UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE ... · ao Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva, como parte dos requisitos necessários ... pelo amor incondicional

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIENCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA

LORENA DE SOUZA ARAÚJO

Avaliação da atividade anti-inflamatória e antioxidante da Olmesartana em modelo

experimental de mucosite oral

NATAL-RN

2017

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LORENA DE SOUZA ARAÚJO

Avaliação da atividade anti-inflamatória e antioxidante da Olmesartana em modelo

experimental de mucosite oral

Dissertação de Mestrado apresentado

ao Programa de Pós-Graduação em Saúde

Coletiva, como parte dos requisitos necessários

à obtenção do título de Mestre em Saúde

Coletiva.

Área de Concentração: Odontologia

Orientadora: Profª Dr.ª Aurigena Antunes

de Araújo.

NATAL-RN

2017

1

Lorena de Souza Araújo

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTIOXIDANTE DA

OLMESARTANA EM MODELO EXPERIMENTAL DE MUCOSITE ORAL

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós Graduação em Saúde Coletiva da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Saúde Coletiva.

Aprovada em: ____/____/______

Banca Examinadora

Prof. Dr.ª Aurigena Antunes de Araujo Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

Orientadora

Profª Dr.ª Renata Ferreira de Carvalho Leitão Universidade Federal do Ceará (UFC)

Membro Externo

Profª Dr.ª Ruthineia Diogenes Alves Uchoa Lins Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

Membro Interno

2

Araújo, Lorena de Souza. Avaliação da atividade anti-inflamatória e antioxidante daOlmesartana em modelo experimental de mucosite oral / Lorena deSouza Araújo. - 2017. 59 f.: il.

Dissertação (Mestrado em Saúde Coletiva) - UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde,Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva, Natal, 2017. Orientador: Aurigena Antunes de Araújo.

1. Mucosite oral - Dissertação. 2. Olmesartana Medoxomila -Dissertação. 3. Inflamação - Dissertação. I. Araújo, AurigenaAntunes de. II. Título.

RN/UF/BSO BLACK D17

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento deOdontologia

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Dedico este trabalho à minha família, amigos e mestres.

4 AGRADECIMENTOS

A Deus, por todas as bênçãos derramadas em minha vida, por me amparar em todos os momentos, pelo amor incondicional e por colocar tantas pessoas maravilhosas em meu caminho.

Aos meus amados pais por me ensinarem os princípios que formaram o meu caráter, pelo apoio e incentivo em cada passo dado. Em especial, minha mãe, Luiza Maria, pelo amparo de toda uma vida.

Ao meu melhor amigo e noivo, Victor Hugo, com amor, admiração e gratidão por sua compreensão, carinho, presençaa e incansável apoio ao longo do período de elaboração deste trabalho.

A minha orientadora, Aurigena Antunes de Araújo, que nos anos de convivência, muito me ensinou, contribuindo para meu crescimento científico e intelectual. Acreditou no meu trabalho e me incentivou, desde o princípio. A sua paixão pela pesquisa e pela docência, certamente, foi uma motivação para meu ingresso e perseverança no curso de mestrado.

A todos os colaboradores e envolvidos na Base de Pesquisa de Farmacologia, em especial o professor Dr. Raimundo de Araújo, a professora Drª. Caroline Addison, os colegas pós-graduandos, Maisie, Susana, Cristiane, Hugo, Roseane, Thais e Vinícius, por conhecimentos compartilhados e disponibilidade.

A dona Neida, por me auxiliar e dedicar tanto esforço, conhecimento e tempo para realização dessa pesquisa.

A Laura, Luiz, Roberto, Matheus por auxilio, dedicação e disponibilidade em ajudar.

Aos técnicos em laboratório, Flávio, César, Carla e Lourdinha pelo apoio, esforço e dedicação durante todo o desenvolvimento da pesquisa.

Aos membros das bancas, de qualificação e defesa, por aceitarem o convite e se dedicarem para a construção de um trabalho melhor.

A todos que, direta ou indiretamente, participaram da minha formação.

5

“Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima.”

(Louis Pasteur)

6 RESUMO

A Mucosite Oral (MO) é uma das principais complicações envolvidas no tratamento do câncer, em especial, da região de cabeça e pescoço. Trata-se de uma inflamação que afeta a mucosa da cavidade oral e se caracteriza clinicamente pelo surgimento de lesões eritematosas, ulceradas e dolorosas, o que pode ocasionar, em casos mais graves, interrupção do tratamento quimioterápico. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da Olmesartana (Olme), um antagonista do receptor AT1 da angiotensina II (Ang II), na mucosite oral. Foi realizado um ensaio pré-clínico, in vivo, randomizado, cego, com utilização de grupos controles. 42 hamsters Golden Siriam foram divididos em 6 grupos: Controle, Trauma Mecânico, 5-FU, Olme 1mg/kg, Olme 5mg/kg e Olme 10mg/kg. Nos grupos doentes a MO foi induzida nos dois primeiros dias do experimento com um quimioterápico, o 5-fluorouracil (5-FU, 60 mg/kg dia 1 e 40 mg/kg dia 2). Os animais foram pré-tratados com Olme oral (1, 5, ou 10 mg/kg) ou veículo (controles) 30 min antes da injeção de 5-FU e diariamente até o décimo dia. As amostras de mucosa da bochecha foram submetidas a análise macroscópica, histopatológica, análise de atividade enzimática bioquímica e imunohistoquímica. Reações em cadeia de polimerase de transcriptase reversa (RT-PCRs) foram utilizadas para quantificar a expressão de NF-κB, p65, PI3K e MKP1. Os níveis de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e quinase regulada extracelularmente (ERK) foram analisados com Western Blot. O tratamento com 10 mg/kg de Olme reduziu os níveis de ulceração, mieloperoxidase (MPO) e malonaldeído (MDA), inflamação celular, edema e hemorragia (todos p <0,05). O tratamento com Olme de 10 mg/kg também reduziu os níveis do fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β, aumentando a expressão PI3K e diminuindo a expressão de NFKB, p65, MKP1 e diminuindo os níveis de iNOS e ERK1/2. A utilização da Olme na dose de 10 mg/kg reduziu o dano e a inflamação da mucosa associados com a MO induzido por 5-FU.

Palavras-chave: Mucosite oral; Olmesartana; Inflamação.

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ABSTRACT

Oral Mucositis (MO) is one of the main complications involved in the treatment of cancer, especially in the head and neck region. It is an inflammation that affects the mucosa of the oral cavity is clinically characterized by erythematous, ulcerated and painful lesions, Which can lead, in more severe cases, to an interruption of chemotherapy treatment. The aim of this study was to evaluate the effect of Olmesartan (Olme), an angiotensin II (Ang II) receptor antagonist, on oral mucositis. A pre-clinical trial was performed, in vivo, randomized, blind, with use of control groups. 42 Golden Siriam hamsters were divided into 6 groups: Control, Mechanical Trauma, 5-FU, Olme 1mg/kg, Olme 5mg/kg and Olme 10mg/kg. In the diseased groups MO was induced on the first two days of the experiment with a chemotherapeutic, 5-fluorouracil (5-FU, 60 mg / kg day 1 and 40 mg / kg day 2). Animals were pretreated with oral Olme (1, 5, or 10 mg/kg) or vehicle (control) 30 min before 5-FU injection and daily until day 10. Cheek pouch samples were subjected to histopathologic analysis, protein/immunology analysis, and immunoistochemistry. Reverse transcriptase polymerase chain reactions (RT-PCRs) were used to quantitate expression of NF- κBp65, PI3K, and MKP1. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) and extracellular regulated kinase (ERK)1/2 levels were analysed with immunoblots. Treatment with 10 mg/kg Olme reduced ulceration, myeloperoxidase (MPO) and malonaldehyde (MDA) levels, cellular inflammation, edema, and hemorrhage (p<0.05). The 10 mg/kg Olme treatment also reduced tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, increasing expression PI3K, and decreasing expression of NFKBp65, MKP1, and decreasing iNOS and ERK1/2 levels. Olme at a dose of 10 mg/kg prevented the mucosal damage and inflammation associated with 5-FU– induced OM.

Keywords:Oralmucositis;Olmesartan;inflammation.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Figura 1. A sequência biológica da mucosite pode ser dividida em cinco fases:

iniciação, geração mensagem, amplificação e sinalização, ulceração, cicatrização.

Adaptado de Sonis (2004) …………………………………………………………….…………19

Figura 2. Estrutura química da molécula de 5-fluorouracil. Adaptado Grem (2001) …..…22

Figura 3. O papel dos macrófagos no processo inflamatório e seus fenótipos. Na fase inicial

do reparo da ferida, após a exposição a citocinas pró-inflamatórias, interferons (IFNs),

PAMPs ou DAMPs, monócitos infiltrantes e macrófagos residentes são ativados e,

principalmente, adquirem um fenótipo pró-inflamatório M1. Eles realizam a fagocitose de

micróbios, eliminam detritos celulares e produzem mediadores pró-inflamatórios. Mais

tarde, durante o processo de cicatrização, a IL4, a IL-10, os Glucocorticóides e as

Prostaglandinas (PGs) induzem os macrófagos a transitar para um fenótipo M2 reparador.

Os macrófagos também removem os neutrófilos nas feridas por fagocitose, um elemento

central para induzir a mudança do fenótipo M1-M2 dos macrófagos. Adaptado de LANDEN

et al., (2016)..……………………………………................…………………………………….24

Figura 4. Estrutura química da Olmesartana. Adaptado de Mire et. al. (2005).…………..27

Figura 5. Desenvolvimento do modelo experimental ………………………………………..31

Figura 6. Aspectos macroscópicos da mucosa de hamsters, após 10 dias de experimento:

controle (A), Trauma Mecânico (B); 5-FU (C); Olme 1 mg/kg (D), Olme 5 mg/kg (E) e Olme

10 mg/kg (F)……………………………………….………………………………………………40

Figura 7. Aspectos microscópicos tecidual da mucosa de hamsters, após 10 dias de

experimento:. Grupo controle (A, E, I); Trauma Mecânico (B, F, J); 5-FU (C, G, K); Olme 1

mg/kg (D), Olme 5 mg/kg (H) e Olme 10 mg/kg (L)….……………………………………….41

Figura 8. Níveis de MDA (A) e GSH (B) dosados em fragmentos de mucosa de hamsters,

após 10 dias de experimento: nos grupos controle, trauma mecânico, 5-FU, Olme 1mg/kg,

Olme 5mg/kg e Olme 10mg/kg. (*p <0.05, **p < 0.01, ***p<0.001) …………………………42

Figura 9. Níveis de MPO (A), IL-1β (B) e TNF-α (C) dosados em fragmentos de mucosa de

hamsters, após 10 dias de experimento: nos grupos controle, trauma mecânico, 5-FU, Olme

1mg/kg, Olme 5mg/kg e Olme 10mg/kg. (*p <0.05, **p < 0.01, ***p<0.001) …........……..43

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Figura 10. Fotomicrografias do tecido da mucosa mostrando a imunomarcação para FGF,

TGF-β, MMP-2 e SOD. Grupo controle (A, B, C, D), 5-FU (E, F, G, H) e Olme10 mg/kg (I,

