica.
5.3.3 Terceira etapa
Na última etapa da pesquisa, ocorreram os experimentos para identificação do
efeito do tratamento com o extrato do bagaço da uva anteriormente à exposição ao
agente carcinogênico.
Uma quantidade de 5 animais receberam o extrato por 4 semanas. Os ratos
recebiam um total de 5 doses por semana de 200 mg/kg de EBU, por peso de animal,
por gavagem, totalizando 20 doses no final da quarta semana. Após 48 horas da
última administração do extrato os animais foram expostos a uma única dose de 200
mg/Kg de DEN, por peso de animal, via intraperitoneal. Um animal recebeu apenas
EBU em 200 mg/Kg de peso de animal, por gavagem, durante o mesmo período.
Após 48 horas da inoculação do agente carcinogênico, todos os animais foram
eutanasiados e avaliados quanto ao aparecimento e evolução de lesões teciduais.
5.4 Procedimento anestésico para ratos
A conhecida associação das drogas xilazina e quetamina nas dosagens de 5
mg/Kg de peso do animal e 50 mg/Kg de peso do animal, respectivamente, foi
utilizada em todos os ratos desta pesquisa, porém numa dose de 3 a 5 vezes maior
que a descrita, com o objetivo de causar a morte dos mesmos.
5.5 Análise histopatológica dos animais
Para a análise tecidual, foram removidos dos animais fígado, baço, rim,
coração e pulmão. Também foi realizada uma inspeção em todo o animal para a
busca de possíveis alterações macroscópicas em outros órgãos. Os órgãos retirados
passaram pelo processo de confecção e coloração de lâminas histopatológicas.
5.6 Processo de confecção e coloração das lâminas histológicas
Foram retirados pequenos e diferentes cortes dos órgãos estudados e
colocados em cassetes identificados (Figura 3).
Figura 3 - Material cortado e colocado no cassete para o processamento
5.6.1 Fixação:
Para a fixação foi utilizado formol a 10% (Figura 4), com a finalidade de evitar o
processo de autólise da célula, impedir a destruição do tecido por procariontes,
endurecer o material para melhor tratamento posterior e aumentar a capacidade de
coloração do material. O tempo de fixação durou em média 48 horas.
Figura 4 - Material em cassetes plásticos e mergulhados em formol a 10%.
5.6.2 Desidratação:
Para a desidratração, o material foi mergulhado em frascos contendo
concentrações crescentes de álcool a 80%, 95%, Absoluto I e Absoluto II. O álcool
absoluto corresponde a 99% de pureza (Figura 5).
Figura 5 - Bateria de álcool para desidratação
.
5.6.3 Diafanização ou clareamento:
Para o clareamento das lâminas, foram realizados 3 banhos de xilol para
permitir melhor penetração de parafina na peça (Figura 6).
Figura 6 - Bateria de frascos com xilol
.
5.6.4 Impregnação:
Em recipientes contendo parafina líquida a 60º C, o material foi colocado em
estufa na mesma temperatura; e recebeu 2 banhos de parafina, cada um com
duração de 1 hora e 30 minutos (Figura 7).
Figura 7 - Peças em fracos de vidro contendo parafina em estufa a 60º C.
5.6.5 Inclusão:
A inclusão foi realizada derramando a parafina em caixinhas feitas com papel,
e em seguida colocando o tecido no interior das embalagens. A Figura 8 mostra o
material incluído na parafina, na figura o bloco da direita foi processado para ser
cortado no micrótomo.
Figura 8 - Material já incluído na parafina.
5.6.6 Microtomia:
Os blocos de parafina foram cortados, em um micrótomo (Figura 9), para a
obtenção de cortes do material, com espessura de 5 a 6 micrômetros.
Figura 9 - Corte do bloco em tiras de 6 micrômetros de espessura.
5.6.7 Passagem em “banho-maria”:
Os cortes, observados na figura 10a, foram distendidos em água aquecida a
56º C para evitar microdobras no material (Figura 1b).
Figura 10 – a. cortes do material prontos para serem distendidos em água aquecida, b. cortes sobre a água aquecida.
