-
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
Síntese e caracterização de compostos de Ru3+ com ligantes:
Glicina
e Guanina e avaliação do efeito antitumoral
Marcio Adriano Sousa Chagas
Mestrado em Química, Área de Concentração Química
Inorgânica.
CUIABÁ
MATO GROSSO - BRASIL
2015
-
I
MARCIO ADRIANO SOUSA CHAGAS
Síntese e caracterização de compostos de Ru3+ com ligantes:
Glicina
e Guanina e avaliação do efeito antitumoral
CUIABÁ
MATO GROSSO - BRASIL
2015
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato
Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre em
Química, Área de Concentração Química Inorgânica
-
II
-
III
MARCIO ADRIANO SOUSA CHAGAS
Síntese e caracterização de compostos de Ru3+ com ligantes:
Glicina
e Guanina e avaliação do efeito antitumoral
APROVADO: 27 de fevereiro de 2015
Prof. Dr. Adriano Buzutti de Siqueira
Prof. Dr. Hugo Delleon da Silva
Prof. Dr. Wagner Batista dos Santos
(Orientador)
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato
Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre
em Química, Área de Concentração Química Inorgânica
-
V
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que
o
melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a
Deus, não
sou o que era antes”. (Martin Luther King)
-
VI
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Cláudio e Adriana, e minha irmã Ana Beatriz, por
todo
apoio durante minha vida acadêmica, e que sempre garantiram o
meu
crescimento pessoal e intelectual, e estiveram sempre ao meu
lado em todos
os momentos, o meu muito obrigado.
A minha companheira Marla T. Kopp, por me acompanhar durante
todo
meu mestrado enfrentando todas as dificuldades sem medir
esforços.
Agradeço a Deus por estar presente em minha vida.
-
VII
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por sempre estar comigo,
sempre
direcionando-me no caminho certo e nunca me deixar enfraquecer
diante às
adversidades.
Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para
realização
deste trabalho, e em especial meu orientador e amigo Prof. Dr.
Wagner
Batista dos Santos pelo exemplo de pesquisador a ser seguido, e
que
sempre esteve disposto a contribuir com o meu crescimento,
fornecendo além
do conhecimento científico, estrutura física com equipamentos e
reagentes
para a realização deste trabalho. Obrigado por estar sempre
presente e por
acreditar em mim.
Ao Prof. Dr. Adriano Buzutti de Siqueira por sempre colaborar
com este
trabalho disponibilizando seu tempo auxiliando em análises e
sugestões que
me ajudaram na conclusão deste trabalho. Além dos momentos de
lazer nas
recreações da AABB onde mostramos todo nosso brilhante futebol.
Que Deus
abençoe o Sr. e sua família.
À Prof.ª Drª. Elisângela de Paula Silveira Lacerda, ao Prof. Dr.
Hugo
Delleon e todo pessoal do LGMC em Goiânia/GO pela utilização
do
laboratório, equipamentos e reagentes, pelo apoio e boa vontade
na
realização das análises biológicas.
Aos Professores de Cuiabá, Dr. Evandro Luiz e Dr. Ailton José
por
disponibilizar os laboratórios para realizar análises
fundamentais para
concluir meu trabalho, aos amigos Carlos Parizzoto por auxiliar
nas análises
de RMN e Cipriano Gozzo por auxiliar nas análises de DRX.
-
VIII
Aos amigos de Cuiabá: Allan, Ghieska, Dudu, Milene, Prof. Léo,
Letícia,
Jaque, Nati, Thiago, Everton, Douglas, Marilene, Tânia, Karol,
Igor,
Elson, Marciano e Jonas, pelo tempo que estivemos juntos nas
disciplinas
e almoços.
Aos amigos de Barra do Garças: Fabrício, Baiano, Nilton, e em
especial
meu amigo José Augusto que desde a graduação compartilha
bons
momentos dentro e fora da Universidade.
A todos vocês o meu sincero obrigado.
-
IX
LISTA DE SÍMBOLOS
RNA – Ácido Ribonucleico
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
Gly – Glicina
Gua – Guanina
UV-Vis – Ultravioleta e visível
FTIRmed – Infravermelho médio com transformada de Fourier
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
TG/DTG – Termogravimetria com derivada da curva
termogravimétrica
DTA – Análise térmica diferencial
DRX – Difratometria de Raios X
MLCT – Transição de carga do metal para o ligante
LMCT – Transição de carga do ligante para o metal
máx – Cumprimento de onda com absorção máxima
- Absortividade molar
Calcd – Valor teórico calculado
-
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Difratograma do composto RuCl3 x 3H2O
.................................. 14
Figura 2 Representação estrutural 3D do Cristal de RuCl3 (ICSD
Coll.
Code: 414040)
.......................................................................................................
15
Figura 3 Diagrama de síntese de complexos de Rutênio.
...................... 16
Figura 4 Estrutura do complexo a) [RuCl(NH3)5]Cl2 b)
cis[RuCl2(NH3)4]Cl
c) fac[RuCl3(NH3)3].
ChemSketch™.................................................................
18
Figura 5 Estrutura complexo
cis-[(diaminodicloro)platina(II)].
ChemSketch™
......................................................................................................
