1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Emanuell dos Santos Silva NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS BIODEGRADÁVEIS DE POLI (ÁCIDO LÁCTICO-CO-GLICÓLICO) FUNCIONALIZADAS PARA INCORPORAÇÃO DE PEÇONHA DE Bothrops jararaca ORIENTADOR: Arnóbio Antônio da Silva Júnior CO-ORIENTADOR: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa NATAL-RN 2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE · 3 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Emanuell dos Santos Silva
NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS BIODEGRADÁVEIS DE POLI (ÁCIDO
LÁCTICO-CO-GLICÓLICO) FUNCIONALIZADAS PARA
INCORPORAÇÃO DE PEÇONHA DE Bothrops jararaca
ORIENTADOR: Arnóbio Antônio da Silva Júnior
CO-ORIENTADOR: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
NATAL-RN
2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Emanuell dos Santos Silva
NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS BIODEGRADÁVEIS DE POLI (ÁCIDO
LÁCTICO-CO-GLICÓLICO) FUNCIONALIZADAS PARA
INCORPORAÇÃO DE PEÇONHA DE Bothrops jararaca
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Arnóbio Antônio da Silva Júnior
CO-ORIENTADOR: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
NATAL-RN
2018
3
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Silva, Emanuell dos Santos.
Nanopartículas poliméricas biodegradáveis de poli (ácido
láctico-co-glicólico) funcionalizadas para incorporação de
peçonha de Bothrops jararaca / Emanuell dos Santos Silva. -
2018.
72f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Centro de Ciências da Saúde, Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas. Natal, RN, 2018.
Orientador: Arnóbio Antônio da Silva-Júnior.
Coorientador: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa.
1. Bothrops (jararaca) - Dissertação. 2. Nanopartículas de
Sistema purificador de água por osmose reversa, modelo OS50 LX –
Gehaka (Brasil);
Vidrarias analíticas.
5.2 Obtenção das nanopartículas de PLGA
Inicialmente, as nanopartículas de PLGA foram obtidas pelo método
nanoprecipitação. Através desta técnica, concentrações de polímero e
surfactantes poliméricos (poloxameros 407 e 188) foram variadas a fim de
melhorar os parâmetros de obtenção das nanopartículas como o tamanho e
eficiência de incorporação. O polímero teve variação entre 0,25% a 1,25% (p/v) e
os surfactantes tiveram variação entre 0,25% - 2,0% (p/v). Para obtenção, o
polímero foi solubilizado em um solvente orgânico (acetona) formando a fase
orgânica (FO). Os surfactantes foram solubilizados com água, separadamente,
formando a fase aquosa (FA). As soluções orgânicas contendo polímero foram
filtradas em membrana de nylon com tamanho de poro de 0,22 µm, da marca
Maxcrom OEM, e as soluções aquosas contendo o surfactante foram filtradas
utilizando membrana de acetato de celulose com tamanho de poro de 0,45 µm
Milipore®. A solução orgânica foi injetada na fase aquosa na proporção de 3:7
(FO/FA) em fluxo contínuo de aproximadamente 1 ml.min-1, utilizando uma agulha
de calibre 25x0,7 mm. Após injeção da fase orgânica na fase aquosa, os sistemas
foram acondicionados a uma temperatura de 25°C, por um período de 24 horas,
sob agitação magnética constante na velocidade de 720 rpm. A otimização
consistiu na escolha da melhor concentração para o polímero na solução orgânica
e melhor concentração de surfactante na fase aquosa.
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5.3 Preparação das nanopartículas de PLGA funcionalizadas com PEI
A formulação contendo 0,5% (p/v) de poloxâmero 407 e 0,75% (p/v) de
PLGA foi considerada a melhor condição experimental da seção 5.2, capaz de
produzir partículas com distribuição de tamanho uniforme inferiores a 200nm. Esta
formulação foi selecionada para a etapa de funcionalização com PEI em
diferentes proporções. O agente funcionalizante foi adicionado a fase orgânica
juntamente com o polímero e foram testadas diferentes razões de PEI:polímero
(1:5, 1:10 e 1:15) (p/p). Ao final desta etapa é esperada a obtenção de partículas
com distribuição de tamanho uniforme menores que 200 nm e com potencial zeta
positivo.