J, K, L). As imagens são mostradas em uma ampliação de 40 ×. Bar = 100 μm. (* P <0,05;

*** p <0,001, teste de Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn) …………………….. …….44

Figura 11. Análise RT-PCR em tempo real da expressão gênica. Efeitos de Olme sobre

NF-kB p65, Pi3K e MKP1 expressão de mRNA .(*** p <0,001* p <0,05) (N = 4 animais por

grupo; Análise duplicada, teste ANOVA seguido de Bonferrone).……………...................45

Figura 12. Immunoblotting. iNOS, ERK 1/2. As bandas foram visualizadas com um sistema

ECL (BioRad). O sinal de quimioluminiscência foi detectado com um sistema ChemiDocTM

XRS (BioRad) e quantificado densitométricamente no software ImageJ (NIH, Bethesda,

MD). (* P <0,05) …………………………………………….........................………………….46

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Sequência de expressão gênica…………………………………………………….38

Tabela 2. Escores, por grupos, das análises macroscópica e microscópica………………41

Tabela 3. Dosagem de ALT, AST, Uréia e Creatinina de todos os grupos experimentais..47

Tabela 4. Contagem global de leucócitos e bacteremia……………………………………..47

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-FU 5-fluorouracil

AA Ácido araquidônico

AINEs Anti-inflamatórios não-esteroides

ALT Alanina transaminase

Ang Angiotensina

Ang I Angiotensina I

Ang II Angiotensina II

ARB Bloqueador do receptor de Angiotensina

AST Aspartato transaminase

AT1R Receptor do tipo 1 de Angiotensina II

AT2R Receptor do tipo 2 de Angiotensina II

BSA Albumina do soro bovino

cDNA DNA complementar

CEUA Comissão de Ética no Ensino e Pesquisa em Animais

cGMP Monofosfato cíclico de guanosina

COX Ciclo-oxigenase

DAMPs Padrões moleculares associados ao dano

DNA Ácido desoxirribonucleico

ECA Enzima Conversora da Angiotensina

ERK Quinase regulada extracelularmente

FDA Food and Drug Administration

FGF Fator de crescimento fibroblástico

GADPH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

GPRC Receptor acoplado à proteína G

12

GSH Glutationa

HE Hematoxilina-Eosina

HTAB Tampão de brometo de hexadecil-metil-amônio

IHC Imuno-histoquímica

IL Interleucina

iNOS Óxido nítrico sintetase induzível

i.p Intraperitonial

K+ Potássio

kg Quilograma

LAFICA Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer

MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno

MDA Malonaldeído

mg Miligrama

MKP1 Fosfatase-1 da proteína quinase ativada por mitógeno

mL Mililitro

mM Milimolar

MMP Metaloproteinase

MO Mucosite Oral

MPO Mieloperoxidase

Na+ Sódio

NF-κB Fator nuclear-kappa B

NFκBp65 Subunidade do complexo de transcrição NF-κB

nm Nanometro

nmol Nanomol

Olme Olmesartana

OMS Organização Mundial de Saúde

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PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos

PBS Tampão fosfato-salino

PGs Prostaglandinas

pg Picograma

PI3K Fosfatidilinositol-3-quinase

RNA Ácido ribonucleico

RNAm RNA mensageiro

ROS Espécies reativas de oxigênio

RT-PCR PCR em tempo real

SOD Superóxido dismutase

TGF Fator de transformação de crescimento

TNF-α Fator de Necrose Tumoral - α

TLRs Receptores Toll-like

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

μg Micrograma

μL Microlitro

μm Micrómetro

°C Grau Celsius

°GL Gay Lussac

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO …………………………………….………………………………………………….16

2. REVISÃO DA LITERATURA………………….……………………………..……….……………..18

2.1. MUCOSITE ORAL………………………………………………………………………..………..18

2.2. 5-FLUOROURACIL ……………………………………………………………..…………………21

2.3. INFLAMAÇÃO …………………………………………………………………………..……….…22

2.4. ANGIOTENSINA II ……...……………………………………………………………..…………..25

2.5. OLMESARTANA………………………………………………….……………………..………….26

3. OBJETIVOS………………………………..……………………………….…………………………28

3.1. OBJETIVO GERAL…………………………………………………………………………………28

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………………………………28

4. MATERIAIS E MÉTODOS………………………………………………….………………………..29

4.1. DESENHO DO ESTUDO ………………………………………………………………………….29

4.2. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS………………………………………………………………………29

4.3. LOCAL DOS EXPERIMENTOS…………………………………………………………………..29

4.4. ANIMAIS E CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS………………………………………………20

4.5. ADMINISTRAÇÃO DA OLMESARTANA ………………………………………………………..30

4.6. DESENVOLVIMENTO DO EXPERIMENTO…………………………………………………….30

4.7 TIPOS DE ANÁLISE………………………………………………………………………………..32

4.7.1.Análise macroscópica da mucosa oral……………………………….……………….….32

4.7.2. Estudo Morfológico……………………………….………………………………………..32

4.7.3. Análise Imunohistoquímica ……………………………….………………………………33

4.7.4. Dosagem de Mieloperoxidase (MPO) …………………………………………………..35

4.7.5. Dosagem de Malonaldeído (MDA)……………………………………………………….35

4.7.6. Dosagem de Glutationa (GSH)……...……………………………………………………36

4.7.7. Dosagem dos níveis de IL-1β e TNF-α (ELISA)…..…………………...……………….36

4.7.8. Avaliação da Expressão Gênica por RT-PCR (PCR em tempo real)……..…………37

4.7.9. Análise de imunomarcação de proteínas (Western-blot)……..……………...………..38

4.7.10. Quantificação de leucócitos, análise bioquímica e análise de bacteremia…………39

15

4.8.ANÁLISE ESTATÍSTICA……………………………………………………………………………39

5. RESULTADOS …………………………………………………………………………………..……40

5.1. Efeitos do tratamento com Olmesartana nas lesões mucosas e morfologia do tecido……..40

5.2. Estresse oxidativo…………………………………………………………………………………..42

5.3. Expressão de enzimas, proteínas e genes envolvidos na inflamação e na formação de tecido de granulação……………………………………………………………………………………….43

5.4. Efeitos sistêmicos da Olmesartana……………………………………………………………….47

6. DISCUSSÃO.………………………………………………………………………….………………48

7. CONCLUSÃO……………………………………………………………………………………….…52

8. REFERÊNCIAS…………………………………….……………………………….…………………53

9. ANEXO……………………………………………….……………………………….………………..59

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1. INTRODUÇÃO

A Mucosite Oral (MO) é uma inflamação que afeta a mucosa da cavidade oral e se

caracteriza clinicamente pelo surgimento de lesões eritematosas, ulceradas e dolorosas

(MERAW; REEVE, 1998). Alguns fatores etiológicos podem estar associados à mucosite,

como traumas físicos na mucosa, deficiências nutricionais e, principalmente, tratamentos

quimio e radioterápicos(KÖSTLER et al., 2006; SPIJKERVET et al., 1989)

A patogênese da MO, induzida por químio e radioterapia, envolve as fases de

iniciação, caracterizada pelo dano ao DNA celular; a fase de resposta ao dano primário,

com a ativação de fatores de transcrição como o fator nuclear kB (NF-kB); a amplificação

do sinal com a ativação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-1β; Culminando na

fase de ulceração da mucosa e, posteriormente, cicatrização (SONIS et al., 2004).

Atualmente, o tratamento da MO visa aliviar a sintomatologia dolorosa, característica

da mucosite, e acelerar o processo de cicatrização. Dessa forma, tem sido descrito na

literatura a utilização da crioterapia (LILLEBY et al., 2006), laserterapia de baixa potência

(BENSADOUN et al., 1999) e diferentes formas de tratamento farmacológico (BARASCH

et al., 2006; EPSTEIN; SCHUBERT, 1999).

Dentre os fármacos utilizados para o tratamento da mucosite estão aqueles que

atuam sobre vias de sinalização conhecidas e relacionadas com a doença, incluindo

bloqueadores mTOR (SLOMOVITZ et al., 2015), agonista de receptor gama ativado por

proliferador de peroxissoma (MANGONI et al., 2017), fator de crescimento do endotélio

vascular de alta afinidade A (todas as isoformas) e ligandos B, fator de crescimento

placentário (COLEMAN et al., 2011) e o palifermin, um derivado recombinante do fator de

crescimento de queratinócitos humanos. O palifermin é o primeiro agente bioativo aprovado

pela Food and Drug Administration (FDA), dos Estados Unidos da América, para a

prevenção da MO (VADHAN-RAJ et al., 2013).

Uma das classes de medicamentos que tem chamado atenção pelos seus efeitos

pleiotrópicos antiinflamatórios são os Bloqueadores da Angiotensina II (Ang II). Sabe-se

que além de suas ações regulatórias cardiovasculares, a aldosterona-renina-angiotensina

também tem efeitos sobre o processo inflamatório (GUERRA et al., 2015, 2016; LIU et al.,

2015). A Ang II medeia as suas ações fisiológicas através dos receptores de Ang II tipo I

(AT1R) e tipo 2 (AT2R) (MONTEZANO et al., 2014). A ativação de Ang II na sinalização do

receptor AT1 envolve mediadores do processo inflamatório e tem demonstrado um

17

aumento na ativação do NF-κB, o estresse oxidativo e a produção de citocinas inflamatórias

(MYKHIN et al., 2005; URSO; CAIMI, 2011).

A Olmesartana é um tipo de bloqueador dos receptores da angiotensina que atua

bloqueando o tipo 1 dos receptores da angiotensina II (AT1R). Verificou-se estes

bloqueadores têm atividade antioxidante e anti-inflamatória (ARAÚJO et al., 2013;

GUERRA et al., 2016). Contudo, os efeitos do antagonista do receptor AT1R olmesartan

(Olme) no processo inflamatório e na cicatrização da mucosite oral, ainda não foram

investigadas em estudos clínicos e pré-clinicos, in vivo. Assim este estudo se propõe a

investigar os efeitos de Olmesartana sobre o processo inflamatório e a cicatrização de

feridas em um modelo experimental de mucosite oral, identificando vias de sinalização

relacionadas ao antagonismo do AT1-R.

18

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Mucosite Oral

A mucosite oral acomete, de forma grave, cerca de 30% a 40% dos pacientes com

câncer no mundo todo, em decorrência da radioterapia e/ou quimioterapia. Entretanto,

quando se refere ao tratamentos de neoplasias de cabeça e pescoço e pacientes que serão

submetidos ao transplante de medula, a incidência é elevada para mais de 60 (SONIS et

al., 2004). Trotti e colaboradores (TROTTI et al., 2003), em uma revisão sistemática,

apresentaram a mucosite como um frequente, e grave, efeito colateral do tratamento do

câncer, passível de ocasionar a hospitalização dos doentes, devido à necessidade de

nutrição enteral ou parenteral, e/ou interrupção do tratamento radio e quimioterápico.

