UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS AVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DE TRÊS MÉTODOS DE BACILOSCOPIA DE ESCARRO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE PULMONAR PATRÍCIA ENEDINA DE LIMA QUINCÓ MANAUS 2012
121
Embed
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - pos.uea.edu.br · UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO ... Imagem com representação da
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
AVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DE TRÊS MÉTODOS DE BACILOSCOPIA DE
ESCARRO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE
PULMONAR
PATRÍCIA ENEDINA DE LIMA QUINCÓ
MANAUS
2012
i
PATRÍCIA ENEDINA DE LIMA QUINCÓ
AVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DE TRÊS MÉTODOS DE BACILOSCOPIA DE
ESCARRO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE
PULMONAR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos
Co-orientadora: Profª Dra. Samira Bührer-Sékula
MANAUS 2012
Ficha Catalográfica
Q7a Quincó, Patrícia Enedina de Lima. Avaliação da acurácia de três métodos de baciloscopia de
escarro para diagnóstico laboratorial da tuberculose pulmonar /. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2012.
ix: 110 f. : il.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2012. Orientador: Profº. Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos. Co-orientadora: Prof.ª Dra. Samira Bührer-Sékula
1.Baciloscopia. 2.Centrifugação 3.Filtração I. Título.
CDU: 614.4
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N. Silva - UEA
iii
RESUMO
A Tuberculose (TB) uma doença curável, ainda é um dos principais problemas de saúde pública. A baciloscopia direta de escarro é ferramenta de diagnóstico fundamental principalmente onde testes mais sensíveis não estão disponíveis. A sensibilidade da baciloscopia direta fica em torno de 50%, decrescendo em suspeitos de TB infectados pelo HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana). O objetivo do estudo foi avaliar acurácia de três métodos de baciloscopia para o diagnóstico laboratorial da TB pulmonar. Comparamos a acurácia dos métodos baciloscópicos (baciloscopia com e sem tratamento do escarro com NALC seguido por centrifugação, baciloscopia em Membranas de Filtração de Policarbonato - MFP) com a cultura em meio Ogawa Kudoh como padrão ouro. Os escarros foram obtidos de 508 suspeitos de tuberculose pulmonar, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado e Policlínica Cardoso Fontes. Maioria HIV positivos. Comparando com a cultura o MFP foi o método de baciloscopia mais sensível. Em pacientes infectados pelo HIV a sensibilidade do MFP foi significativamente maior que após centrifugação do escarro tratado com NALC e sem NALC (61,9%, 47,6% e 45,2% p=0,001) respectivamente. Em pacientes não infectados pelo HIV o método MFP foi significativamente maior que com e sem NALC (81,8%, 63,6% e 57,5%, p=0,001). Nos dois grupos de estudo, HIV infectados ou não, não houve diferenças significativas entre as especificidades dos três métodos estudados. O incremento oferecido pela segunda amostra de escarro foi de 13%, 11% e 4% nas baciloscopias após centrifugação com e sem NALC e em MFP, respectivamente. A concordância entre as baciloscopias e a cultura foi boa (k>0.6<0.8), mas em HIV infectados foi regular (k>0.4<0.6). Análise microscópica de escarro tratado com NALC, comparado com sem NALC não aumentou a sensibilidade da baciloscopia. De modo geral a sensibilidade do MFP foi superior em comparação com os outros dois métodos estudados, sem perda de especificidade. Palavras-chaves: Baciloscopia. Centrifugação. Filtração.
iv
ABSTRACT
Tuberculosis (TB), a curable disease, still a major public health problem. Bacilloscopy test is yet important awaiting the development of more sensitive tests. The sensitivity of bacilloscopy test is around 50%, decreasing in suspected TB patient co-infected with HIV (Human Immunodeficiency). The objective of the study was to evaluate, the accuracy of three methods of sputum bacilloscopy for the diagnosis laboratorial of lung TB. We compared the accuracy of sputum baciloscopy methods (Sputa treated or untreated with NALC; Sputa filtered on Polycarbonate Membrane Filtration) to the culture in Ogawa-Kudoh medium as the gold standard method. The sputa were obtained from 508 patients with suspected pulmonary TB attending in Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado and Policlinica Cardoso Fontes. Most of the patients were HIV positive. Compared with gold standard culture, the MFP was the microscopy method more sensitive. In TB-HIV infected patients, sensitivity for MFP was significantly higher than after centrifugation of sputa treated with and without NALC (61.9%. 45.6% and 45.2%; p = 0.001) respectively. Similarly, in TB patients without HIV, the MFP smear sensitivity was significantly higher (81.8%, 63.6% and 57.5%; p = 0.001) respectively. In both study group, TB patients with or without HIV, no significant differences between the specificities of the three methods were observed. Handling of the second sputum sample similarly by centrifugation with or without NALC and MFP showed an increase of positivity by 13%, 11% and 4% respectively. The correlation between bacilloscopy and culture was good (k>0.6<0.8), but in TB-HIV infected was moderate (k>0.4<0.6). Microscopy evalution of sputum treated with NALC compared to sputum without NALC did not show any increase sensitivity. Altogether, the sensitivity of the MFP method is higher compared to the others studied without loss of specificity.
Ao Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos meu orientador, aos pacientes do estudo,
aos professores do programa pelo conhecimento passado durante as disciplinas. Ao
professor Marcus Vinícius G. Lacerda pela contribuição no estudo, pelos ótimos
conselhos, e por estar sempre disposto a discutir ciência, a professora Maria Paula
Gomes Mourão pelas sugestões apresentadas na aula de qualificação e pelas
palavras de incentivo.
Agradeço a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, a
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado Amazonas – FAPEAM pelo
financiamento, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPQ), ao Instituto de Ciência Tecnologia em Tuberculose (INCT-TB). Aos
funcionários e aos alunos do Programa de Iniciação Científica - PAIC da Gerência de
Bacteriologia da FMT-HVD. Ao apoio, carinho e incentivo da professora Rossiclea
Lins Montes.
A Dra. Irineide Antunes diretora da Policlínica Cardoso Fontes e a Dra.
Marluce Garrido coordenadora do Programa de Controle da Tuberculose do
Amazonas. Agradeço, aos pesquisadores Reynaldo Dietze e Moisés Palaci do
Núcleo de Doença Infecciosas da Universidade Federal do Espírito Santo.
Ao amigo Walber Brandão pela grande contribuição nos testes laboratoriais e
pelo apoio incondicional. Ao amigo Diego Rayan por ter me incentivado a não
desistir. A amiga Helena Coelho por ter estado presente nos momentos de alegria e
aflições durantes as disciplinas e por compartilhar seus conhecimentos.
Ao Dr. Tomàs Maria Pérez Porcuna pelo grande apoio, incentivo, por acreditar
no meu trabalho e pelos sábios conselhos sobre ciência e sobre a vida. A Dra.
Samira Bührer pelo árduo trabalho nesta dissertação e por mostra-se presente no
momento mais difícil desta trajetória. A minha mãe e amiga Esmeralda Ribeiro pela
compreensão, palavras de conforto e por ter estado sempre ao meu lado.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa mundial com distribuição do número estimado de casos incidentes de tuberculose em 2010...............................
2
Figura 2: Distribuição da taxa de Incidência de tuberculose por unidades federais no Brasil em 2011.......................................
3
Figura 3: Imagem do Mycobacterium tuberculosis visualizado no microscópio eletrônico.............................................................
5
Figura 4: Ilustração do granuloma...........................................................
8
Figura 5: Imagem da aplicação do teste tuberculínico............................
10
Figura 6: Fluxograma da Técnica de execução do Quantiferon-TB e TSPOT.....................................................................................
11
Figura 7: Imagem do escarro com presença de BAAR..........................
12
Figura 8: Imagem do meio de cultura Ogawa Kudoh (OK) com colônias de Mycobacterium tuberculosis.................................
15
Figura 9: Imagem da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado...................................................................................
20
Figura 10: Fluxograma da metodologia dos testes realizados no estudo
23
Figura 11: Fluxograma do processamento do escarro ...........................
26
Figura 12: Imagem do suporte de filtros usado na filtração do escarro....
27
Figura 13: Imagem com a sequência da montagem do pré- filtro e do suporte de filtros.......................................................................
27
Figura 14: Imagem da montagem do sistema de filtração........................
28
Figura 15: Imagem com representação da coloração de membranas......
29
Figura 16: Fluxograma dos procedimentos laboratoriais.........................
30
vii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(Acquired Immunodeficiency Syndrome)
AMTD Teste Amplificado Direto (Amplifield Direct Test)
APC Célula Apresentadora de antígeno
a.C antes de Cristo
BAAR Bacilos Álcool-Ácidos Resistentes
BCG Bacilo Calmette-Guérin
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CFP 10 Cols. º C
(Cultura Filtrada de Proteína) Colaboradores Graus Celsius
A capital do estado do Amazonas Manaus foi a 4ª capital com a maior taxa
de incidência do país em 2011 (8). Manaus concentra 50% da população do
estado e 68% dos casos notificados sendo estes distribuídos de forma desigual
nos bairros, observando-se uma alta concentração de casos positivos em bairros
deficientes dos aparatos urbanísticos e preferencialmente com Índice de
Desenvolvimento Humano (IDH) mais baixos (13,12).
1.2 O Complexo Mycobacterium tuberculosis
As micobactérias pertencem à ordem dos Actinomycetales, família das
Mycobacteriaceae e ao gênero Mycobacterium. As espécies do complexo
Mycobacterium tuberculosis (M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M.microti, M.
caprae, M. pinnipedii, M. canetti e M. tuberculosis), pertencem ao gênero
Mycobacterium, apresentam características genotípicas restritas apenas ao
complexo e diferenças fenotípicas, de patogenicidade e epidemiológicas (14,15).
O M. bovis causa TB em vários mamíferos, incluindo bovinos e seres
humanos, foi uma das principais causas da TB humana antes da pasteurização
do leite. O M. bovis - BCG é um derivado atenuado do M. bovis sendo utilizado
na vacina Bacilo Calmette-Guérin (BCG) (16). Anteriormente denominado de M.
tuberculosis Muris, o M. microti é um patógeno de ratazanas e raramente causa
doença em humanos (17). Isolado de leões marinhos e focas, o M. pinnipedii
também é patogênico em coelhos e possivelmente em gados (18).
O M. caprae foi isolado de caprinos e não está restrito somente a este
hospedeiro por ter sido também isolado de gado, javali e suínos, sua ocorrência
foi relatada na França, Áustria e Alemanha (19). Descrito pela primeira vez por
George Canetti em 1969 o M. canetti foi isolado de um paciente nascido na
Somália (20,21). O M. africanum é associado à TB em humanos na África, onde
provoca mais casos que o M. tuberculosis que é o principal responsável pela TB
em seres humanos (22).
5
1.3 Características Gerais do Mycobacterium tuberculosis
O M. tuberculosis é um bacilo delgado ligeiramente encurvado, medindo
1,0 a 4,0 µm de comprimento e 0,3 a 0,6 µm de diâmetro (Figura 3). É um
microorganismo intracelular facultativo, sem flagelos, aeróbio estrito, apresenta
como principal característica o crescimento lento de colónias esbranquiçadas
com aspecto rugoso em meio de cultura sólido, duplicando sua população em 18
a 48 horas dependendo da oferta de nutrientes e oxigênio (15,23).
Figura 3: Imagem do M. tuberculosis visualizado no microscópio eletrônico. Fonte: http://njms.umdnj.edu/departments/medicine/divisions/infectious_disease
A parede celular micobacteriana possui alto teor de lipídeos que consiste
em ácidos graxos de cadeias longas, com 60 a 90 átomos de carbono
denominados ácidos micólicos (24). A notável capacidade de sobrevivência do M.
tuberculosis no hospedeiro infectado está relacionada à presença dos ácidos
micólicos na parede celular, evidenciado pelo fato das drogas isoniazida e
etionamida ao inibirem a biossíntese dos ácidos micólicos resulta em lise celular
(24, 25).
Outra propriedade relacionada aos ácidos micólicos é a resistência à
descoloração com álcool ácido. A parede celular micobacteriana retém o corante
fucsina e uma vez corada, resiste à descoloração, por isso o M. tuberculosis é
designado de Bacilo Álcool Ácido Resistente (BAAR) (23,26). Na parede celular
Em 2010 ocorreram 8,8 milhões de casos novos de tuberculose (TB) no
mundo, desse total, 1,1 milhões eram pacientes infectados pelo vírus da
imunodeficiência humana (HIV) (1). Pacientes co-infectados por TB/HIV apresentam
taxas de mortalidade mais elevadas do que pacientes com TB não infectados (2, 3).
Estudos de autópsia confirmam que TB é uma das principais causas de morte de
infectados pelo HIV (4, 5), ressaltando a importância do diagnóstico e do tratamento
precoce da doença na redução da mortalidade e da transmissão (4, 6).