20
Figura 6 Estrutura geral zwitterion dos aminoácidos. ChemSketch™
21
Figura 7 Diagrama de estruturas planas da glicina de acordo com
seu
pH em solução aquosa. a) pK1 b) Ponto isoelétrico c) pK2.
ChemSketch™
.................................................................................................................................
21
Figura 8 Estruturas das bases nitrogenadas Púricas e Pirimídicas
.... 24
Figura 9 [Ru(NH3)5(GUA)]3+ a) Coordenado através do sítio N7
b)
coordenado através do sítio N9
.......................................................................
25
Figura 10 a) Curvas TG/DTG do complexo b) Curva TG – DTA do
complexo. Complexo: [RuCl3(H2O)2Gly].
....................................................... 33
Figura 11 Espectro UV-VIS do complexo [RuCl3(H2O)2(Gly)], 2 x
10-4 mol
L-1 (290 nm 1686L cm-1 mol-1)
.........................................................................
34
Figura 12 Espectro UV-VIS do composto glicina 2 x 10-4 mol L-1
(194 nm
=13 129 L cm-1 mol-1)
........................................................................................
35
Figura 13 Espectro UV-VIS do composto (RuCl3 x 3H2O) 2 x 10-4
mol L-
1 em 325 nm (2542,5 L cm-1 mol-1) e em 415 nm (1990 L cm-1
mol-1)
.................................................................................................................................
36
Figura 14 Sobreposição UV-VIS de [RuCl3(H2O)2(Gly)],
(NH3+CH2COO-)
e (RuCl3 x 3H2O)
...................................................................................................
37
Figura 15 Espectro de FTIRmed do complexo [RuCl3(H2O)2(Gly)]
.......... 39
-
XI
Figura 16 Sobreposição dos espectros FTIRmed dos compostos e
[RuCl3(H2O)2Gly] e glicina
.................................................................................
40
Figura 18 Representação estrutural plana do complexo
[RuCl3(H2O)2Gly]. ChemSketch™
....................................................................
43
Figura 19 Espectro de RMN 13C do [RuCl3(H2O)2Gly], em D2O
.............. 44
Figura 20 Espectro de RMN 1H do [RuCl3(H2O)2Gly], em D2O
................ 45
Figura 21 Espectro UV-VIS do complexo [RuCl3(H2O)2(Gly)] + GUA
em
solução aquosa.
..................................................................................................
46
Figura 22 Figura 23 Espectro UV-VIS sobreposição do complexo
[RuCl3(H2O)2Gly] + Guanina e Guanina.
......................................................... 47
Figura 24 Estrutura plana do composto Guanina
..................................... 49
Figura 26 a) Difratograma do complexo [RuCl3(H2O)2Gly]. b)
Difratograma do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] + GUA.
................................. 53
Figura 27 Viabilidade celular em células S-180 em concentrações
0,2 -
200 μmol L-1 do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] em 48 horas de
incubação
(DP = 25,92 e E% = 3,00%).
................................................................................
54
Figura 28 Viabilidade celular em concentrações 0,2 - 200 μmol
L-1 do
complexo [RuCl3(H2O)2Gly] em 48 horas de incubação (DP= 0,54 e
E%=
3%). a) Ehrlich b) D17
.........................................................................................
55
Figura 29 Viabilidade celular em células L-929 em concentrações
0,2 -
200 μmol L-1 do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] em 48 horas de
incubação.
(DP= 0,37 e E%= 3,00%)
.....................................................................................
56
-
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 UV-VIS experimental dos grupos avaliados nas análises
.... 38
Tabela 2 FTIRmed experimental e dos grupos identificados nas
análises.
....................................................................................................................
41
Tabela 3 UV-VIS experimental dos grupos avaliados nas análises.
... 47
Tabela 4 Valores experimentais dos grupos identificados nas
análises.
....................................................................................................................
49
Tabela 5 FTIRmed experimental dos grupos identificados nas
análises e
variação entre os grupos específicos.
.................................................... 51
-
XIII
RESUMO
CHAGAS, Marcio Adriano Sousa, M. S., Universidade Federal de
Mato
Grosso, Dezembro de 2014. Síntese e caracterização de compostos
de
Ru3+ com ligantes: Glicina e Guanina e avaliação da
atividade
antitumoral. Orientador: Wagner Batista dos Santos.
Desde a década de 1970 é utilizado complexos metálicos, como
a
cisplatina®, nos tratamentos quimioterápicos, porém até hoje
ainda há falta
de conhecimento no mecanismo de ação dos complexos metálicos
biologicamente ativos que são usados na medicina tradicional
ou
farmacêutica. Compostos de rutênio nos estados de oxidação Ru2+
e Ru3+
estão sendo estudados, onde observa-se bons resultados
referentes a baixa
citotoxidade em células normais e atividade citotóxica eficiente
em células
tumorais. O presente trabalho apresenta a rota de síntese,
caracterização e
avaliação em ensaios citotóxicos de novos compostos de Ru3+
contendo os
ligantes NH2CH2COO-, C5H5N5O, H2O e Cl-, visando diminuir a
citotoxidade
em células normais e aumentar a citotoxidade em células
tumorais
apresentada nos tratamentos quimioterápicos utilizados
atualmente. O
composto foi e caracterizado por espectroscopia eletrônica na
região do UV-
VIS, observando max em 290 nm, e por espectroscopia na região
do
infravermelho médio com transformada de Fourier (FTIRmed), com
bandas
vibracionais características do ligante glicina em a(COO-) 1664
cm-1, s(COO-
) 1388 cm-1, s(NH3+) 1571 cm-1, s(CCN) 889 cm-, na qual a
glicina está em
estado de ziwtterion e coordenada de forma monodentada pelo
sítio de
ligação (COO-). Os espectros de RMN 13C e 1H indicaram os
deslocamentos
químicos referentes ao ligante glicina para os grupos COO- em (c
172,6), CH2
em (c 41,69 e δH 3,45 ppm), e em NH2 (H 4,64 – 4,71 ppm).