5.4 Incorporação de albumina sérica bovina (BSA)
A formulação de nanopartículas utilizando 0,75% (p/v) de PLGA, 0,5% (p/v)
de poloxâmero 407 e a razão 1:5 (p/p) de PEI:PLGA, foi selecionada para
incorporação de albumina sérica bovina (BSA) em diferentes concentrações - 0,5
e 1,0% (p/v) - em relação a massa do polímero. Para obter um volume final de 8
mL de nanopartículas com a proteína incorporada, foi utilizado 2 mL da
suspensão de nanopartículas catiônicas e completou-se o volume com água
purificada. Sob agitação magnética de 720 rpm, as soluções de BSA contendo
1mg/mL foram adicionadas a estas amostras, que ficaram sob agitação por 1 hora
a 22°C ±2, em um sistema fechado para evitar possível evaporação da fase
aquosa. Ao final desta etapa, é esperada a obtenção de partículas carreadas com
albumina para serem utilizadas como sistemas modelo para a incorporação da
peçonha.
5.5 Incorporação da Peçonha de Bothrops jararaca
A formulação de nanopartículas utilizando 0,75% (p/v) de PLGA, 0,5% (p/v)
de poloxâmero 407 e a razão 1:5 (p/p) de PEI:PLGA, foi selecionada para a
incorporação da peçonha de Bothrops jararaca em diferentes concentrações - 0,5
e 1,0% (p/v) - em relação a massa do polímero. Para obter um volume final de 8
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mL de nanopartículas com peçonha incorporado, foi utilizado 2 mL de
nanopartículas catiônicas e completou-se o volume com água ultrapura. Sob
agitação magnética de 720 rpm, as soluções de peçonha contendo 1mg/mL foram
adicionadas a estas amostras, que ficaram sob agitação por 1 hora a 22°C ±2, em
um sistema fechado para evitar possível evaporação da fase aquosa. Ao final
desta etapa é esperada a obtenção de partículas carreadas com peçonha para
serem utilizadas nos estudos de caracterização físico-químicos e performance in
vitro e in vivo.
5.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida
O perfil eletroforético da peçonha de B. jararaca, nanopartícula branca, PEI
e nanopartícula associada a peçonha, foram determinados por eletroforese em
gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), de acordo com
Laemmli (1970) utilizando-se o sistema de minigel (Mini-ProteanTM II) (LAEMMI,
1970). As amostras foram misturadas ao tampão de amostra SDS-PAGE com
redução, fervidas durante 5 minutos e aplicadas ao gel. A eletroforese foi
desenvolvida verticalmente, em placas de dimensão 10,0 x 8,0 x 0,8cm, à
180V, 24 mA, durante 3 horas. A massa molecular relativa das proteínas foi
determinada em gel de poliacrilamida, por comparação da migração eletroforética
de uma mistura de proteínas padrão, obtida comercialmente. O gel obtido foi
corado em solução de Prata (MORRISSEY, 1981).
5.7 Caracterização das nanopartículas
5.7.1 Determinação do tamanho de partícula e do potencial zeta
O diâmetro das partículas foi determinado usando a técnica de
espalhamento de luz (Dynamic Light Scattering) num modelo de analisador
NanoBrook 90Plus (Brookhaven Instruments Corp.) do Laboratório de
Biopolímeros - Biopol, do Centro de Biociências da UFRN. A análise de potencial
zeta foi feita pelo mesmo equipamento através da mobilidade eletroforética
usando o sistema Zeta-Meter a temperatura de 25 ± 2ºC. Para isso, cada sistema
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teve sua viscosidade e índice de refração conferidos, adequando-se para análise
quando injetados no equipamento.
5.7.2 Eficiência de incorporação de proteínas
As nanopartículas funcionalizadas contendo tanto albumina quanto
peçonha de Bothrops jararaca foram centrifugadas a 16.000 x g a 4°C por 30
minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi removido e submetido a
análise de proteínas usando o Kit de Ensaio de Proteína BCA através do método
ácido bicincronínico. O ensaio foi feito em triplicatas, utilizando BSA como
controle, e a eficiência de associação (EA) das proteínas foram calculadas
usando a seguinte equação:
Equação1
5.7.3 Microscopia de Força Atômica (MFA)
A forma e o tamanho das nanopartículas foram observados usando
imagens MFA. As dispersões foram previamente secas sob dessecador durante
24 horas. As medições foram realizadas utilizando MFA (SPM - 9700, Shimadzu)
a 25ºC em cantilever sem contato, digitalização de 1 Hz.
5.7.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Para a obtenção das imagens por MEV, as amostras foram preparadas
espalhando uma gota da dispersão de nanopartículas numa fita de carbono do
microscópio, mantidas em 24h no dessecador utilizando um Microscópio SSX550,
Shimadzu, Tóquio, Japão.
