Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Veridiana Câmara Furtado PERFIL DO POLIMORFISMO GÊNICO DA β-DEFENSINA-1 E DA MBL2 EM PACIENTES COM DIAGNÓSTICO DE ONICOMICOSE CAUSADAS POR Candida spp Recife, 2008
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Universidade Federal de Pernambucofactivation of complement system. Single nucleotide polymorphism (SNP) of the gene hBD-1 and MBL2 genes in patients with onychomycosis caused by Candida
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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas
Veridiana Câmara Furtado
PERFIL DO POLIMORFISMO GÊNICO DA β-DEFENSINA-1 E DA
MBL2 EM PACIENTES COM DIAGNÓSTICO DE ONICOMICOSE
CAUSADAS POR Candida spp
Recife, 2008
PERFIL DO POLIMORFISMO GÊNICO DA β-DEFENSINA-1 E DA
MBL2 EM PACIENTES COM DIAGNÓSTICO DE ONICOMICOSE
CAUSADA POR Candida spp
Tese apresentada ao programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas do Centro de Ciências Biológicas daUniversidade Federal de Pernambuco, como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, Área de concentração-Microbiologia.
Orientadora: Profa. Ana Lúcia Figueiredo Porto, M.D., PhD
Co-Orientador: Prof. Jose Luiz Lima Filho, M. D., PhD
Prof. Sérgio Crovella, M.D., PhD
ii
COMISSÃO EXAMINADORA
Membros Titulares
Profª. Drª. Ana Lúcia Figueiredo Porto Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal-UFRPE, Recife-PE
Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho Departamento de Bioquímica- UFPE, Recife-PE
Prof. Dr. Sérgio Crovella Departamento de Genética- Universidade de Trieste- Itália
Prof. Dr. Paulo Roberto Eleutério Souza Departamento de Genética-UPE, Petrolina-PE
Prof. Dr. Prof. Edson Holanda Teixeira Universidade Federal do Ceará -UFCE
Membros Suplentes
Profª. Drª. Maria Taciana Soares Cavalcante Departamento Morfologia e Fisiologia –UFRPE, Recife-PE
Prof. Dr. Armando Mansden Departamento de Micologia-UFPE-Recife--PE
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Tese: PERFIL DO POLIMORFISMO GÊNICO DA β-DEFENSINA-1 E DA
MBL2 EM PACIENTES COM DIAGNÓSTICO DE ONICOMICOSE CAUSADA
POR Candida spp
Doutoranda: Veridiana Câmara Furtado
Data da defesa: 26/02/ 2008
Banca Examinadora:
Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA-UFPE)
Prof. Dr Paulo Roberto Eleutério de souza Universidade de Pernambuco (UPE) Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA-UFPE)
Prof. Dr. Sérgio Crovella Universidade de Trieste- Itália Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Prof Dr. Edson Holanda Teixeira Universidade Federal do Ceará - UFCE
Profa Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto Universidade Federal Rural de Pernambuco Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA-UFPE)
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AGRADECIMENTOS
- A minha mãe Graciete, verdadeiro anjo, sempre dispostos a ajudar.
- A meu pai Josenaldo, pelo apoio em meios estudos.
- À Prof. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto, pela orientação objetiva e
esclarecedora.
- Ao Prof. Dr Crovella, por ter acreditado no meu projeto e pela generosidade
das indicações bibliográficas.
- Ao Prof. Dr. Armando Marsden, pela generosidade, amizade e contribuição no
desenvolvimento da tese.
- A Prof, Dr. Paulo Roberto Eleutério Souza, pelo apoio no desenvolvimento do
projeto.
- Ao prof. Dr. José Luiz Filho pelo local cedido para o desenvolvimento da tese
- Às Dras. Rossana Sette e Kedma Lima, que fizeram a identificação das
espécies de Candida.
- À .Profa. Dra Aronita Rosenblatt , que ajudaram com seu apoio e para o
desenvolvimento da tese.
- À Dra. Ana Bloter, pelo apoio no desenvolvimento da tese.
- À Profa. Dra. Patrícia Moura pela ajuda na construção do Projeto.
- Às amigas Viviane Araújo e Clarissa Lins, pelo apoio, por acreditar em mim e
por me ajudarem nos experimentos.
v
- Às minhas amigas, Taciana, Silvia e Idjane, pela amizade e apoio durante
essa jornada.
-A Moises por ser uma pessoa sempre disponível em sua atividade está de
bom humor todos os dias do seu trabalho.
- Aos meus amigos do PROCAPE, Cleide, Naila, Dilenia e Cristian pelo apoio
nas horas que foram preciso.
- À minha amiga Valéria Pereira que me acompanha desde a graduação.
-À Maria José – minha tia – pelas orações que tanto me deram forças para
ultrapassar os obstáculos.
- À minha tia Tânia e ao meu tio Rildo, pelo apoio nos momentos necessários.
- À minha querida irmã Fabiana, pelo apoio em todos os momentos.
- Ao meu irmão Josenaldo pela sua amizade e cumplicidade.
- À Adenilda- pelo seu apoioe atenção quando era por mim solicitada.
- Às minhas amigas Pedrita e Monique pela atenção e carinho.
- A todos que direta e indiretamente contribuíram com a realização deste
trabalho, o meu sincero agradecimento.
- A Deus que sempre esteve ao meu lado, dando-me forças e coragem para
seguir em frente.
OBRIGADA!
Veridiana Câmara Furtado
vi
Eu dedico esta tese:
Ao meu Deus que permitiu mais uma jornada.
A minha mãe pelo
apoio, luta, confiança e amor sempre dedicado em todos esses anos.
vii
“Entrega teu caminho ao senhor, confia nele e o mais ele fará.”
Salmo 37:5
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Aspecto macroscópico das lesões nas unhas do 1° 7
E 5° pododáctilo esquerdo Figura 2: Estrutura da lectina ligadora de Manose 14
Figura 3: Caminhos de ativação do sistema Complemento 16
Figura 4: Ativação da via clássica do complemento pela MBL
independente da presença de anticorpo e da subnidade C1
do complemento 17
Figura 5: Estrutura “em forma de tulipa” da MBL 20
Figura 4: Interação da MBL com HIV 21
Figura 6: Modelo tri-dimensional das estruturas secundária
da α-defensinas e β- defensinas 25
Figura 7: Curva de amplificação gerada por PCR em tempo real 32
Figura 8: Princípio da análise da curva de “melting” 33
ix
RESUMO
A β-defensina-1 (hBD1) e a lectina ligadora de manose (MBL) são importantes
componentes do sistema imune inato. As β-defensina-1 são peptídeos que
atuam como antibióticos naturais contribuindo como a primeira linha de defesa
do nosso organismo. Enquanto a MBL é uma proteína capaz de ligar-se à
carboidratos de superfície de microrganismos e ativar o sistema complemento.
Ambas atuam no reconhecimento e eliminação dos microrganismos, tais como;
bactérias, fungos, protozoários e vírus. O presente trabalho teve como objetivo
analisar o polimorfismo do gene da β-defesina-1 e da MBL2 em pacientes com
onicomicose causadas pelas amostras de Candida ssp. Foram selecionados
100 pacientes atendidos no Departamento de Micologia Médica da UFPE e as
amostras de Candida isoladas foram identifidas no Laboratório de Medicina
Diagnóstica – NKB, baseada segundo as suas características morfológicas,
bioquímicas. Em relação a análise do polimorfismo de um único nucleotídeo
(SNPs), o DNA foi extraído de sangue total e submetido à amplificação por
PCR em tempo-real. Os resultados obtidos da identificação das espécies de
Candida foram os seguintes: C. parapsilosis (50%), C. tropicalis (34%) e C.
albicans (6%). Estes resultados mostram que houve um predomínio de
espécies de Candida não-albicans em relação às C. albicans, os resultados da
freqüência alélica da MBL entre os pacientes com onicomicoses e controle
saudáveis mostraram que a freqüência do alelo 0 foi estatisticamente mais
significativa nos pacientes com onicomicose do que nos pacientes saudáveis
(35% vs. 20%, p=0,0001), odds ratio (OR) 1,72 com 95% de intervalo de
confidência. Na expressão da hBD1 foi observado que diferença na freqüência
genotípica (13% s GG,vs CC 2%):odds ratio (OR= 1,98) e quanto ao mutante
alélico foi predominante nos pacientes com onicomicose em relação ao
controle (25% vs. 14%). Esses resultados indicam que a presença de alelo
mutante da β-defesina-1 e/ou da MBL2 podem contribuir, como um dos fatores,
na onicomicose causada por Candida sp.