As implicações clínicas da mucosite estão associadas ao caráter doloroso, que

muitas vezes impossibilita os indivíduos de se alimentarem, podendo causar desnutrição,

bem como pode direcionar um ajuste de dose do quimioterápico e, consequentemente,

comprometer a eficácia do tratamento do câncer (KÖSTLER et al., 2006). O trato

gastrointestinal é severamente afetado pela toxicidade dos agentes terapêuticos anti-

neoplásicos em função de suas características morfológicas e com alta frequência de

renovação celular, sendo afetado clinicamente após 48 horas da exposição a quimioterapia.

A mucosa oral apresenta um epitélio escamoso estratificado, desenvolvendo a MO após

cerca de uma semana após a primeira exposição aos quimioterápicos. Um agravante da

mucosite oral é o atrito constante de alimentos, dentes e língua (MERAW; REEVE, 1998).

Por sua vez, há também danos indiretos que podem ser ocasionados devido à

imunosupressão e ao aumento do risco de infecções bacterianas e fúngicas (SONIS; FEY,

2002).

A caracterização das fases da doença, desenvolvida por Sonis (SONIS et al., 2004),

está representada na figura 1, na qual pode-se observar também uma diferença quanto à

iniciação provocada pelas terapias utilizadas contra o câncer. Sabe-se que a quimioterapia

tem efeito sistêmico, enquanto a radioterapia tende a ser limitada a uma determinada

região. Os regimes de administração das terapias também são diferentes. Enquanto a

quimioterapia pode ser administrada em um curto período de tempo, a radioterapia

normalmente é aplicada em um protocolo de semanas, com doses menores por um período

de tempo prolongado. A diferença no protocolo resulta em mucosite com características

mais agudas quando resultante da toxicidade quimioterápica, enquanto a de origem

19

radioterápica é mais crônica. Entretanto, apesar do tempo das fases serem diferentes, a

sequencia se mantém.

Sonis et al (SONIS et al., 2004) caracterizaram a patogênese da mucosite induzida

pela radiação e pela quimioterapia, em 05 fases: 1) Fase de Iniciação: A radioterapia e a

quimioterapia induzem a ruptura da cadeia de DNA e causam lesão imediata das células

basais. Ao mesmo tempo que numa cascata de eventos complementares, o produto do

estresse oxidativo também se apresenta como iniciador; 2) Fase da resposta de dano

primário: fatores de transcrição são ativados. O fator nuclear-kB (NF-kB) parece ser o mais

relevante, o mesmo é ativado por radiação e quimioterapia e pode regular positivamente

genes que levam à produção de um grupo de citocinas inflamatórias, incluindo o fator de

necrose tumoral α (TNF-α) e a interleucina 1β (IL-1β); 3) Fase de amplificação do sinal: O

TNF-α ativa a via de ceramida e caspases levando a lesão no tecido e ativa as vias de

transcrição mediadas através de NF-kB. Num circuito de retroalimentação, estes processos

resultam na produção adicional de citocinas inflamatórias e também ativam

metaloproteinases de matriz levando a injúria tecidual direta; 4) Fase de Ulceração: os

danos anteriores resultam em ulceração, alteração mais significativa no hospedeiro após

radioterapia e quimioterapia. Devido à imunossupressão dos pacientes, a mucosa ulcerada

permite a invasão de microorganismos da boca para a circulação sistêmica, causando

septicemia; 5) Fase de cicatrização: sinalização para a renovação da proliferação e

Figura 1. A sequência biológica da mucosite pode ser dividida em cinco fases: iniciação, geração mensagem, amplificação e sinalização, ulceração, cicatrização. Fonte: Adaptado de Sonis (2004)

20

diferenciação das células epiteliais. A microbiota oral é também restabelecida. No entanto,

alterações epiteliais secundárias à radioterapia e à quimioterapia permanecem (BISWAL,

2008; SONIS et al., 2004).

A Organização Mundial de Saúde (OMS) classifica a MO de acordo com a gravidade:

na mucosite grau I observa-se apenas a mucosa esbranquiçada ou eritematosa,

especialmente a jugal; o grau II é caracterizado pelo aparecimento de pequenas úlceras

dolorosas; no caso de úlceras que ocupem regiões maiores e refletem na dificuldade de

alimentação, tem-se o grau III; já no grau IV a doença chegou no estágio em que há

necessidade de internação, devido ao comprometimento de toda a mucosa e à

impossibilidade do paciente de se alimentar por via oral. O diagnostico é realizado pelo

exame clínico oral, associado à sintomatologia e ao estado nutricional do paciente (PICO;

AVILA-GARAVITO; NACCACHE, 1998).

Embora sejam conhecidas as implicações clínicas envolvidas na progressão da

doença, não há, atualmente, uma forma de tratamento completamente eficaz. O tratamento

utilizado está voltado não para conter a progressão da doença, mas para alívio da

sintomatologia dolorosa, seja com fármacos locais (EPSTEIN; SCHUBERT, 1999),

sistêmicos (BARASCH et al., 2006) ou com outras terapias, como o laser de baixa

intensidade (BENSADOUN et al., 1999).

O palifermin, fator de crescimento de queratinócitos recombinante 1 (rHuKGF-1), é

o primeiro agente bioativo aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), agência

norte-americana, para a prevenção da MO (VADHAN-RAJ et al., 2013), porém já foi

mostrado que o mesmo tem potencial de causar eventos adversos resultantes da sua ação

farmacológica na pele e epitélio oral, como erupção cutânea, prurido, eritema, parestesia,

alterações na boca e língua e alteração do paladar (SPIELBERGER et al., 2004). Além dos

possíveis efeitos colaterais, uma preocupação importante sobre o KGF é a presença do

seu receptor em células malignas (OELMANN et al., 2004), trazendo a possibilidade do

KGF exógeno estimular células tumorais. Tal possibilidade é altamente indesejada, em

especial, em pacientes já em tratamento do câncer. Assim, ainda existe a necessidade de

se buscar terapias com o objetivo de prevenir e tratar a mucosite oral.

Os anti-inflamatórios não-esteroides (AINEs) são conhecidos há bastante tempo e

continuam sendo uma das classes de fármacos mais prescritas em todo mundo. Apesar da

eficácia no tratamento da inflamação, da dor e do edema, sabe-se que essa classe de

fármacos causa significativos efeitos adversos (RANDALL; SELITTO, 1957). Um importante

21

componente do mecanismo de ação dos AINEs é a inibição da enzima ciclo-oxigenase

(COX), podendo ser inibidores seletivos da COX-2 ou não seletivos, convencionais (LAINE,

2003).

A principal causa dos efeitos adversos dessa classe de fármacos ocorre em função

da ampla variedade de papeis desempenhados pelas prostaglandinas (PGs) no organismo.

As PGs são produto da ação enzimática da COX sobre o ácido araquidônico (AA). O AA é

um produto resultante da degradação de fosfolípidios, que ocorre por ação da enzima

fosfolipase A2 (presente nos leucócitos e plaquetas), ativada por citocinas pró-

inflamatórias, como a IL-1 (ONG et al., 2010). A inibição, seletiva ou não, da COX, resulta

na redução de prostaglandinas, as quais estão envolvidas em diversos mecanismos, como:

inflamação, coagulação sanguínea, metabolismo ósseo, cicatrização de feridas, função

renal, resposta imune, entre outros (LAINE, 2003).

Portanto, diante das complicações relacionadas aos AINEs e necessidade da busca

de formas de prevenção e tratamento da doença, além do alívio da sintomatologia, os

pesquisadores voltam sua atenção para a síntese de novas substâncias com atividades

antiinflamatórias ou a realização de pesquisas para a avaliação de substâncias já

conhecidas utilizadas comumente para o tratamento de outras patologias.

2.2. 5-fluorouracil

A instalação do processo de estresse oxidativo ocorre a partir de um desequilíbrio

entre compostos oxidantes e antioxidantes, resultante de um excesso de radicais livres, em

relação a atividade dos antioxidantes. Tal elevação na quantidade de radicais livres

promove dano às células e tecidos (HALLIWELL; WHITEMAN, 2004).

Agentes quimioterápicos, durante o tratamento do câncer, induzem o estresse

oxidativo. Tal estresse causa danos diretos às células, tecidos e vasos sanguíneos, além

de estimular fatores de transcrição, em especial, o NF-κB, que regula a expressão de genes

pró-inflamatórios (SONIS; FEY, 2002).

De uma forma geral, esses agentes interferem no DNA celular e seus precursores,

inibindo a síntese de proteínas ou causando danos irreversíveis ao material genético. Rang

et.al. (RANG, H.P., RITTER, J.M., FLOWER, R.J., HENDERSON, 2016) classificaram os

fármacos anticâncer como: agentes alquilantes e substâncias relacionadas,

antimetabólitos, antibióticos citotóxicos, derivados de plantas, hormônios, antagonistas

hormonais, anticorpos monoclonais, inibidores de quinases proteicas e outros agentes.

22

O 5-fluorouracil pertence ao grupo dos antimetabólitos, inibe a síntese de DNA e

RNA de diversas formas e é amplamente utilizado no tratamento de adenocarcinomas de

cabeça e pescoço, carcinomas do trato gastrointestinal superior, de mama, entre outros

(LONGLEY; HARKIN; JOHNSTON, 2003). O principal mecanismo de citotoxicidade do 5-

FU é o bloqueio da enzima timidilato sintase, componente necessário para a síntese de

DNA. Além disso, o 5-FU possui outros mecanismos, entre eles, a incorporação ao DNA e

RNA. O objetivo desses mecanismos é a inibição da síntese de DNA e, consequentemente,

a proliferação celular (GREM, 2001; MCCARTHY et al., 1998; RUSTUM et al., 1997).

As neoplasias humanas mais sensíveis ao tratamento do câncer são aquelas que

possuem maior quantidade de células proliferando. Sendo assim, os tecidos não

neoplásicos que mais sofrem com os efeitos colaterais do tratamento com o 5-FU, são os

que proliferam com maior frequência, como a medula óssea, os folículos pilosos e o epitélio

do trato digestivo, estando assim mais sujeitos à lesão (RANG, H.P., RITTER, J.M.,

FLOWER, R.J., HENDERSON, 2016). A mucosa oral, assim como a mucosa de todo o trato

digestivo, está muito exposta ao efeito colateral do fármaco quimioterápico devido à sua

necessidade constante de renovação celular.

2.3. Inflamação

A fase inflamatória é resultante de uma ação coordenada entre o sistema imune e o

tecido lesado (LAINE, 2003). A resposta do organismo ao dano se caracteriza pela ativação

de vias de sinalização que regulam mediadores pró-inflamatórios e antiinflamatórios em

células presentes no tecido lesado e recrutamento de leucócitos do sangue (SONIS et al.,

2004).

Na mucosite oral, as fases de sinalização e amplificação do sinal são marcadas pela

ativação de fatores de transcrição, em especial o NF-kB, por radiação e quimioterapia e,

consequente regulação positiva de genes que levam à produção de um grupo de citocinas

Figura 2. Estrutura química da molécula de 5-fluorouracil (5-FU). Adaptado Grem (2001)

23

inflamatórias, incluindo fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 1β (IL-1β);. O TNF-

α ativa a via de ceramida e caspases levando a lesão tecidual e ativa as vias de transcrição

mediadas por NF-kB. Num circuito de retroalimentação, estes processos resultam na

produção adicional de citocinas inflamatórias e também ativam metaloproteinases de matriz

(MMPs), levando a injúria tecidual direta.