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5.7.5 Análise de espectroscopia na região do infravermelho - Infravermelho
Transformado de Fourier (FTIR – ATR)
As análises espectroscópicas na região do infravermelho foram realizadas
com o objetivo de investigar o nível de interação do fármaco com os componentes
estruturais dos sistemas obtidos em fase sólida ou de possíveis alterações
químicas dos componentes dos sistemas obtidos. Para isso, foram obtidos os
espectros de absorção na região do infravermelho dos componentes estruturais
isolados e, posteriormente, dos diferentes sistemas obtidos, assim como das
respectivas misturas físicas de mesma composição. O equipamento utilizado foi
um Infravermelho Transformado de Fourier (FTIR), SHIMADZU IR Prestige 21. Os
espectros foram registados em 20 varreduras e a uma resolução de 4 cm-1 em
números de onda entre 5000 e 700 cm-1.
5.8 Testes de performance
5.8.1 Estudo de estabilidade física
O estudo de estabilidade física foi realizado para nanopartículas
funcionalizadas (catiônicas), contendo ou não peçonha da serpente Bothrops
jararaca. As análises foram feitas durante o período de 45 dias avaliando o
tamanho médio, potencial zeta e índice de polidispersão conforme o item 5.7.1.
As dispersões foram acondicionadas em geladeira na temperatura de 5 °C ± 2.
5.8.2 Estudo de liberação in vitro
Para determinar o perfil de liberação in vitro das proteínas, as
nanopartículas catiônicas contendo a peçonha da serpente Bothrops jararaca
foram incubadas em solução tampão fosfato pH = 7,4 (KH2PO4 0,05 mol/L) e
mantidas em banho termostatizado à 37 °C ± 0,2 °C, em condição sink, em um
volume final de 1 mL. Em intervalos de tempo pré-determinados, as
nanopartículas foram centrifugadas a 16000 x g a 4,0 °C por 30 min e o
sobrenadante foi retirado para a dosagem de proteínas totais. Novo volume de
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solução tampão foi adicionado aos tubos de dissolução, os quais foram mantidos
no banho termostatizado até o próximo tempo de coleta. Com auxílio da equação
de regressão linear extraída da curva padrão construída nas mesmas condições
da análise, foi determinado o percentual de massa de proteína dissolvida a partir
da seguinte equação (adaptado de SILVA-JÚNIOR et al., 2008):
Equação2
em que MPD (%) é o percentual de massa de proteína dissolvida, MPt é a massa
de proteína determinada no tempo t e MP, a massa de proteína utilizada no
experimento. A massa percentual acumulada de proteínas da peçonha foi plotada
versus o tempo e diferentes modelos matemáticos foram utilizados para linearizar
os dados experimentais. Os modelos matemáticos aplicados para cinética de
liberação foram: Primeira ordem, Bhaskar, Freundlich e Difusão Parabólica. Como
critério de escolha do modelo que melhor explica o fenômeno de liberação das
proteínas das nanopartículas, foi selecionado o coeficiente de determinação (r2),
para avaliar o ajuste do modelo.
5.8.3 Estudo de viabilidade celular in vitro
Amostras de sangue heparinizadas foram coletadas de pacientes
voluntários saudáveis, assegurados pelo comitê de ética humano com número de
CAAE: 56191416.0.0000.5537. As células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) foram separadas por centrifugação sobre um gradiente de Ficoll-Hypaque
(GE, New Jersey, EUA). As células mononucleares foram ressuspensas em meio
RPMI suplementado com 10% de soro humano AB Rh- (Corning, EUA), 10 mM de
HEPES (Sigma, EUA), 1,5 µM de L-glutamina (Sigma, EUA), 200 UI de penicilina
por ml e 200µg de estreptomicina por mL (Sigma, EUA) e foram ajustados para 2
x 106 células/mL. As CMSP (106 células por poço) foram cultivadas in vitro em
placas de fundo plano de 24 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a 37 °C numa
atmosfera umidificada de 5% de CO2 e na presença de diferentes concentrações
de nanopartículas catiônicas (1,7 a 140 µg/mL) ou meio sozinho. Após 3 dias em
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cultura, as células estimuladas foram colhidas e processadas para análises de
apoptose. Para análises de apoptose, foi utilizado o kit de detecção de apoptose
FITC Annexin V (BD), seguindo o protocolo proposto pelo kit. Vinte mil eventos
foram analisados de cada amostra na região de linfócitos usando um citómetro de
fluxo FACS Canto II (BD, citómetro de fluxo Canto II, Becton Dickinson
Bioscience, EUA). Anexina V e Iodeto de Propídio (PI) foram analisados usando o
software FlowJo vX.