Palavras-chave: β-defesina-1, MBL, polimordismo e Candida sp.
x
ABSTRACT
The human β-defensin-1 (hBD1) and mannose-binding lectin (MBL) are
important components of the innate immune system. β-defensin-1 are peptides
that act as natural and antibiotics contributes as first line of body defense. MBL
is a protein that binds on the surface of microorganism and enable the
factivation of complement system. Single nucleotide polymorphism (SNP) of the
gene hBD-1 and MBL2 genes in patients with onychomycosis caused by
Candida species. Was investigated 100 patients attended at the Department of
Medical Mycology/ UFPE and the Candida was identified at Laboratory of
Diagnostic Medicine-based (NKB) second morphological and biochemesty
characteristics. The SNPs analysis DNA was performed using patient extracted
from whole blood and subjected to real-time PCR amplification and genotyping
by melting temperature. The results of Candida species identification were: C.
parapsilosis (50%), C. tropicalis (34%) and C. al assay.albicans (6%). These
results show that there were a predominance of non-Candida albicans species.
The results of the allelic frequency among patients with Candidal
onychomycosis and healthy controls showed that the frequency 0 allele was
significantly higher in patients than healthy patients (35% vs. 20%, p = 0.0001),
odds ratio (OR) 1.72 with a 95% confidence interval regarding hBD1 The
expression was observed that difference in genotypic frequencies (13% s GG,
CC 2%): odds ratio (OR = 1.98) and on the mutant alélico was predominant in
onychomycosis patients in relation to the control (25% vs. 14%). These results
indicate that the presence of β-defesin-1 mutant allele and / or the MBL2 can
contribute, as one of the factors in Candidal onychomycosis
Keywords: β-defesin-1, MBL, polimorphismo and Candida spp
xi
SUMÁRIO
RESUMO x ABSTRACT xi 1. INTRODUÇÃO 01 2. OBJETIVOS 03 2. 1 Objetivo Geral 03 2. 2 Objetivos Específicos 03 3. REVISÃO DA LITERATURA 04 3. 1 Onicomicose 04 3. 2 O Gênero Cândida 08 3. 2. 1 Espécies de Candida spp mais relacionadas com
infecção 09
3. 3 Sistema Imune 11 3. 4 Lectina Ligadora de manose (MBL) 13 3. 4. 1 Polimorfismo Gênico da MBL 22 3. 5 Defensinas 24 3. 5. 1 β-defensinas 3. 5. 2 Polimorfismo Gênico da β-defensina 1 28 3. 6 Polimorfismo de Único Nucleotídeo (SNP) 28 3. 6. 1 Detecção de polimorfismo de um único
nucleotídeo (SNPs) pela técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real)
31
3. 6. 1 Princípio da curva de “melting” 32 4. REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS 34 Capítulo I 44 Capítulo II 56 5. CONCLUSÕES 68 ANEXOS I 69 ANEXO II 73
xii
1. INTRODUÇÃO
As onicomicoses são infecções fúngicas comuns nas unhas, tanto
das mãos quanto dos pés, sendo responsáveis por cerca de 15% a 40% das
doenças ungueais. Sua prevalência está em crescimento o que pode ser
explicado por fatores tais como: o aumento da incidência de imunodeficiências,
idade da população, hábitos esportivos, indumentária, entre outros (SILVA,
2000). Para se conseguir a cura dessas infecções, é imprescindível corrigir os
fatores predisponentes e\ou agravantes que existam. (MINAMI, 200). Porém,
nos últimos anos tem aumentado os casos de onicomicoses causadas por
fungos não dermatófitos. Nesse caso, podemos citar os casos causados por
Candida sp. fazendo parte das infecções causadas por agentes emergentes
(MARTINS et al, 2007).
O sistema imune constitui o mecanismo de defesa do organismo
e está dividido em dois grandes grupos: o sistema imune inato que é a primeira
linha de defesa contra uma grande variedade de microrganismos e o sistema
imune adaptativo que apresenta uma resposta específica. O sistema imune
inato apresenta uma resposta inespecífica mediada por peptídeos, proteínas e
pelos polimorfonucleares, além de células dendríticas e natural Killer. Entre os
componentes do sistema imune inato estão as defensinas e a proteína ligadora
de manose – MBL (ROITT, 2004).
A lectina ligada a manose (MBL) também chamada de proteína
ligada a manose, faz parte da família das proteínas colectinas produzida no
fígado e secretada na corrente sanguínea, e que têm um papel crucial no
sistema imune inato (DOWNING, 2003). A importância dessa proteína está na
capacidade de se ligar a carboidratos do tipo manose, frutose e N-
acetilglicosamina os quais estão presentes na superfície dos microrganismos
(THIEL, 2000). A ligação da MBL, aos carboidratos estruturais da superfície de
bactérias, fungos, protozoários e vírus, apresenta sua atividade antibacteriana
através da destruição dos microrganismos por dois mecanismos: ou caminho
citolítico do sistema complemento ou promovendo a fagocitose por
opsonização (JACK et al, 2001).
1
Entre os outros componentes da imunidade inata temos as
defensinas, que fazem parte do sistema imune inato. São pequenos peptídeos
catiônicos, anfipáticos, contendo em geral de 20 a 45 aminoácidos, não
glicosilados, ricos em arginina com um peso molecular entre 3,5 e 6,0 kDa, as
quais contêm em sua estrutura seis cisteínas que formam pontes dissulfeto
intramoleculares bem características (SANTIAGO et al., 2006). Estas
contribuem para a defesa do organismo contra um amplo grupo de
microrganismos, incluindo bactérias Gram-negativas e positivas, protozoários,
fungos e vírus (ZAPATA & MONTOYA, 2006;). Em humanos foram
descobertas duas classes de defesinas, denominadas α e β, esta classificação
foi realizada através de seus arranjos e seqüências de cisteínas. As β-
defensinas (HBDs) atuam como antibióticos naturais. Podendo ser encontradas
nos trato respiratório e reprodutor feminino (CHEN et al., 2006; HARDER et al.,
2001), em glândulas mamárias (LEHRER; GANZ, 2002. JIA et al., 2001),
epidídimo, líquido seminal, útero, nas glândulas tireoidianas (SANTIAGO et al.,
2006; BIRCHSLER et al., 2001) e tecido epitelial. Já foram descobertas 6 β-
defensinas humanas que são HBD-1, HBD-2, HBD-3, HBD-4, HBD-5 e HBD-6.
Entre as β-defensinas, a HBD-2 e HDB-4 apresentam atividade antifúngica.
Estudos também estão sendo realizados com a HBD-1 quanto a sua
participação no processo de defesa nas infecções causada por Candida sp.
esse estudo foi realizado em pacientes que apresentavam candidíase oral
(BONIOTTO et al., 2004).
Estudar o polimorfismo do gene da β-defensina -1, e da MBL2
nas infecções causadas por Candida sp. poderá esclarecer o papel desses
componentes da imunidade inata frente as onicomicose.
2
2- OBJETIVOS
2. 1-Objetivo geral:
Relacionar o polimorfismo do gene da MBL2 e da β-defensina -1
em pacientes acometidos por onicomicose causada por Candida spp.
2.2 - Objetivos Específicos:
Selecionar os pacientes acometidos por onicomicose causada por
Candida spp;
Isolar e identificar as amostras de Candida;
Analisar o polimorfismo do gene MBL 2 e β-defensina-1 nos
pacientes estudados;
Correlacionar o polimorfismo do gene da MBL 2 e da β-defensina
-1 nos pacientes estudados;
Avaliar os pacientes acometidos por onicomicose por Candida em
relação a idade, sexo, local e tempo da infecção.
3
3 - REVISÃO DA LITERATURA
3. 1 ONICOMICOSE
As onicomicoses são infecções fúngicas determinadas por
diversas espécies de fungos: dermatófitos, não dermatófitos e leveduras. A
distribuição desses diferentes patógenos não é uniforme, e depende de vários
fatores tais como clima, área geográfica e migração. Os dermatófitos eram os
principais causadores de onicomicoses. Nos últimos anos, os casos de
onicomicoses não dermatofíticas, aumentaram, sobretudo na Europa, onde são
responsáveis por 1,6 a 6%. (MARTINS, et al., 2007).
A onicomicose representa 20% das doenças que acomete as
unhas e é uma das mais freqüentes causas de onicopatias em todo o mundo.
Na Austrália, Inglaterra e nos Estados Unidos, a prevalência é estimada em
torno de 3% do total da população em geral, elevando-se para 5% com o
aumento da idade acima dos 55 anos. A maioria dos autores diagnostica como
agentes mais freqüentes os dermatófitos (80 a 90%), seguidos pelas leveduras
(5 a 17%) e por fim fungos filamentosos não dermatofíticos (2 a 12%). Em
Barcelona a prevalência dos fungos filamentosos foi de 7,6%, sendo o
Scopulariopsis brevicaulis a espécie mais freqüentemente encontrada. (Araújo,
et al, 2007). Porém, em estudo realizado na cidade de São José do Rio Preto,
SP relatam uma incidência de onocomicose causadas por Candida sp maior
que por dermatófitos e sendo a C. parapsilosis a predominante com 47%
dentro do grupo das leveduras (MARTINS et al., 2006).