5.6.8 Pescagem:
A lâmina foi mergulhada na água e o material foi coletado esticado sobre a
lâmina (Figura 11a). Em seguida, a lâmina foi colocada sobre uma platina aquecedora
para que fosse feita a secagem e a fusão da parafina impregnada no tecido, evitando
o aparecimento de microdobras (Figura 11b).
a b
a b
Figura 11 - a corte sendo pescado sobre a lâmina de vidro. b lâminas de vidro com os cortes já distendidos sobre a platina
5.6.9 Coloração:
Para a coloração foram realizados os seguintes passos:
� Desparafinação em xilol durante 10 minutos
� Hidratação em álcool:
o Imersão em álcool absoluto
o Imersão em álcool absoluto
o Imersão em álcool 95%
o Imersão em álcool 95%
� Lavagem da lâmina em água corrente durante 3 minutos
� Coração pela hematoxilina (corante básico) durante 5 minutos
� Lavagem da lâmina em água corrente durante 5 minutos
� Coração pela eosina (corante ácido) durante 30 segundos
A Figura 12 mostra os frascos de vidro com os corantes hematoxilia e eosina.
Figura 12 - Frascos de vidro com os principais corantes utilizados na confecção das lâminas histológicas.
� Desidratação do corte em álcool:
o Imersão em álcool 95%
o Imersão em álcool 95%
o Imersão em álcool absoluto
o Imersão em álcool absoluto
� Diafanização ou clareamento:
o Imersão em xilol
o Imersão em xilol
o Imersão em xilol
5.6.10 Montagem:
Para a montagem da lâmina foi colocada uma gota de resina sintética sobre a
lamínula. Sendo esta colocada e comprimida sobre o corte, espalhando a resina em
fina camada entre a lâmina e lamínula (Figura 13).
Figura 13 - Lâmina e lamínula limpas
.
5.6.11 Secagem:
Para a secagem da resina, o material foi deixado em temperatura ambiente.
5.7 Análise das lâminas histopatológicas
A leitura das lâminas foi realizada por um observador às cegas, o qual foi
descrevendo as alterações encontradas, e um outro pesquisador anotando as
informações descritas.
Para a avaliação morfológica, as imagens foram digitalizadas usando uma
câmera acoplada ao microscópio óptico e ao computador, sendo então processada a
análise. Realizou-se uma descrição dos cortes teciduais a fim de se constatar se há
ou não lesão e o grau de lesão nos animais dos diferentes grupos do estudo.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A etapa inicial dos experimentos foi constituída de três protocolos, que
objetivaram determinar as dosagens de DEN e metamidofós que induzissem lesões
teciduais. No primeiro deles, no qual cinco animais receberiam três doses de 200
mg/kg de DEN, uma vez por semana, via intraperitoneal; dois animais morreram após
quatro e seis dias da segunda administração, respectivamente. Optou-se, então, por
não aplicar a terceira dose da substância nos animais sobreviventes. Eles foram
eutanasiados e avaliados histopatologicamente, sendo encontradas alterações como:
desorganização tecidual, acúmulo de células inflamatórias, hemorragia e necrose
(Figura 14). As lesões foram observadas em maior intensidade no fígado, em menor
intensidade no baço, rim e pulmão, e não observadas no coração. As lesões
macroscópicas podem ser observadas na Figura 15.
Segundo Velho et al (2008), o DEN (C4H10N2O) é uma substância do grupo das
nitrosaminas e em alta dose (200 mg/kg) pode induzir a carcinogênese química,
sendo considerado um carcinógeno completo por produzir a indução e a promoção
tumoral em fígado de ratos. Ao ser metabolizado no fígado, este gera um composto
intermediário reativo (radical livre), que induz ao processo de carcinogênese, que é
um processo com múltiplos estágios e que tem início com os focos de necrose no
fígado destes animais, os focos dão origem a hepatócitos alterados e nódulos de
hepatócitos hiperplásicos, sendo considerados como lesões pré-neoplásicas (LPN).
BA
DC
FE
Figura 14 - Análise histopatológica dos órgãos de ratos expostos a duas doses de 200mg/kg de DEN via intraperitoneal. (A) Fígado normal (animal controle). Demais órgãos de animais inoculados com DEN, evidenciando lesões: (B e C) Fígado com intenso infiltrado inflamatório e necrose tecidual; (D) Pulmão com paredes alveolares espessadas (pulmão normal no destaque); (E) Baço com evidência de desorganização estrutural, folículos aumentados e necrose; (F) Rim com foco de infiltrado inflamatório discreto no tecido. (A, B, E e F) aumento de 40X, (C e D) aumento de 100X. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
Figura 15 - Lesões macroscópicas em animal exposto ao DEN.