Diagnósticar TB em infectados pelo HIV é um desafio, onde a clínica e os
achados radiográficos são muitas vezes atípicos (7, 8) e nos casos de baciloscopia
negativa não ajudam no diagnóstico da TB pulmonar (9). A baciloscopia de escarro,
amplamente utilizada e importante ferramenta em cenários onde a cultura não está
disponivel, apresenta baixa sensibilidade decrescendo em suspeitos de TB
infectados pelo HIV (10-12).
A baciloscopia após filtração do escarro através de membrana de
policarbonato (FMP) mostrou ser mais sensível e específica do que as baciloscopias
direta e após centrifugação (13, 14). Avaliamos este método em população de
suspeitos sendo com a maioria HIV positivos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Desenho e local. Estudo prospectivo e cego realizado no período de setembro
de 2011 a janeiro de 2012, em Manaus, Amazonas, Brasil com pacientes do hospital
da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) e do centro
de referência regional para TB, Policlínica Cardoso Fontes.
37
Recrutamento. Foram elegíveis para participar do estudo pacientes com
suspeita clínica, radiológica de TB. A inclusão dos pacientes no estudo ocorreu de
forma consecutiva à medida que compareceram nos serviços acima citados. A coleta
dos dados clínicos e demográficos da população do estudo foi realizadade de forma
prospectiva e foi baseada em informações dos prontuários médicos.
Coleta das amostras. Dos 508 pacientes recrutados foram solicitadas duas
amostras de escarro em dois dias consecutivos. A 2ª amostra de escarro foi
fornecida por 227 pacientes.
Baciloscopia após centrifugação. Os esfregaços foram preparados após
centrifugação a 3000gx a 4ºC por 15 min. e corados pelo método Ziehl-Neelsen (ZN)
(Figura 1).
Baciloscopia após centrifugação com NALC. Amostras de escarro, com
volume igual ou superior a 1,5 ml, foram digeridas com NALC diluído em uma
solução de NaOH 5%-Citrato de sódio 2,9% em um volume correspondente a 10%
do escarro, a temperatura de 20ºC por 15 min. A aliquota foi dividida em duas, na
primeira aliquota foi adicionado tampão fosfato pH 6,8 e após centrifugação a 3000
gx a 4ºC durante 15 min. foi realizado esfregaço do sedimento e corado pelo método
ZN.
Características do sistema de filtração. O sistema possui os seguintes
componentes: 1) Sistema de vácuo em aço inoxidável com 10 pontos de filtração e
válvulas de fechamento manual; 2) Sistema de filtros, formado pelo pré-filtro com
membrana de nylon 25 mm com poros de 30 μm e pelo filtro com membrana de
policarbonato branca de 13 mm com poros de 0.8μm (Millipore) e 3) Bomba de
vácuo para a aplicação de pressão negativa (5 mmHg).
38
Baciloscopia pelo método FMP. Na segunda alíquota, digerida e
descontaminada, foi adicionado hipoclorito de sódio (NaOCl 5%) no volume
referente a duas vezes o volume da alíquota. Em seguida a amostra foi
homogeneizada por 15 min. Foi adicionado etanol 95%/triton1% em quantidade igual
ao volume da mistura e homogeneizada por 15 segundos. Após passagem dos
escarros pelos sistemas de filtros, as válvulas foram fechadas e as membranas
foram coradas pelo método Kinyoun. As membranas foram transferidas para lâminas
de microscopia e foi colocado uma lamínula em cima de cada lâmina para leitura
microscópica.
Leitura e interpretação das microscopias. As lâminas foram observadas ao
microscópio de campo claro com objetiva de imersão (100X) para pesquisa de
Bacilo Álcool-Ácido Resistente (BAAR) em 100 campos e interpretado conforme a
escala semi-quantitativa descrita no Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e outras Micobactérias do Ministerio da Saúde (15).
Cultura em meio Ogawa Kudoh (OK) – padrão ouro. Os escarros foram
descontaminados pelo método de OK(15, 16) e semeados no meio de cultura. As
culturas foram colocadas em estufa bacteriológica a 37°C e lidas até completar 8
semanas. Os resultados das culturas foram relatados como: negativo, sem
crescimento ou positivo, quando houve o crescimento de Unidade Formadora de
Colônias com presença de BAAR confirmada pela microscopia.
Identificação dos isolados de Micobactérias: Isolados de M. tuberculosis foram
identificados usando os critérios de morfologia e pigmentação das colônias,
microscopia, teste da niacina, teste de inibição de crescimento em meio com ácido
p-nitrobenzóico (PNB) e teste de inibição de crescimento em meio com hidrazida do
ácido tiofeno 2-carboxílico.
39
Análise estatística. A sensibilidade, especificidade e os valores preditivos dos
testes foram estimados com um intervalo de confiança de 95%, e foi determinada
pela primeira amostra de escarro com o resultado da cultura finalizado como positivo
e negativo. Para verificação da concordância entre métodos diagnósticos utilizou-se
o índice de Kappa. Os dados foram analisados com EpiInfo (version 3.5.3).
Aspectos éticos. Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Protocolo n. 1845/2011, de 09/09/11.
Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE).
RESULTADOS
População e amostras do estudo: Foram elegíveis para participar do estudo 508
pacientes com suspeita clínica e radiológica de TB (Figura 2). Dos 76 pacientes
excluídos da análise, 3,5%(18/508) tiveram a cultura contaminada, 9,6% (49/508) o
sistema não filtrou os escarros e 1,8% (9/508) forneceram amostra com volume
inferior a 1,5 ml.
As características dos 432 participantes do estudo estão resumidas na Tabela 1. A
média de idade foi de 38,9 anos, 64% (276/432) eram do sexo masculino, 85%
(369/432) eram pacientes ambulatórias e 60% (261/432) eram pacientes infectados
pelo HIV. Setenta e cinco pacientes tiveram cultura positiva na primeira amostra de
escarro, desses 56% (42/75) eram infectados pelo HIV. Pacientes HIV positivo com
cultura positiva apresentaram menor contagem de CD4 do que pacientes com
cultura negativa (média 67 versus 214, p<0.001).
Concordância dos métodos de baciloscopia com padrão ouro: A tabela 2
apresenta as concordâncias entre a cultura de escarro e as baciloscopias realizadas
com os diferentes métodos. Observamos uma concordância boa com todos os
40
métodos sendo que apenas no grupo de pacientes HIV positivo a concordância entre
cultura e as baciloscopias após centrifugação com e sem NALC foi regular, k=0.55 e
k=0,578 respectivamente.
Desempenho dos métodos de baciloscopia: A sensibilidade obtida no método de
baciloscopia em FMP foi maior do que a sensibilidade das baciloscopias após
centrifugação quando tratadas ou não com NALC, (70.6% versus 54.6%, p=0.001) e
(70.6% versus 50.6%, p=0.001), respectivamente. Observamos que no grupo de
pacientes HIV positivo e negativos a maior sensibilidade foi do FMP, 61,9% e 81,8%
respectivamente. Não foi observada diferenças estatisticamente significante entre a
sensibilidade das baciloscopias após centrifugação com e sem NALC, (p>0.246)
(Tabela 3). Em HIV infectados e não infectados não houve diferenças significantes
entre as especificidades dos métodos de baciloscopia estudados (p=<1.00 e
p=<0.13 respectivamente).
Incremento da segunda amostra: Analisamos 227 pacientes que coletaram duas
amostras de escarro, desses 47 tiveram cultura positivas. Para calcular o incremento
da segunda amostra o numerador foram todos pacientes cujo primeiro escarro não
foi positivo, mas o segundo foi positivo e o denominador foi o número total de
pacientes diagnosticados com a doença. A segunda amostra de escarro apresentou
incremento de 11% (5/47) na baciloscopia após centrifugação sem NALC, 13%
(6/47) na baciloscopia após centrifugação com NALC e 4% (2/47) em FMP. Das 47
culturas apenas 3 pacientes eram HIV negativos portanto não estratificamos por
grupos para analisar o incremento.
41
DISCUSSÃO
A baciloscopia em pacientes HIV positivo é menos sensível e métodos rápidos que
auxiliem no diagnóstico podem mudar o prognóstico dos pacientes com co-infecção
TB/HIV. O método de baciloscopia em FMP na população de HIV positivos e HIV
negativos foi mais sensível, 61,9% e 81,8% respectivamente que as outras
baciloscopias estudadas. A sensibilidade de 81,8% nos HIV negativos foi
semelhante aos 80% e 89% relatadas por Smithwick & Stratigos (20) e Fennelly et
al. (8) respectivamente. Além disto, observamos que a sensibilidade no grupo HIV
positivo obtida com método FMP (61.9%) foi superior às de 47,6% e 45,2% das
baciloscopias após centrifugação com e sem NALC, respectivamente.
Quando comparamos a sensibilidade da baciloscopia após centrifugação sem NALC
com a da baciloscopia com NALC, não foi observada diferenças estatisticamente
significante tanto no grupo de pacientes HIV positivo quanto no grupo de HIV
negativo. Esses achados não foram previamente relatados (17).
A especificidade da baciloscopia após centrifugação com NALC e sem NALC foi
igual, tanto em pacientes HIV infectados quanto em pacientes não infectados. O
valor da especificidade da baciloscopia após centrifugação com NALC no grupo HIV
infectados e no grupo de não infectados (99% e 99.3%) respectivamente, são
consistentes com os resultados de outros estudos (17-19).
Em pacientes infectados pelo HIV, a sensibilidade da baciloscopia após
centrifugação combinada com NALC (47,6%) foi menor que a sensibilidade de 52%
encontrada em estudo que incluiu pacientes hospitalizados(18), 61.8% em estudo
que utilizou como critério de elegibilidade a contagem de CD4>200 células /mm³(20)
e 72% encontrada em um estudo que utilizou microscopia de fluorescência (21), mas
42
foi similar a sensibilidade (44%) encontrada em estudo com 166 suspeitos de TB em
um laboratório de referência na África(22) que incluiu pacientes de ambulatório
como em nosso estudo. As diferenças nas metodologias utilizadas talvez explique as
diferenças observadas.
Quando analisamos todo o grupo, a concordância de todas as baciloscopia (FMP,
após centrifugação com e sem NALC), com a cultura foi boa (Kappa=0.73, 0.64 e
0.60). Embora classificada como boa concordância ressalta-se que a baciloscopia
em FMP poderia ter apresentado um desempenho melhor, não fossem as amostras
positivas para 9 culturas negativas. Pesquisamos no Sistema Nacional de
Informação de Notificações de Agravos e buscamos dados laboratoriais adicionais
destes 9 pacientes. Dos nove, 3 também foram positivos nas baciloscopias após
centrifugação com e sem NALC, sendo que 2 eram pacientes HIV positivos que
foram a óbito por sepse e um foi diagnosticado com TB pulmonar através da clínica
e da 3ª cultura de escarro, e encontra-se em tratamento. Dos 6 pacientes que
tiveram apenas a baciloscopia em FMP positiva, 4 foram diagnosticados com TB
pulmonar com base em dados clínicos e em achados radiológicos e tiveram cura
como desfecho, dois foram diagnosticado através da 3ª cultura de escarro, um com
TB pulmonar e extrapulmonar e outro com TB pulmonar. Esses achados sugerem
que as duas culturas de escarro realizados neste estudo não foi sensível o suficiente
para detectar esses nove casos.
No grupo de HIV infectados a concordância das baciloscopias após centrifugação
com e sem NALC foi regular (Kappa=0.57 e 0.55), coerente com o grupo estudado
para o qual a sensibilidade das baciloscopias é em geral mais baixa.
43
Devido a alta sensibilidade do método de baciloscopia em FMP na primeira amostra,
os resultados sugerem que a realização do método em FMP na segunda amostra de
escarro poderia ser dispensada, no entanto neste estudo, o número de pacientes
com cultura positiva que coletaram a segunda amostra foi restrito.
Uma das limitações do estudo foi a não utilização de meios líquidos para cultura que
poderiam ter influenciado na sensibilidade e especificidade dos resultados obtidos.
Apesar dos microscopistas serem experientes e a leitura das microscopias ter sido
“cega” não foi realizado controle de qualidade nas leituras das baciloscopias após
centrifugação sem NALC e em FMP. Leitura posterior no caso da FMP não é
possível, pois observamos perda na coloração dos bacilos após 24hs.
O método de baciloscopia em FMP, apesar de ter baixo custo (3 reais por teste), é
trabalhoso, pois a higienização do sistema de filtração é manual e demorada (50
minutos), além disto, a dificuldade técnica apresentada com 10% (49) das amostras
de escarro não sendo filtradas demonstra a necessidade de aperfeiçoar o sistema
antes mesmo de avaliá-lo na rotina laboratorial de locais com alta prevalência da
doença isolada e associada ao HIV visto que não avaliamos o mesmo em condições
de rotina.
