UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Aline Augusti Boligon Santa Maria, RS, Brasil. 2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA
BUXIFOLIA REISSEK.
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aline Augusti Boligon
Santa Maria, RS, Brasil. 2010
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ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA
BUXIFOLIA REISSEK.
por
Aline Augusti Boligon
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em Controle e Avaliação de Insumos e Produtos Farmacêuticos, da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profª. Drª. Margareth Linde Athayde
Santa Maria, RS, Brasil
2010
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Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA
BUXIFOLIA REISSEK.
elaborada por
Aline Augusti Boligon
como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
A Deus por ter estado sempre presente na minha vida.
A Universidade Federal de Santa Maria pelas oportunidades oferecidas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela
oportunidade e por oferecer subsídios necessários para o desenvolvimento dos
experimentos.
A CAPES pela bolsa concedida.
A Professora Doutora Margareth Linde Athayde, pela orientação, apoio e
amizade, de maneira indispensável, durante todos os passos para a realização
dessa dissertação, dedico meu carinho e admiração.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação pelos conhecimentos
compartilhados durante minha formação, disponibilidade e atenção, mas
principalmente pela constante amizade e incentivo de todos, meus mais sinceros
agradecimentos.
Aos professores João Batista Teixeira da Rocha, Sydney Hartz Alves, Marli
Matiko Anraku de Campos, Ademir Farias Morel e Adair Roberto dos Santos pelo
auxílio na realização das análises.
A Bióloga Mestre em Botânica Nelci Rolim Basto Zacchia, pela identificação
do material vegetal.
A todos os alunos, graduação e pós-graduação, do Laboratório de
Fitoquímica, pelo convívio, amizade, colaboração e aprendizado.
Aos meus pais Glória Maria e Sérgio, exemplos de vida, pelo amor, dedicação
e por me ensinarem a ter caráter e a lutar.
Aos meus irmãos e suas famílias pela amizade e pelos bons momentos de
convivência.
Ao meu noivo Giancarlo, por estar ao meu lado, me ouvir e me apoiar nos
momentos difíceis e compartilhar comigo as vitórias.
A todos aqueles, citados ou não, que contribuíram direta ou indiretamente
para a realização dessa dissertação os mais sinceros agradecimentos.
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RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Universidade Federal de Santa Maria
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA
BUXIFOLIA REISSEK.
AUTORA: ALINE AUGUSTI BOLIGON
ORIENTADORA: MARGARETH LINDE ATHAYDE
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 30 de março de 2010.
A família Rhamnaceae é composta por cerca de 58 gêneros e aproximadamente 900 espécies. A espécie Scutia buxifolia Reissek, é conhecida popularmente como coronilha, é uma planta nativa da América do Sul, com uma dispersão que compõe o estado do Rio Grande do Sul no Brasil, Argentina e Uruguai. A decocção das cascas do tronco e folhas é utilizada popularmente como cardiotônica, hipotensora e diurética. O presente trabalho objetivou isolar e identificar flavonóides e triterpenos presentes em S. buxifolia bem como analisar a capacidade de capturar radicais livres. As cascas do tronco e as folhas de S. buxifolia foram coletadas em outubro de 2007 no município de Dom Pedrito–RS. O material está depositado no herbário do Departamento de Biologia da UFSM catalogado sob o número de registro SMBD 10919. O material vegetal foi seco, moído e macerado utilizando como solvente etanol:água (70:30, v/v). Fez-se fracionamento do extrato bruto com solventes orgânicos de polaridades crescentes (CH2Cl2, AcOEt, n-BuOH). Na fração AcOEt das folhas caracterizou-se os flavonóides quercetina, quercetina 3-0-rhamnosídeo, quercetina 3-0-β-D-glicopiranosídeo e rutina. Da fração CH2Cl2 das cascas do tronco, os esteróides β-sitosterol e estigmasterol, e o triterpeno lupeol. Os compostos isolados foram analisados por 1H-RMN e 13C-RMN e seus dados espectroscópicos foram comparados com os obtidos da literatura. Os compostos isolados foram quantificados por CLAE. O extrato bruto e as frações de S. buxifolia foram investigadas quanto a peroxidação lipídica, atividade antioxidante e conteúdo de fenóis totais. O conteúdo de fenólicos totais variou de 141,09 ± 0,71 a 323,47 ± 2,62 mg/g para as cascas do tronco e de 72,09 ± 0,50 a 383,34 ± 2,31 mg/g para as folhas de S. buxifolia. O extrato bruto e as frações provocaram uma queda acentuada na produção de TBARS com IC50 de 2,93 ± 2,17 a 40,46 ± 2,51 µg/mL para as folhas e 0,66 ± 0,17 a 27,3 ± 1,23 µg/mL para a cascas do tronco. Para o ensaio do DPPH a ordem de captação de radicais livres foi: AcOEt > n-BuOH > CH2Cl2 > extrato bruto, para as duas partes da planta. Palavras – chave: Scutia buxifolia; Rhamnaceae; flavonóides; DPPH; TBARS; CLAE.