Sua prevalência está em crescimento o que pode ser explicado
por fatores como aumento da incidência de imunodeficiências e da idade da
população, melhora da vigilância médica, e dos cuidados, tanto do médico
quanto do paciente, em relação às unhas (RAMOS, 2000).
Alguns fatores favorecem o desenvolvimento, tais como uso de
calçados fechados e/ou úmidos, traumatismos freqüentes nas unhas, e pisar
4
descalço em banheiros públicos são fatores que podem levar ao aumento
dessa incidência. Por estas razões as infecções fúngicas dos pés, entre elas as
onicomicoses, podem ser muito mais comuns em certos grupos, sujeitos a
esses fatores, como é o caso do pessoal das forças armadas, mineiros de
carvão, nadadores freqüentes, escolares, e desportistas, do que se constata
nos estudos de população geral.
A onicomicose ou tinha da unha é afecção eminentemente
crônica, é universal, e se manifesta por descolamento da unha, hiperceratose
subungueal, podendo chegar até a destruição parcial ou total da unha. Há, por
vezes, grande dificuldade para se chegar ao diagnóstico de infecção fúngica
das unhas, o que ocorre tanto em relação ao seu diagnóstico diferencial com
outras onicopátias, quanto à etiologia da própria onicomicose, o que implicará
em diferentes tratamentos.
As manifestações da onicomicose são: unhas frágeis,
quebradiças, com fendas longitudinais ou transversais, chegando até á
alteração completa da lâmina ungueal (RAMOS, 2000). A onicólise se
caracteriza por um descolamento da unha de seu leito na sua região distal e/ou
lateral, dando um aspecto esbranquiçado e criando um espaço subungueal
onde se acumulam germes, sujeira, queratina e outros detritos. Nesses casos é
preciso ter certos cuidados como evitar traumatismo, detergentes e certos
medicamentos, além de tentar erradicar os fungos e bactérias porventura
presentes, e afastar a possibilidade de psoríase (BACHETTI, 2001).
Oníquia e Paroníquia devidas a leveduras: a Candida albicans e
raramente outras leveduras podem produzir paroníquias e, secundariamente,
oníquias. São afetados um ou mais dedos das mãos, raramente os
pododáctilos (referente aos dedos dos pés). A princípio, forma-se coleção
puriforme nas dobras unguiais que se tornam vermelho-vivo e dolorosas, às
vezes acompanhadas de adenite axilar. Em alguns dias, o exsudato começa a
ser eliminado, atenuando-se o caráter inflamatório. Todavia, subsistem edema
e eritema de tonalidade arroxeada das dobras, descoladas em extensão de 1.a
2 mm e fazendo nítido relevo sobre a lâmina unguial. Pela compressão surge
gotícula puriforme entre as dobras e a unha. Nesta, com o tempo, aparecem
sulcos transversais de cerca de 1 mm, paralelos, dando-lhes aspecto ondulado
5
e manchas escuras, circulares ou ovais (LACAZ, 2000).
Em alguns casos as leveduras determinam lesão primária da
lâmina, que se torna friável, opaca e pardacenta; as alterações são
confundíveis com as da onicomicose tricofítica, sendo muito difícil a
diferenciação clínica (BECHELLI et al, 1978). Os fatores que contribuem para
a instalação de onicomicoses podem ser divididos em fatores predisponentes:
sexo, perturbações circulatórias periféricas, resistência diminuída para as
infecções e fatores de precipitação: traumatismos (no trabalho, na manicure,
etc.), infecções (piogênica: S. aureus; micótica - C. albicans); fatores de
manutenção; profissão (imersão dos dedos, maceração), clima (sensibilidade
ao frio), disfunção hormonal (menopausa, obesidade, diabetes). É comum em
mulheres que se põem mais em contato com água (cozinheiras, lavadeiras,
etc.). Nos homens, tal infecção pode ocorrer particularmente nos lavadores de
louças, manipuladores de frutas, jardineiros, operários de curtume, etc.
(Esteves et al, 1978) As alterações clínicas vão de pequenas manchas
esbranquiçadas ou amareladas (discromia), espessamento, fendilhação,
descolagem que promove a separação da unha em duas lâminas e
hiperceratose sub-unguial. Nas partes lesadas, observa-se perda de brilho,
opacidade e, destruição da unha (BECHELLI et al, 1978).
A onicomicose tem sido vista, por muitos, como um problema
meramente estético e tem tido por isso sua importância negligenciada. É
necessário, no entanto, ser dimensionado de uma maneira categórica o seu
real significado, já que interfere de modo expressivo no bem estar e na
qualidade de vida dos pacientes. A onicomicose está, com certeza, associada
ao desconforto físico e psicológico, e por ser doença contagiosa e de aspecto
muito desagradável, a maior parte dos pacientes com lesão de unha da mão
procuraram escondê-la, e, quando no pé, local de desenvolvimento mais
freqüente, muitos evitaram ir à praia ou à piscina para não ter que tirar os
sapatos em público. Além disso, uma onicomicose não tratada pode vir a
causar problemas mais sérios com o passar do tempo, ou seja, se o indivíduo
seja acometido por alguma doença que comprometa sua imunidade como, por
exemplo: Diabetes Mellitus, doenças auto-imunes ou até mesmo passar por
algum processo cirúrgico e usos de drogas imunossupressoras. Também tem
6
sido relatada a importância dessa infecção em crianças e portadores do vírus
do HIV (PIRACCINI & TOSI, 2008).
Diante desses relatos a onicomicose está deixando de ser vista
como apenas um problema estético sem maiores agravantes para a saúde e
passando a ser considerada uma doença que, aparentemente inofensivo, pode
vir a se tornar sério problema para o indivíduo portador. O que vai depender do
seu estado geral de saúde bem como seu organismo responde
imunologicamente a infecções. Salientando que nos últimos anos vem
aumentando a prevalência de do gênero Candida causando onicomicose
(SEGAL, et al, 2000).
oFigura 1 – Aspecto macroscópico das lesões nas unhas do 1 e
5º Pododáctilo Esquerdo. Cortesia do Prof. Armando Marsden
7
3. 2 O GÊNERO CANDIDA
A Candida faz parte da classe dos Ascomicetos, um grupo de
fungos potencialmente patogênicos que podem causar doenças infecciosas
nos seres humanos, por exemplo, a Candidíase ou Candidose. Sendo
considerado um fungo microscópico de paredes finas e pequenas, medindo
cerca de 4 a 6 µm (SANTOS et al., 2004).
Em 1923, foram classificados por Berkhout do seguinte modo:
3. 6. 2. 2 Detecção do produto amplificado (AMPLICOM)
A coloração pelo SYBR Green é um dos métodos usados para
analise de PCR em tempo real. O corante SYBER Green se liga a alça menor
do dsDNA e emite luz fluorescente. Quando o dsDNA é desnaturado o corante
SYBR Green se desloca. Quanto maior o número de duplas fitas de DNA
formadas durante a reação de PCR (formação de amplicons), maior a emissão
de fluorescência (RIRIE et al., 1997; CHENG et al., 2004).
34
4. REFERÊNCIAS Abbas, A.K; Lichtman, A. H; Pober J. S. Imunologia celular e molecular ed. Rio deJaneiro:. cap. 1, p. 03 -06. 2002 Almeida, L. M. M; Guilhermett, V; Robson, A. Mrossi, M; Svidzinski, I. E. Freqüência de onicomicoses por leveduras em Maringá, Paraná, Brasil, Anais Brasileiro de Dermatologia.82 ;(2):151-6.. 2000 Araújo JM, Brandão LC; Guimarães RL ; Santos S, Falcão EA, Milanese M, Segat L; Souza PRE, Lima-Filho JL de; Crovella S. Mannose binding lectin gene polymorphisms are associated with type 1 diabetes in Brazilian children and adolescents. Human Immunology; 68: 739-743, 2007. Ashitani, J; Mukae, H; Hiratsuka, T; Nakazato, M; Kumamoto, K; Matsukura, S. Plasma and BAL fluid concentrations of antimicrobial peptides in patients with Mycobacterium avium-intracellulare infection. Chest; 4: 1131-1137, 2001 Birchsler, T; Reinhart, S; Buchner, K; Loeliger, S; Reinhard, S; Hossle, P; Aguzzi, A; Launer, R. Human Toll-like receptor mediates induction of the antimicrobial peptide human beta-defensin 2 in response to bacterial lipoprotein. Europa J Immunol. 31: 3131-3137, 2001 Boniotto, M; Hazbon, M. H; Jordan,W. J; Lennon, G. P; Eskdale, J; Alland; Gallagher, G. Novel hairping primer assay to study the association of the -44 single-nucleotide polymorphism of the DEFB-1 gene with early-onset periodontal disease. Clinical and Diagnostic Laboratory I mmunology,. 766-769, 2004 Boniotto, M., S. Crovella, et al. Polymorphisms in the MBL2 promoter correlated with risk of HIV-1 vertical transmission and AIDS progression. Genes Immun, v1,(.5).346-8, 2000. Chang, T. L; Francois, F; Mosoia, A; Klotman, M. E. C. A. F. Mediated human immunodeficiency virus (HIV) type 1 transcriptional inhibition is distinct from alpha-defensin-1 HIV inhibition. J Virol. 77: 6777-84, 2003
Cheng, J., Y. Zhang, et al. Real-time PCR genotyping using displacing probes. Nucleic Acids Res,. v.32, n.7, p.61. 2004.