Com relação aos experimentos do segundo protocolo, nas doses únicas de
100 mg/kg de DEN e eutanásia após 24 horas, assim como na dose única de 200
mg/kg e eutanásia após 48 horas, também foram encontradas alterações como:
desorganização tecidual, acúmulo de células inflamatórias, hemorragia e necrose, e
mais uma vez as lesões foram mais evidentes no fígado, bem menos evidentes no
baço, rim e pulmão, e ausentes no coração. Macroscopicamente, o fígado dos dois
animais expostos ao carcinógeno apresentou manchas esbranquiçadas, sendo estas
ausentes nos animais-controle. Já microscopicamente, como mostra a Figura 16, o
fígado do rato que recebeu a maior dose mostrou-se mais comprometido, já que
continha uma maior quantidade de áreas lesionadas.
BA
DC
FE
Figura 16 - Análise histopatológica do fígado de ratos injetados com 100 ou 200mg/kg de DEN via intraperitoneal. (A e B) Fígado normal (animais injetados com NaCl 0,9%). Animais injetados com 100mg/kg de DEN evidenciando lesões: (C e E) Fígado com infiltrado inflamatório e necrose tecidual moderados. Animais injetados com 200mg/kg de DEN: (D e F) Fígado com intenso infiltrado inflamatório e necrose tecidual. Todos os aumentos são de 100X. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
No terceiro protocolo, no qual foram avaliados os efeitos do metamidofós,
alguns animais que receberam a dose de 4,5 mg/kg apresentaram sangramento pelos
olhos e nariz e um apresentou contorções abdominais (indicativo de dor),
aproximadamente 30 minutos após a administração. Após esse mesmo intervalo de
tempo, tais sintomas começaram a diminuir e na manhã seguinte os animais estavam
aparentemente normais. Já no grupo que recebeu a dose de 6,0 mg/kg do agrotóxico,
todos os ratos apresentaram sangramento pelos olhos e nariz e alguns, contorções
abdominais 20 a 30 minutos depois da exposição, diminuindo a intensidade após
meia hora. Todos os animais expostos às duas maiores doses apresentaram tremor
de corpo inteiro em todas as aplicações semanais do agrotóxico, assim como
taquipnéia, e ainda, salivação excessiva, formando espuma ao redor da boca e nariz.
Esses efeitos fazem parte da chamada síndrome colinérgica aguda (RIO DE
JANEIRO, 2000) que incluem convulsões, taquicardia, taquipnéia, sangramento
através dos olhos e nariz, salivação excessiva e contorções abdominais,
demonstrando a toxicidade causada por esse agrotóxico. Os animais expostos ao
metamidofós na dose de 1,0 mg/kg visualmente não sofreram nenhum dos sintomas
dessa síndrome; verificando apenas tremor de corpo inteiro em alguns deles, porém
em intensidade muito menor que os demais grupos.
De acordo com Maretto et al (2012), a exposição aguda (24 horas) a uma dose
sub-letal de 8 mg/kg (via intraperitoneal) do agrotóxico metamidofós altera a função
de dois importantes reflexos cardiovasculares envolvidos na manutenção da pressão
arterial. Esse efeito pode ser um dos mecanismos que contribuem para a toxicidade
cardiovascular relacionada à exposição aos organofosforados.
Nas análises histológicas dos órgãos de todos os animais expostos ao
Metamidofós, sacrificados após 4 semanas e 8 semanas, nenhuma alteração
significativa foi observada, independente da dose do agrotóxico utilizada (1,0, 4,5 e
6,0 mg/kg). Entretanto, estudos utilizando a via oral (ração contaminada) por meio de
doses de 2,5 mg/kg e 5,0 mg/kg do agrotóxico (durante 90 dias) o consideraram
genotóxico e mutagênico a partir dos resultados de três testes utilizados: teste de
Ames nas cepas Salmonella typhimurium, TA98 e TA100 (KARABAY; OGUZ, 2005).