Como consequência da lesão ao tecido, as células da mucosa, por exemplo,

queratinócitos, macrófagos, fibroblastos e mastócitos, estão sujeitas a dois tipos de alertas:

os padrões moleculares associados ao dano (DAMPs), que são moléculas liberadas por

células mortas, como proteínas intracelulares e material genético; e os padrões moleculares

associados a patógenos (PAMPs), que são moléculas exógenas ao hospedeiro, produzidas

por agentes patógenos, por exemplo, polissacarídeos e polinucleótideos bacterianos

(STRBO; YIN; STOJADINOVIC, 2014). Após o dano, esses sinais de perigo são

reconhecidos pelos receptores de reconhecimento de padrões, em especial, os receptores

Toll-like (TLRs). A estimulação dos TLRs, presentes na células, induz a ativação de vias de

sinalização intracelular, incluindo o fator nuclear kappa de células B ativadas (NF-κB) e

proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK), relacionada com a proliferação e

diferenciação celular, os quais promoverão a expressão de vários genes, citocinas e

quimiocinas pró-inflamatórias, a fim de ampliar a resposta (LANDÉN; LI; STÅHLE, 2016).

As citocinas desempenham papeis fundamentais nas respostas inflamatória e

imune. Se tratam de glicoproteínas, produzidas pelas células, que atuam como

mensageiros químicos, podendo modular (aumentando ou reduzindo) a resposta do

organismo (ZHANG; AN, 2007). Na mucosite, em especial, é possível destacar o papel pró-

inflamatório da IL-1β e TNF-α. A IL-1β possui diversos efeitos biológicos, incluindo o

aumento da expressão de uma variedade de genes envolvidos na resposta inflamatória,

citocinas e outros mediadores, juntamente com o TNF-α, atua na ativação da via NF-kB,

agindo de uma forma sinérgica, levando a indução de moléculas de adesão essenciais para

o início da resposta (ONG et al., 2010). Já a IL-10, está intimamente relacionada com a

redução da resposta inflamatória, através da supressão das citocinas, quimiocinas,

moléculas de adesão e demais mediadores pró-inflamatórios, incluíndo o NF-kB (ZHANG;

AN, 2007). Tal função, demonstra a importância do aumento da IL-10 em situações em

que a inflamação potencializa o dano tecidual, como é o caso da MO.

24

A fosfatase-1 da proteína quinase ativada por mitógeno (MKP1), que é induzida pelo

estresse oxidativo celular (CHANG et al., 2015), desencadeia a ativação da via de quinase

regulada extracelularmente (ERK).

A sinalização pró-inflamatória gerada à partir da IL-1β, TNF-α, quimiocinas e sinais

de perigo recruta neutrófilos e monócitos do sangue para fora do vaso, os quais são

atraídos para o local do tecido lesado (REINKE; SORG, 2012). Os macrófagos recrutados

da lâmina própria da mucosa e os diferenciados a partir dos monócitos recrutados da

corrente sanguínea são ativados de forma clássica (fenótipo M1), realizam fagocitose de

patógenos e restos celulares, além de amplificar a resposta inflamatória produzindo, em

Figura 3. O papel dos macrófagos no processo inflamatório e seus fenótipos. Na fase inicial do

reparo da ferida, após a exposição a citocinas pró-inflamatórias, interferons (IFNs), PAMPs ou

DAMPs, monócitos infiltrantes e macrófagos residentes são ativados e, principalmente, adquirem

um fenótipo pró-inflamatório M1. Eles realizam a fagocitose de micróbios, eliminam detritos

celulares e produzem mediadores pró-inflamatórios. Mais tarde, durante o processo de

cicatrização, a IL4, a IL-10, os Glucocorticóides e as Prostaglandinas (PGs) induzem os

macrófagos a transitar para um fenótipo M2 reparador. Os macrófagos também removem os

neutrófilos nas feridas por fagocitose, um elemento central para induzir a mudança do fenótipo

M1-M2 dos macrófagos. Fonte: Adaptado de LANDEN et al., (2016).

25

associação com os neutrófilos, citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-1β, IL-6, óxido

nítrico sintase induzível (iNOS) e MMPs (BARRIENTOS et al., 2008; GALLI;

BORREGAARD; WYNN, 2011; LANDÉN; LI; STÅHLE, 2016). As MMP-2 e MMP-9 são

secretadas como enzimas capazes de degradar a matriz extracelular e membrana basal,

principalmente o colágeno, elastina e fibronectina (Figura 3).

Em contrapartida, os macrófagos também desenvolvem um importante papel na

transição da fase inflamatória para a fase de cicatrização. Há uma mudança do fenótipo

pró-inflamatório M1, para o fenótipo reparador M2, ativado pela expressão de citocinas anti-

inflamatórias (por exemplo, IL-10) e fatores de crescimento, como o fator de transformação

de crescimento (TGF-β) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), produzidas

pelos macrófagos na ausência de neutrófilos, o que suprime a produção de mediadores

pró-inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β, IL-6 (DE WAAL MALEFYT et al., 1991) e promove

a proliferação fibroblástica, formação da matriz extracelular e angiogênese (GALLI;

BORREGAARD; WYNN, 2011; LANDÉN; LI; STÅHLE, 2016)

A via PI3K (PI3K/AKT/mTOR) é bem caracterizada pelo seu papel na sobrevivência

celular e pode representar um mecanismo compensatório em relação a NF-kB e MAPK,

com objetivo de limitar os eventos pró-apoptóticos e pró-inflamatórios em resposta ao

estímulo séptico (DUBROVSKA et al., 2009; LIU et al., 2009). As PI3Ks são enzimas

envolvidas na fosforilação do lipídio de membrana inositol, mediando a transdução celular

de sinal. A ativação da PI3K por receptores, gera um segundo mensageiro o PIP3

(fosfatidilinositol 3,5 trifosfato). O PIP3 recruta a AKT/PKB (proteína cinase B), a AKT

fosforila e ativa o mTORC1, uma proteína cinase chave na regulação da sobrevivência

celular, a diferenciação, crescimento, proliferação, metabolismo, migração e angiogênese

(DUBROVSKA et al., 2009; HSIEH et al., 2012; LIU et al., 2009).

2.4. Angiotensina II

A Angiotensina II é o peptídeo mais relevante quando se trata de mediação da ação

vascular, sendo assim, um dos principais responsáveis pela regulação da pressão

sanguínea, liberação de aldosterona e homeostase de eletrólitos e fluídos. A formação da

Ang II se dá à partir do angiotensinogênio (produzido pelo fígado), transformado,

inicialmente em angiotensina I (Ang I), pela ação enzimática da renina. Em seguida a ação

da enzima conversora de angiotensina (ECA) sobre a Ang I gera a Ang II, durante a

passagem sanguínea pelos pulmões (BRUNTON et al., 2010).

26

Dentre as funções e efeitos do sistema renina-angiotensina estão: o aumento da

resistência periférica total, o que resulta rapidamente na vasoconstrição; alteração da

função renal, aumentando a reabsorção de sódio (Na+) e potássio (K+) e alterando a

hemodinâmica renal; alteração da estrutura cardiovascular, estimulando a migração,

proliferação e hipertrofia das células musculares lisas vasculares e aumento da produção

de matriz extracelular pelos fribroblastos cardíacos. Este conjunto de mecanismos com o

objetivo de elevar a pressão arterial. Porém, é sabido que, a ativação dos receptores AT1

também estimula a atividade de NADH/NADPH oxidase, ligada a membrana, que promove

a liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS), sinalizando diversas cascatas

envolvidas na inflamação, promovendo a ativação de MAPK, NF-kB, moléculas de adesão

e citocinas pró-inflamatórias (BRUNTON et al., 2010).

Portanto, observa-se que além do importante papel na regulação da homeostase

circulatória, a Ang II age também como um mediador pro-inflamatório através da

estimulação do receptor AT1. Por essa razão, supõe-se que a concentração de Ang II é

aumentada no tecido durante o processo inflamatório, aumentando também a

permeabilidade vascular (através da liberação de prostaglandinas e VEGF) e a liberação

de ROS ativando a via NF-κB e, consequentemente, regulando positivamente mediadores

pró-inflamatórios, como citocinas e quimiocinas (CHANG; WEI, 2015).

Diante disso, tem-se buscado investigar o papel da angiotensina II (Ang II) na MO

(ARAÚJO et al., 2013) através da modificação na via clássica do sistema renina-

angiotensina aldosterona. Estudos recentes tem mostrado que a modificação desta via, por

inibição seletiva dos receptores AT1 - através do uso de fármacos da classe dos

bloqueadores do receptor de angiotensina - resulta em uma atividade anti-inflamatória

(GUERRA et al., 2015, 2016; LIU et al., 2015). Atestando o envolvimento direto da Ang II

na sinalização de mediadores do processo inflamatório, ativação do NF-κB, aumento do

estresse oxidativo e, consequente, produção de citocinas inflamatórias.

2.5. Olmesartana

A Olmesartana (Olme) é um fármaco da classe dos bloqueadores do receptor de

angiotensina (ARB), um antagonista seletivo dos receptores da angiotensina II, que atua

bloqueando o tipo 1 dos receptores da angiotensina II (AT1-R), levando a prevenção da

vasoconstrição, redução da retenção de sódio e água, e diminuição da proliferação celular

e hipertrofia. Além de promover o bloqueio dos AT1-R, Olmesartana também apresenta

27

efeito inibitório sobre a Enzima Conversora da Angiotensina (ECA), prevenindo um

aumento nos níveis de angiotensina II (KOIKE; SADA; MIZUNO, 2001).

Trata-se de um pró-fármaco, Olmesartan medoxomilo, o qual, após a administração,

há um rompimento da fração éster, liberando a forma ativa, a olmesartana não esterificada

(RNH-6270) (KOIKE; SADA; MIZUNO, 2001; MIRE; SILFANI; PUGSLEY, 2005). O efeito

resultante do bloqueio da via clássica da Angiotensina e sua ligação ao recetor AT1 ocorre

nos tecidos, incluindo o músculo liso vascular e a glândula suprarrenal, independente da

origem ou via de síntese da angiotensina II. O antagonismo seletivo da Olme induz um

aumento nos níveis plasmáticos de renina, angiotensina I e angiotensina II e diminuição

das concentrações plasmáticas da aldosterona. O efeito resultante do bloqueio da via

clássica da Angiotensina e sua ligação ao recetor AT1 em tecidos, incluindo o músculo liso

vascular e a glândula suprarrenal (GARDNER; FRANKS, 2003; KOIKE; SADA; MIZUNO,

2001; MANORIA; MANORIA; MANORIA, 2006).

A eficácia na redução da pressão arterial, em pacientes com hipertensão leve a

moderada, foi demonstrada em ensaios clínicos randomizados, em comparação com

placebo e com outros anti-hipertensivos, como atenolol, captopril, losartana, valsartana,

candesartana, felodipino, anlodipino e olmesartana + hidroclorotiazida (BALL; WILLIAMS;

STUMPE, 2001; MIRE; SILFANI; PUGSLEY, 2005; OPARIL et al., 2001; STUMPE;

LUDWIG, 2002). Swindle et. al. (SWINDLE et al., 2011) afirmaram que o tratamento com

Olme foi associado a menor risco de eventos cardíacos e menor custo dos recursos de

saúde em relação a outros ARBs, durante um seguimento médio de 2 anos e meio.