Conclusão
O tratamento do escarro com NALC não incrementou a sensibilidade da
baciloscopia após centrifugação indicando que o método com a menor complexidade
acelera o processo de diagnóstico.
A sensibilidade do método FMP no grupo HIV positivo foi superior a todas as
outras técnicas utilizadas sem perda da especificidade podendo ser uma
44
metodologia útil no diagnóstico deste grupo de risco, diminuindo a morbidade e
melhorando o prognóstico dos pacientes.
Referências
1. 9 de Março de 2010 , posting date. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual nacional de vigilância laboratorial da tuberculose e outras micobactérias. Brasília. [Online.]
2. 15 de Maio de 2012, posting date. World Health Organization 2011. Global Tuberculosis Control 2011. [Online.]
3. Ansari, N. A., A. H. Kombe, T. A. Kenyon, N. M. Hone, J. W. Tappero, S. T. Nyirenda, N. J. Binkin, and S. B. Lucas. 2002. Pathology and causes of death in a group of 128 predominantly HIV-positive patients in Botswana, 1997-1998. Int J Tuberc Lung Dis 6:55-63.
4. Banda, H., C. Kang'ombe, A. D. Harries, D. S. Nyangulu, C. J. Whitty, J. J. Wirima, F. M. Salaniponi, D. Maher, and P. Nunn. 2000. Mortality rates and recurrent rates of tuberculosis in patients with smear-negative pulmonary tuberculosis and tuberculous pleural effusion who have completed treatment. Int J Tuberc Lung Dis 4:968-974.
5. Cattamanchi, A., J. L. Davis, W. Worodria, S. den Boon, S. Yoo, J. Matovu, J. Kiidha, F. Nankya, R. Kyeyune, P. Byanyima, A. Andama, M. Joloba, D. H. Osmond, P. C. Hopewell, and L. Huang. 2009. Sensitivity and specificity of fluorescence microscopy for diagnosing pulmonary tuberculosis in a high HIV prevalence setting. Int J Tuberc Lung Dis 13:1130-1136.
6. Cattamanchi, A., D. W. Dowdy, J. L. Davis, W. Worodria, S. Yoo, M. Joloba, J. Matovu, P. C. Hopewell, and L. Huang. 2009. Sensitivity of direct versus concentrated sputum smear microscopy in HIV-infected patients suspected of having pulmonary tuberculosis. BMC infectious diseases 9:53.
7. Davis, J. L., W. Worodria, H. Kisembo, J. Z. Metcalfe, A. Cattamanchi, M. Kawooya, R. Kyeyune, S. den Boon, K. Powell, R. Okello, S. Yoo, and L. Huang. 2010. Clinical and radiographic factors do not accurately diagnose smear-negative tuberculosis in HIV-infected inpatients in Uganda: a cross-sectional study. PLoS One 5:e9859.
8. Fennelly, K. P., C. G. Morais, D. J. Hadad, S. Vinhas, R. Dietze, and M. Palaci. 2012. The small membrane filter method of microscopy to diagnose pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol 50:2096-2099.
9. Getahun, H., M. Harrington, R. O'Brien, and P. Nunn. 2007. Diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis in people with HIV infection or AIDS in resource-constrained settings: informing urgent policy changes. Lancet 369:2042-2049.
10. Greenberg, A. E., S. Lucas, O. Tossou, I. M. Coulibaly, D. Coulibaly, S. Kassim, A. Ackah, and K. M. De Cock. 1995. Autopsy-proven causes of death in HIV-infected patients treated for tuberculosis in Abidjan, Cote d'Ivoire. AIDS 9:1251-1254.
11. Hargreaves, N. J., O. Kadzakumanja, C. J. Whitty, F. M. Salaniponi, A. D. Harries, and S. B. Squire. 2001. 'Smear-negative' pulmonary tuberculosis in a DOTS programme: poor outcomes in an area of high HIV seroprevalence. Int J Tuberc Lung Dis 5:847-854.
12. Kivihya-Ndugga, L. E., M. R. van Cleeff, W. A. Githui, L. W. Nganga, D. K. Kibuga, J. A. Odhiambo, and P. R. Klatser. 2003. A comprehensive comparison of Ziehl-Neelsen and fluorescence microscopy for the diagnosis of tuberculosis in a resource-poor urban setting. Int J Tuberc Lung Dis 7:1163-1171.
13. Kudoh, S., and T. Kudoh. 1974. A simple technique for culturing tubercle bacilli. Bull World Health Organ 51:71-82.
45
14. Lawn, S. D., and R. Wood. 2011. Tuberculosis in antiretroviral treatment services in resource-limited settings: addressing the challenges of screening and diagnosis. J Infect Dis 204 Suppl 4:S1159-1167.
15. Matee, M., L. Mtei, T. Lounasvaara, W. Wieland-Alter, R. Waddell, J. Lyimo, M. Bakari, K. Pallangyo, and C. F. von Reyn. 2008. Sputum microscopy for the diagnosis of HIV-associated pulmonary tuberculosis in Tanzania. BMC Public Health 8:68.
16. Mukadi, Y. D., D. Maher, and A. Harries. 2001. Tuberculosis case fatality rates in high HIV prevalence populations in sub-Saharan Africa. AIDS 15:143-152.
17. Perkins, M. D., and J. Cunningham. 2007. Facing the crisis: improving the diagnosis of tuberculosis in the HIV era. J Infect Dis 196 Suppl 1:S15-27.
18. Reid, M. J., and N. S. Shah. 2009. Approaches to tuberculosis screening and diagnosis in people with HIV in resource-limited settings. Lancet Infect Dis 9:173-184.
19. Schutz, C., G. Meintjes, F. Almajid, R. J. Wilkinson, and A. Pozniak. 2010. Clinical management of tuberculosis and HIV-1 co-infection. Eur Respir J 36:1460-1481.
20. Smithwick, R. W., and C. B. Stratigos. 1981. Acid-fast microscopy on polycarbonate membrane filter sputum sediments. J Clin Microbiol 13:1109-1113.
21. Steingart, K. R., V. Ng, M. Henry, P. C. Hopewell, A. Ramsay, J. Cunningham, R. Urbanczik, M. D. Perkins, M. A. Aziz, and M. Pai. 2006. Sputum processing methods to improve the sensitivity of smear microscopy for tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis 6:664-674.
22. Wilkinson, D., and A. W. Sturm. 1997. Diagnosing tuberculosis in a resource-poor setting: the value of sputum concentration. Trans R Soc Trop Med Hyg 91:420-421.
46
FIGURA 1. Esquema do processamento das amostras de escarros
FIGURA 2. População e amostras do estudo
47
TABELA 1: Características demográficas e clínicas
Características Total (N=432)
Cultura positiva (N=83)
Cultura negativa (n=349)
Idade, anos Mediana (IQR) Média (DP)
37.0 (18-86)
38.9 (14.2)
32.0 (18-76) 34.7 (12.3)
38.0(18.0-86)
39.8 (14.9)
Sexo Feminino Masculino
156 (36%) 276 (64%)
26 (31%) 57 (69%)
130 (37%) 219 (63%)
Local da seleção FMT-HVD Cardoso Fontes
338 (78%) 94 (22%)
60 (72%) 23 (28%)
278 (80%) 71 (20%)
Procedência Ambulatório Enfermaria
369 (85%) 63 (15%)
61 (73%) 22 (27%)
308 (88%) 41 (12%)
Infecção pelo HIV Sim Não
261 (60%) 171 (40%)
43 (52%)
40 (48%)
218 (62%) 131 (38%)
Contagem de CD4 (células/mm³) Mediana (IQR) Média (DP)
178(11-870)
193 (153)
45 (11-315)
67 (56)
189 (16-870)
214 (154)
Tipo de caso suspeito Novo caso suspeito Suspeito de TB após abandono de tratamento Recidiva de TB após cura
Abreviações: Cl, Intervalo de confiança; VPP, Valor Preditivo Positivo; VPN, Valor Preditivo Negativo; HIV, Vírus da Imunodeficiência Humana.*A sensibilidade e especificidade foi estimado pela análise da primeira amostra de escarro de cada paciente com o resultado da cultura finalizada como positiva ou negativa
49
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Smith DW. Koch's postulates and the Koch phenomenon, an update. Indian J Chest Dis Allied Sci 1982;24(2-3):95-100. 2. Rosemberg J. Tuberculose - Aspectos históricos, realidades, seu romantismo e transculturação. Bol. Pneumol. Sanit. 1999;Vol. 7(2):5-29.
3. Perkins MD, Cunningham J. Facing the crisis: improving the diagnosis of tuberculosis in the HIV era. J Infect Dis 2007;196 Suppl 1:S15-27. 4. Eamranond P, Jaramillo E. Tuberculosis in children: reassessing the need for improved diagnosis in global control strategies. Int J Tuberc Lung Dis 2001;5(7):594-603. 5. Flynn JL, Chan J. What's good for the host is good for the bug. Trends Microbiol 2005;13(3):98-102. 6. WHO. 10 Facts About Tuberculosis. [acesso em 03 de dezembro de 2010]; Disponível em: http://www.who.int/features/factfiles/tuberculosis/en 7. WHO. Global Tuberculosis Control Report 2011. [acesso 18 de maio de 2012]; Disponível em: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/
8. Brasil. Ministério da Saúde. Situação da Tuberculose no Brasil. 2012 [acesso em 18 de Abril de 2012]; Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/apresentacao_dia_mundial_tb_26_03_12.
9. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Boletim Epidemiológico. Especial Tuberculose. 2012 [acesso em 24 de Agosto de 2012]; Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/bolepi_v43_especial_tb_correto.pdf
10. Brasil. Ministério da Saúde. Série Histórica do número de casos novos de tuberculose. 2011 [acesso em 24 de Agosto de 2012]; Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/casos_novos_tuberculose_1990_2010_30_05_2012.pdf
11. Brasil. Ministério da Saúde. Série Histórica da Taxa de Mortalidade de Tuberculose. 2010 [acesso em 24 de Agosto de 2012]; Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/taxa_mortalidade_tuberculose_1999_2010_30_05_2012.pdf 12. Marreiro LS, Cruz MA, Oliveira MN, Garrido MS. Tuberculose em Manaus, Estado do Amazonas: resultado de tratamento e descentralização. Epidemiol. Serv. Saúde 2011;18(3):237-242. 13. Souza MG, Pinheira ES. Incidência e Distribuição da Tuberculose na Cidade
de Manaus/AM, Brasil. Rev. Geogr. Acadêmica 2009;3(2):35-43.
14. EUZÉBY, J. P. List of bacterial names [acesso em 2 de Maio de 2012]; Disponível em: http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.htm 15. Souza GR, Kritski AL, Conde MB. Tuberculose: do ambulatório à enfermaria. 3ª ed. São Paulo: Atheneu; 2005. 259 p 16. Dannenberg AM, Jr. Pathogenesis of pulmonary Mycobacterium bovis infection: basic principles established by the rabbit model. Tuberculosis (Edinb) 2001;81(1-2):87-96. 17. Sula L, Radkovsky I. Protective effects of M. microti vaccine against tuberculosis. Journal of hygiene, epidemiology, microbiology, and immunology. 1976;20(1):1-6. 18. Cousins DV, Bastida R, Cataldi A, Quse V, Redrobe S, Dow S, et al. Tuberculosis in seals caused by a novel member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2003;53(Pt 5):1305-14. 19. Aranaz A, Cousins D, Mateos A, Dominguez L. Elevation of Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae Aranaz et al. 1999 to species rank as Mycobacterium caprae comb. nov., sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2003;53(Pt 6):1785-9. 20. Van Soolingen D, Hoogenboezem T, de Haas PE, Hermans PW, Koedam MA, Teppema KS, et al. A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium tuberculosis complex, Canetti: characterization of an exceptional isolate from Africa. Int J Syst Bacteriol 1997;47(4):1236-45. 21. Miltgen J, Morillon M, Koeck JL, Varnerot A, Briant JF, Nguyen G, et al. Two cases of pulmonary tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis subsp canetti. Emerg Infect Dis 2002;8(11):1350-2. 22. Niemann S, Rusch-Gerdes S, Joloba ML, Whalen CC, Guwatudde D, Ellner JJ, et al. Mycobacterium africanum subtype II is associated with two distinct genotypes and is a major cause of human tuberculosis in Kampala, Uganda. J Clin Microbiol 2002;40(9):3398-405. 23. Pasqualotto AC, Schwarzbold AV. Doenças Infecciosas. Consulta rápida Porto Alegre: Artmed; 2007. 816 p.
24. Brennan PJ, Nikaido H. The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem 1995;64:29-63. 25. Molle V, Gulten G, Vilcheze C, Veyron-Churlet R, Zanella-Cleon I, Sacchettini JC, et al. Phosphorylation of InhA inhibits mycolic acid biosynthesis and growth of Mycobacterium tuberculosis. Molecular microbiology. 2010;78(6):1591-605 26. Bhatt A, Fujiwara N, Bhatt K, Gurcha SS, Kremer L, Chen B, et al. Deletion of
kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and subclinical latent tuberculosis in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104(12):5157-62.