5.9 Testes in vivo
5.9.1 Animais
Camundongos Balb/c (25–35 g) de 6–8 semanas de idade foram obtidos do
“Biotério de Criação de Animais do Centro de Ciências da Saúde da UFRN”. Os
animais foram mantidos em salas com temperatura controlada, recebendo
alimento e água ad libitum. Os animais foram mantidos nas salas de experimentos
por pelo menos 1 semana para se adaptarem. Os experimentos foram submetidos
às exigências das regulamentações estabelecidas pela Comissão de Ética de Uso
de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética de
uso de Animais do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte sob o protocolo de número 026.037/2017.
5.9.2 Obtenção dos soros
Os camundongos foram imunizados semanalmente por via subcutânea
(s.c), durante 6 semanas, com 100 μL de diferentes concentrações da peçonha
(0,5 e 1 %) adsorvidas as nanopartículas catiônicas de PLGA, bem como
associadas ao hidróxido de alumínio (Al(OH)3) na concentração de 10%, como
mostra a divisão dos grupos no Quadro 1. O sangue dos animais foi coletado por
punção cardíaca para obtenção das amostras de soro. Amostras de sangue, na
ausência de anticoagulante, foram mantidas a 37°C por 30 minutos e,
posteriormente, a 4°C por 2 horas para retração do coágulo. Em seguida, as
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amostras foram centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos a 4 °C, sendo o
sobrenadante (soro) coletado e estocado a -20 °C.
Quadro 1. Distribuição dos grupos de animais experimentais que foram imunizados com peçonha de Bothrops jararaca ou peçonha de Bothrops jararaca associado ás nanopartículas funcionalizadas de PLGA e ao hidróxido de alumínio. N=49 animais para cada tratamento, 7 por grupo.
Grupos Tratamento
Grupo 1 (7 animais) 100 µL Nanopartículas de PLGA s.c
Grupo 2 (7 animais) 100 µL Hidróxido de alumínio 10% s.c
Grupo 3 (7 animais) 100 µL PBS s.c
Grupo 4 (7 animais) 100 µL Nanopartículas + Peçonha de Bothrops
jararaca 0,5% s.c
Grupo 5 (7 animais) 100 µL Hidróxido de alumínio 0,1% + Peçonha de
Bothrops jararaca 0,5% s.c
Grupo 6 (7 animais) 100µL Nanopartículas + Peçonha de Bothrops
jararaca 1,0% s.c
Grupo 7 (7 animais) 100µL Hidróxido de alumínio 0,1% + Peçonha de
Bothrops jararaca 1,0% s.c
5.9.1.1 Avaliação dos títulos de anticorpos por ELISA (Enzyme Linked
Immuno Sorbent Assay)
Os títulos de anticorpos das amostras dos soros de camundongos foram
obtidos após o processo de imunização e determinados por ensaios de ELISA.
Para tanto, placas de poliestireno foram sensibilizadas com 100 µL de peçonha
em tampão PBS (10 µg/mL) e incubadas “overnight” a 4°C. Após este período, as
placas foram lavadas com PBS e incubadas por 2 h a 37°C com a solução de
bloqueio (PBS/BSA/ 5%) e, posteriormente, incubadas com 100 µL dos soros
(soro de camundongo normal, soro de camundongo anti-peçonha, diluídas em
PBS/BSA 0,1%, e incubadas a 37°C por 1 h. As placas foram lavadas com
PBS/Tween 0,05% (três lavagens/ 5 min) e incubadas com o anticorpo secundário
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(anti-IgG de camundongo) conjugado com peroxidase, diluído 1:3.000, por 1 h a
37°C. As placas foram lavadas com PBS/Tween 0,05% e as reações reveladas
pela adição de o-fenilenediamina e peroxido de hidrogênio, e interrompidas após
20 minutos pela adição de ácido sulfúrico 2M. As absorbâncias foram
determinadas a 492 nm em leitor de ELISA.
5.10 Análise estatística
Os dados experimentais foram apresentados com as médias dos valores
experimentais e seus respectivos desvios padrões. Inicialmente será realizado
teste de normalidade, seguido de teste t Student para análises pareadas de duas
médias ou da análise da variância de uma entrada (ANOVA), seguido de teste
Tukey quando aplicável, e foram considerados significativamente diferentes os
valores p < 0,05.
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
De acordo com os métodos desenvolvidos para a preparação de
nanopartículas poliméricas, nesse trabalho foram utilizados métodos que
envolvem o uso de um polímero já formado, seguido do método de
nanoprecipitação.