Técnicas
termoanalítcas TG/DTG e TG-DTA foram empregadas para avaliação
crítica
das curvas indicando, a decomposição térmica em 4 etapas
consecutivas,
-
XIV
sendo que a 115°C, ocorreu a desidratação térmica
(TG=12,18%;
Calcd=11,32%), e a 665º C formou-se o resíduo RuClO (TG=
41,11%;
Calcd=40,81%), o que confirma a estequiometria do composto
Bis-aquo-
tricloro-glicinrutenio III [RuCl3(H2O)2Gly]. Foi realizado a
síntese do complexo
[RuCl3(H2O)2Gly] com a guanina (C5H5N5O), base nitrogenada
presente no
DNA, onde foi observado interação do complexo através de
espectroscopia
UV-VIS com max em 244 e 272 nm diferenciando do espectro do
complexo
de partida. Através da espectroscopia FTIRmed foi observado a
interação da
guanina com o complexo através das variações entre as vibrações
simétricas
δs(N7-N9) 1435 cm-1 e assimétricas δas(N7-N9) 1260 cm-1 de seu
grupo
imidazólico. Para avaliar as características cristalinas, a
análise de DRX foi
realizada indicando característica cristalina dos compostos
sintetizados. Foi
realizado ensaios de redução do MTT para avaliar a atividade
citotóxica do
complexo [RuCl3(H2O)2Gly] em linhagens de células S-180,
Ehrlich, D-17 e
normal L929, onde observou-se que a atividade citotóxica é baixa
em relação
as células tumorais e normais.
-
XV
ABSTRACT
CHAGAS, Marcio Adriano Sousa, M. D., FEDERAL UNIVERSITY OF
MATO
GROSSO, 2015, February. Synthesis and characterization of
Ru3+
compounds with ligand: Glycine, guanine, and evaluation of
antitumor
activity. Adviser: Wagner Batista dos Santos.
Since the 1970s is used metal complexes, such as cisplatin™
in
chemotherapy treatments, but even today there still a lack of
knowledge on
the mechanism of action of biologically active metal complexes
that are used
in traditional medicine or pharmaceutical. Ruthenium compounds
in the
oxidation states Ru2+ and Ru3+ are under investigation where
good results
have been regarding the low cytotoxicity on normal cells and
efficient cytotoxic
activity in tumor cells. This work presents the synthesis,
characterization and
application in an anti-tumor bioassay of a new Ru3+ compound
containing
NH2CH2COO-, C5H5N5O, H2O e Cl- in order to reduce the
cytotoxicity of
currently used drugs. The compound was synthesized and
characterized by
UV-VIS spectroscopy, with peaks at 290 nm and absorption
spectroscopy by
Fourier transform infrared medium spectroscopy (FTIRmed),
demonstrating
vibrational bands characteristic of the binders: a(COO-)1664
cm-1, s(COO-)
1388 cm-1, s(NH3+) 1571 cm-1, s(CCN) 889 cm-. The 13C and 1H NMR
spectra
showed the chemical shifts regarding glycine ligand groups to
COOH (δc
172,6), CH2 (δc 41,69 e δH 3,45 ppm), and NH2 (δH 4,64 – 4,71
ppm). The
complex was studied by thermoanalytical techniques (TG/DTG and
TG-DTA),
and a critical evaluation of the curves indicated that thermal
decomposition
occurred in four steps: thermal dehydration occurred at 115°C
(TG=12.18%;
Calcd=11.32%) and 665ºC. The residue was composed of RuClO
(TG=
41.11%; Calcd=40.81%), confirming the stoichiometry of the
compound Bis-
aquo-trichlorine-glycinerutheniumIII [RuCl3(H2O)2Gly]. We
performed the
synthesis of the complex [RuCl3(H2O)2Gly] with guanine
(C5H5N5O), DNA
-
XVI
base, where the complex interaction was observed by UV-VIS
spectroscopy
peaks at 244 and 272 nm differentiating the starting complex
spectrum.
Through of FTIRmed spectroscopy was observed guanine interaction
with the
complex by variations between the symmetric vibration δs(N7-N9)
1435 cm-1
and asymmetric δas(N7-N9) 1260 cm-1 its imidazole group. To
evaluate the
characteristics of the crystal, XRD analysis was performed
indicating the
crystalline character of the compound. Antitumor assay was
performed to
evaluate the activity of the complex [RuCl3(H2O)2Gly] in tumor
cell linesS-180,
Ehrlich, D-17 and normal L929 where it was observed that the low
cytotoxic
activity towards tumor cells and normal.
-
XVII
SUMÁRIO
1. Introdução
..........................................................................................
