MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRO-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Desenvolvimento biotecnológico de uma emulsão de uso tópico a base de óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) LUCAS AMARAL MACHADO Natal-RN
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE · óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) LUCAS AMARAL MACHADO Natal-RN. LUCAS AMARAL MACHADO Desenvolvimento biotecnológico de uma
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PRO-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Desenvolvimento biotecnológico de uma emulsão de uso tópico a base de
óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw)
LUCAS AMARAL MACHADO
Natal-RN
LUCAS AMARAL MACHADO
Desenvolvimento biotecnológico de uma emulsão de uso tópico a base de
óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw)
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte como requisito
para obtenção do título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa de Egito
Co-orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior
Natal-RN
2015
“Há homens que lutam um dia e são bons.
Há outros que lutam um ano e são melhores.
Há os que lutam muitos anos e são muito bons.
Porém, há os que lutam toda a vida.
Esses são os imprescindíveis”
(Bertolt Brecht)
Dedico este trabalho:
Ao meu pai e ao meu irmão que em vida sonharam o meu
sonho ao meu lado, mas que hoje o realizam junto
comigo, na minha memória e em meu coração, dando-me
força, abençoando meus passos e sorrindo com as
vitórias que não são só minhas, mas nossas.
AGRADECIMENTOS
Em mais esta etapa de vida, várias pessoas foram essenciais para que eu
chegasse até esta fase do meu mestrado, e a elas eu presto meus
agradecimentos.
Agradeço à minha mãe, Ereni, pelo apoio e fé sempre depositados em mim
e nos meus sonhos.
À minha irmã, Paola, pelo importante papel que tem na minha vida.
À minha sobrinha Gabriela pela felicidade que me trouxe e por se tornar a
razão da minha vida.
Aos amigos Giovani Kolling, Roberta Timm, Alice Lüdtke, Rodolpho Brito
pelos momentos de conversas, conselhos e alegrias.
Aos que fazem parte do Laboratório de Sistemas Dispersos, especialmente
a Cybelle, Sarah, Rosilene e Christian Assunção e demais que compartilham
alegrias e conhecimentos no dia-a-dia.
Aos amigos e companheiros de equipe, Éverton, Andreza, Renata, Teresa,
Christian e Júnior Xavier pelo apoio em todos os momentos enfrentados no
desenvolver deste trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates pelos conhecimentos,
correções e suporte financeiro em aquisição de materiais necessários.
Ao Prof. Dr. Arnóbio Antônio, meu co-orientador, pelo apoio, disponibilidade
e correções.
Não menos importante, agradeço a CAPES pela bolsa concedida e CNPq
pelo financiamento de alguns matérias do projeto.
RESUMO
A pele é um dos maiores órgãos do corpo humano e representa cerca de
16% do peso corporal. A proteção do corpo frente a microrganismos do meio
externo é uma das suas mais importantes funções, devendo, a pele, manter-se
íntegra para que esta função seja exercida, de modo que, quando há uma lesão
na mesma, o processo de reestruturação necessita ser iniciado, podendo, ainda,
ser comprometido devido a algumas patologias, justificando ainda mais a
necessidade do desenvolvimento de produtos de uso tópico que favoreçam ou
mesmo acelerem a cicatrização da pele. Assim, o objetivo deste estudo foi extrair
e desenvolver uma emulsão adequada para uso tópico a base de óleo de rã-
touro. Duas amostras de óleo fora obtidas por diferentes métodos. As amostras
foram fisioquimicamente caracterizadas e seus compostos identificados através
de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM). O
equilíbrio hidrifílico-lipofílico requerido (EHLr) do óleo de rã-touro foi determinado
e em seguida um diagrama de fases construído. A estabilidade da emulsão de
uso tópico foi determinada. A análise de citotoxicidade do óleo de rã-touro in
natura e na emulsão de uso tópico foi realizada através do ensaio de MTT,
utilizando linhagem de fibroblastos normais (3T3) e de melanoma (B16F10). O
rendimento da extração a quente foi de 60,6%. Os principais compostos
insaturados foram o ácido eicosapentaenóico (17,6%) e ácido araquidônico
(8,4%). O estudo de EHLr demonstrou a presença de sistemas estáveis com EHL
entre 12 e 13,5 e o diagrama de fases revelou a predominância de sistemas
caracterizados como emulsão (62%). A emulsão tópica apresentou tamanho de
gotícula igual a 390 nm, polidispersão de 0,05, potencial zeta -25 mV e manteve-
se estável durante os 90 dias avaliados. O óleo de rã-touro e a emulsão tópica
não apresentaram citotoxicidade frente à linhagem de células 3T3. No entanto,
inviabilizaram (p > 0,05) o crescimento das células B16F10. Em conclusão, o óleo
de rã-touro apresenta características químicas desejáveis para o desenvolvimento
de sistemas terapêuticos de uso farmacêutico e/ou cosmético.