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ABSTRACT
Master’s Degree Dissertation
Postgraduate Program in Pharmaceutical Sciences
Federal University of Santa Maria
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF FLAVONOIDS AND TERPENOIDS OBTAINED FROM THE LEAVES AND STEM BARK OF SCUTIA
BUXIFOLIA REISSEK.
AUTHOR: ALINE AUGUSTI BOLIGON
ADVISER: MARGARETH LINDE ATHAYDE
Date and Place of the Defense: Santa Maria, March 30th, 2010.
The Rhamnaceae family is composed of some 58 genera and about 900 species. Scutia buxifolia Reissek species, popularly known as coronilha, is a local plant from South America, with a dispersion that comprise Rio Grande do Sul state in Brazil, Argentina and Uruguay. The stem bark and leaves decoction are popularly used as cardiotonic, antihypertensive and diuretic. This work aims to isolate and identify flavonoids and triterpenes present in Scutia buxifolia and analyze ability to capture free radicals. Stem bark and leaves of S. buxifolia were collected in October 2007 in Dom Pedrito-RS (coordinates 30º 59'09''S and 54º27'44''W). The material is deposited in the herbarium of the Department of Biology UFSM cataloged under the registration number SMBD 10919. The dried plant material was ground and macerated using ethanol: water (70:30, v/v) as solvent. The crude extract was fractionated with solvents of increasing polarity (CH2Cl2, AcOEt, n-BuOH). In AcOEt fraction of the leaves was characterized quercetin, quercetin 3-0-rhamnosíde, quercetin 3-0-β-D-glucopyranoside and rutin, and the CH2Cl2 fraction of stem bark the steroids β-sitosterol and stigmasterol, and the triterpene lupeol. The compounds were analyzed by 1H-NMR and 13C-NMR and spectroscopic data were compared with those obtained from the literature. The compounds were quantified by HPLC in the fraction used for insolation. The crude extract and fractions of S. buxifolia were investigated for lipid peroxidation, antioxidant activity and total content of phenols. The total phenolic content ranged from 141.09 ± 0.71 to 323.47 ± 2.62 mg/g for stem bark and 72.09 ± 0.50 to 383.34 ± 2.31 mg/g for leaves of S. buxifolia. Crude extract and fractions caused a sharp fall in TBARS production with IC50 from 2.93 ± 2.17 to 40.46 ± 2.51 µg/mL for the leaves and 0.66 ± 0.17 to 27.3 ± 1.23 µg/mL for the stem bark. The order of capture of free radicals was: AcOEt > n-BuOH > CH2Cl2 > crude extract, for the two parts of the plant.