6.1 Efeito da variação da concentração do polímero no tamanho da partícula
O efeito inicial da concentração do polímero no tamanho das
nanopartículas é mostrado na Figura 5, onde foi utilizada uma fase aquosa fixa
contendo 0,25% (p/v) dos poloxameros (188 e 407) a serem testados, e
quantidade variadas de polímero entre 0,25-1,25% (p/v).
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Figura 5. Diâmetro e potencial zeta (PZ) de nanopartículas poliméricas a partir da variação da
concentração de PLGA, onde [A] são sistemas estabilizados com poloxâmero 188 (P188) e [B]
estabilizados com poloxâmero 407 (P407).
Na figura 5A, é possível observar o diâmetro médio das nanopartículas
estabilizadas com poloxâmero 188 que variaram entre 121-168 nm. Na figura 5B
o diâmetro médio das nanopartículas estabilizadas com poloxâmero 407 variou
entre 129-186 nm. Os sistemas apresentaram distribuição homogênea com
polidispersões menores de 0,3 e potencial zeta levemente negativo (p<0,05).
Resultados semelhantes foram encontrados em estudos desenvolvidos por
Anwer e colaboradores (2016), os quais durante estudos de formulação de
nanopartículas de PLGA para incorporação de quercitina, fixaram uma
concentração de tensoativo e variaram concentrações crescentes de PLGA. Os
diâmetros encontrados foram entre 118 e 179 nm (ANWER et al., 2016).
O aumento do diâmetro médio de nanopartículas poliméricas com o
aumento da concentração do polímero matriz é bastante reportado na literatura
(JAVADZADEH et al., 2010; THIOUNE et al., 1997). Os resultados mostram que o
acréscimo da concentração do polímero resulta no aumento significante do
tamanho médio da partícula (p<0,05). Esse fenômeno é atribuído ao aumento da
viscosidade da fase orgânica onde a resistência na transferência de massa leva a
difusão lenta do solvente na fase aquosa e consequentemente a formação de
gotas maiores durante a adição da fase (DE OLIVEIRA et al., 2013).
As partículas menores foram obtidas com baixas concentrações de
polímero e a concentração escolhida para seguir com os estudos foi a de 0,75%
A B
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(p/v) por apresentar, no uso dos dois surfactantes, uma maior massa de polímero
com menor variação do diâmetro. O potencial zeta de todas as concentrações
estão próximos de 0 mV, pois tanto o polímero quanto os surfactantes utilizados
na obtenção são não-iônicos, conferindo uma carga neutra na camada de difusão
da partícula.
6.2 Efeito da variação da concentração do surfactante no tamanho da
partícula
Os poloxameros 407 e 188 foram utilizados como surfactantes poliméricos
para estabilizar os sistemas com o objetivo de reduzir o tamanho das partículas.
Ambos os tensoativos são não-iônicos com baixa toxicidade e baixa irritabilidade,
tornando-os viáveis na aplicação como sistemas de liberação de fármacos e
biomoléculas (DEVI; SANDHYA; HARI, 2013).
Os resultados experimentais mostrados na Figura 6, representam as
variações do tamanho da partícula e seus respectivos valores de potencial zeta.
Nesta etapa, a concentração da fase orgânica é fixa contendo 0,75% (p/v) de
polímero e a fase aquosa foi variada entre 0,25 – 2,0% (p/v) para ambos os
poloxâmeros, separadamente.
Na figura 6A, podemos observar o diâmetro médio das nanopartículas
estabilizadas com poloxâmero 188, que variaram entre 121-195 nm. Na figura 6B
o diâmetro médio das nanopartículas, estabilizadas com poloxâmero 407, variou
entre 99-146 nm. O segundo ponto de concentração do surfactante poloxâmero
407 (0,5%) reduziu o tamanho das partículas consideravelmente, quando
comparado à concentração anterior (0,25%).
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Figura 6. Diâmetro e potencial zeta de nanopartículas poliméricas a partir da variação da
concentração dos surfactantes, onde A são sistemas estabilizados com poloxâmero 188 e B
estabilizados com poloxâmero 407.