Palavras chaves: Óleo de rã-touro, Rana catesbeiana Shaw. Emulsão, EHL,
diagrama de fases, citotoxicidade.
ABSTRACT
The skin is one of the largest organs of the human body and accounts for about
16% of body weight. The body protection against the external environment
microorganisms is one of its most important functions, however is necessary that
the skin remain intact for this function be exercised, so that when there is an injury
on the skin, the process of restructuring needs to be starts, however this
restructuration may also be compromised due to some diseases, justifying even
more the need for the development of topical products that promote or accelerate
the skin healing. Thus the aim of this study was to extract bullfrog oil and to
develop a suitable topical emulsion. Two different oil samples were extracted by
hot or organic solvent process. Titration techniques and gas chromatography-
mass spectrometry were used to characterize the bullfrog oil. The required
hydrophile-lipophile balance (HLBr) of bullfrog oil was determined and a pseudo-
ternary phase diagram was constructed. The stability of the topical emulsion was
evaluated. Then, cellular viability was determined by MTT assay using normal
fibroblasts (3T3) and melanoma (B16F10) cells lines. The hot extraction yield was
60.6%. The major polyunsaturated compounds found were Eicosapentaenoic acid
(17.6%) and Arachidonic acid (8.4%). HLBr study demonstrated the presence of
stable systems with HLB ranging from 12.1 to 13.5 and the pseudo-ternary phase
diagram showed mainly emulsion systems (62%). Topical emulsion showed 390
nm, polydispersity 0.05, zeta potential -25 mV and remained stable for ninety
days. The bullfrog oil and topical emulsion did not showed citotoxicity in normal
fibroblasts cells. However, these systems showed significantly inhibition of
melanoma cells growth. In conclusion, the bullfrog oil presented desirable
chemical characteristics required to be used for the development of a
Sistemas emulsionados foram obtidos predominantemente (62%), os quais
apresentaram concentrações de água que variaram entre 20% a 80% e
concentrações de óleo de rã-touro até 60%. Estes resultados corroboram com
estudos como os de Prajapati et al. (2012), o qual demonstrou a formação de uma
emulsão com concentrações de óleo entre 30% e 50% (Prajapati, Dalrymple et al.,
2012) e também o estudo de Espinosa et al (2013), que por sua vez obteve
sistemas emulsionados com concentrações de lipídios entre 5% e 70% (Espinosa
e Scanlon, 2013). Também foram observados em nosso estudo a presença de
sistemas opacos com um leve grau de transparência (nanoemulsões, 6%),
sistemas límpidos e com alta viscosidade (géis, 2%) e sistemas transparentes
com elevadas concentrações de tensoativos (microemulsões, 4%). Sistemas
semelhantes têm sido desenvolvidos e caracterizados em outros estudos que
também utilizaram o diagrama de fases pseudoternário como ferramenta para
determinar as melhores concentrações dos componentes de sistemas
emulsionados (Moghimipour, Salimi et al., 2012; Nanjwade, Katare et al., 2013;
Patel, Barot et al., 2013). Portanto, com base nos resultados obtidos e devido ao
objetivo do estudo ser o desenvolvimento de uma emulsão tópica com caráter
externo aquoso, foi escolhido uma emulsão contendo 12% de óleo de rã-touro,
8% da mistura de tensoativos (Tween® 20:Span® 80, 6.29:3.71) e 80% de água.