Além disso, pesquisas relatam um possível efeito do metamidofós como
desregulador endócrino; correlacionando-o, por exemplo, ao retardo no
desenvolvimento de ratos (CASTRO, CHIORATO e PINTO 2000 apud ARAÚJO,
2005), e outros artigos que o correlacionam com problemas de fertilidade em
camundongos (BURRUEL et al, 2000 apud ARAÚJO, 2005). Evidenciando, dessa
forma, que os diversos efeitos deste agrotóxico, inclusive o carcinogênico, ainda
necessitam ser mais estudados.
Com os resultados da exposição ao DEN obtidos no primeiro e segundo
momentos da primeira etapa dos experimentos padronizou-se uma única dose de 200
mg/kg de DEN via intraperitoneal. Visando-se um menor tempo de experimento e,
principalmente, menor toxicidade da exposição ao agente carcinógeno e ausência de
óbito nos animais estudados.
Na segunda etapa da pesquisa, na qual os animais depois de expostos ao
DEN passaram a ser tratados com o extrato do bagaço da uva (EBU) por 4 semanas,
o resultado do nível de lesão tecidual do grupo tratado com o extrato durante 4
semanas após o DEN foi menor quando comparado com o grupo exposto ao DEN,
porém não tratado com EBU e eutanasiados após 48 horas. Os valores de
intensidade de necrose indicam que ocorreu menor lesão no grupo DEN/EBU em
comparação ao animal exposto somente ao DEN.
A regeneração hepática deve ser considerada uma resposta natural do fígado
às agressões, mas há certas limitações nesse processo, que depende das áreas
afetadas possuírem adequado suprimento sangüíneo, drenagem livre de bile e
arquitetura hepática normal, possuindo colunas de células em regeneração com
orientação do arcabouço original de reticulina. Os hepatócitos proliferantes podem
diferir dos hepatócitos normais em algumas de suas reações enzimáticas, mas há
evidências de que eles sofram diferenciação e, dessa forma, podem substituir
aqueles hepatócitos residuais danificados e restaurar o fígado normal se a agressão
cessar (KELLY, 1993).
Quando a inflamação crônica ocorre em todo o fígado, há perda do
parênquima hepático com distorção da arquitetura hepática que resulta em fibrose e
regeneração nodular do parênquima (Kelly, 1993). Após a destruição do parênquima
hepático, pode ocorrer regeneração do parênquima, substituição por fibrose e
hiperplasia biliar (CULLEN; MACLACHLAN, 2001).
Necrose hepática extensa geralmente é seguida por regeneração do
parênquima sem fibrose, desde que o arcabouço de reticulina da porção afetada
permaneça intacto e que não haja colapso como na necrose hepática massiva
(CULLEN; MACLACHLAN, 2001). Esta é uma reação fundamental do fígado à
agressão e significa que a perda de grande quantidade de hepatócitos pode ser
completamente recuperada e o fígado poderá retornar inteiramente ao normal
(WIGHT, 1994).
No entanto, na necrose massiva ou quando a lesão for repetitiva, as áreas
afetadas irão colapsar após a remoção dos hepatócitos necróticos, resultando numa
cicatriz (cicatrização pós-necrótica ou cirrose pós-necrótica) (CULLEN;
MACLACHLAN, 2001).
Se a integridade estrutural do fígado for danificada durante a agressão celular,
a regeneração poderá ser desordenada e embora a massa hepática possa retornar
ao seu tamanho normal, as relações estruturais da arquitetura hepática não serão
restauradas e a regeneração será nodular (WIGHT, 1994), isto é, quando a necrose
hepática é contínua, o fígado tentará regenerar sua massa funcional, mas o esforço
regenerativo prolongado e a presença de dano na matriz extracelular normal do
fígado frequentemente resultam em proliferação nodular do parênquima com
distorção da arquitetura normal do fígado (CULLEN; MACLACHLAN, 2001). Essa
nodularidade pode ser causada pela constrição das faixas de tecido fibroso (KELLY,
1993).
Como não foi encontrado nenhum dos indícios de regeneração hepática nos
cortes teciduais analisados, a ação do EBU pode ser considerada quimioprotetora ou
quimiopreventiva, quando suplementado continuamente durante as etapas de
iniciação e promoção da hepatocarcinogênese.
As lesões teciduais no fígado dos ratos tratados com EBU após a exposição ao
DEN podem ser observadas na Figura 17.