Diversos estudos demonstraram a capacidade dos poloxâmeros de
estabilizarem e reduzirem o tamanho de nanopartículas poliméricas (GIROTRA;
SINGH; KUMAR, 2016; JAIN et al., 2013; MANDAL; KUNDU, 2009;
SANTANDER-ORTEGA et al., 2006). Comumente, encontram-se resultados da
influência da variação da concentração de poloxâmero 188 nos aspectos físico-
químicos da obtenção de nanopartículas. Como no caso de Girotra e
colaboradores (2016), que utilizaram o componente para modular o tamanho de
nanopartículas de PLGA para incorporar zomultriptano, diminuindo ou
aumentando o diâmetro da partícula conforme a alteração da razão de massa do
tensoativo (GIROTRA; SINGH; KUMAR, 2016). Já em estudos desenvolvidos por
Shubhra e colaboradores (2014), observou-se o efeito do revestimento de
poloxamero na superfície de nanopartículas magnéticas para adsorção de
proteínas plasmáticas. Os resultados do revestimento de nanopartículas
magnéticas de PLGA por poloxâmero 188, levaram a um aumento do tamanho da
partícula, uma vez que o revestimento foi realizado com as nanopartículas já
obtidas (SHUBHRA et al., 2014).
Essa característica de aumento de partícula também é observada nos
resultados de obtenção das nanopartículas do presente estudo.
Os dados mostram que os aumentos das concentrações dos surfactantes
tendem a aumentar o diâmetro médio da partícula (p<0,05). Isto pode ser
A B
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explicado devido à adsorção de moléculas excedentes de poloxâmero ao redor da
partícula nas primeiras etapas do processo de obtenção. Quando a gotícula de
fase orgânica é envolvida pelo surfactante, acima de sua concentração crítica, a
coalescência das gotículas diminui até que superfície fica saturada de surfactante
e para de coalescer. Essa etapa final da obtenção leva a um tamanho específico
de partícula polimérica que pode ser determinada experimentalmente de acordo
com os tipos de surfactantes utilizados (MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI,
2011; SHUBHRA et al., 2014).
Os dois poloxâmeros possuem cadeias hidrofílicas similares, mas são
distintos quando compara-se as frações de massa das cadeias hidrofóbicas. A
cadeia hidrofóbica do poloxâmero 407 possui a massa da fração de óxido de
propileno maior que a do poloxâmero 188. Com isso, os tamanhos obtidos são
semelhantes quando comparados o desempenho dos surfactantes. Com tudo, é
possível observar que os sistemas estabilizados com poloxâmero 407 apresentam
tamanho menores devido às suas características mais hidrofóbicas tendo melhor
afinidade pelo polímero hidrofóbico, PLGA (JINDAL; MEHTA, 2015).
Com isso, os dois surfactantes têm se mostrado eficazes para obter e
estabilizar (p<0,05), com sucesso, as nanopartículas de PLGA, porém o sistema
escolhido para continuar os estudos foi o que contém 0,5% (p/v) de poloxâmero
407, por apresentar menor tamanho. O potencial zeta de todas as concentrações
estão em torno de 0 mV (± 10), pois tanto o polímero quanto os surfactantes
utilizados são não-iônicos, atribuindo uma falta de carga na camada de difusão da
partícula. A distribuição dos sistemas apresentou polidispersões menores de 0.3.
6.3 Efeito da variação do agente funcionalizante no tamanho da partícula
O sistema escolhido para etapa de funcionalização foi da formulação
contendo 0,75% (p/v) de PLGA e 0,5% (p/v) de poloxâmero 407. Nesta fase, há a
adição do policátion polietilenimina no processo de obtenção para conferir uma
carga positiva a superfície da partícula tornando-a catiônica. A figura 7 mostra o
efeito da adição da PEI no tamanho da partícula e no potencial zeta. Razões de
PEI/polímero (p/p) – 1:5, 1:10, 1:15 – foram utilizadas considerando a
concentração de polímero de 0,75% (p/v).
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Figura 7. Diâmetro e potencial zeta de nanopartículas poliméricas de PLGA a partir da variação da
razão de PEI:PLGA.
Os dados mostram um aumento linear do valor de potencial zeta (p<0,05),
variando de 0 a 45 mV, sendo observado desde as amostras que não contem PEI
até a maior razão de PEI/polímero (1:5). Os diâmetros médios das partículas
também variaram aumentando de 100nm, na formulação com a ausência da PEI,
para 150 nm na formulação com maior razão de PEI (p<0,05). A polidispersão dos
sistemas se manteve abaixo de 0,3 reafirmando a homogeneidade das partículas.
Apesar da citotoxicidade implícita da PEI, este componente é
frequentemente utilizado na composição de sistema de entrega de moléculas
ativas (MESQUITA et al., 2017; MUNIER et al., 2005; WANG et al., 2016).