Figura 4. Estrutura química espacial da Olmesartana. Fonte: adaptado de Mire et. al. (2005).

28

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral:

- Avaliar a atividade antioxidante e anti-inflamatória da Olmesartana, um antagonista

do receptor AT1 da angiotensina II, em modelo experimental de mucosite oral.

3.2. Objetivos específicos:

- Avaliar macroscópicamente e morfologicamente os efeitos da Olmesartana em

modelo experimental de mucosite oral;

- Avaliar o estresse oxidativo através dos níveis de Malonaldeído (MDA), Glutationa

(GSH) e Superoxido dismutase (SOD) em modelo experimental de mucosite oral;

- Avaliar os níveis de citocinas IL-1β, TNF-α,

- Avaliar a atividade da Mieloperoxidase (MPO);

- Avaliar a marcação tecidual dos fatores de crescimento FGF, TGF-β e

metaloproteinase (MMP-2);

- Avaliar a Expressão Gênica por RT-PCR (PCR em tempo real) dos genes NFKBP65,

MKP1 e Pi3K;

- Analisar a quantificação proteica de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e quinase

regulada pela sinalização extracelular (ERK);

-Avaliar a condição sistêmica dos animais, pela dosagem de ALT, AST, creatininina e

ureia, contagem de leucócitos e bacteremia.

29

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. DESENHO DO ESTUDO

Trata-se de um ensaio pré-clínico, in vivo, randomizado, cego, controlado por placebo.

4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

A experimentação animal seguiu o protocolo aprovado pela Comissão de Ética no

Ensino e Pesquisa em Animais (CEUA) - UFRN, protocolo nº 14/2016 (anexo 1).

4.3 LOCAL DOS EXPERIMENTOS

Os procedimentos experimentais e laboratoriais, incluindo o preparo e a

manipulação dos animais, a coleta de materiais orgânicos e os diferentes tipos de análise

foram realizados pelo laboratório de Farmacologia do Centro de Biociências da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, e laboratório de histologia do

departamento de Morfologia do mesmo centro. As análise por Western Blotting foram

realizadas no Departamento de Morfologia da Universidade Federal do Ceará - UFC.

4.4 ANIMAIS E CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS

Foram utilizados 42 hamsters Golden Syrian (Mesocricetus auratus), machos, com,

aproximadamente, 90 dias de vida e 140g. Os hamsters foram mantidos sob condições de

humidade controlada (45-55%), sala climatizada (22ºC ±2ºC), e com ciclo claro-escuro de

12-12horas durante os experimentos. Eles receberam acesso livre a alimentos

padronizados de roedores e água.

- Grupo Controle: Grupo cujos animais (7) não foram submetidos à indução da Mucosite

Oral (MO). Animais receberam administração intraperitoneal da solução salina no 1° e 2°

dia. No quarto dia foram anestesiados, mas não receberam trauma mecânico e gavagem

diária utilizando o veículo usado para dissolver a olmesartana (água destilada).

- Grupo Trauma Mecânico (TM): Grupo cujos animais (7) foram submetidos somente a um

trauma mecânico na região da mucosa no 4° dia. Animais receberam administração

intraperitoneal da solução salina no 1° e 2° dia, sendo tratados por gavagem diária

utilizando o veículo usado para dissolver a olmesartana (água destilada).

30

- Grupo 5-FU: Grupo cujos animais (7) foram submetidos ao trauma mecânico na região

da mucosa 4° dia e além disso foram submetidos ao quimioterápico 5- fluorouracil 1° e

2° dia. Animais foram tratados com gavagem diária utilizando o veículo usado para

dissolver a olmesartana (água destilada).

- Grupo Olme 1mg/kg: Grupo cujos animais (7) foram submetidos ao trauma mecânico na

região da mucosa 4° dia e submetidos ao quimioterápico 5- fluorouracil 1° e 2° dia.

Animais foram tratados com gavagem diária utilizando a Olmesartana dissolvida em água

destilada, na dose de 1mg/kg.

- Grupo Olme 5mg/kg: Grupo cujos animais (7) foram submetidos ao trauma mecânico na

região da mucosa 4° dia e submetidos ao quimioterápico 5- fluorouracil 1° e 2° dia.

Animais foram tratados com gavagem diária utilizando a Olmesartana dissolvida em água

destilada, na dose de 5mg/kg.

- Grupo Olme 10mg/kg: Grupo cujos animais (7) foram submetidos ao trauma mecânico

na região da mucosa 4° dia e submetidos ao quimioterápico 5- fluorouracil 1° e 2° dia.

Animais foram tratados com gavagem diária utilizando a Olmesartana dissolvida em água

destilada, na dose de 10mg/kg.

4.5. ADMINISTRAÇÃO DA OLMESARTANA

Um comprimido da Olmesartana medoxomil (Benicar®) 20mg foi triturado

diariamente com o auxílio de grau e pistilo. Em seguida, foi adicionada água destilada

(veículo) para compor as soluções nas concentrações adequadas para cada grupo. A

administração da Olme nas doses de 1mg/kg, 5mg/kg e 10 mg/kg foi realizada, por via oral,

através de gavagens diárias. A gavagem é um procedimento de inserção de uma cânula

(própria para hamsters) por via oral, até a porção gástrica do animal, no qual a solução é

administrada através de uma seringa descartável acoplada à cânula. Trata-se de um

procedimento indolor, realizado conforme exigências éticas.

4.6. DESENVOLVIMENTO DO EXPERIMENTO

Utilizou-se o modelo de mucosite oral experimental, desenvolvido por Sonis e

colaboradores (SONIS et al., 1990) e adaptado no Laboratório de Farmacologia da

Inflamação e do Câncer (LAFICA) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, da

Faculdade de Medicina – UFC (LEITÃO et al., 2007; LIMA et al., 2005). A MO foi induzida

31

por uma Injecção intraperitonial (i.p.) de 5-fluorouracil (5-FU) numa dose de 60 mg/kg no

dia 1°, seguido por administração de 5-FU i.p. na dose de 40 mg/kg no dia 2°. No dia 4°,

induziu-se um trauma mecânico com uma agulha romba de calibre 0,7x 25 sob anestesia

(cetamina 80 mg/kg e xilazina 10 mg/kg), a fim de reproduzir os sinais clínicos da irritação

crônica e como fator potenciador para a mucosite. Os animais do grupo controle e trauma

mecânico, receberam i.p. solução salina, em vez de 5-FU. Olme foi administrado por via

oral (gavagem) durante 10 dias (Figura 5). A gavagem foi realizada uma hora antes da

administração de 5-FU e da indução do trauma.

No dia 10 de tratamento, os animais foram eutanasiados com uma sobredosagem

de tiopental a 2% (80 mg/kg i.p.). As amostras de sangue foram colhidas por punção

cardíaca. Conjuntos de amostras de tecidos foram coletados e armazenados em paralelo

para análises, de acordo com cada ensaio. Especificamente, as amostras utilizadas para

analise histopatológica, imuno-histoquímica (IHC) e análise de imunofluorescência foram

armazenadas em formaldeído a 10%, as amostras que foram utilizados para a reação em

cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) foram colocados e armazenadas

em Trizol (-80 °C) e amostras a serem utilizadas para Western Blot, mieloperoxidase

(MPO), malonaldeído (MDA) e glutationa (GSH) foram congelados a -80°C.

Figura 5.Desenvolvimento do modelo experimental.

32

4.7. TIPOS DE ANÁLISE

4.7.1.Análise macroscópica da mucosa oral

As amostras de tecido da mucosa oral foram análisadas macroscopicamente. Os

parâmetros avaliados foram a presença e a intensidade do eritema, hiperemia, hemorragia,

úlceras e abcessos, os quais foram classificados conforme estudos anteriores (DE

ARAUJO et al., 2015; MEDEIROS et al., 2011):

Escore 0, mucosa completamente saudável, sem a erosão ou a vasodilatação;

Escore 1, presença de eritema, mas sem evidência de erosão na MO;

Escore 2, eritema grave, vasodilatação e erosão superficial;

Escore 3, formação de úlceras em uma ou mais faces da mucosa, mas não afetando mais

de 25% da área superficial da MO, bem como eritema grave e vasodilatação;

Escore 4, formação cumulativa de úlceras de cerca de 50% da área superficial da MO;

Escore 5, impossibilidade de exposição da MO devido a ulceração completa.

4.7.2. Estudo Morfológico

As amostras foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10%, desidratadas e

embebidas em parafina. Seções ultra-finas (5 μm) foram coradas com hematoxilina e

eosina, foi realizado processamento histológico detalhado a seguir:

- Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

Álcool etílico 80°GL (2 minutos); Álcool etílico 95°GL (2 minutos); Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

- Passagem em xilol, 3 banhos de 1 hora cada;

- Inclusão em parafina;

- Cortes seriados de 4μm em micrótomo;

- Montagem sobre lâminas de vidro;

- Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos cada);

- Hidratação em cadeia descendente de etanóis:

Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

33

Álcool etílico absoluto II (5 minutos); Álcool etílico absoluto III (5 minutos); Álcool etílico 95°GL (5 minutos); Álcool etílico 80°GL (5 minutos); - Lavagem em água destilada; - Coloração pelos métodos HE ou Tricrômio de Mallory;

- Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

Álcool etílico 80°GL (2 minutos); Álcool etílico 95°GL (2 minutos); Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

- Passagens rápidas em xilol (3 trocas);

- Montagem das lâminas em resina Permount®

A infiltração de células inflamatórias, a vasodilatação, a presença de hemorragia, edema,

ulcerações e abscessos foram determinadas de forma unicega, examinadas por

microscopia ótica e classificadas como se segue (MEDEIROS et al., 2011):

Escore 1, epitélio normal e tecido conjuntivo sem vasodilatação, ausência ou discreta

infiltração celular, e ausência de áreas hemorrágicas, ulcerações ou abscessos;

Escore 2, vasodilatação discreta ou áreas de re-epitelização, infiltração inflamatória discreta

com prevalência mononuclear e ausência de áreas hemorrágicas, edema, ulcerações ou

abscessos;

Escore 3, vasodilatação moderada, áreas de degeneração epitelial hidrópica, infiltração

inflamatória com prevalência de neutrófilos, presença de áreas hemorrágicas, edema e

eventual ulceração e ausência de abscessos;

Escore 4, vasodilatação grave e infiltração inflamatória com neutrófilos.

4.7.3. Análise Imuno-histoquímica

Secções de tecido com 4 μm de espessura (3 amostras por grupo) foram obtidas

utilizando um micrótomo e transferidas para lâminas especiais cobertas por gelatina, sendo

posteriormente cada secção desparafinizada e reidratada. Os cortes da mucosa foram

lavados e incubados com os seguintes anticorpos primários (Santa Cruz Biotechnology,

Interprise, Brasil): FGF, 1: 400; TGF, 1: 400; MMP-2, 1: 400 e SOD, 1: 400. Os cortes foram

lavados e incubados com os anticorpos secundários estrepto-avidina conjugada com HRP

34

(Biocare médicos, Concord, CA, EUA) durante 30 minutos. A imuno-reatividade foi

visualizada usando um kit para detecção colorimétrica seguindo as instruções do fabricante

(TrekAvidin-HRP rótulo + kit, Biocare médicos, Dako, EUA).