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Figura 17 - Análise histopatológica dos órgãos de ratos injetados com DEN 200mg/kg via intraperitoneal e tratados com EBU por 4 semanas. (A) Fígado normal (animal controle). (B) Animal tratado apenas com EBU, demonstrando aspecto normal do órgão. Demais lâminas de dois animais do grupo exposto ao DEN e tratado com EBU: (C e D) Animal 1 com foco de infiltrado inflamatório discreto no tecido. (E e F) Animal 4, sem evidência de lesão hepática. (A, B, D e F) aumento de 100X, (C e E) aumento de 40X. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
As propriedades biológicas da uva têm sido estudadas mundialmente. A
avaliação de sua atividade quimioprotetora tem sido investigada em diferentes
protocolos experimentais frente ao DEN, que depende de ativação pelo sistema
metabolizador de drogas do fígado para exercer sua ação carcinogênica e tóxica. A
participação da necrose na hepatocarcinogênese, estimulando a proliferação celular e
o desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas, é necessária na etapa de iniciação da
carcinogênese hepática (HAW et al., 2000, ESTEVÃO et al., 2002).
De acordo com Dinicola et al (2010), em estudo com linha de células humanas
de câncer de cólon (Caco-2), doses elevadas de extrato de semente de três tipos de
uva induziram uma inibição significativa no crescimento de células Caco-2. Além
disso, apontou mecanismos que conduziram a uma indução de apoptose.
No estudo de Raina e colaboradores (2007), ratos com adenocarcinoma de
próstata foram alimentados com extrato de semente de uva por sonda oral em dose
de 200 mg/kg de peso corporal, durante 4 a 28 semanas de idade. Os resultados
mostraram uma redução significativa no peso dos órgãos do trato geniturinário nos
ratos que consumiram o extrato, assim como a inibição do crescimento do câncer,
explicada pela forte supressão da progressão do ciclo celular e aumento da apoptose.
Efeitos do extrato de uva na dose de 200mg/kg foram examinados em ratos
com xenoenxerto de câncer colorretal, e sem qualquer toxicidade, tal dosagem
provocou diminuição de até 44% no volume de tumores após 8 semanas de
tratamento. O extrato inibiu a proliferação de células e aumentou a morte celular por
apoptose nos tumores (KAUR et al, 2006).
Já na terceira etapa do presente estudo, na qual os animais foram tratados
com o extrato do bagaço da uva antes da indução da lesão pelo DEN, os resultados
obtidos mostraram que não houve diferença na intensidade e grau das lesões
encontradas nestes animais quando comparados ao grupo exposto somente ao
agente carcinógeno, como demonstrado na Figura 18.
BA
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Figura 18 - Análise histopatológica dos órgãos de ratos tratados com EBU por 4 semanas e injetados com DEN 200mg/kg via intraperitoneal. (A) Fígado normal (animal injetado com NaCl 0,9%). (B) Animal tratado apenas com o EBU, demonstrando aspecto normal do órgão. Demais lâminas de dois animais do grupo tratados com EBU e injetados com DEN: (C e D) Animal 1; e (E e F) Animal 4, ambos com infiltrado inflamatório e necrose tecidual intensa no parênquima hepático. (A, B, D e F) aumento de 100X, (C e E) aumento de 40X. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
No que diz respeito à ação de subprodutos da uva na fase anterior à indução
do câncer, os dados são escassos. Em contrapartida, estudos apontam resultados
positivos do extrato de uva e/ou subprodutos como promissor agente hipolipemiante,
anti-inflamatório e anti-aterosclerótico.
Uma pesquisa avaliou o potencial quimiopreventivo da variedade de uva Vitis
vinifera em lesões de pele em ratos iniciadas pelo 7,12-dimetil-benz [a] antraceno
(DMBA) em dose única; e duas semanas após a iniciação, houve a promoção da
carcinogênese reaplicando o agente duas vezes por semana durante vinte semanas.
O tratamento tópico prévio (1 hora antes de cada aplicação) com o extrato da uva
resultou na proteção contra a tumorogênese cutânea, com a redução do número de
animais com tumor e o número de tumores por rato. Sugerindo, assim, que tal fruta
pode ser usada como um agente quimiopreventivo contra o estresse oxidativo e a
carcinogênese (ALAM et al, 2002).