7
2. Objetivos
.............................................................................................
9
2.1 Objetivo Geral
..............................................................................
9
2.2 Objetivos Específicos
...................................................................
9
3. Revisão da
Literatura.......................................................................
10
3.1 Histórico do Rutênio
...................................................................
10
3.2 Aspectos químicos do Rutênio
................................................... 10
3.4 Aspectos Específicos do Ru2+ Ru3+
............................................ 13
3.5 Compostos de coordenação aplicados na medicina
.................. 18
3.6 Ligantes aminoácidos e bases nitrogenadas
............................. 20
4. Materiais e Métodos
.........................................................................
27
4.1 Síntese do complexo [RuCl3(H2O)2Gly]
...................................... 27
4.1.1 Materiais
............................................................................
27
4.1.2 Síntese
..............................................................................
27
4.2 Síntese do Complexo [RuCl3(H2O)2Gly] + (Gua)
........................ 27
4.2.1 Materiais
.................................................................................
27
4.2.2 Síntese
....................................................................................
27
4.3 Instrumentação
..........................................................................
28
4.4 Ensaio de viabilidade celular pelo método do MTT
.................... 29
5. Resultados e Discussões
................................................................
32
5.1 [RuCl3(H2O)2Gly].
.......................................................................
32
-
XVIII
5.1.1 Técnicas termoanalíticas Curvas TG/DTG e TG - DTA .....
32
5.1.2 Espectroscopia eletrônica UV-VIS
.......................................... 34
5.1.3 Espectroscopia FTIRmed
.......................................................... 38
5.1.4 Espectroscopia RMN 13C e 1H
................................................ 43
5.2 [RuCl3(H2O)2Gly] + Gua
.............................................................
45
5.2.1 Espectroscopia eletrônica UV-VIS
.......................................... 45
5.2.2 Espectroscopia FTIRmed
.......................................................... 48
5.3 Análise DRX
...............................................................................
51
5.4 Ensaios biológicos
.....................................................................
54
6. Conclusão
.........................................................................................
58
7. Referências Bibliográficas
..............................................................
59
-
7
1. Introdução
Relatos apontam que, desde o século XVI já se fazia o uso de
metais ou
compostos contendo metais de transição na terapêutica. Em 1969,
a
atividade antitumoral do complexo metálico inorgânico
cisplatina® foi
descoberta1 e possibilitou o desenvolvimento de outros tipos de
drogas
antitumorais, como os complexos metálicos orgânicos e/ou
inorgânicos de
platina2, rutênio3 e ródio4.
Os compostos inorgânicos derivados de metais de transição
mais
estudados como agentes antitumorais são os compostos de platina
e rutênio
destacando-se os compostos de Ru nos estados de oxidação Ru2+ e
Ru3+
com ligantes aminas5, N-heterocíclicos6,3, arenos7 e
alquilsufóxidos8, exibem
além da atividade antitumoral atividades antimetastáticas.
Estudos realizados por Gallori9 et. al. sugeriram que os
compostos de
rutênio podem se ligar a molécula do DNA, indicando que esta
interação é a
responsável pela alteração do ciclo celular, provocando a morte
celular por
mecanismos como apoptose. Os complexos de rutênio interagem
com
proteínas específicas tais como albumina e glutationa. Isso pode
ser
observado na utilização do rutênio vermelho, utilizados
tradicionalmente
como corante citológico para microscopia eletrônica. Nesse
processo a
ligação ocorre nos sítios aniônicos de proteínas ligantes de
cálcio10,11.
Vários estudos sugerem que Complexos de Ru2+ e Ru3+ com ligantes
amina
tendem a ligar seletivamente a sítios imino e carbonilicos de
biomoléculas,
que não protonam em pH neutro, portanto, deixam os pares de
elétrons do
átomo de nitrogênio disponíveis para ligação coordenada com íons
metálicos.
Consequentemente, complexos de rutênio frequentemente se ligam
a
nitrogênio e carbono imidazólico de proteínas e nucleotídeos
purínicos12,13.
Complexos metálicos formados entre proteínas e grupos tiólicos
são
-
8
possíveis, mas frequentemente instáveis14. Santos et. Al.,
investigaram a
atividade antitumoral do composto cis-[RuCl2(NH3)4]Cl em quanto
a sua
atividade antitumoral in vitro sobre duas linhagens de células
tumorais
humanas (Jurkat e SK_BR-3) e de camundongo (A-20 e Sarcoma
S-180),
obtendo-se resultados promissores para o tratamento do
câncer15.
Estudos experimentais e teóricos tem comprovado a interação
dos
complexos de Ru2+/3+ com nucleotídeos purínicos do DNA
provocando a
apoptose celular. Estas interações decorrem dos sítios de
ligação dos
ligantes ou coordenadas diretamente ao metal através da guanina
constituída
no DNA das células16,11.
As sínteses realizadas utilizando complexos de Ru3+ na presença
da
guanina tem apresentado resultados que comprovam a interação
destes com
o DNA17. Uma vez estabelecida à metodologia para aplicação dos
compostos
na verificação das atividades antitumorais, novos estudos foram
realizados e
permitiram analisar, de forma prática, o potencial de novos
compostos
sintéticos na atividade antitumoral e, ao mesmo tempo,
proporcionaram um
melhor direcionamento para o desenvolvimento de novas rotas de
síntese e
purificação de substâncias efetivas à atividade biológica.