1H-RMN – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
13C-RMN – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
Abs – Absorbância
AcOEt – Acetato de etila
ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
BuOH – n-Butanol
CC – Cromatografia em coluna
CCD – Cromatografia em camada delgada
CG-MS – Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
CH2Cl2 – Diclorometano
DPPH – 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazyl
EB – Extrato bruto
EtOH – Etanol
Fig. – Figura
GF254 – Gel de sílica com indicador de fluorescência para λ 254 nm
HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência
MeOH – Metanol
min. – Minutos
OMS – Organização Mundial da Saúde
TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
UV – Ultravioleta
λ – Comprimento de onda
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LISTA DE ANEXOS
Anexo 01: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina..............................58 Anexo 02: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina..................................................................................................................59 Anexo 03: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina-3-0-ramnosídeo.................................................................................................................60 Anexo 04: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina-3-0-ramnosídeo.................................................................................................................61 Anexo 05: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina 3-0-β-D-glicopiranosideo..........................................................................................................62 Anexo 06: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina 3-0-β-D-glicopiranosideo..........................................................................................................63 Anexo 07: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): rutina......................................64 Anexo 08: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): rutina.......................................65 Anexo 09: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol + estigmasterol..............................................................................................................66 Anexo 10: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol + estigmasterol..............................................................................................................57
Anexo 11: Artigo publicado: Revista Saúde..............................................................68 Anexo 12: Artigo aceito para publicação: Revista Saúde.........................................73
glicopiranosídeo (tR = 5,3 min) e rutina (tR = 4,8 min). Extratos de origem natural
geralmente contêm uma série de componentes químicos diversos que estão
presentes em concentrações variáveis, é importante a utilização de métodos
cromatográficos para analisar estas misturas complexas. O perfil por CLAE da fração
acetato de etila foi obtido, bem como a quantificação de rutina e quercetina baseada
nas curvas de calibração obtidas com soluções de referência. Curva de calibração
para a quercetina: Y = 30153x - 235135, r = 0,9983; e curva de calibração para
rutina: Y = 19217x - 16949, r = 1,000. Quercitrina e isoquercitrina também foram
quantificadas, mas elas foram expressas separadamente, como conteúdo em
quercetina. O componente principal foi quercitrina, seguido por rutina, quercetina e
isoquercitrina.
Os dados de isolamento dos flavonóides, sua quantificação por CLAE, a
determinação dos teores de polifenóis totais e a avaliação da atividade antioxidante
por dois métodos (DPPH e TBARS) originaram a publicação no periódico
Bioresource Technology.
Da fração em diclorometano das cascas do tronco de S. buxifolia foram
isolados o lupeol e uma mistura de esteróides contendo β-sitosterol e estigmasterol.
Extratos vegetais normalmente possuem vários triterpenos e o fracionamento por
técnicas cromatográficas convencionais dificilmente leva ao isolamento de
substâncias puras; normalmente o resultado é uma mistura de triterpenos de difícil
resolução. Dados de 13C-RMN de triterpenos registrados na literatura mostram que
os deslocamentos dos carbonos sp2, são altamente característicos de cada
esqueleto, pelo menos em triterpenos oxigenados em C-3. Isso permite que
substâncias possam ser identificadas por dados de 13C-RMN, mesmo em misturas
(OLEA, ROQUE, 1990; GALOTTA et al., 2005).