35
Colombo et al. Micologia clínica: Epidemiologia das infecções hematogênicas por Candida spp. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. Vol. 36, n. 5, 599-607, 2003. Colombo et al. Sociedade Brasileira de Infectologia. Edição nº 7, 2004. Cooper, M. A., T. A. Fehniger, et al. NK cell and DC interactions. Trends Immunol, v.25, n.1, Jan, p.47-52. 2004. Crosdale, D. J., W. E. Ollier, et al. Mannose binding lectin (MBL) genotype distributions with relation to serum levels in UK Caucasoids. Eur J Immunogenet, 27, n.3, p.111-7. 2000. Davies, E. J., L. S. Teh, et al. A dysfunctional allele of the mannose binding protein gene associates with systemic lupus erythematosus in a Spanish population. J Rheumatol. v.24, n.3, p.485-8. 1997. Dobson-Stone, C., R. D. Cox, et al. Comparison of fluorescent single-strand conformation polymorphism analysis and denaturing high-performance liquid chromatography for detection of EXT1 and EXT2 mutations in hereditary multiple exostoses. Eur J Hum Genet, v.8, n.1, p.24-32. 2000. Dork, T; Stuhrmann. Polimorfisms of the human β-defensin -1 gene. Molecular and Cellular Probes, 12, 171-173, 1998 Downing I, Koch C, Kilpatrick C. David. Immature dentritic cells possess a sugar-sensituve receptor for human mannan-binding lectin. Immunology. 109, 360-64, 2003. Eisen, D. P. e R. M. Minchinton. Impact of mannose-binding lectin on susceptibility to infectious diseases. Clin Infect Dis. v.37, n.11, p.1496-505. 2003. Goldman, M. J; Anderson, G. M; Stolzenberg, E. D; Kari, U. P; Zassloff, M. Human b-defensin-1 is salt-sensitive antibiotic in lung that is inactivated in cystic fibrosis. Cell. 4: 553-560, 1997
Ganz, T; Wileyi, C. Biosynthesis of defensis and other antimicrobial peptides
36
.Antimicrobial peptides. Cuba Foundation Symposium 186; p.62-76 1994.
Garred, P., H. O. Madsen, et al. Susceptibility to HIV infection and progression of AIDS in relation to variant alleles of mannose-binding lectin. Lancet, v.349, n.9047, 25, p.236-40. 1997. Garred P, Mandsen H O, Marquart H, Hansen T M, Sorensen S F, Petersen J, Volck B, Svejgaard A, Graudal N A, Rudd P M, DweK R A, Sim R B, Andersen V. Two edged role of mannose binding lectin in rheumatoid arthristis: a Cross sectional study. Jornal Rheumatol. 27(1): 26-34, 2000. Gray, I. C., D. A. Campbell, et al. Single nucleotide polymorphisms as tools in human genetics. Hum Mol Genet, v.9, n.16, p.2403-8. 2000. Guo, N., T. Mogues, et al. The human ortholog of rhesus mannose-binding protein-A gene is an expressed pseudogene that localizes to chromosome 10. Mamm Genome, v.9, n.3, p. 246-9. 1998. Gross, E., N. Arnold, et al. A comparison of BRCA1 mutation analysis by direct sequencing, SSCP and DHPLC. Hum Genet, v.105, n.1-2, Jul-Aug, p.72-8. 1999. Klotman E. M; Chang L. T. Defensins in inate antiviral immunity. Neture reviews immunology. V, 6. 447-455, 2006 Haerder, J; Bartels, J; Christophers, E; Schoder, J. M. Isolation and characterization of human beta-defensin -3, a novel human inducible peptide antibiotic. In Critical Reviews Oral Biology & Medicine. ; 276 (8): 5707-13, 2001 Halushka, M. K., J. B. Fan, et al. Patterns of single-nucleotide polymorphisms in candidate genes for blood-pressure homeostasis. Nat Genet, v.22, p.239-47. 1999. Higuchi, R., G. Dollinger, et al. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y), v.10, n.4, Apr, p.413-7. 1992. Jack L. D; Klein J. N, Turner W. M. Mannose-binding lectin: Targeting the microbial world for complement attack and opsonophagocytosis. Immunological Reviews. Vol (180): 86-99, 2001.
37
Lau, Y. L., C. S. Lau, et al. Mannose-binding protein in Chinese patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, v.39, n.4, p.706-8. 1996. Jia, H. P; Schuttte, B. C; Schudy, A; Linzmeier, R; Guthmiller, J. M;Jhonson G. K, Discovery of new human beta-defensins using e genomics-based approach. Gene. 263: 211-8, 2001 Kurtzman, C. P; Fell, J. W. The yeast’s: a taxonomic study. 4. Ed. Elsevier, New York,. p. 919-9253, 1998 Lacaz, C. S; Porto, E; Heins-Vaccari, M. E; Melo, N.T. Fungos Ascomicetos Algas de interesse médico. 2005 Lehner, R. I; Ganz, T. Innate and adaptive mucosal immunity in protection against HIV infection. Vaccine, v.21 Suppl 2, Jun 1, p.S68-76. 2003. Lehrer, R. I; Ganz, T. Defensins of vetebrate animals. Los Angeles USA: Elsevier Science Ltda, 2002. Lichten, M. J. e M. S. Fox. Detection of non-homology-containing heteroduplex molecules. Nucleic Acids Res, v.11, n.12, p.3959-71, 1983. Lida. Aritoshi I, Susumu S, Akihiro S, Atsushi T, Naoyuki K; Yusuke N. Japanese single nucleotide polymorphism database for 267 possible drug-related genes. Cancer Sci 97: 16–24, 2006 Liew, K. J. e V. T. Chow. Differential display RT-PCR analysis of ECV304 endothelial-like cells infected with dengue virus type 2 reveals messenger RNA expression profiles of multiple human genes involved in known and novel roles. J Med Virol, v.72, n.4, p.597-609. 2004. Lipscombe, R. J., D. W. Beatty, et al. Mutations in the human mannose-binding protein gene: frequencies in several population groups. Eur J Hum Genet, v.4, n.1, p.13-9. 1996. Jϋliger S, Luckner D, Mordumuller B, May Jurgen, Weierich, Lell B, Luly A, Kremsner P. G, Kun J. F. J. Promoter Variants of the Human Mannose-Binding Lectin Gene Show Diffrent Binding. Biochemical and Biophysical Reseca communications. 275, 617-622, 2000.
38
Maas, J., A. M. De Roda Husman, et al. Presence of the variant mannose-binding lectin alleles associated with slower progression to AIDS. Amsterdam Cohort Study. Aids, v.12, n.17, Dec 3, p.2275-80. 1998. Madsen, H. O., P. Garred, et al. A new frequent allele is the missing link in the structural polymorphism of the human mannan-binding protein. Immunogenetics, v.40, n.1, p.37-44. 1994. Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol, v.20, n.2, p.137-51. 2006. Martins EA,Guerrer LV,Cunha KC, Soares MMCN, Almeida MTG. Onicomicose:estudo clínico , epidemiológico e micológico no municípiode São José do Rio Preto. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical-;40(5):596-598, 2007. Matsushita, M. e T. Fujita. Activation of the classical complement pathway by mannose-binding protein in association with a novel C1s-like serine protease. J Exp Med, v.176, n.6, p.1497-502. 1992. McBride, M. O., P. B. Fischer, et al. Mannose-binding protein in HIV-seropositive patients does not contribute to disease progression or bacterial infections. Int J STD AIDS, v.9, n.11, p.683-8. 1998. Mead, R., D. Jack, et al. Mannose-binding lectin alleles in a prospectively recruited UK population. The ALSPAC Study Team. Avon Longitudinal Study of Pregnancy and Childhood. Lancet, v.349, n.9066, Jun 7, p.1669-70. 1997. Mezzari et al. Os anfifúngicos nas infecções por Candida sp.. Edição 63. 2004 Minchinton M. R; Dean M; M, Clark, T. R; Heatley. S; Mullighan G. C. Analysis of the relationship between mannose-binding lectin (MBL) genotype, MBL levels and function in an Australian blood donor population. Scand J. Immunol, 56: 630-41, 2002. Miranda, L. N; Souza, A. P. I; Sienra, R; Rodrigues, E; Levin, A. S. Colonização por Candida parapsilosis em indivíduos com candemia: avaliação de potenciais fontes. Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de São Paulo (FM-USP), 2005.