Pensando em
preservar a ação antitumoral do rutênio e na diminuição de sua
atividade
citotóxica em células normais, o presente estudo relata o
desenvolvimento da
rota de síntese de complexos de RU3+ com ligante glicina, e
caracterização
através de análise UV-Vis, FTIRmed, RMN 13C e 1H, TG/DTG,
TG-DTA, DRX.
O ensaio de viabilidade celular pelo método de redução do MTT
foi realizado
com células normais L929 e células tumorais sarcoma S180,
Ehrlich e D-17.
A síntese e caracterização do complexo inicialmente sintetizado
com glicina,
coordenado à guanina foi realizada para estudar o possível sítio
de interação
entre o complexo com uma das bases que compõem a estrutura do
DNA da
célula.
-
9
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Obter novos compostos de Ru3+ com ligantes mono e bidentados e
avaliar
atividade citotóxica destes, frente a linhagens celulares normal
L929 e
tumorais S180, Ehrlich e D-17. Foram utilizados, ligantes
nitrogenados, mono
e/ou bidentados e ligantes carboxilato, provenientes do
aminoácido essencial
glicina e base nitrogenada guanina.
2.2 Objetivos Específicos
Sintetizar compostos de Ru3+ utilizando ligantes como aminoácido
glicina
(NH3CH2COO-); e a base nitrogenadas guanina (C5H5N5O).
Otimizar os processos de purificação dos compostos
sintetizados.
Determinar as propriedades estruturais e espectroscópicas na
região do
UV-Visível; FTIRmed, RMN 13C e 1H e por Difratometria de raios X
pelo método
do pó.
Realizar a caracterização de estrutura por meio de análise
térmica TG/DTG
e TG-DTA.
Avaliar o efeito e citotóxico dos compostos sintetizados.
-
10
3. Revisão da Literatura
3.1 Histórico do Rutênio
A história do rutênio tem início em 1804, quarenta anos antes da
sua
descoberta, quando Fourcrov e Vauquelin18, observaram que uma
solução de
cor azulada era formada quando soluções de metais conhecidos do
grupo da
platina eram tratadas com zinco, atribuindo-se incorretamente o
resultado
desta solução a presença de irídio.
Em uma série de artigos na “Annalen der Physikund Chemie”, foi
anunciado
a descoberta dos metais: “Pluran”, “Ruthen” e “Polin”. Porém
Osann retirou
seus artigos após Berzelius não descobrir algo novo sobre as
amostras,
alegando que as mesmas eram misturas de óxidos de Si, Ti, Zr, Fe
e Ir. Em
meados de 1840, Carl E. Claus realizou analises nas partes
minerais
insolúveis tratadas com água régia e isolou um novo metal, o
qual chamou
de “Rutheniun” por conta dos primeiros trabalhos realizados por
Osann e em
homenagem a Rússia, que em latim medieval chama-se
“Ruthenia”.
Novamente Berzelius analisou o novo composto e aceitou como um
novo
elemento publicando inicialmente no “Memory of the Imperial
University of
Kazan” em 1844, e no “Bulletin de l’Academie Impériale dês
Sciences de St.
Pestersbourg” no ano seguinte. Houve um desentendimento entre
Claus e
Osann que o primeiro alegou que o novo elemento na realidade
foi
descoberto por ele e não por Osann, iniciando assim uma batalha
de Claus
para provar que foi ele quem descobriu o novo elemento. Com
vários estudos
sobre a investigação da química do Rutênio Claus relatou as
características
do elemento no livro “Neuebeitrage Zur Chemie der Platinmetalle”
em 186318.
3.2 Aspectos químicos do Rutênio
As condições isotópicas do rutênio encontradas são:
96Ru(5,58%),
98Ru(2,22%), 99Ru(12,81%), 100Ru(16,98%), 102Ru(31,34%) e
104Ru(18,97%).
-
11
O estado de valência mais estável do rutênio é o trivalente,
sendo o estado
+2/+3 bastante utilizado na síntese de complexos de rutênio.
O RuO4 é reduzido a uma mistura de cloro-complexos de Ru2+/3+
através do
ataque ácido com solução concentrada de HCl, onde o produto
é
comercializado como RuCl3 . nH2O, sendo esta substância a mais
utilizada
atualmente para síntese destes compostos.
O rutênio, elemento do grupo da platina, possui características
marcantes,
sendo obtido a partir de tetróxidos do metal através da oxidação
com agentes
oxidantes em água. O óxido RuO4 de cor amarelada, funde a 25°C,
sendo
formado a partir da oxidação de soluções ácidas de rutênio por
MnO4, Cl2 ou
HClO4 a quente. Podem ser destilados das soluções, ou arrastados
por
corrente de ar. O RuO4 é bastante reativo e ataca violentamente
a matéria
orgânica, portanto é altamente tóxico19.
3.3 Conceitos em Química de Coordenação
Os compostos de coordenação primeiramente foram classificados
como
ácido e base de Lewis por atuarem como receptores (íons
metálicos centrais)
e doadores (ligantes) de pares eletrônicos20, porém várias
substâncias não
se adequavam a este conceito. Sendo assim, ácidos e bases de
Lewis podem
ser considerados simplesmente receptores e doadores de elétrons,
tornando
a classificação mais ampla21,22.