5.4. DESENVOLVIMENTO DA EMULSÃO TÓPICA DE ÓLEO DE RÃ-TOURO
Uma emulsão tópica foi desenvolvida a partir da emulsão básica
selecionada no diagrama de fases pseudoternário. Esta emulsão foi desenvolvida
com a adição de excipientes com o intuito de melhorar as características
organolépticas do óleo de rã-touro, mantendo fixas as concentrações de óleo de
rã-touro e a mistura de tensoativos, definidas na emulsão básica. As emulsões
tópica e básica foram caracterizadas e suas estabilidades avaliadas a fim de
compará-las e então determinar se a adição dos excipientes aumenta sua
estabilidade.
Dentre os aspectos macroscópicos dos sistemas produzidos foi possível
observar a coloração branca, ausência de odor característico do óleo de rã-touro
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e sistema fluído (emulsão básica) e viscoso (emulsão tópica). Estas
características não sofreram alterações ao longo do estudo. No entanto, foi
observada que a emulsão tópica apresentou um índice de cremagem máximo de
2,4%, semelhante ao resultado obtido no estudo de EHLr (2,5%). Este mesmo
índice não pôde ser observado na emulsão tópica, uma vez que a alta
viscosidade reduz a motilidade das gotículas dispersas no sistema, melhorando
sua estabilidade (Allen, Popovich et al., 2011). O índice de cremagem é um
parâmetro importante para avaliar a estabilidade dos sistemas emulsionados,
visto que este fenômeno precede a coalescência e a separação de fases. Assim,
o conhecimento prévio sobre este índice, permite a reversão ou até mesmo a
prevenção da separação de fases do sistema através da adição de excipientes
que atuam como agentes de estabilidade (Lieberman, 1988).
A figura 6 apresenta os resultados obtidos nos ensaios de tamanho de
gotícula e pH das emulsões tópica e básica, analisadas por 90 dias. Foi
observado um aumento significativo do tamanho das gotículas na emulsão tópica
quando comparada com a emulsão básica. Este resultado pode ser explicado
pela adição de excipientes na fase interna da emulsão tópica. Ambas as amostras
não apresentaram variação significativa em seu tamanho durante os 90 dias
analisados, fato já esperado, uma vez que as instabilidades são influenciadas
principalmente pelo EHL requerido pelo óleo, o qual já havia sido previamente
estudado e definido. Assim, nossos resultados mostram-se em concordância com
a teoria descrita por Griffin, o qual diz que mantendo-se o EHLr é possível
desenvolver sistemas com a mesma estabilidade, provando que o EHL do óleo de
rã-touro é realmente 12,1 (Griffin, 1949).
Figura 6: Tamanho de gotícula e pH da emulsão básica e da emulsão tópica
durante 90 dias de análise. A: tamanho de gotícula; B: análise de pH.
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O potencial zeta da emulsão básica (-32.79 mV ± 2.90) e da emulsão
tópica (-25.02 mV ± 4.33) sugerem que estes sistemas são estáveis. Os valores
de potencial zeta superiores a 25 mV (valores absolutos) indicam que as forças
de repulsão são maiores que as forças de atração, mantendo, desta forma, as
gotículas dispersas (Netz e Ortega, 2002; Roland, Piel et al., 2003). A análise de
pH demonstrou que a emulsão tópica não apresenta variação significativa ao
longo dos 90 dias estudados, entretanto a emulsão básica se manteve estável
apenas até o 15° dia. A ausência de conservantes e de agentes antioxidantes
podem ter influenciado nestes resultados, uma vez que a degradação
microbiológica e/ou química podem promover a alteração de cor, odor e pH da
formulação (Aulton e Taylor, 2013).
A estabilidade das emulsões foi realizada e avaliada quanto suas
características organolépticas, resistência centrífuga e ciclos gelo/degelo. Ambas
as amostras mantiveram suas características organolépticas e apresentaram-se
resistentes ao ensaio de resistência centrífuga, demonstrando, desta forma, a
estabilidade física dos sistemas (Xavier, Silva et al., 2012). No estudo de ciclos
gelo/degelo, foi observada a separação de fases na emulsão básica a partir do
segundo ciclo, enquanto que a emulsão tópica permaneceu estável durante todos
os 6 ciclos realizados, indicando que a adição dos excipientes é responsável pela
melhora da estabilidade do sistema em elevadas variações de temperatura
(Cooper, 1981).