27. Brennan PJ. Structure, function, and biogenesis of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb) 2003;83(1-3):91-7
28. McNeil M, Daffe M, Brennan PJ. Location of the mycolyl ester substituents in the cell walls of mycobacteria. J Biol Chem 1991;266(20):13217-23.
29. Ishikawa E, Ishikawa T, Morita YS, Toyonaga K, Yamada H, Takeuchi O, et al. Direct recognition of the mycobacterial glycolipid, trehalose dimycolate, by C-type lectin Mincle. J Exp Med 2009;206(13):2879-88. 30. Indrigo J, Hunter RL, Jr., Actor JK. Influence of trehalose 6,6'-dimycolate (TDM) during mycobacterial infection of bone marrow macrophages. Microbiology 2002;148(Pt 7):1991-8. 31. Briken V, Porcelli SA, Besra GS, Kremer L. Mycobacteriallipoarabinomannan and related lipoglycans: from biogenesis to modulation of the immune response. Mol Microbiol 2004;53(2):391-403. 32. Alderwick LJ, Lloyd GS, Lloyd AJ, Lovering AL, Eggeling L, Besra GS. Biochemical characterization of the Mycobacterium tuberculosis phosphoribosyl-1-pyrophosphate synthetase. Glycobiology. 2011;21(4):410-25. 33. Diagnostic Standards and Classification of Tuberculosis in Adults and Children. This official statement of the American Thoracic Society and the Centers for Disease Control and Prevention was adopted by the ATS Board of Directors, July 1999. This statement was endorsed by the Council of the Infectious Disease Society of America, September 1999. Am J Respir Crit Care Med 2000;161(4 Pt 1):1376-95. 34. Saiga H, Shimada Y, Takeda K. Innate immune effectors in mycobacterial infection. Clin Dev Immunol;2011:347594. 35. Kaufmann SH. How can immunology contribute to the control of tuberculosis? Nat Rev Immunol 2001;1(1):20-30. 36. Lapa JR, Silva, Boéchat N. O resurgimento da tuberculose e o impacto do estudo da imunopatogenia pulmonar. J. Bras Pneumol 2004;30(4):478-84. 37. Ahmad S. Pathogenesis, immunology, and diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection. Clin Dev Immunol;2011:814943. 38. Weston D. The pathogenesis of infection and immune response. Br J Nurs. 2010;19(16):S4-11. 39. Harding CV, Boom WH. Regulation of antigen presentation by Mycobacterium tuberculosis: a role for Toll-like receptors. Nat Rev Microbiol.
52
2010;8(4):296-307. 40. Kornfeld H, Mancino G, Colizzi V. The role of macrophage cell death in tuberculosis. Cell Death Differ 1999;6(1):71-8. 41. Berrington WR, Hawn TR. Mycobacterium tuberculosis, macrophages, and the innate immune response: does common variation matter? Immunol Rev 2007;219:167-86 42. Lee J, Kornfeld H. Interferon-gamma Regulates the Death of M. tuberculosis Infected Macrophages. Journal of cell death. 2010;3:1-11.. 43. Pieters J. Mycobacterium tuberculosis and the macrophage: maintaining a balance. Cell Host Microbe 2008;3(6):399-407. 44. Daley CL. Molecular epidemiology: a tool for understanding control of tuberculosis transmission. Clin Chest Med 2005;26(2):217-31, vi. 45. Conde MB, Melo FA, Marques AM, Cardoso NC, Pinheiro VG, Dalcin Pde T, et al. III Brazilian Thoracic Association Guidelines on tuberculosis. J Bras Pneumol 2009;35(10):1018-48. 46. Campos HS. Diagnóstico da Tuberculose. Pulmão RJ 2006;15(2):92-99. 47. Lange C, Mori T. Advances in the diagnosis of tuberculosis. Respirology. 2010;15(2):220-40. 48. Schutz C, Meintjes G, Almajid F, Wilkinson RJ, Pozniak A. Clinical management of tuberculosis and HIV-1 co-infection. Eur Respir J. 2010;36(6):1460-81. 49. Lawn SD, Wood R. Tuberculosis in antiretroviral treatment services in resource-limited settings: addressing the challenges of screening and diagnosis. J Infect Dis. 2011;204 Suppl 4:S1159-67. 50. Chamie G, Luetkemeyer A, Walusimbi-Nanteza M, Okwera A, Whalen CC, Mugerwa RD, et al. Significant variation in presentation of pulmonary tuberculosis across a high resolution of CD4 strata. Int J Tuberc Lung Dis. 2010;14(10):1295-302. 51. Davis JL, Worodria W, Kisembo H, Metcalfe JZ, Cattamanchi A, Kawooya M, et al. Clinical and radiographic factors do not accurately diagnose smear-negative tuberculosis in HIV-infected inpatients in Uganda: a cross-sectional study. PLoS One. 2010;5(3):e9859. 52. Korzeniewska-Kosela M, Krysl J, Muller N, Black W, Allen E, FitzGerald JM. Tuberculosis in young adults and the elderly. A prospective comparison study. Chest 1994;106(1):28-32. 53. Jones BE, Ryu R, Yang Z, Cave MD, Pogoda JM, Otaya M, et al. Chest
53
radiographic findings in patients with tuberculosis with recent or remote infection. Am J Respir Crit Care Med 1997;156(4 Pt 1):1270-3.
54. Teixeira HC, Abramo C, Munk ME. Immunological diagnosis of tuberculosis: problems and strategies for success. J Bras Pneumol 2007;33(3):323-34. 55. Marchi AM, Juttel ID, Kawacubo EM, Dalmarco EM, Blatt ST, Cordova CMM. Evaluation of Methods for Detection and Identification of Mycobacterium Species in Patients Suspected of Having Pulmonary Tuberculosis. Brasilian Journal of Microbiology 2008;39:613-618.
56. Macente S, Ribeiro F. Diagnóstico Molecular de M. tuberculosis: Uma Revisão de Técnicas. Revista Saúde e Pesquisa. 2009;2:225-231. 57. Tuberculosis Coalition for Technical Assistence. Handbook for Using The International Standards for Tuberculosis Care. 2007. [Acesso em 8 de Setembro de 2010 ]; Disponível em: http://www.nationaltbcenter.edu/international/ISTC_handbook.pdf. 58. Huebner RE, Schein MF, Bass JB, Jr. The tuberculin skin test. Clin Infect Dis 1993;17(6):968-75. 59. Cezar MC. Diagnóstico e Tratamento da Tuberculose Latente Pulmão RJ. 2012;1(21):41-5. 60. Pai M, Zwerling A, Menzies D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Ann Intern Med 2008;149(3):177-84. 61. Friedman L, Dvorak HF. The negative tuberculin test: tuberculin, HIV, and anergy panels. Am J Respir Crit Care Med. 1995;151(2 Pt 1):580. 62. Jalba MS. Atypical mycobacterial infection, starvation and effect of BCG vaccination on tuberculin skin test. Thorax. 2003;58(4):367-8. 63. Moreno S, Blazquez R, Novoa A, Carpena I, Menasalvas A, Ramirez C, et al. The effect of BCG vaccination on tuberculin reactivity and the booster effect among hospital employees. Arch Intern Med. 2001;161(14):1760-5. 64. Richeldi L. An update on the diagnosis of tuberculosis infection. Am J Respir Crit Care Med. 2006;174(7):736-42. 65. Miranda C, Tomford JW, Gordon SM. Interferon-gamma-release assays: Better than tuberculin skin testing? Cleveland Clinic journal of medicine. 2010;77(9):606-11. 66. Shah M, Dipietro D, Greenbaum A, Ketemepi S, Martins-Evora M, Marsiglia V, et al. Programmatic Impact of QuantiFERON-TB Gold In-Tube Implementation on Latent Tuberculosis Diagnosis and Treatment in a Public Health Clinic. PLoS One. 2012;7(5):e36551.
67. Diel R, Goletti D, Ferrara G, Bothamley G, Cirillo D, Kampmann B, et al. Interferon-gamma release assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: a systematic review and meta-analysis. Eur Respir J. 2011;37(1):88-99. 68. Lalvani A, Pareek M. Interferon gamma release assays: principles and practice. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica. 2010;28(4):245-52. 69. Pai M, Riley LW, Colford JM, Jr. Interferon-gamma assays in the immunodiagnosis of tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis. 2004;4(12):761-76. 70. Menzies D, Pai M, Comstock G. Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research. Annals of internal medicine. 2007;146(5):34-54. 71. Jurcev-Savicevic A, Katalinic-Jankovic V, Mise K, Gudelj I. The role of interferon-gamma release assay in tuberculosis control. Arhiv za higijenu rada i toksikologiju. 2012;63(1):49-59. 72. Sester M, Sotgiu G, Lange C, Giehl C, Girardi E, Migliori GB, et al. Interferon-gamma release assays for the diagnosis of active tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Eur Respir J. 2011;37(1):100-11. 73. Soysal A, Bakir M. T-SPOT.TB assay usage in adults and children. Expert Rev Mol Diagn. 2011;11(6):643-60. 74. Rangaka MX, Wilkinson KA, Glynn JR, Ling D, Menzies D, Mwansa-Kambafwile J, et al. Predictive value of interferon-gamma release assays for incident active tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2012;12(1):45-55. 75. Dyrhol-Riise AM, Gran G, Wentzel-Larsen T, Blomberg B, Haanshuus CG, Morkve O. Diagnosis and follow-up of treatment of latent tuberculosis; the utility of the QuantiFERON-TB Gold In-tube assay in outpatients from a tuberculosis low-endemic country. BMC infectious diseases. 2010;10:57.
76. World Health Organization. Use of tuberculosis interferon-gamma release assays (IGRAs) in low- and middle-income countries 2011. [Acesso em 10 de Junho de 2012]; Disponivel em: http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502672_eng.pdf. 77. Steingart KR, Henry M, Ng V, Hopewell PC, Ramsay A, Cunningham J, et al. Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis 2006;6(9):570-81. 78. Cattamanchi A, Davis JL, Worodria W, den Boon S, Yoo S, Matovu J, et al. Sensitivity and specificity of fluorescence microscopy for diagnosing pulmonary tuberculosis in a high HIV prevalence setting. Int J Tuberc Lung Dis 2009;13(9):1130-6.