Na fração diclorometânica das cascas do tronco e folhas de S. buxifolia foi
identificada a presença de β-sitosterol e estigmasterol através de CLAE e CCD. As
cascas do tronco apresentaram a maior quantidade destes triterpenos, sendo
priorizada para o isolamento da mistura. Foram isolados 48 mg de um composto
cristalino branco, a substância apresentou-se como uma mancha única (CCD), de
coloração roxa após revelação com o reagente anisaldeído-sulfúrico e aquecimento
a 100 °C. Através dos espectros de 13C-RMN e 1H-RMN (páginas 66 e 67)
atribuíram-se os deslocamentos químicos e caracterizaram-se os átomos de
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hidrogênio e de carbono que compõem a estrutura dos compostos. Dentre os sinais
verificados no espectro de 13C-RMN, quatro deslocamentos na região de carbonos
sp2 (121,67; 129,27; 138,30; 140,47 ppm) sugerem duas ligações duplas. Segundo
dados da literatura, sinais nestes deslocamentos (121,67 e 140,74 ppm) são
característicos de esteróides com uma dupla ligação entre C-5 e C-6 (AHMAD et al.,
1992; CHAURASIA et al., 1987; DE-EKNAMKUL, POTDUANG, 2003; GOULART et
al., 1993; ZANON et al., 2008) e em 129,27 e 138,30 ppm são característicos de
uma dupla ligação entre C-22 e C-23 na cadeia lateral de esteróides (DE-
EKNAMKUL, POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993). Esses deslocamentos
químicos são muito importantes na elucidação estrutural de esteróides e são
específicos de β-sitosterol e estigmasterol. Estes compostos possuem uma mesma
insaturação (∆5), portanto os sinais nos espectros de 13C-RMN irão coincidir e assim
os sinais para C-5 e C-6 estarão mais intensos quando comparados com os outros
dois sinais referentes a insaturação em ∆22 (que está presente somente no
estigmasterol) (DE-EKNAMKUL, POTDUANG, 2003). Por apresentarem
propriedades muito semelhantes, β-sitosterol e estigmasterol, geralmente são
isolados na forma de mistura (CHAVES et al., 2004; DE-EKNAMKUL, POTDUANG,
2003; GOULART et al., 1993; ZANON et al., 2008).
O triterpeno lupeol (82 mg) também foi isolado da fração em diclorometano das
cascas do tronco de S. buxifolia, esta substância foi caracterizada por cromatografia
em camada delgada como um composto cristalino branco apresentando-se como
uma manha única, de coloração violácea após revelação com o reagente
anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100 °C. O espectro de 13C-RMN mostrou
sinais característicos de uma dupla ligação de compostos com esqueletos derivados
do lupeol (109,31 e 151,29 ppm), que conjuntamente com o grupo metila em δC
20,93, são indicativos de grupo isopropenil (C-29, C-20 e C-30, respectivamente)
(ALMEIDA et al., 2003; AGUIAR, et al., 2005), permitindo identificar a substância
como lupeol.
Esses triterpenos, embora comuns no reino vegetal, ainda não haviam sido
descritos para a espécie, o que permitiu a publicação do artigo no periódico Latin
American Journal of Pharmacy.
No anexo desta dissertação, encontram-se mais dois artigos, que também
fizeram parte do estudo fitoquímico e das atividades biológicas da planta.
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6 CONCLUSÕES
• A maior atividade antioxidante, usando o método do DPPH, foi encontrada
para a fração butanólica e acetato de etila das cascas e folhas de S. buxifolia.
• As frações e os extratos brutos das folhas e das cascas de S. buxifolia
inibiram a produção do TBARS e apresentaram atividade antioxidante, tais
efeitos podem estar relacionados com a presença de compostos fenólicos e
de flavonóides.
• A fração acetato de etila das cascas apresentou a maior inibição da produção
de TBARS.
• Quercetina, quercitrina, isoquercitrina e rutina foram isolados da fração
acetato de etila das folhas de Scutia buxifolia. Sendo quercitrina o flavonóide
majoritário (18,3%).
• Lupeol e a mistura de β-sitosterol + estigmasterol foram isolados da fração
diclorometânica das cascas de S. buxifolia.
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ANEXOS
58
ANEXO 01: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Quercetina
59
ANEXO 2: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Quercetina
60
ANEXO 03: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Quercetina-3-0-Ramnosídeo
61
ANEXO 4: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Quercetina-3-0-Ramnosídeo
62
ANEXO 05: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Quercetina 3-0-β-D-
glicopiranosideo
63
ANEXO 6: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Quercetina 3-0-β-D-
glicopiranosideo
64
ANEXO 07: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Rutina
65
ANEXO 08: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Rutina
66
ANEXO 09: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol +
estigmasterol
67
ANEXO 10: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol +
estigmasterol
68
ANEXO 11: Artigo publicado - Revista Saúde
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70
71
72
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ANEXO 12: Artigo aceito para publicação - Revista Saúde
Aline Augusti Boligon, Andrieli Cassel Feltrin, Vanessa Janovik, Janaína Kieling
Frohlich, Margareth Linde Athayde. Estudo fitoquímico das cascas do tronco de