39
Moller-Kristensen M, Jensenius C. J, Jensen L, Thielens N, Rossi V, Arlaud G, Thiel S. Levels of mannan-binding lectin-associated serine protease-2 in healthy individuals. Journal of Immunological Methods. Vol (282): 159-167, 2003. Nepomuceno, R. R., A. H. Henschen-Edman, et al. cDNA cloning and primary structure analysis of C1qR(P), the human C1q/MBL/SPA receptor that mediates enhanced phagocytosis in vitro. Immunity, v.6, n.2, Feb, p.119-29. 1997. Neth O, Jack L. D, Dodds W. A, Holzel H, Klein J. N, Turner W. M. Mannose-Binding Lectin Binds to a Range of Clinically Relevant Microorganisms and Promotes complement Deposition. Infection and Immunity. Vol (68), nº 2 (688-693), 2000. Neville et al. Isolation of Candida parapsilosis in a patient with clinic diagnosis of chronic atrophic candidiasis. Medical Mycology, the Pathogenic Fungi and the Pathogenic Ascomycetes, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 705 p, 2002 Nowotny, S., Scharek, S., Zieris, R., Naumann, T.,Beyer, E. Hybridtechnologie und Präzisionstechnik zum Laserstrahl-Auftragsschweißen. LaserOpto, Vol.33, No.1, pp.57-60, 2001 Pellis V; Seta F; Crovella S; Bulla R; Guaschino S; Radillo O, Gerred P; Tedesco F. Mannose binding lectin and C3 act as recognition molecules for infectious agents in the vagina. Clinical and Experimental Immunology. 139: 120-126, 2005. Presanis J. S; Kojima, M; Sim R. B. Biochemistry and genetics of mannan-binding lectin (MBL). Biochemical Society Transactions. Vol (31), 2003. Richard J. J, Bai M, Chadwick R. B, White T. C, Dale B. A. Single-Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in Humman β- Defensin 1: High-Throughupt SNP Assays and Association With Candida Carriage in type I Diabettics and Nondiabetic Controls. Journal of Clinical Microbiology. V. 41, p. 90-96, 2003. Roitt et al. Microbiology and Immunology.Imunology (7ht Ed). Chaper 6. p19-29, 2006.
Santiago-Rivas, B; Sada, E; Hernandez-Ndo, R; Tsutsumi, V. Péptidos antimicrobianos en la inmunidad innata de enfermidades infecciosas. Salud Publica, México:; 48: 62-71. 2006 Santos, P. R; Sander, G. B; Costa, A. F; Pico, P.D. Diagnóstico da candidíase. Disponível: http://www.unimedpoa.com.br/cooperadoonline/downloads/links/cap11_b.htm Sastry, K., G. A. Herman, et al. The human mannose-binding protein gene. Exon structure reveals its evolutionary relationship to a human pulmonary surfactant gene and localization to chromosome 10. J Exp Med, v.170, n.4, Oct 1, p.1175-89. 1989. Schutte, B. C; Mitros, J. P; Bartlett, J. A; Walters, J. D; Jia, H. P; Welsh, M. J. Discovery of five conserved beta-defensin gene clusters using a computacional search strategy. In: Proceedigs of the National Academy of Sciences. USA; 99; p. 2129-33. 2002. Schwartz, S. A. e M. P. Nair. Current concepts in human immunodeficiency virus infection and AIDS. Clin Diagn Lab Immunol, v.6, n.3, p.295-305. 1999. Sierra, S., B. Kupfer, et al. Basics of the virology of HIV-1 and its replication. J Clin Virol, v.34, n.4, Dec, p.233-44. 2005. Silva, M. R. Onicomicoses - Diagnóstico Diferencial. Dermatologia Atual. Rio de Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro. Vol, 6.p 27-34, 2000 Smet, Kris; Contreras, Roland. Human Antimicrobial Peptides: Defensins, Cathelicidins And Histatins. Biotechnology Letters.V.27, P. 1334-1337, 2005 Souza, P. R. E. ; Arraes, Lc ; Bruneska, D ; Castelo Filho, A ; de Souza Cavada, B ; Lima Filho, Jl ; Crovella, S. A cost-effective melting temperature assay for the detection of single-nucleotide polimorphism in MBL-2 gene of HIV-1-infected children. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 39, p. 719-723, 2006. ______P. R. E. ; Arraes, L. C ; Lima Filho, J. L ; Bruneska, D ; Milanese, M ; Crovella, S. CCR5 promoter polymorphisms and HIV-1 perinatal transmission in Brazilian children. Journal of Reproductive Immunology, v. 69, p. 77-84, 2005.
41
Sullivan, K. E., C. Wooten, et al. Mannose-binding protein genetic polymorphisms in black patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, v.39, n.12, Dec, p.2046-51. 1996. Summerfield, J. A., M. Sumiya, et al. Association of mutations in mannose binding protein gene with childhood infection in consecutive hospital series. Bmj, v.314, n.7089, Apr 26, p.1229-32. 1997. Taylor, M. E., P. M. Brickell, et al. Structure and evolutionary origin of the gene encoding a human serum mannose-binding protein. Biochem J, v.262, 15, p.763-71. 1989. Thiel, S., T. Vorup-Jensen, et al. A second serine protease associated with mannan-binding lectin that activates complement. Nature, v.386, n.6624, p.506-10. 1997. Thiel; Steffen. Indications of mannan-binding lectin (MBL) in the tretment of immunocompormised individuals. Appl. N.: 568142. 2000.
Townsend R, Read C. R, turner W. M, Klein J. N, Jack L. D. Differential recognition of obligate anaerobic bacteria by human mannose-binding lectin. Clin Exp Immunol. Vol (124): 223-228; 2001. Turner W. M. Mannose-binling lectin: the pluripotent molecule of the innate immune system. Vol (17) n° 11, 1996. Underhill, P. A., L. Jin, et al. Detection of numerous Y chromosome biallelic polymorphisms by denaturing high-performance liquid chromatography. Genome Res, v.7, n.10, p.996-1005, 1997. Valore, E. V; Park, C.H; Quayle, A. J; Wiles, K .R; Mccray, J. P. B; Ganz, T. Human beta-defensin-1: an antimicrobial peptide of urogenital tissues. J Clin Invest.101 (8): 1633-42, 1998 Wallis, R. Structural Basis for Mannose-Binding Protein Function in Innate Immunity. Immunobiology of Carbohydrates, p.1-12. 2003.
42
Wang, W. P., K. Y. Ni, et al. [Approaches for SNP genotyping]. Yi Chuan, v.28, n.1.117-26. 2006. Wang, D. G., J. B. Fan, et al. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science, v.280, n.5366, p.1077-82. 1998. Wenz, H. M., S. Baumhueter, et al. A rapid automated SSCP multiplex capillary electrophoresis protocol that detects the two common mutations implicated in hereditary hemochromatosis (HH). Hum Genet. 104: (1), p.29-35. 1999. Wilhelm, J., A. Pingoud, et al. Real-time PCR-based method for the estimation of genome sizes. Nucleic Acids Res, v.31, n.10, p.e56. 2003. Worthley, D. L., P. G. Bardy, et al. Mannose-binding lectin: biology and clinical implications. Intern Med J, v.35, n.9, Sep, p.548-55. 2005. Yamaguchi, Y; Nagase, T; Makita, R; Fukuhara, S; Tomita, T; Identification of multiple novel epididymis-specific bete-defensin isoforms in the humans and micce. J Immunol. 169: 2516-23, 2002 Yang, D; Biragyn, A; Kwak, L. W, Oppenhein, J. J. Mammalian defensins in imuity: more than just microbicidal. Trends Immunol. 23:291-6, 2002 Zapata, W; Montoya, M. T. Factores solubles con actividad inhibitoria contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. Colombia, USA:. V. 26 n.3, 2006
43
CAPÍTULO I
44
ARTIGO A SER SUBMETIDO À REVISTA HUMAN IMMUNOLOGY
CAPÍTULO I: Análise da Relação entre o Polimorfismo do Gene da Lectina Ligadora de Manose (MBL2) e Onicomicoses causadas por
Candida spp.