79. Hung NV, Sy DN, Anthony RM, Cobelens FG, van Soolingen D. Fluorescence microscopy for tuberculosis diagnosis. Lancet Infect Dis. 2007;7(4):238-9. 80. Anthony RM, Kolk AH, Kuijper S, Klatser PR. Light emitting diodes for auramine O fluorescence microscopic screening of Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2006;10(9):1060-2. 81. Schaefer S, Boehm SA, Chau KJ. Automated, portable, low-cost bright-field and fluorescence microscope with autofocus and autoscanning capabilities. Applied optics. 2012;51(14):2581-8. 82. Miller AR, Davis GL, Oden ZM, Razavi MR, Fateh A, Ghazanfari M, et al. Portable, battery-operated, low-cost, bright field and fluorescence microscope. PLoS One. 2010;5(8):e11890. 83. Cattamanchi A, Dowdy DW, Davis JL, Worodria W, Yoo S, Joloba M, et al. Sensitivity of direct versus concentrated sputum smear microscopy in HIV-infected patients suspected of having pulmonary tuberculosis. BMC infectious diseases. 2009;9:53. 84. Ongkhammy S, Amstutz V, Barennes H, Buisson Y. The bleach method improves the detection of pulmonary tuberculosis in Laos. Int J Tuberc Lung Dis. 2009;13(9):1124-9. 85. Chew R, Calderon C, Schumacher SG, Sherman JM, Caviedes L, Fuentes P, et al. Evaluation of bleach-sedimentation for sterilising and concentrating Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. BMC infectious diseases. 2011;11:269. 86. Steingart KR, Ng V, Henry M, Hopewell PC, Ramsay A, Cunningham J, et al. Sputum processing methods to improve the sensitivity of smear microscopy for tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis 2006;6(10):664-74. 87. Smithwick RW, Stratigos CB. Acid-fast microscopy on polycarbonate membrane filter sputum sediments. J Clin Microbiol 1981;13(6):1109-13. 88. Fennelly KP, Morais CG, Hadad DJ, Vinhas S, Dietze R, Palaci M. The small membrane filter method of microscopy to diagnose pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol. 2012;50(6):2096-9. 89. Garg SK, Tiwari RP, Tiwari D, Singh R, Malhotra D, Ramnani VK, et al. Diagnosis of tuberculosis: available technologies, limitations, and possibilities. J Clin Lab Anal 2003;17(5):155-63 90. Yeager H, Jr., Lacy J, Smith LR, LeMaistre CA. Quantitative studies of mycobacterial populations in sputum and saliva. Am Rev Respir Dis. 1967;95(6):998-1004. 91. Hobby GL, Holman AP, Iseman MD, Jones JM. Enumeration of tubercle
56
bacilli in sputum of patients with pulmonary tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 1973;4(2):94-104. 92. Herold CD, Fitzgerald RL, Herold DA. Current techniques in mycobacterial detection and speciation. Crit Rev Clin Lab Sci 1996;33(2):83-138. 93. Pronyk PM, Kahn K, Hargreaves JR, Tollman SM, Collinson M, Hausler HP, et al. Undiagnosed pulmonary tuberculosis deaths in rural South Africa. Int J Tuberc Lung Dis 2004;8(6):796-9. 94. Ansari NA, Kombe AH, Kenyon TA, Hone NM, Tappero JW, Nyirenda ST, et al. Pathology and causes of death in a group of 128 predominantly HIV-positive patients in Botswana, 1997-1998. Int J Tuberc Lung Dis 2002;6(1):55-63. 95. Souza SL, Feitoza PV, Araujo JR, Andrade RV, Ferreira LC. [Causes of death among patients with acquired immunodeficiency syndrome autopsied at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas]. Rev Soc Bras Med Trop 2008;41(3):247-51. 96. Cruciani M, Scarparo C, Malena M, Bosco O, Serpelloni G, Mengoli C. Meta-analysis of BACTEC MGIT 960 and BACTEC 460 TB, with or without solid media, for detection of mycobacteria. J Clin Microbiol. 2004;42(5):2321-5. 97. Chew WK, Lasaitis RM, Schio FA, Gilbert GL. Clinical evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) compared with radiometric (Bactec) and solid media for isolation of Mycobacterium species. Journal of medical microbiology. 1998;47(9):821-7. 98. Rodrigues C, Shenai S, Sadani M, Sukhadia N, Jani M, Ajbani K, et al. Evaluation of the bactec MGIT 960 TB system for recovery and identification of Mycobacterium tuberculosis complex in a high through put tertiary care centre. Indian journal of medical microbiology. 2009;27(3):217-21. 99. Sorlozano A, Soria I, Roman J, Huertas P, Soto MJ, Piedrola G, et al. Comparative evaluation of three culture methods for the isolation of mycobacteria from clinical samples. Journal of microbiology and biotechnology. 2009;19(10):1259-64. 100. Chihota VN, Grant AD, Fielding K, Ndibongo B, van Zyl A, Muirhead D, et al. Liquid vs. solid culture for tuberculosis: performance and cost in a resource-constrained setting. Int J Tuberc Lung Dis. 2010;14(8):1024-31. 101. Moore DA, Evans CA, Gilman RH, Caviedes L, Coronel J, Vivar A, et al. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med 2006;355(15):1539-50. 102. Minion J, Leung E, Menzies D, Pai M. Microscopic-observation drug susceptibility and thin layer agar assays for the detection of drug resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2010;10(10):688-98.
57
103. Caviedes L, Moore DA. Introducing MODS: a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. Indian J Med Microbiol 2007;25(2):87-8. 104. Chaiyasirinroje B, Aung MN, Moolphate S, Kasetjaroen Y, Rienthong S, Rienthong D, et al. Prospective evaluation of simply modified MODS assay: an effective tool for TB diagnosis and detection of MDR-TB. Infection and drug resistance. 2012;5:79-86. 105. Ha DT, Lan NT, Kiet VS, Wolbers M, Hang HT, Day J, et al. Diagnosis of pulmonary tuberculosis in HIV-positive patients by microscopic observation drug susceptibility assay. J Clin Microbiol. 2010;48(12):4573-9. 106. Cohen RA, Muzaffar S, Schwartz D, Bashir S, Luke S, McGartland LP, et al. Diagnosis of pulmonary tuberculosis using PCR assays on sputum collected within 24 hours of hospital admission. Am J Respir Crit Care Med. 1998;157(1):156-61. 107. Kim MH, Yang HY, Suh JT, Lee HJ. Comparison of in-house PCR with conventional techniques and Cobas Amplicor M. tuberculosis kit for detection of Mycobacterium tuberculosis. Yonsei medical journal. 2008;49(4):537-44. 108. Cheng VC, Yew WW, Yuen KY. Molecular diagnostics in tuberculosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005;24(11):711-20. 109. Update: Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morbidity and mortality weekly report. 2000;49(26):593-4. 110. Greco S, Girardi E, Navarra A, Saltini C. Current evidence on diagnostic accuracy of commercially based nucleic acid amplification tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Thorax. 2006;61(9):783-90. 111. Ling DI, Flores LL, Riley LW, Pai M. Commercial nucleic-acid amplification tests for diagnosis of pulmonary tuberculosis in respiratory specimens: meta-analysis and meta-regression. PLoS One. 2008;3(2):e1536. 112. Lima SS, Clemente WT, Palaci M, Rosa RV, Antunes CM, Serufo JC. Conventional and molecular techniques in the diagnosis of pulmonary tuberculosis: a comparative study. J Bras Pneumol 2008;34(12):1056-62. 113. Silva RM, Bazzo ML, Chagas M. Quality of sputum in the performance of polymerase chain reaction for diagnosis of pulmonary tuberculosis. Braz J Infect Dis;14(1):116-20. 114. Ogusku MM, Salem JI. Análise de diferentes primers utilizados na PCR visando ao diagnóstico da tuberculose no estado do Amazonas. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 2004;30(4):343-349. 115. Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, Nicol MP, Shenai S, Krapp F, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med.
58
2010;363(11):1005-15. 116. Helb D, Jones M, Story E, Boehme C, Wallace E, Ho K, et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand, near-patient technology. J Clin Microbiol. 2010;48(1):229-37. 117. Blakemore R, Story E, Helb D, Kop J, Banada P,et al. (2010) Evaluation of the analytical performance of the Xpert MTB/RIF assay. J ClinMicrobiol 48(7): 2495–2501. 118. Lawn SD, Nicol MP. Xpert(R) MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicin resistance. Future Microbiol. 2011;6(9):1067-82. 119. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual nacional de vigilância laboratorial da tuberculose e outras micobactérias. Brasília. 2008 [Acesso em 9 deMarçode2010];Disponívelem:http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_vigilancia_laboratorial_tuberculose.pdf.
Impressão dactiloscópica Assinatura do Voluntário Nome do Voluntário -impresso
Assinatura do responsável legal Nome do responsável legal
Assinatura da testemunha
Impressão dactiloscópica
Nome da testemunha
Assinatura do investigador Nome do investigador
74
ANEXO F
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
75
Descrever e fornecer informações para uma apropriada coleta de amostras de
escarros destinadas a realização dos exames de baciloscopias e a cultura.
1. Pote para coleta de escarro
2. Papel toalha ou papel higiênico;
3. Luvas;
4. Fita gomada ou etiquetas para identificar o pote da amostra;
5. Pincel permanente para identificar a etiqueta ou a fita gomada.
1. Utilizar luvas, máscaras, aventais e calçados fechados para realização de todos
os procedimentos.
2. Instruir claramente o paciente sobre o procedimento de coleta de escarro.
3. O paciente deve coletar o escarro da antibioticoterapia.
4. A amostra de escarro deve ser coletada em local aberto ao ar livre ou em sala
bem arejada.
5. O escarro deve ser coletado em pote de plástico transparente, de boca larga com
tampa de rosca, fornecido pela Unidade de Saúde FMT-HVD e Policlínica Cardoso
Fontes.
PROCEDIMENTO PARA COLETA DE ESCARRO ESPONTÂNEO
POP - 01
Página 1 de 3
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD) e Policlínica Cardoso Fontes.
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Setor de entrega de amostras de escarro
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia) Dra. Irineide Assumpção Antunes (Diretora da Policlínica Cardoso Fontes)
A. OBJETIVOS
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. CONDIÇÕES GERAIS
76
6. O profissional do laboratório ao receber o pote com a amostra de escarro do
paciente deve usar luvas e fazer a assepsia do pote com hipoclorito de sódio a 1%
para evitar contaminação de si próprio e a contaminação da requisição médica que
acompanha o material.
7. Identificar claramente a amostra coletada utilizando o pincel permanente.
1. Coletar duas amostras de escarro de cada paciente.
2. A primeira amostra é coletada durante a primeira consulta e a segunda é coletada
na manhã seguinte, assim que o paciente despertar.
3. Orientações para coleta da 1ª amostra de escarro
3.1. Fornecer ao paciente orientação e simulação da técnica de coleta utilizando para
isso o pote, e indicando a quantidade adequada a ser coletada( mínimo 1,5 mL).
3.2. Entregar ao paciente o pote para coleta devidamente identificado, junto com um
papel toalha ou papel higiênico. A identificação deve ser feita no corpo do pote.
3.3. Indicar ao paciente o local onde ele efetuará coleta.
3.4. Orientar o paciente a lavar a boca fazendo bochechos com bastante água. Não
precisa estar de jejum.
3.5 No local indicado para realização do procedimento o paciente deve abrir o pote e
forçar a tosse do seguinte modo:
i. Inspirar profundamente, isto é, puxar o ar pelo nariz e ficar com a boca fechada
soltar o ar lentamente pela boca, fazer isso duas vezes.
ii. Inspirar profundamente mais uma vez, prender a respiração por alguns
instantes e solte o ar com força e rapidamente pela boca.
iii. Inspire profundamente mais uma vez, prenda a respiração por alguns instantes
e, em seguida, force a tosse para poder liberar o escarro que está dentro do
pulmão. Escarre diretamente dentro do pote e não deixe o escarro escorrer por
fora do pote.
iv. Repita as orientações (2) e (3) por mais duas vezes, até conseguir uma
quantidade maior de amostra.
D. PROCEDIMENTO
POP - 01 Página 2 de 3
77
v. Orientar o paciente a tampar o pote após a coleta rosqueando-o firmemente.
Após o procedimento o paciente deve lavar as mãos com água e sabão.
vi. Orientar o paciente a carregar o pote sempre com a tampa voltada para cima.
4. Orientações para coleta da 2ª amostra de escarro:
4.1. Orientar o paciente a beber no mínimo 8 copos de líquidos (água ou refrescos) no
dia anterior á coleta.
4.2. Orientar o paciente a dormir sem travesseiro no dia anterior a coleta. Isso também
facilita a saída do escarro do pulmão.
4.3 Orientar o paciente (no dia da coleta e assim que despertar) a lavar a boca fazendo
bochechos com bastante água e, em jejum, forçar a tosse e escarrar dentro do pote,
seguido às mesmas orientações da coleta da primeira amostra.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
E. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 01 Página 3 de 3
78
A baciloscopia ou exame microscópico é a pesquisa de Bacilo Álcool-Ácido Resistente
(BAAR) em um esfregaço de amostra clínica, preparado e corado com metodologia
padronizada.
Descrever o procedimento para realização do exame de baciloscopia.
1. Solução de Álcool a 70%;
2. Solução Fenol a 5%;
3. Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha);
4. Palito de madeira;
5. Lápis de grafite;
6. Lâminas de vidro para microscopia com borda fosca;
7. Recipiente com tampa contendo pedaços de gaze;
8. Recipiente para descarte de materiais contaminados;
9. Cabine de Segurança Biológica (CSB).
10. Cronômetro.
11. Álcool etílico comercial.
12. Fucsina Fenicada a 0,3%.
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA BACILOSCOPIA APÓS
CENTRIFUGAÇÃO
POP - 02
Página 1 de 6
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. DESCRIÇÃO
C. RECURSOS NECESSÁRIOS
B. OBJETIVO
79
13. Solução Descorante de Álcool-Ácido a 3%.
14. Azul de Metileno a 0,3%.
16. Funil de vidro haste curta de 50 a 80 mm de diâmetro para filtrar corantes.
17. Algodão hidrófilo e suporte para corar lâmina
18. Óleo de imersão
19. Microscópico de Campo claro
20. Centrifuga
1. Realizar os procedimentos utilizando luvas descartáveis, máscaras N95, aventais
de mangas longas, com punhos sanfonados.
2. Abrir um pote de cada vez e com cuidado para evitar a formação de aerossóis.
1. Preparo do esfregaço
1.1 Ligar a CSB e a luz UV 10 a 15 minutos antes do seu uso;
1.2 Desligar luz UV e descontaminar a superfície interior com gaze estéril embebida
em Solução de Álcool a 70%
1.3 Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver
respingos;
1.4 Colocar todo material necessário para baciloscopia dentro da cabine e devem
ficar atrás da área em que se desenvolve o trabalho e nunca sobre as grades de
circulação de ar da CSB;
1.5 Manter o papel-toalha e o frasco com Solução de Fenol a 5% na cabine para
utilização em caso de respingos.
1.6 Escrever, com grafite, na borda fosca da lâmina o mesmo número colocado no
corpo do pote de escarro.