O detalhamento do processamento imunohistoquíco está descrito a seguir:

Amostras submetidas a cortes com 4 μm de espessura; Transferência para lâminas silanizadas; Desparafinização: 2 banhos em xilol à temperatura ambiente (10 minutos cada); Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis: Álcool etílico absoluto I (5 minutos); Álcool etílico absoluto II (5 minutos); Álcool etílico absoluto III (5 minutos); Álcool etílico 95°GL (5 minutos); Álcool etílico 80°GL (5 minutos); Passagens rápidas em água destilada (2 trocas); Recuperação antigênica (Proteinase K); Lavagem com PBS; Passagens rápidas em água destilada (2 trocas); Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% (10 volumes), em

proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (10 minutos cada);

Lavagem em água corrente (10 minutos); Passagens rápidas em água destilada (2 trocas); Aplicação da proteína block por 10 minutos (BSA 0,05% em PBS); Passagens rápidas em água destilada (2 trocas); Dupla lavagem com PBS; Aplicação do anticorpo primário específico e incubação (overnight); Remoção do excesso do anticorpo primário com a pipeta com PBS; Aplicação do anticorpo secundário kit DAKO LAB (LSAB+System-HRP); Dupla lavagem com PBS; Strepto-avidina HRP (30 minutos); Dupla lavagem com PBS; Incubação com DAB (10 minutos); Lavagem com água destilada; Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (5 minutos); Lavagem com água corrente;

35

Desidratação em cadeia ascendente de etanóis: Álcool etílico 80°GL (2 minutos); Álcool etílico 95°GL (2 minutos); Álcool etílico absoluto I (5 minutos); Álcool etílico absoluto II (5 minutos); Álcool etílico absoluto III (5 minutos); Passagens rápidas em xilol (3 trocas); Montagem das lâminas em resina Permount®

4.7.4. Dosagem de Mieloperoxidase (MPO)

A extensão do acúmulo de neutrófilos em amostras da mucosa oral foi medida

através da dosagem de MPO. Amostras de tecido recolhidas no dia do sacríficio dos

animais foram armazenadas a -80ºC até sua utilização. As amostras foram

homogeneizadas e centrifugadas, a atividade MPO foi avaliada de acordo com o método

de Kaplow descrito na literatura (BRADLEY; CHRISTENSEN; ROTHSTEIN, 1982).

As amostras de tecido foram homogeneizadas em tampão de brometo de hexadecil-

metil-amônio (HTAB), mantendo a proporção de 50mg de tecido para, 1mL de HTAB. Em

seguida, o homogenato foi submetido à ação do sonhador por 5 minutos e realizados dois

ciclos de congelamento/descongelamento. Então, centrifugaram-se as amostras a

5.000rpm, a 4ºC, por 20 minutos. Terminada a centrifugação, 0,1ml do sobrenadante de

cada amostra foi removido, montado em uma placa de 96 poços, e a este foi adicionado

2ml da solução de o-dianisidina, tampão fosfato de sódio, peróxido de hidrogênio e água

destilada. Esta mistura foi colocada em um espectrofotômetro a fim de medir a absorbância

a 450nm nos tempos 0, 30 segundos, 78 segundos e 5 minutos. Considerando que uma

unidade de MPO equivale a uma mudança na absorbância de 1,13x10-2 nm. Com os tempos

acima descritos, foi feita uma curva e foi escolhido o tempo de 1 minuto como o mais

representativo do evento.

4.7.5. Dosagem de Malonaldeído (MDA)

O malonaldeído (MDA) é um produto final resultante da peroxidação lipídica, foi

utilizado, neste estudo, para quantificar o aumento de radicais livres presentes na mucosa

(MAYNE, 2003). O conteúdo de MDA foi medido como descrito, em detalhe anteriormente

(SIDDIQUE; ARA; AFZAL, 2012). Resumidamente, as amostras (4 por grupo) foram

suspensas em tampão Trisma (1:5, p/v),cortadas com tesoura, durante 15 seg, em cima de

36

uma placa que estava acondicionada com gelo. A suspensão resultante foi homogeneizada

durante 2 min e depois centrifugada a 2500xg, a 4°C, durante 10 min. Combinou-se 300 μl

de sobrenadante de cada amostra com 750 μl de reagente cromogénico [10,3 mM 1-metil

fenilindole em acetonitrilo + 225 μl HCL (37%)] em tubos Eppendorff, sob uma cobertura. A

mistura foi deixada incubando num banho de água morna (45°C) durante 40 min,

centrifugada a 2500×g durante 5 min a 4°C e depois alíquotas de 300 μL de cada tubo

foram lidas por espectrofotometria UV/visível (Bioplus 2000, São Paulo, Brasil) a 586 nm.

Os resultados foram lidos por interpolação em relação a uma curva padrão e são expressos

como nmol/g de tecido.

4.7.6. Dosagem de Glutationa (GSH)

O conteúdo de GSH foi medido como descrito anteriormente na literatura (HU, 1994).

As amostras de da mucosa foram homogeneizadas (4 / grupo) e armazenadas em ácido

etilenodiamina-tetra-acético 0,02 M a -80°C em 0,25 mL de solução a 5%, depois foi

adicionado 320 mL de água destilada e 80 mL de ácido tricloroacético a 50%. As amostras

foram centrifugadas a 3000 x g durante 15 min a 4 ° C. O sobrenadante (400 μL) foi

combinado com 800 μL de tampão Tris 0,4 M (pH 8,9) e 20 μL de ácido ditiobis-2-

nitrobenzóico 0,01 M). A absorbância foi medida a 420 nm, e os resultados são relatados

como unidade de GSH/g de tecido.

4.7.7. Dosagem das concentrações teciduais de IL-1β e TNF-α (ELISA)

Foi realizada a coleta de amostras de mucosa oral (4 por grupo) e armazenamento

a -80C° para depois serem analisadas. Posteriormente essas amostras foram

homogeneizadas e processadas, como descrito, em pormenor, na literatura (SAFIEH-

GARABEDIAN et al., 1995).

Resumidamente, determinou-se interleucina (IL) -1β (intervalo de detecção, 62,5-

4000 pg/mL, limite mínimo de detecção: 12,5 ng/mL) e fator de necrose tumoral (TNF)-α

(gama de detecção, 62,5-4000 pg/mL; Limite mínimo de detecção: 50 ng/ml) usando kits

comerciais de ensaio imunoenzimático (R & D Systems, Minneapolis, MN).

As placas de microtitulação foram revestidas com anticorpos de captura anti IL-1β e

TNF-α durante a noite, a 4°C e incubadas, durante 16 h, depois disso, foram lavadas três

vezes com tampão de lavagem (0,05% de Tween® 20 em PBS, pH 7,2-7,4); realizou-se o

bloqueio por adição de 300 mL de regente (1% de BSA em PBS, pH 7,2-7,4), durante 1

hora; Foram lavadas três vezes com tampão de lavagem, depois foram adicionadas

37

amostras e padrões, e incubadas, durante 2 h, à temperatura ambiente. As placas foram

lavadas três vezes com tampão de lavagem em seguida, adicionou-se 100 ul do anticorpo

de detecção, diluído, em cada poço, durante 2 h, foram lavadas três vezes com tampão de

lavagem, adicionou-se 100 ul da diluição de trabalho de estreptavidina-HRP (1: 5000), em

cada poço, durante 20 minutos, à temperatura ambiente. Realizaram-se as ultimas três

lavagens, com tampão de lavagem e adicionou-se 100 ul de solução de substrato a cada

poço, durante 20 minutos; reação enzimática foi parada com H2SO4 e as medições foram

realizadas com a(CHOMCZYNSKI; SACCHI, 2006)bsorbância a 490 nm. Os valores

resultantes são expressos em pg/mL.

4.7.8. Avaliação da Expressão Gênica por RT-PCR (PCR em tempo real)

A análise por RT-PCR foi realizada com o iniciador de SYBR Green Master Mix. As

amostras de RNA total foram extraídas dos tecidos da mucosa jugal com o reagente Trizol

(Life Technologies, CA) (CHOMCZYNSKI; SACCHI, 2006) e depois isoladas e purificadas

com um Sistema de Isolamento de RNA SV (Promega Corporation, EUA). A concentração

de RNA foi determinada medindo a densidade óptica a um comprimento de onda de 260

nm (OD260), com uma unidade de densidade equivalente a 40 μg/ml de RNA. O cDNA foi

produzido a partir do RNA isolado (5 μg) numa mistura reacional contendo 4 μL de tampão

de reação 5x, 2 μl de dNTP (10 mM), 20 unidades de inibidor de RNase, 200 unidades de

transcriptase reversa de mieloblastose aviária e 0,5 μg de Primer oligo Dt (High-capacity

cDNA Rverse Transcription Kit, Foster City, CA) num volume total de 20 μl. Deixou-se

prosseguir a reação a 42°C durante 60 min e depois extinguiu-se por aquecimento a 70°C

durante 10 min.

A expressão gênica foi avaliada por amplificação por PCR com os pares de

iniciadores (Tabela 1) em placas num termociclador Step-One-Plus (Applied Biosystems,

EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada 1×PCR Master Mix, foram

adicionados 2,5 μl de cDNA num volume final de 20 μl. As condições de PCR foram as

seguintes: 95°C durante 5 min, quarenta ciclos de 30s a 95°C, 30s a 52-60°C (alvo) e 60s

a 72°C. A quantidade relativa comparada ao grupo controle (grupo sem ligação + solução

salina) foi calculada pelo método Ct comparativo, em que Ct é o número do ciclo no qual o

nível de fluorescência excede primeiro o limiar. Os valores de Ct reportados foram obtidos

subtraindo os valores de Ct detectados para o gene alvo daquele detectado para um gene

de referência, nomeado, GADPH. A especificidade dos produtos de PCR obtidos foi

confirmada com curvas de melting.