45
Análise da Relação entre o Polimorfismo do Gene da Lectina Ligadora de Manose (MBL2) e Onicomicoses causadas por Candida spp.
b, fFurtado, V. C. ; Araújo, V. P. a b, f; Souza, P. R. ; Marsdem. A. L. a; Sette. R. c; Lucas,
C. A. b a, b; Moura, P. ; Guimarães, L. R. b ; Lima-Filho, J. L. b; Porto, A. L. F. b, g & Crovella, S. b, d, h
a Departamento de Micologia Médica, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); b Laboratório Imunopatologia Keizo Asami- LIKA/ UFPE; c Laboratório Medicina Diagnóstica-NKB; d Departamento de Genética- Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); f Universidade de Pernambuco (UPE); g. Departamento de Morfologia e Fisiologia Anima,Universidade Federal Rural de Pernambuco- UFRPE; h. Department of Developmental and Reproductive Sciences, Department University of Trieste, Italy. Correspondencia do autor Veridiana Câmara Furtado
RESUMO A onicomcose é uma infecção causada por fungos que atinge indivíduos em todas as regiões do mundo. A lectina ligadora de manose (MBL) é um importante constituinte do sistema imune inato, atua ligando-se a carboidratos presente na superfície de vários microrganismos como vírus, bactérias e fungos ativando o sistema complemento. Esse estudo objetivou a análise do polimorfismo do gene da MBL2 em 100 pacientes com onicomicose causada por Candida spp. atendidos no Laboratório de Micologia Médica da Univerdidade Federal de Pernambuco. A análise do polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene da MBL2 foi realizada através da técnica de PCR em tempo real. As amostras de Candida foram submetidas à identificação por análises morfológicas e bioquímicas, bem como o cultivo em meio cromogênico (CROMOagar Candida®). Os resultados obtidos mostraram predominância de Candida não-albicans como C. parapsilosis (50%), C. tropicalis (34%) e C. albicans (6%). O resultado do polimorfismo demonstrou que o alelo 0 foi mais freqüente em pacientes com onicomicose do que em relação ao controle saudável (35% vs. 20%, p = 0,0001), respectivamente. Quanto à distribuição do genótipo A0 foi significativamente diferente entre os pacientes com onicomicose e o controle saudável (10% vs. 6%, p = 0,0003), respectivamente. Os resultados obtidos deste trabalho mostraram que o alelo 0 conferiu uma maior susceptibilidade à onicomicose causada por Candida spp. (OR= 2,19, e IC= 95%). INTRODUÇÃO Oniconicose é uma infecção, primária ou secundária, considerada um problema
universal atingindo 30% das infecções fungicas superficiais. Contudo, a participação de
fungos emergentes nesta infecção tem aumentado nos últimos anos e dentre os
microrganismos, Candida spp. tem despertado um grande interesse na área médica por
se destacar como fungos emergentes sendo o principal fungo associado a infecções
hospitalares, e o quarto envolvido nestas infecções. Porém seu interesse não é limitado a
apenas a pacientes com infecções hospitalares e imuno comprometidos, mas se
destacam nas onicomicoses como agentes etiológico logo após dos fungos dermatófitos
[1, 2, 3]
A lectina ligadora de manose (MBL) é um importante componente do sistema
imune inato sintetizada no fígado, e derivada de lectina do tipo C, sendo liberada na
corrente sanguínea. A MBL2 apresenta na unidade de sua estrutura primária uma
molécula helicoidal de 96 kDa constituída de três cadeias de colágeno idênticas de 32
kDa cada com regiões de carboidratos apresentando domínio C-terminal. Essas
unidades são estabilizadas por regiões N-terminal ricas em cisteínas ligadas por pontes
de sulfeto [4, 5].
47
Uma das principais características da imunodeficiência severa é a associação da
baixa imunidade do hospedeiro com a infecção causada por microrganismos
específicos. Entretanto, há numerosos estudos que mostram a deficiência da MBL como
um importante fator de risco para adquirir infecções, particularmente em crianças, e
doenças associadas à imunodeficientes como no caso do HIV [6, 7].
O polimorfismo de um único nucleotídeo (SNPs) nas regiões não identicadas e
identificadas dos códons do gene MBL2 são responsáveis pela variações na produção e
função da MBL2 in vivo [8].
As variações dos níveis de MBL2 são resultantes do polimorfismo na região
promotora do gene as quais influenciam nos níveis sorológicos da lectina [9]. A
deficiência desta proteína tem sido associada com o aumento da susceptibilidade a
infecções em pacientes neutropênicos, com meningite meningocócicas, com infecções
fúngicas invasivas, infecção por HIV e entre outras. Existem vários relatos que sugerem
que a MBL2 é capaz de modular a severidade da doença e pode ser usada como
predicativo de terapia [10, 11].
Em humanos, baixos níveis de MBL2 pode ser causado por uma das três
mutações estruturais localizada no exon 1 do seu gene. Que são causadas pelo
polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) nos códon 52, 54 e 57 do gene. Estas
mutações são freqüentemente representadas por D, B e C, respectivamente, com “A”
representando o tipo selvagem. Em complementação, mutações estruturais do gene da
MBL2 em muitos polimorfismo da região promotora na posição -550, -221 e da região
5’ do gene da MBL2 codificam os alelos H/L e X/Y que representam os níveis de MBL2
em indivíduos com o gene tipo selvagem e em indivíduos heterozigotos para mutação
estrutural do gene. O halótipo HYA produz altos níveis de MBL, o halótipo LYA produz
níveis intermediários e o halótipo LXA produz baixos níveis. Enquanto a descrição das
variações estrutural do gene da MBL2, muitos estudos e trabalho adotam o A/A para
homozigotos selvagem, 0/0 para homozigotos mutante e A/0 para heterozigotos. O
termo “halótipo B” e “halótipos H“ referem respectivamente, as variantes estruturais e
promotoras de alelos da MBL [12,13,14].
Esse estudo teve como objetivo investigar a possível associação da
freqüência do polimorfismo do gene da MBL2 em pacientes acometidos por
onicomicose causada por Candida sp.
48
MATERIAL E MÉTODOS
Seleção dos pacientes Foram selecionados e coletadas amostras de 100 pacientes (ambos os sexos) na
faixa etária entre 18 a 70 anos, atendidos no Laboratório de Micologia Médica - UFPE.
Como critério de inclusão dos pacientes foram utilizados o critério de idade entre 18 a
70 anos, com apresentação de solicitação médica para realização do exame, e que
aceitaram fazer parte da pesquisa, respondendo a um questionário e assinando o termo
de livre esclarecimento. Como critérios de exclusão foram eliminados os pacientes que
apresentassem os seguintes históricos: Diabetes Mellitus, HIV, portadores de doenças
malignas, submetidos a tratamento quimioterápicos até seis meses antes da coleta,
utilizando drogas imunosupressoras, transplantados, sem apresentar nenhuma outra
doença imunosupressora diagnosticada e que não tenha adquirido a infecção após
internamento ou procedimento cirúrgico nos últimos seis meses.
Isolamento e Identificação da Candida spp.
Foram realizada raspagem das áreas lesionadas das unhas das mãos e dos pés
com o auxílio de um bisturi e submetidas ao exame direto após clarificação com KOH a
30% e cultivo em meio de cultura Sabouraud acrescido de clorafenicol 2% (p/v). As
culturas depois de isoladas foram submetidas à identificação através de análises
morfológicas utilizando a técnica de microcultivos em lâmina, produção de tubo
germinativo a 37ºC em placas contendo soro humano, provas bioquímicas
convencionais como teste de fermentação e assimilação de carboidratos. Além da
utilização do meio cromogênico (CROMagar ® Candida)
Extração do DNA
Foi utilizado sangue total para a extração do DNA genômico através do kit
GenomePrep (Armesham-Pharmacia, Buckinghamshire, UK). E o processo de extração
foi realizado conforme protocolo estabelecido pelos fabricantes.
49
Genotipagem do gene da MBL2
Os três polimorfismos (na posição 52, 54 e 57 do primeiro exon do gene) foram
agrupados juntos na categoria (alelo 0), porque eles tem um efeito substancial na MBL
sérica, a combinação dos três alelos selvagem foram agrupados como alelo “A”. A
genotípagem do polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) da MBL2 foi determinado
pela temperatura de “melting” como previamente descrito por Souza [15]. Para o
genotipagem da SNP da MBL2 foram utilizados os seguintes oligonucleotídeos (5’
AGGCATCAACGGCTTCCCA-3’). Com amplificação de 90pb e temperatura de
“melting” de 84ºC [10].
Análise estatística
A freqüência genotipica e alélica foi calculada por contagem direta do gene pelo
teste exato de Fisher’s usando a comparação das freqüências genotípicas usando 2 x 2 e
3 x 2.
RESULTADOS Identificação das espécies de Candida Os resultados da identificação realizados com amostras de 100 pacientes com
onicomicose por Candida sp estão representados na tabela 1. Pode-se observar que
ocorreu uma predominância de C. parapsilosis (50%) e C. tropicalis (34%), em vez da
C. albicans que foi encontrada em 6% das amostras. Enquanto que, o percentual de 1 a
2 % correspondeu as demais espécies de Candida.