Utilizando da estratégia de funcionalizar nanopartículas poliméricas de
forma catiônica, Kim e colaboradores (2005) adicionaram na fase externa do
processo de obtenção de nanopartículas de PLA (poli ácido lático) e PLGA, uma
polietilenimina de 64kDa em diferentes concentrações, para conseguir
nanopartículas catiônicas. Foi observado que com o aumento da concentração de
PEI, as nanopartículas reduziram o seu tamanho. Este dado é justificado pelos
autores através da carga positiva da PEI que pode afetar o processo de
solidificação das partículas (KIM et al., 2005).
O mesmo não acontece na funcionalização das nanopartículas desse
presente trabalho. Durante o processo de obtenção, a polietilenimina está
presente na fase orgânica (fase interna) juntamente com o polímero. Quando
45
ocorre o processo de nucleação das nanopartículas, uma parte das moléculas de
PEI é capturada pela matriz polimérica de PLGA, e outra parte ancora na
superfície da nanopartículas, que se acumulam com o aumento de sua
concentração. Esse acúmulo resulta no aumento do diâmetro das nanopartículas.
Além disso, o policátion utilizado apresenta massa molar de 25kDa,
caracterizando-se assim um dendrímero. As moléculas de PEI se organizam na
superfície das partículas de forma que as porções protonadas das moléculas
confiram um potencial zeta positivo na camada de difusão das nanopartículas
(SHABANIAN et al., 2015; SPERLING; PARAK, 2010).
6.4 Incorporação de proteínas em nanopartículas catiônicas de PLGA
No final da etapa de funcionalização das nanopartículas de PLGA (item
6.3), os nanocarreadores apresentaram o potencial zeta positivo, indicando que
as partículas apresentam superfície catiônica. A formulação escolhida para etapa
de incorporação de proteínas foi a que contém 0,5% de poloxâmero 407, 0,75%
de PLGA e a PEI na razão de 1:5 (p/p) PEI/polímero. Para incorporação de
proteínas aniônicas nos carreadores, a proteína modelo utilizada foi a albumina
bovina sérica (BSA). A tabela 1 mostra a eficiência de associação (EA) das
proteínas na superfície da nanopartículas catiônicas (NPC).
Tabela 1: Eficiência de Adsorção de BSA em nanopartículas catiônicas de PLGA
Notas: NPC, nanopartículas catiônicas; BJ, Bothrops jararaca; Al(OH)3, Hidróxido de Alumínio. Os
resultados são expressos como média ± desvio padrão (n=3).
Figura 15. Avaliação dos títulos de anticorpos obtidos a partir de animais imunizados com
hidróxido de alumínio (Al(OH)3) e nanopartículas catiônicas (NPC) associadas a peçonha de
A B
62
Bothrops jararaca (BJ) em diferentes concentrações (0,5 e 1,0%). A) Densidades ópticas na
diluição de 1:200, B) Curva de densidades ópticas em diluição seriada.
Analisando a figura 15, podemos observar o decréscimo da densidade
óptica de anticorpos (15 B) e identificar que a diluição de 1:25600 é a diluição
máxima capaz de observar a detecção de anticorpos. Após aplicar ANOVA,
seguido de Tukey, para comparar os resultados dos grupos imunizados (15 A), os
grupos das NPC contendo as concentrações de peçonha obtiveram produção de
anticorpos equivalentes aos grupos com hidróxido de alumínio contendo peçonha,
ou seja, não mostraram diferença estatística (p>0,05).
Apesar dos valores não mostrarem diferença estatística entre os grupos, o
grupo NPC+BJ0,5% apresenta diluições superiores aos outros grupos. Esse
resultado pode ser correlacionado com os dados de liberação, sendo esse o
sistema capaz de liberar quase 100% do seu conteúdo no período de 7 dias,
sugerindo uma maior eficiência no reconhecimento das proteínas liberadas e uma
maior produção de anticorpos desse grupo.
Diversos estudos já sugerem que micropartículas e nanopartículas de
PLGA podem ser utilizadas como imunoadjuvantes. Esta capacidade pode ser
explicada pelo fato de nanopartículas de PLGA estimularem citocinas pro-
inflamatórias, quando fagocitadas por macrófagos (NAJAFI-HAJIVAR et al., 2016;
PAWAR et al., 2013).