De acordo com a complexidade nos compostos de coordenação,
Pearson23
propôs duas categorias de ácido e base para especificar a
natureza da
ligação entre os íons metálicos e ligantes. Definindo-se
que:
1. As substâncias que apresentam grande afinidade pelo próton
e
possui pequena polaridade são consideradas bases duras;
-
12
2. Bases moles são substâncias que apresentam
características
opostas, isto é, apresentam pequena afinidade por prótons e
grande polaridade;
3. Os íons metálicos que possuem grandes afinidades com
ligantes duros (bases duras) são considerados ácidos duros;
4. Íons metálicos que tem afinidade com ligantes moles
(bases
moles) são considerados ácidos moles.
É importante salientar que esta classificação leva em
consideração a
densidade de cargas existentes, e que fatores, tais como: a
configuração
eletrônica, estado de oxidação, tipo de ligante e o solvente
também devem
ser levados em conta.
As principais características das estruturas geométricas dos
complexos
metálicos foram identificadas por Alfred Werner (1866-1919),
onde em 1893
lançou um importante trabalho sobre a química de coordenação na
“Beitrag
zur Konstitution anorganiscer Verbindungen”, Werner reportou os
conceitos
de átomo central, número de coordenação e do que chama-se hoje
de
valências primaria e secundária. Antecipa ainda os atuais
conceitos de
ligação iônica e covalente, além de propor a existência de um
arranjo
octaédrico para átomos com número de coordenação 6 e quadrado
planar
para complexos de platina com número de coordenação 424.
Mais
especificamente as teorias de Werner podem ser resumidas nos
seguintes
postulados:
a) A maioria dos elementos possui a mesma valência primária,
relacionada ao estado de oxidação e uma valência secundária,
relacionada ao número de coordenação;
b) Todos os elementos tendem a satisfazer tanto as valências
primárias quanto as secundárias;
-
13
c) As valências secundárias estão dirigidas para posições fixas
no
espaço.
Para estabelecer estes postulados Werner supunha que em
compostos de
coordenação existia um centro metálico e em volta moléculas
ligadas ao
metal, tal que possam suprir as valências primarias e
secundárias do
complexo.
3.4 Aspectos Específicos dos íons Ru2+ Ru3+
Eletronicamente, os estados 2+ e 3+ do rutênio são de spin baixo
e
apresentam algumas propriedades diferentes. O Ru3+, (d5),
apresenta
configuração eletrônica (t2g)5, é um ácido duro, bastante inerte
em relação à
troca de ligantes, sendo quimicamente semelhante ao Co+3, que é
(t2g)6. Esta
deficiência eletrônica do Ru3+, torna-o um receptor de elétrons
π, em
contraste com o Co3+, e deste modo, o Ru3+ tende a ser
estabilizado por
ligantes que atuem como bases duras, ou seja, com ligantes
muito
eletronegativos ocorrendo através de interações eletrostáticas
ou por meio
de interações covalentes (ligações covalentes coordenadas) com
ligantes
que atuem como doadores eletrônicos n sentido → . Esta interação
leva a
um abaixamento na carga formal do íon metálico central, causando
sua
estabilização. Em um estado de oxidação mais baixo, o Ru2+,
isoelétrico com
Rh3+, Ir3+ e Co3+, tem configuração (t2g)6, o que faz com que as
características
duras do Ru2+ sejam substituídas por outras essencialmente
moles. Então,
íons do Ru2+ tendem a ser estabilizados por ligantes tipicamente
moles23.
Porém, neste caso, o mecanismo é bastante diverso. A preferência
do Ru2+
por ligantes insaturados foi explicada por Nyholm e Tobe25. Eles
procuraram
justificar essa preferência argumentando que a formação de
ligações
covalentes com os átomos doadores dos ligantes, conduziria a um
excesso
de carga negativa sobre o metal, diminuindo sua estabilidade, a
não ser que
esse excesso pudesse ser removido através de interações de
retrodoação
-
14
por meio dos orbitais de simetria . Entre os ligantes
insaturados que
aparecem em complexos de Ru2+, merecem destaque os ligantes
aromáticos
heterocíclicos nitrogenados do tipo piridina, que têm orbitais ,
de baixa
energia e simetria adequada para a retrodoação.
Os compostos de Ru2+ são inertes. Esta inércia é explicada pela
teoria do
campo cristalino26, sendo decorrente da configuração eletrônica
(t2g) e dos
valores elevados do parâmetro 10 Dq.
Em termos de estabilidade, os compostos de Ru2+ apresentam
estabilidade
3 vezes superior à esperada para os elementos da primeira série
de
transição. Comumente são diamagnéticos, dependendo do
ligante,
hexacoordenados e relativamente inertes frente às reações de
substituição.
O RuCl3, utilizado como precursor de várias sínteses para obter
complexos
de rutênio possui suas características cristalinas apresentadas
na figura 1 e
2, onde pode-se observar os sinais de difração específicos do
RuCl3 . 3H2O
e o seu empacotamento cristalino 27.