1.7 Retirar lentamente a tampa da amostra para evitar a formação de aerossóis e
colocar suavemente virada para cima.
D. CONDIÇÕES GERAIS
E. PROCEDIMENTO
POP - 02 Página 2 de 6
80
1.8 Transferir a amostra para o tubo de centrífuga de 50 ml, deixando escorrer
suavemente o escarro pela parede interna do tubo.
1.9 Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos.
1.10 Após a parada total da centrífuga, esperar 5 minutos para abrir.
1.11 Retirar as tubos fechados da centrífuga e colocar na CBS.
1.12 Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrífuga em um recipiente.
1.13 Ressuspender o sedimento com 0,3 ml de Água destilada estéril
1.14 Identificar as lâminas com o número de registro da amostra
1.15 Preparar o esfregaço da baciloscopia concentrada utilizando o sedimento
1.16 Colocar a lâmina com o esfregaço voltado para cima, para secar em temperatura
ambiente
1.17 Fechar bem os tubos das amostras já processadas e armazenar a temperatura
de 2 e 8ºC, até a realização da cultura.
1.18 Limpar a CSB com gaze estéril embebida em Solução de Álcool a 70%.
1.19 Deixar a CSB e a lâmpada UV ligadas por 10 a 15 minutos, antes de desligá-la.
2. Fixação do esfregaço
Depois de secas, fixar as lâminas, uma de cada vez, no bico de Bunsen. Com o
esfregaço voltado para cima passar rapidamente, por três vezes, sobre a chama do
bico de Bunsen como auxílio de uma pinça anatômica.
3. Coloração dos esfregaços - Método de Ziehl-Neelsen 3.1 Colocar as lâminas com o esfregaço voltado para cima, sem encostar umas nas
outras no suporte para corar.
3.2 Filtrar a Fucsina Fenicada a 0,3% para dentro de um frasco depois filtre o Azul de
Metileno a 0,3% em outro frasco.
3.3 Cobrir com a Fucsina filtrada, todo o esfregaço das lâminas.
3.4 Enrolar um chumaço de algodão na ponta da haste de metal. Umedecer o algodão
com álcool etílico.
3.5 Colocar fogo no algodão umedecido com álcool etílico.
POP - 02 Página 3 de 6
81
3.6 Passar a chama lentamente por debaixo das lâminas até que ocorra a emissão de
vapores visíveis, essa operação deve durar 5 minutos, a contar da primeira emissão
de vapores. Retirar imediatamente a chama para evitar que a Fucsina ferva
3.7 Inclinar as lâminas para derramar a Fucsina na pia.
3.8 Abrir devagar a torneira até obter um filete de água corrente para lavar as lâminas.
Deixar o filete de água cair em cima de cada lâmina, para que escorra óleo de imersão
suavemente sobre o esfregaço até eliminar todo o corante. Lavar também o lado
oposto ao esfregaço.
3.9 Cobrir completamente cada lâmina com a Solução Descorante de Álcool-Ácido a
3%, e esperar 1 minuto.
3.10 Inclinar as lâminas para derramar a solução descorante na pia.
3.11 Deixar o filete de água corrente cair em cima do número de cada lâmina, para
que escorra suavemente sobre o esfregaço e eliminar o Álcool-Ácido.
3.12 Verificar se os esfregaços ficaram descorados. Considera-se descorado o
esfregaço que apresentar coloração esbranquiçada ou levemente rosada.
3.13 Cobrir o esfregaço com o Azul de Metileno já filtrado e esperar 30 segundos.
3.14 Inclinar cada lâmina com o auxílio da pinça anatômica para derramar o Azul de
Metileno na pia.
3.15 Deixar cair um filete de água corrente em cima da lâmina, até eliminar todo o Azul
de Metileno a0,3%. Lavar também o lado oposto ao esfregaço para eliminar o Azul de
Metileno a 0,3% depositado ali.
3.16 Colocar cada uma das lâminas em pé, para secar
4. Leitura das lâminas
4.1 Limpar a lente de imersão do microscópico antes de iniciar a leitura e após leitura
de cada esfregaço.
4.2 Pingar uma gota de óleo de imersão no centro da lâmina, sem tocar no esfregaço
com o conta-gotas para evitar transferir material de uma lâmina para outra.
4.3 Colocar a lâmina no charriot do microscópio. Girar o canhão do microscópio até
que a lente objetiva de 10x esteja sobre a lâmina, focar a imagem com os botões
macro e micrômetro
4.4 Trocar a objetiva de 10x pela objetiva de imersão (100x) imergindo-a no óleo.
4.5 Aproximar a objetiva de 100x lentamente para não quebrar a lâmina.
4.6 Ajustar o foco com o botão micrométrico até que a imagem fique nítida.
POP - 02 Página 4 de 6
82
4.7 Ler 20 campos e somar os resultados e calcular a média.
4.8 Analisar a média obtida para os resultados nos 20 primeiros campos observados,
considerando as seguintes possibilidades.
i. Se a média for de mais de 10 BAAR por campo, encerrar a leitura. Essa amostra é
positiva +++.
ii. Se a média for inferior a 10 BAAR por campo ou não contiver BAAR, continuar a
leitura até completar 50 campos.
4.9 Fazer a leitura e até completar 50 campos e somar os resultados dos 50 campos e
calcular a média.
4.10 Analisar a média obtida para os resultados dos 50 campos observados,
considerando as seguintes possibilidades:
i. Se a média obtida for de 1 a 10 BAAR por campo, encerrar a leitura. Essa amostra é
positiva ++.
ii. Se a média obtida for inferior a 1 BAAR por campo ou não contiver BAAR, continuar
a leitura até completar 100 campos.
4.11 Fazer a leitura e anotar os resultados até completar 100 campos somar e analisar
os resultados considerando as seguintes possibilidades:
i. Se for encontrado um total de 10 a 99 BAAR nos 100 campos examinados, encerrar
a leitura. Essa amostra é positiva +.
ii. Se for encontrado um total de 1 a 9 BAAR nos 100 campos examinados, relatar o
número exato de BAAR encontrados.
iii. Se não forem encontrados BAAR, nos 100 campos observados, essa amostra é
negativa.
4.12 Os critérios para leitura e interpretação dos resultados estão resumidos no
quadro 1 em anexo.
QUADRO 1: Critérios para Leitura da Baciloscopia Fonte: Manual Nacional de Vigilância
Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias, do Ministério da Saúde, 2008.
POP - 02 Página 5 de 6
83
4.13 Limpar as lâminas depois de lidas pressionando levemente o esfregaço com
papel absorvente, cuidando para não remover o esfregaço.
4.14 Juntar as lâminas e identificar com data da leitura para colocar na caixa porta
lâminas.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
.
F. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 02 Página 6 de 6
84
Cultura é o exame laboratorial que permite a multiplicação e o isolamento de bacilos
álcool-ácido resistentes (BAAR) a partir da semeadura de amostra clínica, em meios
de cultura específicos para micobactérias.
Descrever o procedimento para realização do exame de cultura de escarro no meio
sólido Ogawa Kudoh.
1. Pipetador automático ou manual;
2. Tubos de ensaio estéril para colocar 3 ml de Solução de NaOH a 4%;
3. Estante para os tubos de ensaio estéril 20 x 150 mm;
4. Estufa bacteriológica a 36 ± 1ºC;
5. Cronômetro;
6. Solução de NaOH a 4%;
7. Solução de Álcool a 70%;
8. Solução de Fenol a 5%;
9. Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada;
10. Swab estéril: palito de madeira com algodão hidrófilo enrolado na ponta;
esterilizado em autoclave ou forno de Pasteur que atinja temperatura de 200ºC.
11. Meios de cultura Ogawa Kudoh.
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA CULTURA
POP - 03
Página 1 de 3
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. DESCRIÇÃO
B. OBJETIVO
C. RECURSOS NECESSÁRIOS
85
12. Recipiente para descarte de materiais contaminados
1. Ligar a CSB e a luz UV 10 a 15 minutos antes do seu uso.
2. Desligar luz UV e descontaminar a superfície interior com gaze estéril embebida em
Solução de Álcool a 70%.
3. Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver
Respingos.
4. Colocar todo material necessário para cultura dentro da cabine e devem ficar atrás
da área em que se desenvolve o trabalho e nunca sobre as grades de circulação de ar
da CSB.
5. Manter o papel-toalha e o frasco com Solução de Fenol a 5% na cabine para
utilização em caso de respingos.
5. Descontaminar o escarro pelo método de Ogawa Kudoh.
5.1 Colocar 3 ml de Solução de NaOH a 4% em cada tubo estéril já identificado,
utilizando pipeta.
5.2 Abrir lentamente o tubo de centrifuga com a amostra a ser processada.
5.3 Introduzir o swab no tubo contendo escarro..
5.4 Inserir o swab impregnado com a amostra no tubo contendo Solução de NaOH a
4%, sem encostar na parede, e deixar em repouso até 2 minutos (máximo).
6. Após o término dos 2 minutos e, passar o swab sobre a superfície do tubo com meio
Ogawa Kudoh.
7. Descartar o swab no recipiente para descarte de materiais contaminados.
8. Fechar os tubos de meio de cultura sem rosquear a tampa até o fim e colocar na
estufa bacteriológica a temperatura de 37ºC..
9. Limpar a CSB, ao do preparo dos esfregaços, com gaze estéril embebida em
Solução de Álcool a 70%.
10. Deixar a CSB e a lâmpada UV ligadas por 10 a 15 minutos, antes de desligá-la.
D. PROCEDIMENTO
POP - 03 Página 2 de 3
86
11. Leitura e interpretação dos resultados
11.1 Realizar a leitura dos tubos de cultura semeados após 48 horas de incubação e
posteriormente de 7 em 7 dias até completar 8 semanas.
11.2 Nos tubos em que não são visualizadas colônias incubar novamente e realizar as
leituras nas próximas semanas até completar 8 semanas.
11.3 Nos tubos em que são visualizadas colônias realizar a baciloscopia para
confirmar a presença de BAAR (Bacilos Álcool-Ácidos Resistentes).
i. Se confirmada a presença de BAAR consultar a escala semiquantitativa em anexo
para interpretação dos resultados, levando em conta o número de colônias
visualizadas.
ii. Se houver a presença de outros microorganismos que não sejam BAAR (Bacilo
Álcool-Ácido Resistente) descrever resultado como cultura contaminada.
12. Escala semiquantitativa:
Cultura Positiva - Menos de 20 colônias, relatar a quantidade.
Cultura positiva (+) - De 20 a 100 colônias.
Cultura Positiva (++) - Mais de 100 colônias separadas.
Cultura Positiva (+++) - Colônias confluentes (tapete)
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
E. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 03 Página 3 de 3
87
Consiste na realização do esfregaço após centrifugação e tratamento do escarro com
N-acetil-L-cisteína e Hidróxido de sódio (NALC-NaOH).
Descrever o procedimento para realização do exame de baciloscopia após tratamento
do escarro com NALC-NaOH seguido por centrifugação.
1. Cabine de Segurança Biológica (CSB);
2. Centrífuga com rotor para tubos de 50 ml;
3. Tubos de centrífuga de polipropileno, estéreis, descartáveis, com fundo cônico;
4. Microscópico de Campo claro;
5. Pipetador automático ou manual;
6. Cronômetro;
7. Solução Depurante (Solução de NaOH a 4%, Solução de Citrato de sódio a
2,9%, NALC);
8. Solução Tampão Fosfato pH 6,8;
9. Álcool etílico comercial;
10. Fucsina Fenicada a 0,3%;
11. Solução Descorante de Álcool-Ácido a 3%.
12. Azul de Metileno a 0,3%.13. Funil de vidro haste curta de 50 a 80 mm de diâmetro
para filtrar corantes.
16. Água destilada estéril.
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA BACILOSCOPIA APÓS
CENTRIFUGAÇÃO COM NALC
POP - 04
Página 1 de 3
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. DEFINIÇÃO
B. OBJETIVO
C. RECURSOS NECESSÁRIOS
88
17. Solução de Álcool a 70%.
18. Solução de Fenol a 5%.
19. Recipiente para descarte de materiais contaminados
20. Recipiente com tampa contendo pedaços de gaze;
21. Lâminas de vidro para microscopia com borda fosca.
1. Ligar a CSB e a luz UV 10 a 15 minutos antes do seu uso.
2. Desligar luz UV e descontaminar a superfície interior com gaze estéril embebida
em Solução de Álcool a 70%.
3. Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver
respingos.
4. Colocar todo material necessário para baciloscopia dentro da cabine e devem ficar
atrás da área em que se desenvolve o trabalho e nunca sobre as grades de
circulação de ar da CSB.
5. Manter o papel-toalha e o frasco com Solução de Fenol a 5% na cabine para
utilização em caso de respingos.
6. Identificar o número de registro da amostra nos tubos de centrífuga.
7. Transferir a amostra para o tubo de centrífuga de 50 ml, deixando escorrer
suavemente o escarro pela parede interna do tubo.