Table 1: Resultados da identificação e freqüência de amostras de Candida spp isoladas de pacientes com onicomicose atendidos no Laboratório de Micologia Médica da Universidade Federal de Pernambuco.
Amostras Candida spp Freqüência (%) C. parapsilosis 50
C. tropicalis 34 C. albicans 6
C. guilliermondii 2 C. krusei 2
C. glabrata 2 C. famata 2
C. glabrata and C. famata 1 C .parapsilosis and C. guilliermondii 1
50
Estudo do polimorfismo do gene da MBL2 Nas análises das amostras de DNA extraídas dos 100 pacientes e dos 150
controles saudáveis, realizadas através do método baseado na temperatura de “melting”,
foi possível detectar o polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene da MBL2
e os resultados encontrados foram os seguintes: A/A (um pico de 83,1 ± 0,1 oC), A/0
(dois picos de 82,6 ± 0,3 e 80,7 ± 0,1 oC), e 0/0 (um pico de 81,7 ± 0,1 oC). A
frequência do polimorfismo do gene da MBL2 em pacientes com onicomicose e
controle saudável esta apresentada na tabela 2.
A frequência do genótipo 0/0 homozigoto foi significativamente alta nos
pacientes com onicomicose (0,10) do que nos pacientes controles (0,06; p = 0.0003),
enquanto que freqüência do genótipo MBL2 A/A homozigoto foi alta no controle
saudável (0,67) do que nos pacientes infectados (0,39; p = 0,0003). No caso do alelo 0,
esse foi significativamente mais freqüente no grupo de pacientes com onicomicose
(0,35; p=0,0001), do que no controle saudável (0,20), odds ratio [OR] de 2,19, com
intervalo de confiança de 95%.
Table 2. Frequência genotípica e alélica do gene da MBL2 em pacientes com
onicomicose causada por Candida sp. atendidos no Laboratório de Micologia Médica
CI= Intervalo de confiança; OR= odds ratio. CI= 2,39
51
DISCUSSÃO
A identificação das amostras de Candida sp. demostrou a prevalência de
Candida não-albicans em relação a C. albicans. Estes dados estão de acordo com outros
autores que citam que a predominância de Candida não-albicans, na população de
pacientes com onicomicoses no Brasil e em outros países (Israel, Inglaterra, Canadá,
Estados Unidos) [1, 3, 16].
Estudo realizado na cidade de Maringá – Paraná/ Brasil com pacientes
acometidos por onicomicose, mostrou que a freqüência de C. parapsilosis (44%)
seguida C. tropicalis (22%) e C. albicans (15%) [17]. Estudos similares realizados em
Israel apresentaram C. parapsilosis como principal agente de onicomicose. Trabalhos
realizados no município de São Jose do Rio Preto, São Paulo, demonstraram uma maior
freqüência de onicomicoses causadas por C. parapsilopsis (47%) seguida de C.
guilliermondii (9%) e C. tropicalis (7 %), representando as espécies de Candida não-
albicans[1].
Em onicomicose superficial branca diagnosticadas em pacientes com HIV e
crianças saudáveis na Itália, não foi observado a prevalência espécies de Candida sp na
infecção [18], esses dados estão contrapostos aos obtidos nesse trabalho, os quais
obtiveram como o principal agente envolvido na onicomicose a C. parapsilosis, porém
o grupo de pacientes selecionados nesse trabalho não foram pacientes imunodeprimidos
e com imunidade em estágio da maturação, o que pode ter concorrido para as respostas
encontradas.
Três variantes da MBL2 (Arg52Cys, Gly54Asp, Gly57Glu) foram
agrupadas e denominadas alelo 0, a combinação das três formas do alelo selvagem foi
denominado alelo A, o genótipo do tipo selvagem (A/A) confere aos indivíduos um
maior nível de produção de MBL e os indivíduos com o genótipo heterozigoto (A/0)
apresentam níveis intermediários de MBL circulante enquanto indivíduos que
apresentam o genótipo homozigoto mutante (0/0) são susceptíveis à determinadas
infecções. Estudos mostram que indivíduos que apresentam genótipos A0 e 00
desenvolveram a forma mais severa de infecção por HIV do que indivíduos que
apresentam o genótipo AA [11, 7].
Trabalho realizado por Liu et al, 2006 com pacientes que apresentaram
candidíase vulvovaginal (CVV) e candidíase vulvovaginal recorrentes (CVVr),
52
demonstrou que o genótipo mutante 00 foi mais freqüente nos que apresentaram CVVr
em comparação ao controle, sendo observado baixos níveis de MBL2 nesses pacientes
[19].
Em outra pesquisa realizada com pacientes com candidíase vulvovaginal,
demonstrou que a MBL2 e C3 presente na cavidade vaginal age reconhecendo as
moléculas dos agentes infecciosos que colonizam a mucosa cervico vaginal, atribuindo
a deficiência da MBL2 a susceptibilidade à infecção [20]. Dados obtidos por outros
autores relataram a relação entre a redução no nível da MBL e o aumento da ocorrência
do polimorfismo do gene da MBL2 apresentado por mulheres com candidíase
vulvovaginal recorrente (VVCr) [21, 22].
A relação entre a Candida albicans e o hospedeiro é devido à expressão das
glucanas presente na parede celular do microrganismo, sendo determinada pela resposta
imune do hospedeiro. As variações na regulação do sistema imune está envolvida na
capacidade da Candida sp. em passar de saprófitos para parasita. Esse fato pode ser
verificado por muitos dos pacientes apresentarem dificuldade na obtenção da cura
através de tratamentos convencionais. A expressão das moléculas de glucanas tem um
importante papel na biologia da Candida albicans para o controle da estrutura e
plasticidade da parede celular e no envolvimento da interação levedura/hospedeiro.
Essas glucanas são reconhecidas como não próprias pela imunidade inata e adaptativa
no sistema imune do hospedeiro [23].
A partir dos resultados obtidos da avaliação do polimorfismo de um único
nucleotídeo do gene da MBL2 em pacientes com onicomicose por Candida sp., foi
possível analisar a freqüência genotípica e alélica para o gene MBL2, a qual demonstrou
que a presença de um alelo mutante nos pacientes estudados, sugere o seu envolvimento
na susceptibilidade à onicomicose por Candida. Os dados aqui relatados são os
primeiros descritos na literatura envolvendo a expressão de gene da MBL2 em pacientes
com onicomicoses sem doenças primárias imunosupressoras.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [4] Jack DL, Klein J Nigel, Turner MW. Mannose-binding lectin: targeting the
microbial word for complement attack and opsonophagocytosis. Immunogical reviews 2001 180: 86-99.
53
[5] Minchinton MR, Dean MM, Clark TR, Heatley S; Mullighan GC. Analysis of the relationship between mannose-binding lectin (MBL) genotype, MBL levels and function in an Australian blood donor population. Scand. J. Immunol 2002; 56: 630-41.
[3] Ip WK, To YF, Cheng SK, Lau YL. Serum Monnose-Binding Lectin levels and MBL Gene Polymorfisms in Diferrent Age and Gender Groups of Southern Chinese Adults. Scand. Journal of Immunology 2003; 50: 310-314.
[8] Roos A, Dialtjes P, Vossen RHAM, Daha MR, Kinijff P. Detection of three single nucleotide polymorfhisms in the gene encoding mannose-binding lectin in a single pyrosequencing reaction. Journal of immunological methods 2006; 309: 108-114.
[9] Townsend R, Read CR, turner WM, Klein JN, Jack LD. Differential recognition of obligate anaerobic bacteria by human mannose-binding lectin. Clin Exp Immunol 2001; 124: 223-228.
[10] Araújo JM, Brandão LC; Guimarães RL ; Santos S, Falcão EA, Milanese M, Segat L; Souza PRE, Lima-Filho JL de; Crovella S. Mannose binding lectin gene polymorphisms are associated with type 1 diabetes in Brazilian children and adolescents. Human Immunology 2007; 68: 739-743.
[11] Ji X, Gewurz H, Apear GT. Mannose binding lectin (MBL) and HIV. Mol Immunol, 2005; 42: 145-52.
[12] Turner W. M. Mannose-binling lectin in health and disease. Molecular Immunology 2003; 40: 423-429.
[13] Eisen PD, Minchinton MR. Impact of Mannose-Binding Lectin on Susceptibility to Infectious Diseases. Clinical Infectious Diseases. 2003; 37: 1496-1505.
[14] Juliger S, Luckner D, Mordmuller B, May J, Weierich A, Lell B, Luty A, Kremsner PG, Kun JFJ. Promotor Varients of the Human Mannose-Binding Lectin Gene Show Different Binding. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000; 275: 617-622.
[1] Segal R; Kimchi A; Kritzman A; Inbar R; Segal Z. The frequency of Candida parapsilosis in onychomycosis. An epidemiological survey in Israel. Mycoses. 2000; 43; 349-353.