Figura 1 Difratograma do composto RuCl3 x 3H2O
-
15
Figura 2 Representação estrutural 3D do Cristal de RuCl3 (ICSD
Coll. Code: 414040)
Há uma grande série de reações químicas do rutênio com
ligantes
nitrogenados, onde pode-se ilustrar na figura 3:
-
16
R u C l 3 ( a q ) [ R u ( N H 3 ) 5 ( N 2 ) ] 2 + [ R u ( N H 3
) 5 ( H 2 O ) ]
2 + N 2 H 4 H 2 O
N 2
[ R u ( N H 3 ) 6 ] 2 +
[ R u ( N H 3 ) 6 ] 3 + [ R u C l ( N H 3 ) 5
+
o x i d a ç ã o a o a r
C l 2
[ R u ( N H 3 ) 5 ( L ) ] 2 +
L = l i g a n t e s p i r i d í n i c o s
Z n N H 4 O H e b u l i ç ã o N H 4 O H
N H 4 C l C l 2 , 2 5 0 C
[ R u ( N H 3 ) 5 ( H 2 O ) ] 3 +
N H 4 O H
Z n , A r g ô n i o
[RuCl(NH3)5]2+
Figura 3 Diagrama de síntese de complexos de Rutênio.
O grupo [Ru(NH3)5Cl]3+ apresenta uma reatividade considerável,
formando
complexos com CO, RCN, N2O, SO2 e outros. Em 1965, foi isolado,
sob
condições ambientes, um composto contendo o íon complexo
[Ru(NH3)5(N2)]2+, que foi o primeiro composto estável contendo
nitrogênio
molecular como ligante 28,29. Neste caso, isso foi possível
justamente devido
à retrodoação “backdonation” do rutênio2+, para o nitrogênio. Os
estudos das
aminas de rutênio foram intensificados no final da década de
1960 30. Durante
a década de 1980, Franco et. al.,31 fizeram estudos com aminas
de rutênio
na forma cis e trans de rutênio, assinalando as diferenças entre
esses dois
isômeros, observadas através bandas de transferência de carga
(MLCT).
Atualmente, vários outros estudos envolvendo a rota sintética,
baseadas em
reações [Ru(NH3)4Cl]Cl2 com azinas ortossubstituídas e
investigação das
propriedades tais como condutância, propriedades eletroquímicas
e
Ressonância Magnética Nuclear (RMN), tem sido feitas32.
-
17
Síntese, caracterização e determinação de propriedades têm sido
feitas
usando o ligante NO33, em complexos de “trans-aminas” de rutênio
(trans-
[Ru(NH3)4(H2O)(NO)]Cl3.H2O), comparando-se as suas propriedades
com o
complexo isoeletrônico trans-[Ru(NH3)(H2O)(CO)]Cl3.H2O.
Allen e Senoff 29 estudaram os espectros eletrônicos de absorção
na região
do UV-VIS dos complexos [Ru(NH3)6]X2, [Ru(NH3)6]X3, [Ru(NH3)5X
]X e
[Ru(NH3)5X]X2 onde X = Cl-, Br-, I-, BF4-, no estado sólido
fazendo atribuições
das bandas observadas na região eletromagnética em 485 – 425 nm
para
complexos de Ru3+, não observadas para complexos de Ru2+. A
descrição da
síntese do cloreto de cis e trans diclorotetraaminarutênio III,
foram reportaram
ressaltando a importância destes dois compostos como percussores
de
inúmeras sínteses 34. Complexos de rutênio têm sido muito
estudados como
uma nova perspectiva de agentes anticancerígenos. Estes
compostos
possuem atividade anticancerígena superior ao do cisplatina, com
menor
toxicidade às células normais e com maior seletividade para
células
cancerigenas3. Complexos de rutênio, possuem a capacidade de
sofrerem
hidrólise e portanto de se ligar no DNA. Além do mais, alguns
compostos de
rutênio são também eficientes em reações de intercalação à
molécula de
DNA 35. Devido às características químicas dos íons Ru2+/3+
como, a
labilidade de alguns ligantes, a estabilidade dos compostos e a
semelhança
química com o íon Fe2+, tornam o rutênio promissor na síntese de
novos
fármacos antitumorais. A semelhança do rutênio com o ferro
evidencia um
mecanismo de ação similar ao de transporte de metais de
transição não
tóxicos como o íon ferroso, ligando-se a biomoléculas, o que faz
com que
este tenha uma menor toxicidade 36. Compostos de Ru3+ podem
ligar-se à
transferrina, albumina ou outras moléculas que o transportam
tendo alvo o
DNA das células 37. Aminas de Rutênio sintetizadas por Clarke38,
figura 4,
atuam como agentes antitumorais e podem ser transportados para o
interior
da célula por biomoléculas específicas39.
-
18
Figura 4 Estrutura do complexo a) [RuCl(NH3)5]Cl2 b)
cis[RuCl2(NH3)4]Cl c)
fac[RuCl3(NH3)3]. ChemSketch™
Esses compostos apresentam forte afinidade pelo anel imidazólico
da
histidina ligada à biomoléculas como a transferrina, o que
provavelmente
pode facilitar sua entrada na célula3. Primeiramente, o composto
é
transportado para dentro da célula através da transferrina e ao
chegar à
célula, este é reduzido à Ru2+ por moléculas redutoras, como
glutationa ou
ascorbato, que estão em maior concentração, para só então sofrer
hidrólise
e se ligar ao DNA ou alguma outra biomolécula. 40,41.