Em base de dados da literatura científica, buscaram-se todos os trabalhos
experimentais, tanto in vivo quanto in vitro, que associavam a uva ou algum
subproduto da fruta à prevenção ou tratamento de carcinogenicidade. Foram
encontrados 36 trabalhos sobre o assunto, dentre estes, 12 artigos envolvendo
somente experimentos in vivo, 21 artigos contendo apenas experimentos in vitro e 3
artigos englobando ambos os métodos de pesquisa. A utilização da uva ou de seus
subprodutos se deu sempre na forma de extrato, variando sua composição em: uva
inteira, uva inteira sem semente, apenas semente, apenas casca e semente, suco da
fruta e vinho. Dos 36 artigos revisados, todos mostraram em seus resultados ao
menos um efeito benéfico do extrato direta ou indiretamente ligado ao processo de
carcinogenicidade. Na Tabela 1, encontram-se os efeitos gerais da atuação do
extrato, sendo os efeitos mais relatados o de indução de apoptose e atividade
antiproliferativa. Essa revisão mostrou que o extrato da uva, seja da própria fruta ou
seus subprodutos, tem um efeito benéfico quando relacionado ao câncer. Indicando
que tais produtos são promissores, podendo exercer uma ação quimiopreventiva e/ou
quimioterápica.
Tabela 1 – Quantidade de trabalhos experimentais sobre a atuação do extrato de uva ou de
seus subprodutos na carcinogenicidade, descritos na literatura até meados de outubro do ano
de 2012.
Tipo de trabalho Resultado encontrado
In vivo In vitro Apoptose 06 15
Inibição do estresse oxidativo 02 -
Proteção do sistema imunitário 01 -
Redução do crescimento de células cancerosas
04 12
Diminuição da proliferação celular 06 04
Aumento do dano ao DNA 01 02
Atividade antimetastática 02 01
Atraso na formação de tumor 01 -
Diminuição na incidência de tumores 01 -
Supressão da progressão do ciclo celular
02 01
Redução no percentual de implante 01 -
Redução do índice de invasão 02 -
Prevenção dos danos induzidos por UV 01 -
Fonte: ALAM et al., 2002; AGARWAL et al., 2002; CHATELAIN et al, 2011; CHEN et al., 2009; DHANALAKSHMI et al., 2003; DINICOLA et al., 2010; DINICOLA et al.,, 2012; FILIP et al., 2011; GAO, 2009; HANAUSEK et al., 2011; HUANG et al., 2008; HUDSON et al.,2007; KAUR et al., 2006; KAUR et al., 2008; KAUR et al., 2011; KIM et al., 2004; LAZZÈ et al, 2009; LEIFERT et al., 2008; MARTÍNEZ et al., 2005a; MARTÍNEZ, 2005b; MENIN et al., 2011; MORRÉ et al., 2006; PARK et al., 2011; RAINA, 2007; RAMCHANDANI, 2008; SHANG et al., 2008; SHARMA et al., 2004; SHROTRIYA et al., 2012; SINGH, 2004; SINGLETARY et al., 2003; TYAGI et al., 2003; VELIOGLU; et al., 1998; VELMURUGAN et al., 2010a; VELMURUGAN et al., 2010b; WEN et al., 2008; UCHINO et al., 2010
7 CONCLUSÕES
Baseando-se no fato de que no grupo de animais tratados com o extrato do
bagaço da uva após a exposição ao carcinógeno não houve achados de regeneração
hepática - como perda do parênquima hepático com distorção da arquitetura hepática
que resulta em fibrose, e regeneração nodular do parênquima por meio da
substituição por fibrose e hiperplasia biliar; assim como cicatrização pós-necrótica -
pode-se considerar um possível efeito protetor do extrato do bagaço da uva Moscato
canelli na carcinogênese química experimental pela inibição da iniciação e promoção
de lesões pré-neoplásicas em ratos. Esse possível efeito foi observado apenas
quando a suplementação foi empregada durante os estágios iniciais da
carcinogênese.
Animais tratados com o extrato anteriormente à exposição ao DEN não tiveram
proteção contra as lesões hepáticas provocadas pelo carcinógeno, na dose e tempo
utilizado nesse estudo, necessitando de mais estudos para identificar um possível
potencial quimiopreventivo da uva Moscato canelli.
Apesar dos resultados obtidos colaborarem com a utilização do bagaço da uva
como um possível agente protetor, maiores estudos são necessários para
compreender os mecanismos envolvidos nesses processos e para um promissor
emprego do bagaço como adjuvante no tratamento do câncer.
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