38

4.7.9. Análise de imunomarcação de proteínas (Western-blot)

Os segmentos de tecido da mucosa jugal foram homogeneizados em tampão de lise

RIPA (Tris-HCL 25 mmol/L, pH 7,6, NaCl 150 mmol/L, EDTA 5 mmol/L, NP40 1%, triton X-

100 a 1%, desoxicolato de sódio a 1% 0,1% de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida) e

inibidor de protease (1 μL em 100 μL de RIPA). Após centrifugação (17 min, 4°C, 13 000

rpm), recolheu-se o sobrenadante e determinou-se as concentrações de proteína por

ensaio com ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific) de acordo com o protocolo do

fabricante. Realizou-se eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida-

poliacrilamida (10% ou 8%) com alíquotas de 40 μg de proteína que tinha sido preparada

em tampão de amostra Laemmli (BioRad) e desnaturada a 95°C durante 5 minutos. As

bandas de proteína resultantes foram transferidos para uma membrana PVDF (BioRad),

durante 2 horas, bloqueada com BSA a 5% durante 1 h, incubados durante a noite com um

anticorpo primário (anti-β actina, SC-81178, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology, Anti-óxido

nítrico sintase induzível-iNOS-sc8310, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, ou anti-quinase

regulada pela sinalização extracelular (ERK) 1/2, 136200, 1: 500, Invitrogen) e depois

incubadas durante 1h e 30min com um anticorpo secundário (goat anti-rabbit, 656120,

1:1000; or goat anti-mouse IgG, 626520, 1:500; Invitrogen). As bandas foram visualizadas

com um sistema ECL aplicado de acordo com as instruções do fabricante (BioRad). O sinal

de quimioluminescência foi detectado com um sistema ChemiDocTM XRS (BioRad) e

quantificado densitometricamente em software ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Tabela 1. Sequência de expressão gênica

Fonte: Autor (2017)

Genes (espécie) Primer Iniciador Primer Reverso

GADPH (Hamster Golden Sirium)

GGTTGCCAAACCTTATCAGAAATG TTCACCTGTTCCACAGCCTTG;

NFKBP65 (Hamster Golden Sirium)

TCTGCTTCCAGGTGACAGTG ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT

MKP1 (Rattus norvegicus) CCTGTACCTGGGAGTGCTT CCCAAGGCGTCGAGCATAT

PI3K (Rattus norvegicus) TCACCTCTGAGACCGACACC ACTGGCTGAGTAGGAGAACT

39

4.7.10. Quantificação de leucócitos, análise bioquímica e análise de bacteremia

Para a contagem de leucócitos, amostras de 20 μl de sangue total foram combinadas

com 380 μl de solução de Turk. As contagens totais de leucócitos por mm3 foram

determinadas por procedimentos convencionais de microscopia manual de luz (DE SOUZA;

FERREIRA, 1985).

O soro foi obtido por centrifugação de sangue total sem anticoagulantes a 2.500 rpm

durante 15 min. Os níveis séricos de alanina amino transferase (ALT), aspartato amino

transferase (AST), creatinina e ureia foram determinados com kits de diagnóstico

padronizados (LABTEST®) e espectrofotometria.

Para análise de bacteremia, amostras de 10 μl de sangue total foram diluídas dez

vezes em meio de infusão. O crescimento bacteriano foi analisado após 24h e 48h a 37°C

por análise visual da turvação do meio de cultura, em que a presença de turvação indicou

positividade para a bacteremia.

4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados de ensaio enzimático e citocinas foram médias obtidas a partir de

experiências realizadas em triplicatas. Os dados são apresentados como médias de grupo

± erros padrão ou como medianas com intervalos, conforme apropriado. A análise de

variância (ANOVA) seguida pelo teste de Bonferroni foi utilizada para comparar os valores

médios entre os grupos. O teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn foi usado

para comparar medianas. As análises estatísticas foram realizadas no software Prism 5.0

(GraphPad, La Jolla, CA). Um valor p <0,05 indicou uma diferença estatisticamente

significativa.

40

5. RESULTADOS

5.1. Efeitos do tratamento com Olmesartana (Olme) nas lesões mucosas e morfologia do tecido.

A mucosa oral (MO) dos animais do grupo 5-FU, não tratados, apresentou lesões

evidenciadas macroscopicamente eritema grave, hiperemia, áreas hemorrágicas e

ulceração extensa (Figura 6C), com media de escore macroscópico 5 (4,5-5) (Tabela 2). O

estudo histopatológico da morfologia do tecido mostrou intenso ingurgitamento vascular e

vasodilatação, acentuada presença de infiltrado inflamatório, predominantemente

neutrofílico, edema e ulceração extensa com formação de abscessos (Fig. 7C, G, K) com

mediana de escore da análise morfológica 4 (4-4) (Tabela 2).

Figura 6. Aspectos macroscópicos da mucosa de hamsters, após 10 dias de experimento: controle (A), Trauma Mecânico (B); 5-FU (C); Olme 1 mg/kg (D), Olme 5 mg/kg (E) e Olme 10 mg/kg (F).

41

Figura 7. Aspectos microscópicos tecidual da mucosa de hamsters, após 10 dias de experimento:. Grupo controle (A, E, I); Trauma Mecânico (B, F, J); 5-FU (C, G, K); Olme 1 mg/kg (D), Olme 5 mg/kg

(H) e Olme 10 mg/kg (L).

Tabela 2. Escores, por grupos, das análises macroscópica e microscópica

Análise Macroscópica (comparados ao grupo 5-FU)

Análise Microscópica (comparados ao grupo 5-FU)

Controle 0 (0-0)### 1 (1-1)#### Trauma mecânico 2 (1,5-3)# 2 (2-2)## 5-FU 5 (4,5-5) 4 (4-4) Olme 1mg/kg 3 (2,5-3,5) 4 (3,5-4) Olme 5mg/kg 3 (1,5-3) 4 (4-4) Olme 10mg/kg 2 (1-2,5) # 2 (1,5-2)###

42

Comparado com o grupo 5-FU, o grupo Olme 10mg/kg apresentou, na análise

macroscópica, lesões menos graves, com eritema discreto, mas sem úlceras (Figura 6F)

escore 2 (tabela 2) p<0,05. Histopatologicamente, em comparação com o grupo 5-FU, o

grupo Olme10mg/kg reduziu o infiltrado inflamatório, edema e hemorragia (Figura 7L),

escore 2 (tabela 2). Os grupos Olme1 (Figura 6D) e Olme5 (Figura 6E) apresentaram,

macroscopicamente, presença eritema, hiperemia, áreas hemorrágicas e ulceração

extensa, bem como, histopatologicamente observou-se a presença de infiltrado

inflamatório, com prevalência de neutrófilos, edema, úlceras e abscessos (Fig. 7D e 7H,

respectivamente).

5.2. Estresse oxidativo

Como mostrado na Figura 8A, os níveis de malonaldeído (MDA), um indicador de

peroxidação lipídica, foram diminuídos nas amostras de tecido do grupo controle e Olme10

mg/kg em relação ao grupo 5-FU (p <0,01 e p <0,05, respectivamente). Enquanto os níveis

de glutationa (GSH) no grupo Normal e no grupo Olme 10mg/kg foram aumentados em

relação ao grupo 5-FU (p <0,05) (figura 8B). Observa-se também marcação de SOD menos

intensa nas amostras do grupo Olme10mg/kg quando em comparação com o grupo 5-FU,

p <0,01 (figura 10).

Tabela 4. Contagem de leucócitos e análise de bacteremia.

Figura 8. Níveis de MDA (A) e GSH (B) dosados em fragmentos de mucosa de hamsters, após 10 dias de experimento: nos grupos controle, trauma mecânico, 5-FU, Olme 1mg/kg, Olme 5mg/kg e Olme 10mg/kg.

(*p <0.05, **p < 0.01, ***p<0.001).

A B

43

5.3. Expressão de enzimas, proteínas e genes envolvidos na inflamação e na formação de tecido de granulação

Aumentos na atividade de mieloperoxidase (MPO) no modelo de MO induzida, foram

revertidos com Olme 10 mg/kg em comparação com o grupo 5-FU (p <0,05) (figura 9A). Os

níveis de IL-1β e TNF-α no grupo 5-FU foram aumentados em relação aos níveis

observados para o grupo controle (p <0,05 e p <0,001, respectivamente, Figura 9B e 9C).

Estes aumentos foram compensadas de forma significativa com Olme 10 mg/kg no caso de

TNF-α (p <0,01) e com Olme 5 mg/kg e Olme 10 mg/kg Olme para IL-1β, (p <0,05), Figura

9.

Figura 9. Níveis de MPO (A), IL-1β (B) e TNF-α (C) dosados em fragmentos de mucosa de hamsters, após 10 dias de experimento: nos grupos controle, trauma mecânico, 5-FU, Olme 1mg/kg, Olme 5mg/kg e

Olme 10mg/kg. (*p <0.05, **p < 0.01, ***p<0.001)

B

A

C

44

Figura 10. Fotomicrografias do tecido da mucosa mostrando a imunomarcação para FGF, TGF-β, MMP-2 e SOD. Grupo controle (A, B, C, D), 5-FU (E, F, G, H) e Olme10 mg/kg (I, J, K, L). As imagens são mostradas em uma ampliação de 40 ×. Bar = 100 μm. (* P <0,05; *** p <0,001, teste de Kruskal-

Wallis seguido do teste de Dunn)

45

Os efeitos do tratamento com Olme sobre as alterações induzidas por MO nos

marcadores IHC foram evidentes com Olme 10 mg/kg (Figura 10). O tratamento com Olme

10 mg/kg resultou em FGF, TGF-β e MMP-2 mais intensos em relação ao grupo controle,

p <0,05.

A análise da expressão relativa do genes por RT-PCR, observou-se que os grupos

controle e Olme 10mg/kg apresentaram uma menor expressão de NFKBp65 em relação ao

5-FU (p <0,001 e p <0,05, respectivamente, figura 11). Controle e Olme 10 mg/kg

aumentaram a expressão de expressão de RNAm de PI3K (p <0,05 e p <0,001,

respectivamente), em relação aos níveis observados no grupo 5-FU. Os grupos controle e

Olme 10mg/kg reduziram a expressão de MKP1 em relação à de 5-FU (p <0,001, figura

11).

Figura 11. Análise RT-PCR em tempo real da expressão gênica. Efeitos de Olme sobre NF-kB p65, Pi3K e MKP1 expressão de mRNA .(*** p <0,001* p <0,05) (N = 4 animais por grupo; Análise

duplicada, teste ANOVA seguido de Bonferrone).

46

A análise dos níveis de expressão de proteína de ERK2 e iNOS mostrou que os

níveis no grupo Olme 10 mg/kg foram significativamente menores (p<0,05, para ambos),

em relação ao grupo 5-FU, como consta na figura 12.

Figura 12. Immunoblotting. iNOS, ERK 1/2. As bandas foram visualizadas com um sistema ECL (BioRad). O sinal de quimioluminiscência foi detectado com um sistema ChemiDocTM XRS (BioRad)

e quantificado densitométricamente no software ImageJ (NIH, Bethesda, MD). (* P <0,05)

47

5.4. Efeitos sistêmicos da Olmesartana

Níveis de enzimas hepáticas (ALT e AST) e marcadores de função renal (ureia e

creatinina) não diferiram significativamente entre os grupos (Tabela 3). Os animais do grupo

5-FU (25000 + 11174 mm3), tinham níveis de leucócitos significativamente aumentados em

comparação com o grupo Normal (p <0,001, Tabela 4), o que não foi observado nos grupos

Olme.

Os resultados de análise de bacteremia de cada grupo estão descritos na Tabela 4.

Enquanto no grupo controle apenas uma amostra exibe bacteriemia, os grupos 5-FU, Olme

1mg/kg, Olme 5mg/kg e Olme 10mg/kg apresentaram bacteriemia (+) em praticamente

todas as amostras.