8. Adicionar com pipeta estéril a cada um dos tubos de centrífuga a Solução
Depurante (NALC-NaOH), na quantidade correspondente 10% da amostra. Usar uma
pipeta para cada amostra.
9. Fechar bem os tubos de centrífuga e inverter cuidadosamente o tubo para misturar
bem, evitando a agitação forte que resulta em oxidação e inativação da NALC.
10. Deixar os tubos de centrífuga em repouso por 15 minutos à temperatura
ambiente, para fluidificação/descontaminação.
11. Completar até o volume de 50 ml com Solução Tampão Fosfato pH 6,8.
12. Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos.
13. Após a parada total da centrífuga, esperar 5 minutos para abrir
14. Retirar as tubos fechados da centrífuga e colocar na CBS.
15. Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrífuga em um recipiente.
16. Ressuspender o sedimento com 0,3 ml de Água destilada estéril.
D. PROCEDIMENTO
POP - 04 Página 2 de 3
89
17. Identificar as lâminas com o número de registro da amostra.
18. Preparar o esfregaço da baciloscopia concentrada depositando duas gotas do
sedimento na lâmina.
19. Corar conforme descrito no item 3 do POP 02.
20. Ler as lâminas conforme descrito no item 4 do POP 02.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
E. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 04 Página 3 de 3
90
A técnica de baciloscopia após concentração de escarro por filtração consiste na
digestão, descontaminação e fluidificação do espécime de escarro com a solução de
NALC-NaOH, hipoclorito de sódio e etanol/triton X-100 1%, e passagem da mistura por
uma membrana de policarbonato de 13mm, com poros de 0,8µm, sob pressão
negativa exercida por uma bomba a vácuo de pulso contínuo.
Descrever o procedimento para realização do exame de baciloscopia após
concentração da amostra de escarro por filtração.
1. Materiais para montagem do suporte de filtro
1.1 Pré-filtro e filtro;
1.2 Anel fino e grosso para o filtro;
1.3 Anel para do pré-filtro;
1.4 Bases de metal para o filtro;
1.5 Bases de polipropileno para o pré-filtro;
1.6 Membranas de nylon de 25 mm com poros de 30 µm;
1.7 Membranas de policarbonato brancas (Osmonics) de 13 mm com poros de 0,8 µm;
1.8 Pinça;
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA BACILOSCOPIA APÓS
CONCENTRAÇÃO DA AMOSTRA POR FILTRAÇÃO
POP - 05
Página 1 de 7
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. DEFINIÇÃO
B. OBJETIVO
C. RECURSOS NECESSÁRIOS
91
2. Materiais para processamento do escarro
2.1 CSB, classe II;
2.2.Pipetador automático ou manual;
2.3 Agitador tipo vórtex;
2.4 Tubos de centrífuga de 50 mL;
2.5 Pipetas graduadas de 10 mL e 25 mL estéreis;
2.6 Pipetas graduadas de 2 mL estéreis ou Ponteiras de 1000 µL;
2.7 Solução de NALC/NaOH;
2.8 Solução de NaOCL 5%;
2.9 Solução de etanol 95%/Triton 1% (MIX).
3. Materiais para filtração do escarro
3.1 CSB, classe II;
3.2 Bomba de vácuo;
3.3 Equipamento de filtração;
3.4 Tubos de centrífuga de 50 mL contendo as amostras processadas;
3.5 Pipetas pequenas ou ponteiras de 200µL para uso do citifluor;
3.6 Suporte de filtros montados;
3.7 Pinças;
3.8 Agulha de biópsia;
3.9 Tabela de identificação das amostras;
3.10 Recipiente com solução de NaOCl 5% para descarte das peças utilizadas.
4. Materiais para coloração das membranas e montagem das lâminas
4.1 Lâminas de vidro para microscopia;
4.2 Lamínulas;
4.3 Citifluor;
4.4 Carbol Fucsina (Kinyoun);
4.5 Álcool ácido;
4.6 Água destilada filtrada;
1. Montagem do suporte de filtros
1.1 Montar na seguinte ordem: filtro e pré-filtro.
D. PROCEDIMENTO
POP - 05 Página 2 de 7
92
1.2 Montagem do filtro
1.2.1 Inserir o anel preto na extremidade inferior do filtro
1.2.2 Inserir no filtro com o auxílio da pinça, as seguintes peças, em ordem: anel fino ,
base de metal, membrana de policarbonato com seu lado brilhante voltado para cima,
anel branco ou preto.
1.3 Montagem do pré-filtro
1.3.1 Encaixar a base de polipropileno com a protuberância voltada para baixo.
1.3.2 Colocar a membrana de nylon com auxílio da pinça sobre a base de
polipropileno.
1.3.3 Posicionar o anel em cima da membrana com a pinça.
1.4 Montagem do suporte de filtros
1.4.1 Encaixar o pré-filtro sobre o filtro. Não aperte muito
2. Processamento do escarro
2.1 Identificar os tubos de centrífuga de 50 mL com o numero da amostra.
2.2 Transferir as amostras de escarro para os respectivos tubos, deixando escorrer
suavemente o escarro pela parede interna do tubo.
2.3 Caso a amostra contenha mais do que 1,0 mL, identifique outro tubo de centrífuga
com o mesmo número da amostra.
2.4 Calcular para cada amostra um volume de NALC- NaOH correspondente a 10% ao
da amostra. Anotar os valores nas tampas dos tubos de centrífuga contendo a
amostra.
2.5 Com uma pipeta de 2mL, adicionar a cada tubo, a solução de NALC-NaOH em um
volume correspondente ao anotado na tampa da respectiva amostra.
2.6 Fechar os tubos e homogeneizar as amostras em um agitador do tipo vórtex por
pelo menos 15 segundos.
2.7 Deixar agir por 15 minutos (com homogeneizações de 15 segundos a cada 5
minutos).
2.8 Transferir 1,0 mL das amostras digeridas para novos tubos de 50 mL previamente
identificados com os respectivos números das amostras.
POP - 05 Página 3 de 7
93
2.9 Com o auxílio de uma pipeta de 10 mL, adicionar 2 mL (volume referente a duas
vezes o volume inicial da amostra) de NaOCL 5% ao tubo contendo 1,0 mL de
amostra digerida.
2.10 Deixar agir por 15 minutos (com homogeneizações por 15 segundos a cada 5
minutos).
2.11 Adicionar 3 mL (volume referente ao mesmo volume da mistura de amostra
digerida e solução de NaOCl) da solução de etanol/Triton 1% (MIX) ao tubo.
Homogeneizar em um agitador do tipo vórtex por 15 segundos.
3. Filtração do escarro
3.1 Com o coletor de vácuo no interior da CSB, inserir a mangueira da bomba de
vácuo no terminal de ar do equipamento.
3.2 Verificar se todas as válvulas estão fechadas (posição horizontal).
3.3 Enroscar o suporte de filtros sobre o tubo de centrífuga contendo as amostras
processadas.
3.4 Inverter a peça com o tubo e inserir nos pontos de filtração.
3.5 Enroscar o conjunto inteiro (suporte de filtros e tubos com amostras) até sentir que
o anel encostou-se ao ponto de sucção. Não aperte muito.
3.6 Desenroscar o tubo, tampá-lo e descartar no recipiente para descarte de materiais
contaminados.
3.7 Repetir os procedimentos acima citados para todas as amostras.
3.8 Na tabela de identificação das amostras, anotar para cada número de 1-10, o
correspondente número da amostra que será filtrada;
3.9 Ligar a bomba a vácuo e ajustar a pressão negativa para - 5 mmHg;
3.10 Abrir todas as válvulas (Posição vertical);
3.11 Após a passagem de todo o volume da amostra pelo pré-filtro, contar 15
segundos e fechar a torneirinha e desligar a bomba á vácuo.
3.12 Desenroscar e desmontar o pré-filtro. Descartar as membranas em recipiente
para descarte de materiais contaminados e transferir as peças para o recipiente
contendo a solução descontaminante de NaOCL 5%;
3.13 Caso encontre líquido sobre a membrana, abra lentamente a válvula até que o
mesmo seja completamente sugado, fechando imediatamente a válvula.
3.14 Retirar o filtro do ponto de filtração do equipamento
POP - 05 Página 4 de 7
94
3.15 Remover e transferir o anel grosso do filtro para o recipiente contendo a solução
descontaminante de NaOCL 5%.
3.16 Com o auxílio de uma agulha de biópsia, retirar a membrana com pinça e
transferi-la para lâmina de vidro previamente identificada, com o seu lado brilhante
voltado para cima (Figura 1);
3.17 Aquecer as lâminas na chapa a 80° C por 10 minutos;
.
4. Colorar as membranas pelo método de Kinyoun
4.1 Adicionar carbol fucsina sobre as membranas.
4.2 Aguardar 5 minutos.
4.3 Remover o excesso de corante com o auxílio da pinça, tomando o cuidado para
não deixar a membrana cair.
4.4 Lavar com água.
4.5 Adicionar álcool ácido sobre as membranas e aguardar por 2 minutos.
4.6 Remover o álcool ácido com água.
4.7 Transferir a membrana para a lâmina previamente identificada.
4.8 Esperar a lâmina secar.
4.8 Adicionar com o auxílio de uma pequena pipeta uma gotícula de citifluor em uma
das bordas da membrana e outra gotícula no centro.
4.9 Cobrir com uma lamínula tomando o cuidado de evitar a formação de bolhas de ar
sobre a membrana.
4.10 Realizar a leitura microscópica conforme já descrito no item 4 do POP 02
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
Morais, G. C. V. Padronização e avaliação da acurácia do exame de baciloscopia
em membrana de policarbonato após concentração pelo sistema BacFil para o
diagnóstico da tuberculose pulmonar. 2009. Dissertação (Mestrado em Doenças
Infecciosas) - Universidade Federal do Espírito Santo, UFES, Vitória, 2009.
E. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 05 Página 5 de 7
95
Fennelly KP, Morais CG, Hadad DJ, Vinhas S, Dietze R, Palaci M. The small
membrane filter method of microscopy to diagnose pulmonary tuberculosis. J Clin
Microbiol. 2012;50(6):2096-9.
F. ANEXO
POP - 05 Página 6 de 7
Figura 1: Suporte de filtros montado
Figura 2: Peças do filtro
Figura 3: Peças do pré-filtro
Figura 4: Suporte encaixado no tubo
escarro
96
POP - 05 Página 7 de 7
Figura 4: Sistema de filtração montado
97
Descrever o procedimento para preparar as soluções usadas no processo de filtração
do escarro.
1. Para preparo das soluções
1.1 Agitador magnético;
1.2 Balança analítica;
1.3 Autoclave;
1.4 Água destilada;
1.5 Recipiente para pesagem;
1.6 Frascos de 500 mL com tampa de rosca;
1.7 Béquer;
1.8 Espátula;
1.9 Tubo de polipropileno com tampa de rosca de 50 mL;
1.10 Pipetas graduadas estéreis;
1.11 Bastão de vidro
1.12 Frasco de vidro de 250 mL para preparo da solução;
1.13 Frasco âmbar para guardar a solução.
1.15 Hidróxido de sódio;
1.16 Triton X-100 – 10% etanol PA.
1.17 NaOCL 10%;
1.16 NALC
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DE SOLUÇÕES USADAS NA
FILTRAÇÃO DO ESCARRO
POP - 06
Página 1 de 4
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Sala de Preparo de Soluções e Meios
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVOS
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
98
1. Preparo da solução depurante (solução de NaOH 5%, Citrato de sódio 2,9 %,
NALC).
1.1 Preparar a solução de NaOH 5%
1.1.2 Pesar e medir os reagentes de acordo com o volume final a ser preparado, como
mostrado no quadro abaixo:
VOLUMES FINAIS
Reagentes 500 mL 1000 mL 2000mL
NaOH 25g 50g 100g
Água destilada 500 mL 1000mL 2000mL
1.1.3 Colocar água destilada em um béquer.
1.1.4 Acrescentar NaOH aos poucos.
1.1.5 Com o auxilio de um bastão de vidro homogeneizar até dissolução completa do
NaOH.
1.2 Preparo do Citrato de sódio 2,9%
1.2.1 Pesar e medir os reagentes de acordo com o volume final a ser preparado, como
mostrado no quadro abaixo:
VOLUMES FINAIS
Reagentes 500 mL 1000 mL 2000mL
Citrato de sódio 14,5g 29g 58g
Água destilada 500 mL 1000mL 2000mL
1.2.3 Colocar água destilada em um béquer e acrescentar citrato de sódio aos poucos.
1.2.4 Com o auxilio de um bastão de vidro homogeneizar até completa dissolução
1.2.5 Preparo da solução de NaOH 5%/citrato de sódio 2,9%
1.2.5.1 Misturar em volumes iguais as soluções de NaOH 5% e de citrato de sódio
1.2.5.2 Distribuir em frascos de 500 mL com tampa de rosca.
C. PROCEDIMENTO
POP - 06 Página 2 de 4
99
1.2.5.3 Identificar os frascos com o nome e a concentração da solução, data do
preparo, data de validade e nome do responsável pelo preparo.