5.5. ENSAIO DE CITOTOXICIDADE
A viabilidade celular das linhagens 3T3 e B16F10, tratadas com óleo de rã-
touro e com a emulsão tópica em três diferentes concentrações foi avaliada
através do ensaio de MTT durante o período de 24, 48 e 72 horas.
O crescimento de células 3T3 não apresentou nenhuma diferença
estatística quando tratados com as amostras de emulsão tópica e óleo de rã-touro
quando comparados com o controle negativo (p < 0,05). Estes resultados foram
observados em todas as amostras ao longo das 72 horas avaliadas (Figura 7A).
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Desta forma, é possível sugerir que nenhuma das amostras possui atividade
citotóxica nestas concentrações frente a linhagem de células 3T3, o que indica
que o óleo de rã-touro pode ser adequado para desenvolvimento de sistemas
terapêuticos. Este é um resultado importante, uma vez que o conhecimento sobre
a segurança de produtos naturais é essencial em indústrias alimentícias e
farmacêuticas (Paiva, Rao et al., 1998; Paiva, Gurgel et al., 2004; Alencar, Xavier
et al., 2015).
Os resultados obtidos na linhagem de melanoma (B16F10) demonstraram
que as concentrações inferiores da emulsão tópica e do óleo de rã-touro (0,1
µg/mL e 10 µg/mL) não interferem na viabilidade celular. No entanto, as
concentrações elevadas (100 µg/mL), promoveram a redução da viabilidade
destas células ao longo do tempo, não havendo diferença significativa desta
inibição entre o óleo in natura e a emulsão tópica após as 48 horas de análise. A
emulsão tópica e o óleo de rã-touro demonstraram que apresentam citotoxicidade
dependentes da concentração e do tempo de incubação para a linhagem de
melanoma e acredita-se que esta atividade pode estar relacionada com a
presença do composto ethyl iso-allocholate, já que algumas bibliografias citam
que o mesmo possui atividades antiasmática e antitumoral (Saravanan,
Chandramohan et al., 2014), identificado na caracterização química deste óleo.
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Figura 7: Viabilidade celular da emulsão tópica e do óleo de rã-touro em
três concentrações destas amostras. A: viabilidade celular da linhagem 3T3; B:
viabilidade celular da linhagem B16F10.
Baseado nestes resultados é possível sugerir que o óleo de rã-touro é um
composto natural seguro e sua utilização sob a forma in natura ou adicionados em
um sistema emulsionado para uso tópico é adequado, uma vez que o óleo não
apresenta citotoxicidade. No entanto, quando incorporados em um sistema
emulsionado, há uma melhora nas características organolépticas do óleo de rã-
touro. Além disso, o óleo e a emulsão tópica mostraram atividade inibitória do
crescimento de células B16F10, sugerindo que este sistema poderia ser um
agente com potencial antitumoral.
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6. CONCLUSÕES
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6. CONCLUSÕES
Os resultados demonstram que:
O óleo de rã-touro obtido pela extração a quente a partir do tecido
adiposo da Rana catesbeiana Shaw apresentou uma rica
composição de ácidos graxos insaturados (ácido eicosapentaenóico
(17,6%) e ácido araquidônico (8,4%)).
O EHL capaz de produzir emulsões estáveis do tipo O/A contendo
óleo de rã-touro variou entre 12 e 13,5.
O diagrama de fases foi capaz de produzir sistemas dispersos, dos
quais 62% corresponderam a emulsões.
A emulsão básica deste desenvolvida neste estudo foi composta por
2.97% de Span® 80, 5.03% de Tween® 20, 12% de óleo de rã-touro
e 80% de água (v/v).
A emulsão tópica foi produzida na presença de excipientes e
apresentou-se mais estável em comparação com a emulsão básica,
preservando as características iniciais, obtidas no momento da
produção.
A emulsão tópica de óleo de rã-touro e o óleo in natura não
apresentaram citotoxicidade frente a linhagem de fibroblastos
normais, entretanto, promoveram a redução da viabilidade celular da
linhagem de melanoma.
Assim, é possível concluir que o óleo de rã-touro é um óleo apropriado
para o desenvolvimento de sistemas terapêuticos devido sua rica composição de
compostos bioativos que lhe confere potente atividade terapêutica. Possibilitando
o avanço dos estudos que visam não só comprovar sua atividade antitumoral,
mas também o desenvolvimento de novos sistemas que contribuam para o
avanço das pesquisas no combate ao câncer no mundo todo.