Grupos ALT AST Uréia Creatinina

Controle 43 ± 13,1 96,5 ± 40,2 50,8 ± 9,7 0,52 ± 0,12

Trauma mecânico 38,5 ± 12,5 74,8 ± 11,5 62,3 ± 16,7 0,87 ± 0,4

5-FU 41,6 ± 6,8 69,6 ± 23,2 51,2 ± 7,5 0,47 ± 0,1

Olme 1mg/kg 56,8 ± 20,4 108 ± 39,1 63,5 ± 6,7 0,4 ± 0,23

Olme 5mg/kg 46,8 ± 14,7 136,3 ± 67,1 55,3 ±2,7 0,6 ± 0,2

Olme 10mg/kg 47 ± 4,3 155,3 ± 111,1 59,5 ±14,4 0,5 ± 0,06

Tabela 3. Dosagem de ALT, AST, Uréia e Creatinina de todos os grupos experimentais.

Tabela 4. Contagem global de leucócitos e análise de bacteremia.

Grupos Contagem de Leucócitos (comparados ao grupo Controle)

Nº total de amostras de sangue/Nºde bacteremias positivas

Controle 5483±1412 5/1 (+) Trauma mecânico 4260±2569 5/4 (+) 5-FU 25000±11174*** 5/5 (+) Olme 1mg/kg 4750±1358 4/4 (+) Olme 5mg/kg 3563±1036 4/4 (+) Olme 10mg/kg 4150±1640 4/3 (+)

48

6. DISCUSSÃO

A fase de iniciação da mucosite, descrita por Sonis (2004) é marcada pelos danos

causados ao DNA das células e estruturas células, como proteínas e lipídios, em virtude

dos mecanismo de ação da radioterapia ou quimioterapia, muitos desses eventos, gerados

pelas espécies reativas de oxigênio (ROS) que afetam o ciclo celular e a apoptose. Agentes

quimioterápicos são capazes de induzir a produção de ROS em excesso, durante o

tratamento para o câncer, levando ao estresse oxidativo. Tal estresse constitui uma das

etapas iniciais para o desenvolvimento da mucosite. As espécies reativas de oxigênio

causam danos diretos às células, tecidos e vasos sanguíneos, além de estimular fatores de

transcrição, em especial, o NF-κB, que regula a expressão de genes pró-inflamatórios

(SONIS; FEY, 2002), levando à produção de importantes citocinas pró-inflamatórias como

o TNF-α, IL-1β e IL-6, que são de grande relevância para o desenvolvimento da lesão. Além

disso, estudos tem demonstrado que o óxido nítrico (NO), liberado sequencialmente após

ativação de TNF-α, é um mediador com ações deletérias na mucosa (LEITÃO et al., 2011,

2007).

O estresse gerado no tecido é evidenciado pela elevação dos produtos da

peroxidação lipídica, destacando-se o malonaldeído (MDA), redução da capacidade

antioxidante enzimática - representada pela superóxido desmutase (SOD) - e não

enzimática - pela Glutationa (GSH) e também pela expressão da oxido nítrico sintase

(NOS), da qual deriva o NO envolvido na patogênese da mucosite (LEITÃO et al., 2007).

Danificando funções essenciais das células devido a produção excessiva de radicais livres

(HALLIWELL; WHITEMAN, 2004).

O presente estudo mostrou que o bloqueio de sinalização AT1 com Olme pode ter

efeitos anti-oxidantes, anti-inflamatórios e cicatrizantes na MO. Reduções na peroxidação

lipídica associada a Olme foram observadas, como evidenciado pela redução dos níveis de

malonaldeído (MDA), bem como aumentos dos níveis de glutationa (GSH), importante

agente antioxidante não enzimático, reduções na atividade da enzima superóxido

desmutase (SOD), antioxidante enzimática estimulada pela presença de radicais livres

(Halliwell, B.; Whiteman, M. 2004), e da oxido nítrico sintase induzida (iNOS), enzima

responsável pela ativação do óxido nítrico em condições inflamatórias, a qual foi

demonstrado por Leitão et. al. (LEITÃO et al., 2007) que sua modulação negativa atenua

significativamente as lesões teciduais, sendo observada diminuição do infiltrado

inflamatório, do edema, da hemorragia e das formações ulcerosas e de abscessos. Estes

49

dados, em conjunto, sugerem que o bloqueio do receptor AT1, com Olmesartana na dose

de 10mg/kg, levou a uma redução do estresse oxidativo, consistente com resultados

anteriores (ANUPAMA et al., 2016; PRUSTY; SAHU; SUBUDHI, 2017; RAJTIK et al., 2016;

SATO et al., 2014).

Os fármacos quimioterápicos, além de ocasionarem dano direto ao DNA das células,

estimulam a produção de espécies reativas de oxigênio que também causam danos diretos

às células, tecidos e vasos sanguíneos, além de estimular fatores de transcrição, em

especial, o NF-κB, que regula a expressão de genes pró-inflamatórios (SONIS; FEY, 2002)

que por sua vez regulam positivamente a produção de citocinas pró-inflamatórias tais como

IL-1β e TNF-α, que iniciam a inflamação em resposta a lesões teciduais (SULTANI et al.,

2012). A literatura tem afirmado que ativação do receptor AT1 também aumenta os níveis

de NF-κB e a geração de espécies reativas de oxigênio, levando à ativação subsequente

de moléculas de adesão, quimiocinas, citocinas (ex. TNF-α) e fatores de crescimento

(CHANG; WEI, 2015; MACKENZIE, 2011). Nakano et. al. (NAKANO et al., 2009),

mostraram previamente que o antagonismo do receptor AT1 com telmisartan, inibe a

ativação de NF-κB induzida por TNFα em células B. Neste estudo, o antagonismo do

receptor AT1 com Olme 10mg/kg reduziu significativamente a expressão genética relativa

de NFKBp65, contudo, apenas doses as duas doses mais elevadas reduziram os níveis da

citocina inflamatória IL-1β e apenas a dose mais elevada reduziu os níveis de TNF-α. A

maior concentração de Olme 10 mg/kg também proporcionou benefícios morfológicos

discretos, incluindo vasodilatação e re-epitelização, infiltração inflamatória discreta com

prevalência mononuclear, prevenção de áreas hemorrágicas, edema, ulcerações e

abscessos.

Observou-se redução da expressão gênica da fosfatase-1 da proteína quinase

ativada por mitógeno (MKP1) no grupo Olme 10mg/kg, provavelmente resultante da

diminuição do estresse oxidativo celular, tendo em vista que sua ativação se dá por meio

desse estresse (CHANG et al., 2015). A MKP1 desencadeia a ativação da via de quinase

regulada extracelularmente (ERK), esta via constitui uma cascata de eventos de ativação

enzimática por meio de fosforilações resultando na ativação da ERK 1/2 e seus substratos,

essencial para a proliferação e diferenciação celular (MANSOUR et al., 1994), que

desempenha um papel importante na regulação da expressão da citocina pro-inflamatória

IL-1β (WANG et al., 2004). Acreditamos que os níveis reduzidos de IL-1β observados com

o tratamento com Olme estão relacionados à regulação negativa de ERK1/2, sugerindo que

50

a dose de Olme 10mg/kg também deve regular negativamente a proteína quinase ativada

por mitógeno MAPK/ERK.

O fator de estimulação de colónias de granulócitos (GM-CSF), que pode ser regulado

positivamente por ERK2, estimula a proliferação e diferenciação de progenitores de

neutrófilos (CHANG et al., 2015). Assim, a atividade reduzida de ERK2 pode ter contribuído

para a redução da extensão de neutrófilos (atividade MPO) observada no nosso grupo

Olme10 mg/kg. O equilíbrio da expressão dos fatores TGF-β e FGF-2 envolvidos na

formação de tecido de granulação essencial para a cicatrização de feridas (PAKYARI et al.,

2013) percebido no grupo Olme 10mg/kg, em relação aos grupos controle e 5-FU, são

consistentes com a fase final de formação de tecido de granulação, associada ao equilíbrio

na marcação de metaloproteinase-2 (MMP2), que participa da degradação da matriz

provisória. Acredita-se que o aumento da imunomarcação no grupo 5-FU deve-se a super-

estimulação desses fatores pela exacerbação do processo inflamatório.

Ao mesmo tempo, o grupo Olme 10mg/kg também apresentou expressão

aumentada de Pi3K, bem caracterizada pelo seu papel na sobrevivência celular e pode

representar um mecanismo compensatório em relação as vias do NF-kB e MAPK, com

objetivo de limitar os eventos pró-apoptóticos e pró-inflamatórios em resposta ao estímulo

séptico (LIU et al., 2009). A expressão aumentada de PI3K, representa uma tentativa do

organismo de conter o processo inflamatório instalado, desencadeado pela toxicidade

direta e indireta causada pelo agente antineoplásico, tal aumento é benéfico quando se

trata da redução dos efeitos colaterais da terapia, em especial a mucosite, porém a literatura

tem demonstrado que a ativação da via Pi3K pode apresentar-se como um mecanismo de

resistência ao tratamento (DUBROVSKA et al., 2009; HSIEH et al., 2012; LIU et al., 2009).

Na fase de proliferação da cicatrização, a matriz de ferida provisória formada durante

a hemostase é substituída por tecido de granulação, que consiste em fibroblastos,

granulócitos, macrófagos e vasos sanguíneos em complexo com colágeno. Os fibroblastos,

que migram principalmente da derme próxima para a ferida, em resposta a citocinas e

fatores de crescimento (por exemplo TGF-β e FGF) produzidos por plaquetas e macrófagos

em tecidos danificados, desempenham um papel central na granulação de tecidos. Uma

vez na matriz da ferida provisória, proliferam os fibroblastos que sustentam a organização

do tecido (LANDÉN; LI; STÅHLE, 2016).

Foi possível notar, baseado nas análises bioquímicas que não houveram alterações

hepáticas e de função renal, indicando a boa tolerabilidade dos fármacos em função da

51

ausência de toxicidade para com esses órgãos, fato já presente na literatura (WANG et al.,

2012). A relevância maior desse dado se deve, em especial, devido à associação com o

quimioterápico, 5-fluorouracil. Outro dado obtido das análises bioquímicas foi o aumento

significativo da contagem de leucócitos no grupo 5-FU, o que não foi observado nos grupos

Olme, levando a crer que a atenuação da resposta inflamatória também reduziu a

leucocitose. Enquanto a análise de bacteremia apontou bacteremia positiva, indicando

presença sepse em todos os grupos, a exceção do grupo controle, devido à

imunossupressão causada pela terapia antineoplásica e presença de ulceração na

cavidade oral, servindo como acesso fácil para as infecções (MCCARTHY et al., 1998).

52

7. CONCLUSÃO

Em conclusão, a utilização de Olmesartana em uma dose de 10 mg/kg previniu o

aumento dos marcadores inflamatórios e do estresse oxidativo. Consequentemente,

observou-se que a Olmesartana pode minimizar o estresse oxidativo e a resposta

inflamatória do organismo, o que tende a ser um avanço em se tratando da mucosite oral.

Faz-se necessário continuar as pesquisas para determinar se pacientes hipertensos

com câncer poderão se beneficiar do efeito anti-inflamatório e antioxidante mediado pela

Olmesartana.

53

8. REFERÊNCIAS

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9. ANEXO