1.2.5.4 Autoclavar a 127ºC/15 min.
1.2.5.5 Esperar esfriar e guarda a solução sob refrigeração.
1.3 Preparar a solução de depurante (NaOH 5%, Citrato de sódio 2,9 %, NALC).
1.3.1 Pesar e medir os reagentes de acordo com o volume final a ser preparado, como
mostrado no quadro abaixo:
VOLUMES FINAIS
Reagentes 5 mL 10 mL 15 mL
NALC 0,25g 0,50g 0,75g
NaOH 5%/Citrato de sódio 1,45% 5 mL 10 mL 15 mL
1.3.2 Pesar o NALC e transferir para o tubo de centrifuga de 50 mL.
1.3.3 Na CSB, adicionar ao NALC a solução de NaOH 5%/Citrato de sódio 2,9%.
1.3.4 Fechar bem o tubo e inverter cuidadosamente até dissolução completa do NALC.
1.3.5 Evitar a agitação forte que resulta em oxidação e inativação do NALC.
1.3.6 Após a adição de NALC, a solução depurante deverá ser usada em 24 horas.
2. Preparo da solução de NaOCl 5%
2.1 Preparar a solução de NaOCl 5% à partir de outra solução a 10%.
2.1.2 Preparar a solução somente no dia do uso.
2.1.3 Medir com uma pipeta 25 mL água destilada e transferir para um tubo de 50 mL.
2.1.4 Acrescentar 25 mL de NaOCl 10% e homogeneizar.
2.15 Identificar o tubo com o nome da solução e reservar à temperatura ambiente até
momento do uso.
3. Preparo da solução de Etanol95%/Triton 1% (mix)
3.1 Preparar 100 mL de uma solução de Triton X-100 a 1% a partir de uma solução-
estoque a 10%
3.1 Adicionar 90 mL de água destilada filtrada no frasco de vidro;
3.2 Acrescentar 10 mL de Triton X-100 – 10%.
POP - 06 Página 3 de 4
100
3.3 Homogeneizar com a pipeta por aproximadamente 5X ou até completa
homogeneização da solução;
3.4 Transferir a solução de triton 1% para o frasco âmbar.
3.5 Identificar o frasco âmbar com o nome da solução e data;
3.6 Adicionar 40 mL de Etanol PA em um tubo de centrífugo previamente identificado
com o nome da solução;
3.7 Acrescentar 10 mL da solução Triton 1%. Homogeneizar;
3.8 Identificar o tubo com o nome da solução
3.9 Cobrir o tubo com papel alumínio e armazenar à temperatura ambiente.
Fennelly KP, Morais CG, Hadad DJ, Vinhas S, Dietze R, Palaci M. The small
membrane filter method of microscopy to diagnose pulmonary tuberculosis. J Clin
Microbiol. 2012;50(6):2096-9.
Morais, G. C. V. Padronização e avaliação da acurácia do exame de baciloscopia
em membrana de policarbonato após concentração pelo sistema BacFil para o
diagnóstico da tuberculose pulmonar. 2009. Dissertação (Mestrado em Doenças
Infecciosas) - Universidade Federal do Espírito Santo, UFES, Vitória, 2009.
;
POP - 06 Página 4 de 4
D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
101
Descrever o procedimento para limpeza das peças do sistema de filtração.
1. Esponja macia;
2. Papel absorvente ou pano seco;
3. Detergente neutro;
4. Água da torneira;
5. Água destilada;
6. Solução de NaOCl 5%.
1. Limpeza do sistema de filtro e do anel
1.1 Deixar o sistema de filtro e o anel por 30 minutos em um recipiente contendo com
solução de NaOCl 5%.
1.2 Descartar a solução na pia.
1.3 Enxaguar as peças por 3 vezes com água da torneira para retirada do excesso de
NaOCl que fica sobre a superfície das peças.
1.4 Lavar as peças com detergente neutro
1.5 Enxaguar mais 3 vezes com água da torneira;
1.6 Deixar de molhos por 20 minutos em água destilada;
1.7 Descartar a água do recipiente e colocar as peças para secarem.
PROCEDIMENTO PARA LIMPEZA DO SISTEMA DE FILTRAÇÃO
POP - 07
Página 1 de 2
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Sala de Esterilização
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVOS
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. PROCEDIMENTO
102
2. Limpeza do coletor de vácuo
2.1 Acrescentar a solução de NaOCl 5% em todos os pontos de sucção do
equipamento e esperar 30 minutos.
2.2 Remover a tampa de rosca e eliminar na pia o material filtrado.
2.3 Enxaguar o interior do equipamento com água.
2.4 Esfregar a superfície externa do equipamento com detergente neutro e uma
esponja e enxaguar com água da torneira
2.5 Colocar água destilada no interior do equipamento, tampar e deixar de molho por
cerca de 10 minutos;
2.6 Desprezar a água e retirar o excesso de umidade da superfície com papel
absorvente ou pano seco;
2.7 Colocar o equipamento na vertical, com a extremidade aberta voltada para baixo
para secagem interna.
POP - 07 Página 2 de 2
103
Descrever o procedimento para o preparo da solução de fenol 5% e álcool 70%
1. Para o preparo da solução de fenol 5%
1.1 Cristal de fenol;
1.2 Água destilada;
1.3 Balão;
1.4 Frasco âmbar.
1.5 Banho maria
2. Para o preparo da solução de álcool a 70%
2.1 Álcool etílico comercial 95% 700 ml;
2.2 Água destilada qsp 1.000 ml.
1. Preparação da Solução de Fenol a 5%
1.1 Colocar o fenol em um balão de 1.000 ml.
1.2 Adicionar 700 ml da água destilada aos poucos no balão sobre o fenol.
1.3 Colocar o balão para aquecer em banho Maria até o fenol dissolver completamente
1.4 Retirar do banho maria e acrescentar água destilada até completar 1.000 ml.
1.5 Deixar esfriar em temperatura ambiente
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DO FENOL 5% E ÁLCOOL 70%
POP - 08
Página 1 de 2
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVO
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. PROCEDIMENTO
104
1.6 Colocar a solução de fenol a 5% em um frasco âmbar de 1.000ml hermeticamente
fechado, rotulado com o nome da solução, data da preparação e validade.
1.7 Armazenar essa solução em temperatura ambiente.
2. Preparação da Solução de Álcool a 70%
2.1 Colocar o álcool etílico em um balão de 1.000 ml.
2.2 Adicionar Água destilada aos poucos no balão sobre o álcool etílico até completar
1000 ml.
2.3 Colocar a solução da álcool etílico em um frasco bem vedado já rotulado com o
nome do corante, data da preparação e de validade.
2.4 Armazenar ao abrigo da luz e a temperatura ambiente
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 08 Página de 2 de 2
105
Descrever o procedimento para o preparo da solução de NaOH 4% utilizado na
descontaminação do escarro para realização da cultura
1. Hidróxido de sódio (NaOH). 2. Água destilada.
3. Autoclave.
4. Bastão de vidro.
5. Frasco autoclavável
1. Dissolver 4g de Hidróxido de sódio em 100mL de água destilada no frasco
autoclavável
2. Misturar utilizando o bastão de vidro
3. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DA SOLUÇÃO DE NaOH 4%
POP - 09
Página 1 de 1
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Sala de Preparo de Soluções e Meios
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVO
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. PROCEDIMENTO
D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
106
Descrever o procedimento para preparo do tampão fosfato
Preparação da S o pH 6,8 – Método NALC-NaOH (h) Preparação da Solução A
1. Fosfato dissódico (Na2HPO4);
2. Fosfato monopotássico (KH2PO4);
3. Água destilada;
4. Autoclave;
5. Frasco autoclavável;
6. Medidor de pH;
7. Balão volumétrico;
1. Dissolver em um balão volumétrico 9,47g de fosfato dissódico em 1000mL de água
destilada.
2. Em outro balão volumétrico dissolver 9,07g de fosfato monopotássico em 1000mL
de água destilada.
3. Misturar 50 ml de (Solução A) e 50 ml de (Solução B) em um frasco autoclavável
4. verificar o pH, que deverá ser 6,8.
5. Se precisar ajustar o pH, use a solução (Solução A) para aumentar e a solução
(Solução B) para diminuir.
6. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos.
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO
POP - 10
Página 1 de 2
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Sala de Preparo de Soluções e Meios
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. PROCEDIMENTO
A. OBJETIVO
107
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
POP - 10 Página de 2 de 2
D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
108
Descrever o procedimento para o preparo de corantes utilizados no método de
coloração de Ziehl-Neelsen.
1. Para preparação do Álcool Ácido a 3%
1.1 Etílico comercial;
1.2 Ácido clorídrico concentrado;
1.3 Balão volumétrico;
1.4 Frasco de 1.000.
2. Para preparação do Azul de Metileno a 0,3%
2.1 Azul de Metileno 3 g;
2.2 Água destilada qsp 1.000 mL;
2.3 Balão volumétrico de 1.000 mL;
2.4 Frasco âmbar;
2.5 Funil.
3. Para preparação da Fucsina Fenicada a 0,3%
3.1 Álcool etílico 95% PA;
3.2 Fucsina Básica;
3.3 Balão volumétrico;
3.4 Cristal de fenol;
3.5 Água destilada;
3.6 Banho Maria.
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DE CORANTES
POP - 11
Página 1 de 3
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVO
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
109
1. Preparação da Fucsina Fenicada a 0,3%
1.1 Preparar a solução de Fucsina Básica e uma solução de fenol aquoso.
1.1.1 Colocar 3g de Fucsina em um balão de 1.000 mL.
1.1.2 Adicionar aos poucos 100 mL de álcool etílico no balão sobre a Fucsina.
1.1.3 Agitar o balão suavemente até a completa dissolução da Fucsina. 3 gramas é a
quantidade indicada na fórmula, desde que a Fucsina tenha no mínimo 88% de
concentração de corante.
1.1.4 Calcular o fator de correção se a concentração for menor, e multiplica-lo por 3
gramas, para encontrar a quantidade de Fucsina necessária.
1.1.4.1 Fórmula do fator de correção = 1 dividido pelo equivalente decimal da
concentração do corante = percentual de concentração do corante dividido por 100.
1.2 Preparar a solução B.
1.2.1 Colocar 50g de fenol em um balão de 1.000 mL.
1.2.2 Adicionar 700 ml da água destilada aos poucos no balão sobre o fenol.
1.2.3 Colocar o balão para aquecer em banho maria até o fenol dissolver
completamente.
1.2.4 Retirar do banho maria e acrescentar água destilada até completar 1.000 mL.
1.2.5 Deixar esfriar em temperatura ambiente.
1.3 Colocar 900 mL da solução B no balão contendo a solução A e agitar.
1.3.1 Tampar a boca do balão com papel alumínio e deixar repousar por 24 horas.
1.3.2 Filtrar, em funil com papel de filtro, diretamente em frasco âmbar de 1000 ml já
rotulado com o nome do corante, data da preparação, de validade, e a frase “Filtrar
antes de usar“.
1.3.3 Armazenar esse corante, ao abrigo da luz e a temperatura ambiente.
2. Preparação da solução descorante de Álcool Ácido a 3%
2.1 Colocar 970 mL de álcool-etílico comercial, em um balão de 1.000 mL.
2.2 Adicionar 30 mL de ácido clorídrico, lentamente, deixando escorrer pelas paredes
do balão que contém o álcool etílico.
2.3 Agitar o balão suavemente.
2.4 Colocar o álcool-ácido em um frasco de1.000 mL rotulado com nome do
descorante, data da preparação, e de validade.
C. PROCEDIMENTO
POP - 11 Página 2 de 3
110
2.5 Armazenar essa solução em temperatura ambiente.
3. Preparação de Azul de Metileno a 0,3%
3.1 Colocar 3g de azul de metileno em um balão volumétrico de 1.000 mL
3.2 Adicionar a 100 mL da Água destilada ao Azul de Metileno.
3.3 Agitar o balão suavemente até a completa dissolução.
3.4 Adicionar o restante da água e agite bem.
3.5 Filtrar diretamente em um frasco âmbar de 1000 mL já rotulado com nome do
corante, data de preparação e validade, e a frase “Filtre antes de usar“.
3.6 Armazenar a solução de Azul de Metileno ao abrigo da luz e à temperatura
ambiente.
3.7 Três gramas é a quantidade indicada na fórmula, desde que o Azul de Metileno
tenha no mínimo 82% de concentração de corante. Se a concentração for menor, é
preciso calcular o fator de correção e depois multiplicá-lo por 3 gramas.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.