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7. PERSPECTIVAS
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7. PERSPECTIVAS
Avaliar, através de citometria de fluxo em qual fase de crescimento
celular o óleo e a emulsão tópica possuem atividade;
Realizar a marcação das amostras com substância fluorescente
para verificar se a atividade ocorre em nível superficial de
membrana ou se ocorre no interior da célula;
Avaliar atividade antitumoral;
Avaliar a cinética de liberação do óleo de rã-touro;
Testar os sistemas in vivo.
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8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
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8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Os trabalhos abaixo são produções relacionados aos resultados
apresentados neste documento.
Trabalhos apresentados em congressos
VERISSIMO, L. M. ; MACHADO, L.A. ; RUTCKEVISKI, R. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; DANTAS, T. R. F. ; OLIVEIRA, C. M. ; SILVA JUNIOR, A. A. ; EGITO, E.S.T. . Development of biotechnological emulsion based on bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oil: A preliminary study. 2014.
MACHADO, L.A. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; SANTOS, N. D. Uso de ativos naturais no tratamento da asma: revisão da literatura. In: XIV Congresso Científico e XIII Mostra de Extensão da UnP, 2012.
SANTOS, N. D. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; MACHADO, L.A. Estudo das propriedades terapêuticas da rã-touro (Rana catesbeiana Shaw). In: XIV Congresso Científico e XIII Mostra de Extensão da UnP, 2012.
Resumos publicados em anais de congressos
XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; MACHADO, L.A. ; RUTCKEVISKI, R. ; DANTAS-SANTOS, N. ; EGITO, E.S.T. ; VAUTHIER, C. . Emulsions based on natural oils as antimicrobial agents. In: XIIIèmes Journées de I'École Doctorale - Innovaton Thérapeutique, 2013, Kremlin-Bicêtre. XIIIèmes Journées de I'École Doctorale - Innovaton Thérapeutique, 2103.
MORAIS, A. R. V. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MACHADO, L.A. ; DANTAS, T. R. F. ; OLIVEIRA, C. M. ; DANTAS-SANTOS, N. ; VERISSIMO, L. M. ; EGITO, E.S.T. . Analyses of the glass transition temperature of microemulsion containing glucose and lactose by differential scanning calorimetry. In: 3rd Conference on Innovation in Drug Delivery: Advances in local drug delivery, 2013, Pisa. 3rd Conference on Innovation in Drug Delivery: Advances in local drug delivery, 2013.
MACHADO, L.A. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; DANTAS-SANTOS, N. . Uso de ativos naturais no tratamento da asma: revisão da literatura. In: XIV Congresso Científico e XIII Mostra de Extensão da UnP,
2012, Natal. Uso de ativos naturais no tratamento da asma: revisão da literatura, 2012. DANTAS-SANTOS, N. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; MACHADO, L.A. . Estudo das propriedades terapêuticas da rã-touro (Rana catesbeiana Shaw). In: XIV Congresso Científico e XIII Mostra de Extensão da UnP, 2012, Natal. Estudo das propriedades terapêuticas da rã-touro (Rana catesbeiana Shaw), 2012.
Resumos expandidos publicados em anais de congressos
SILVA-FILHO, M.A. ; RUTCKEVISKI, R. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; MORAIS, A. R. V. ; ALENCAR, E. N. ; MACHADO, L.A. ; OLIVEIRA, C. M. ; DANTAS, T. R. F. ; DANTAS-SANTOS, N. ; EGITO, E.S.T. . Quality control of bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oil: a contribution for the extraction and chemical identification. In: XXI International Conference on Bioencapsulation, 2013, Berlin. XXI International Conference on Bioencapsulation, 2013.
MORAIS, A. R. V. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MACHADO, L.A. ; OLIVEIRA, C. M. ; DANTAS, T. R. F. ; DANTAS-SANTOS, N. ; EGITO, E.S.T. . Optimization of lyophilization process of microemulsion containing lactose and glucose by experiment design. In: 3o Encontro Brasileiro de Inovação Terapêutica, 2013, Jaboatão dos Guararapes. 3o Encontro Brasileiro de Inovação Terapêutica, 2013.
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