[2] Szepitowski JC, Reich A, Panca P, Garlowka E, Baran E, Behalf, Polish. Evaluation of quality of in patiens with toenail onychomycosis by Polish verson of an international onycomycosis-specific questionnaire. European academy of Dermatology and venereology. 2007; 21: 491-496.
Onicomicose:estudo clínico , epidemiológico e micológico no municípiode São José do Rio Preto Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical-2007;40(5):596-598.
[15] Araújo JM, Brandão LC; Guimarães RL; Santos S, Falcão EA, Milanese M, Segat L; Souza PRE, Lima-Filho JL de; Crovella S. Mannose binding lectin gene polymorphisms are associated with type 1 diabetes in Brazilian children and adolescents. Human Immunology 2007; 68: 739-743.
[16] Gautret P,Rodier MH, Kauffmann-Lacroroix ,Jacquemin J L Case Report and Review.Onychomycosis due to Candida parapsilosis. 2000.Mycoses 43 433.
[17] Souza EAF, Almeida L.M.M, Guilhermetti E, Mota VA,Rossi RM; Svidzinski, TI. E. Freqüência de onicomicoses por leveduras em Maringá, Paraná, Brasil. 2007; 82 (2): 151-156.
54
[18]Piaccini BM,Tosti A; White Superficial Onichomycosis Archdermatologic 2004;140:696-701.
[6] Ji X,Gewurz H,Spear GT.Mannose bbinding lectin (MBL) and HIV 2005 42 145-152.
[7] Souza, P. R. E.; Arraes, Lc; Bruneska, D; Castelo Filho, A; de Souza Cavada, B; Lima Filho, Jl; Crovella, S. A cost-effective melting temperature assay for the detection of single-nucleotide polimorphism in MBL-2 gene of HIV-1-infected children. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2006 v. 39, p. 719-723.
[19] Liu,. F; Liao. Q; Liu. Z. Mannose-binding lectin and vulvovaginal candidiasis. Gynecology & Obstetrics. 2006; 92: 43-47,
[20] Pellis V; Seta F; Crovella S; Bulla R; Guaschino S; Radillo O, Gerred P; Tedesco F. Mannose binding lectin and C3 act as recognition molecules for infectious agents in the vagina. Clinical and Experimental Immunology. 2005; 139: 120-126.
[22] Babula, O; Lazdane G; Kroice, J; Ledge W; Witkin, S. S. Ralation between Recorrent Vulvovaginal Candidiasis, Vaginal Concentration of Mannose-Binding Lectin, and a Manonose-Binding Lection Gene Polymorphism in Lactvian Women. Brief Report. 2003; 73: 733-737.
[23] Poulain, D; Jouault, T. Candida albicans cell wall glycans, host receptors and responses: elements for a decisive crosstalk. Current Opinion in Microbiology 2004 (7): 342-349.
55
CAPÍTULO II
56
ARTIGO Á SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO Journal of Clinical Microbiology
CAPÍTULO II: Análise do Polimorfismo de um único Nucleotídeo (SNP) do gene da β Defensina-1 em pacientes com Onicomicoses causadas por Candida
sp
57
Análise do Polimorfismo de um único Nucleotídeo (SNP) do gene da β Defensina-1 em pacientes com onicomicoses causadas por
Candida spp
b, fFurtado, V. C. ; Araújo, V. P. a b, f; Souza, P. R. ; Marsdem. A.L. a; Sette. R. c; Lucas, C. A. b; Lins, C.I. M. a, b; Guimarães, L. R. b ; Lima-Filho, J. L. b; Crovella, S. b, d, h & Porto, A. L. F. b, g
a Departamento de Micologia Medica, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); b Laboratório Imunopatologia Keizo Asami-LIKA/ UFPE; c Laboratório Medicina Diagnostica-NKB, Recife, PE; d Departamento de Genético- Universidade Federal de Pernambuco UFPE; f Universidade de Pernambuco-UPE; g. Departamento de Morfologia e fisiologia Animal-Universidade Federal Rural de
Pernambuco- UFRPE; h. Departament of Developmental and Reproductive Sciences, Department University of
Onicomicose:estudo clínico , epidemiológico e micológico no municípiode São
José do Rio Preto Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical-
2007;40(5):596-598.
16. Linzmeier R, Gannz T. Human defensin gene copy number polymorphisms:
Comprehensive anly sis of independent variation in α and β-defensin regions at
8 p22-p-23, Genomics. 2005; 86: 423-430.
17. Dork, T; Stuhrmann. Polimorfisms of the human β-defensin -1 gene. Molecular
and Cellular Probes. 1998;12, 171-173,
18. Schofield DA, Westwater C,Balish E,Divergent chemokine, cytokine and β
defensin responses to gastric candidiasis in immunocompetent C57BL/6 and
BALB/c mice. Journal of Medical Microbiology.2005; 54:87-92.
19. Feng Z,Jiang B,Candra J, Ghannoum M, Nelson S, Weinberg A.Human Beta –
defensins:Differential Activity against Candidal Species and Regulation by
Candida albicans. Research Reports.2005; 84(5):445-450.
67
CONCLUSÃO
• Nos pacientes selecionadas com diagnóstico de onicomicose causada por
Candida sp. houve uma predominância de C. parapisilosis (50%), C. tropicalis
(34%). Enquanto, a C. albicans foi de apenas 6 %. Esse resultado mostra uma
predominância de espécies de Candida não albicans em relação à C. albicans.
Isto pode ser devido ao fato dos pacientes selecionados não apresentarem
doenças primárias que levem a imunosupressão.
• A análise do polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) do gene da MBL2
mostrou diferença significativa tanto alélica como genotípica entre os pacientes
estudados e o grupo controle saudável, sugerindo que a presença de um alelo
mutante 0 pode contribuir com a susceptibilidade a onicomicose causada por
Candida sp.
• O estudo do polimorfismo gênico da β-defensina-1, nos pacientes acometidos
por onicomicose causada por Candida sp., mostrou diferença significativa entre
os pacientes com onicomicose e o grupo controle em relação à expressão
genotípica e alélica entre os dos grupos. Evidenciando que presença de um alelo
mutante G pode agir favorecendo a onicomicose causada por Candida sp.
• O estudo do polimorfismo do gene da MBL2 e β-defensina-1 contribui para uma
análise do comportamento da imunidade inata frente a pacientes com
onicomicose causada por Candida sp. o que mostra a importância desses dois
componentes do sistema imune inato na defesa ou controle da infecção.
• Salientamos que se faz necessário mais estudos para um melhor esclarecimento
da participação da MBL2 e β-defensina-1 na onicomicose causada por Candida.
Pois não existe nenhum outro relato dessa associação na literatura.
68
ANEXO I
69
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Brief Communications should be limited to 2500 words, with an abstract of 150 words maximum and up to 30 references. Review articles should be no more than 5000 words (excluding references, tables and figures), with an abstract of 200 words maximum and up to 80 references. Reports of Meetings or Workshops, Editorials, and Reviews. A letter of inquiry should be sent to the Editor, prior to the submission of these materials. Preparation of Articles The manuscript should include the following sections: Title Page, Abstract (not more than 200 words), Keywords (up to 5), Abbreviations (list of abbreviations used), Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements, References, Tables, Figure Legends, and Figures. The title page should include the names and affiliations of the authors, the complete address, e-mail address, and telephone and facsimile numbers of the corresponding author, five keywords, and an abbreviated title of not more than 45 characters and spaces. Footnotes in the text should be defined on the page on which they appear and be numbered consecutively with superscript Arabic numerals. References. Identify references in the text by Arabic numerals in brackets, and number consecutively in the References section in the order they are first mentioned. References should follow the standard "Vancouver" style. List all authors, but if the number exceeds six, give only the first six followed by et al. Examples: Journal. Leen MPJM, Gorski J. Differential expression of isomorphic HLA-DR genes is not a sole function of transcription. Hum Immunol 1996;50:111-15. Book. Peter JB, Shoenfeld Y. Autoantibodies. Amsterdam: Elsevier; 1996. Chapter in a book. Bendtzen K, Hansen MB, Ross C, Svenson M. Cytokine autoantibodies. In: Peter JB, Shoenfeld Y, editors. Autoantibodies. Amsterdam: Elsevier; 1996. Tables. Each table should be typed double-spaced on a separate page, and numbered with Arabic numerals in the order of reference in the text. Use only horizontal rules. Table titles should be informative, with detailed information appearing as footnotes and identified in the table by superscript letters. Figures. Authors should consult the Elsevier website for guidelines for preparing (electronic) artwork: http://authors.elsevier.com/artwork. N.B. With web submission, only the following formats are acceptable: TIFF, PDF and EPS. Please keep in mind that in the journal illustrations will appear either across a single column (=8.3 cm) or a whole page (=17.6 cm). The illustrations
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