Nosso grupo de pesquisa foi pioneiro no contexto de produção de
nanopartículas poliméricas para produção de soro anti-peçonha de animais
peçonhentos. Soares e colaboradores (2012), desenvolvendo estudo em nosso
laboratório, conseguiram obter nanopartículas de quitosana como agente
imunoadjuvante para produzir soro antipeçonha do escorpião Tityus serrulatus
(ROCHA SOARES et al., 2012). Em 2016, Ayari-Riabi e colaboradores,
desenvolveram nanopartículas aniônicas de PLA conjugadas a peçonha de duas
espécies de escorpião (Androctonus australis hector e Buthus occitanus
tunetanus) para avaliação da capacidade imunogênica das partículas (AYARI-
RIABI et al., 2016).
Considerando que a dosagem dos título de anticorpos seja
aproximadamente o dobro da absorbância obtida dos grupos controles temos que:
63
a diluição que representa os títulos do grupo Al(OH)3 + BJ 0,5% seja 1:28000; os
títulos do grupo Al(OH)3 + BJ 1,0% seja 1:28000; os títulos do grupo NPC+ BJ
0,5% seja superior a 1:51200 e os títulos do grupo NPC+ BJ 1,0% seja a
1:25600.
As nanopartículas catiônicas de PLGA conseguiram com sucesso estimular
o sistema imune e produzir uma resposta ativa contra a peçonha da serpente
Bothrops jararaca. A capacidade das NPC serem usadas como imunoadjuvantes
é confirmada uma vez que apresentam perfil de produção de anticorpo
semelhante ao do hidróxido de alumínio sendo uma alternativa biocompatível e
inovadora para futuros dispositivos de imunização.
7. CONCLUSÕES
Este trabalho desenvolveu com sucesso a obtenção de um sistema de
nanopartícula polimérica funcionalizada com uma carga catiônica para associação
de proteínas da peçonha da serpente Bothrops jararaca.
Através da nanoprecipitação foi realizada a padronização da produção de
nanopartículas utilizando PLGA como polímero matriz e surfactantes poliméricos
(poloxamero 407 e 188). Após o estudo de variação dos componentes, a
formulação final com concentrações fixas, foi capaz de produzir nanopartículas
com diâmetro médio de 99 nm.
No estudo de funcionalização, a polietilenimina foi capaz de fornecer uma
carga catiônica nas nanopartículas de PLGA, que mantiveram seu tamanho
reduzido com diâmetro médio de 140 nm e potencial zeta de +47,4 mV.
As nanopartículas funcionalizadas com carga catiônica foram testadas para
adsorver proteínas utilizando primeiramente a albumina bovina sérica como
proteína modelo, e em seguida utilizou-se a peçonha da serpente Bothrops
jararaca. Em ambos os testes, a eficiência de associação foi alta com percentual
acima de 95% e ensaios como eletroforese e infravermelho confirmaram a alta
eficiência de associação. Além disso, os diâmetros das nanopartículas
permaneceram abaixo de 200 nm e com potencial zeta positivo.
64
Com análises microscópicas, através de microscopia de força atômica e
microscopia eletrônica de varredura, foi revelado que as nanopartículas são
esféricas e com sua superfície lisa.
Para testar o desempenho do nanocarreador polimérico funcionalizado com
adsorção de proteínas em sua superfície, testes de performances in vitro e in vivo
foram realizados.
Estudos de estabilidades indicaram que as nanopartículas funcionalizadas,
contendo ou não proteínas adsorvidas, conseguem se manter estáveis
fisicamente por mais de 6 semanas com mínimas variações de tamanho das
partículas.
Quando submetidas a teste de viabilidade celular, as nanopartículas
funcionalizadas sem a presença de proteínas apresentaram-se viáveis em
estudos com células mononucleares do sangue periférico, apresentando um perfil
de início de morte celular (apoptose tardia) apenas depois de 72 horas.
Para testar a performance da liberação dos sistemas contendo proteínas
da peçonha associadas, as nanopartículas foram capazes de prolongar a
liberação das proteínas por pelo menos 7 dias, sob condições específicas.
Utilizando um protocolo de imunização aprovado por comitê de ética para
uso de animais, as nanopartículas funcionalizadas contendo diferentes
concentrações de peçonha, foram capazes de induzir uma resposta imunológica
de memória contra a peçonha, de forte intensidade atingindo títulos de anticorpos
superiores a escalas de diluição de 1:51200.
Portanto, as nanopartículas de PLGA funcionalizadas com polietilenimina
se mostraram um interessante sistema bionanotecnológico de interesse
farmacêutico, uma vez que sua aplicação não se limita apenas ao uso como
dispositivo de imunização. O sistema também se mostra uma excelente
ferramenta de utilização para outros campos de estudo farmacêutico, como
biologia molecular, diagnóstico e aumento de eficácia terapêutica.
65
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