Compostos contendo N, S e O como bases “duros” ou “moles”, têm
um
importante papel na atividade biológica como anticâncer e
antiviral 42,43. Os
aminoácidos podem se coordenar aos metais de transição como
ligantes
monodentados, onde há coordenação ao metal através de somente um
sítio
de ligação, bidentados, através de dois sítios de ligação, tri e
tetradentados,
sendo que ligações com características bidentadas são mais
comuns44,45
3.5 Compostos de coordenação aplicados na medicina
Vários elementos inorgânicos possuem papel crucial em sistemas
vivos46.
Estes apresentam afinidades por moléculas indispensáveis para
a
sobrevivência, como oxigênio, (O2) óxido nítrico, (NO) e outros.
Por exemplo,
o transporte de elétrons e de oxigênio no meio biológico é
feito,
-
19
respectivamente, pelos citocromos e hemoglobina47. Muitos metais
são
fundamentais no sistema biológico, uma vez que estes se ligam e
interagem
com biomoléculas48. O cobre tem, dentre suas principais funções,
a
mobilização do ferro para a síntese da hemoglobina, a síntese do
hormônio
da adrenalina e a formação dos tecidos conjuntivos. O zinco
participa da
síntese proteica, metabolismo de DNA e RNA, carboidratos,
lipídios e assim
vários metais de alguma forma tem sua importância no meio
biológico. Há
5000 anos, os egípcios usavam cobre para esterilizar a água. O
ouro também
era usado para a fabricação de medicamentos, tanto na Arábia
quanto na
China, há mais de 3500 anos. Porém, somente nos últimos 100 anos
é que
as propriedades dos compostos inorgânicos começaram a ser
estudadas de
forma racional. A esse respeito, podemos citar o emprego de
compostos de
ouro no tratamento da tuberculose; dos antimoniais para o
tratamento de
leishmaniose49 e de compostos à base de arsênio para o
tratamento da
sífilis47. A química dos fármacos inorgânicos teve impulso após
os trabalhos
de Paul Ehrlich, prêmio Nobel em Medicina e Fisiologia de 1908.
Paul Ehrlich
é considerado o fundador da quimioterapia. Ele introduziu a
relação estrutura
e atividade de compostos inorgânicos pela primeira vez e usou o
arsênio para
preparar drogas para o tratamento de sífilis50. Após estudos
realizados pelo
Físico Barnett Rosenberg, a respeito das propriedades de
inibição de divisão
celular de bactérias por compostos de platina, que a química
medicinal
ganhou maior notoriedade. Rosenberg testou vários compostos de
platina,
sendo que o cis-[(diaminodicloro)platina(II)], figura 5,
tornou-se fármaco no
tratamento de vários tipos de câncer, incluindo o de testículo,
ovários e
outros1.
-
20
Figura 5 Estrutura complexo cis-[(diaminodicloro)platina(II)].
ChemSketch™
Após o uso da cisplatina como droga no tratamento do câncer de
testículo,
foi registrado em 1978 uma diminuição de cerca de 80% na morte
de homens
com este tipo de câncer51. Após a descoberta da propriedade
medicinal dos
compostos de platina, outros compostos inorgânicos começaram a
aparecer
como potenciais fármacos no combate a várias doenças. Por
exemplo,
podemos citar os compostos de bismuto (citrato de bismuto),
utilizado no
tratamento para os distúrbios gástricos, juntamente com outras
drogas
orgânicas52.
3.6 Ligantes aminoácidos e bases nitrogenadas
Um aminoácido é uma molécula orgânica que contém um grupo
amina
e um grupo carboxila, e uma cadeia lateral que é específica para
cada
aminoácido53. São moléculas anfóteras, ou seja, podem se
comportar como
ácido ou como base em meio aquoso aumentando a concentração de
H3O+
ou OH- em uma solução54, como representado na figura 6.
-
21
Figura 6 Estrutura geral zwitterion dos aminoácidos.
ChemSketch™
Eles se diferem apenas no grupo R ligado ao carbono α. São vinte
os
aminoácidos naturais, monômeros construtivos das proteínas,
indispensáveis
para o metabolismo de um grande número de funções biológicas nos
seres
vivos55. Estes aminoácidos realizam um grande número de
transformações
químicas para outras biomoléculas, como parte de sua síntese e
degradação
celular normal. Muitos aminoácidos são sintetizados, para
atender
importantes funções biológicas como, por exemplo, a de
neurotransmissor. A
glicina, é o aminoácido mais simples e que também tem várias
funções no
organismo humano. Em solução aquosa a glicina apresenta seu pK1
em pH
2,34; pk2 em pH 9,60 e sua forma de ziwtterion em pH 5,7,
como
apresentados na figura 7.
Figura 7 Diagrama de estruturas planas da glicina de acordo com
seu pH em solução aquosa. a) pK1 b) Ponto isoelétrico c) pK2.
ChemSketch™
-
22
Este aminoácido mostra-se útil no tratamento do mal
funcionamento da
glândula pituitária, e é também fundamental para a formação dos
músculos.
Os nutricionistas usam a glicina no tratamento da hipoglicemia,
pois este
estimula a liberação do glucagon (hormônio envolvido no
metabolismo de
carboidratos) que, por sua vez, mobiliza o glicogênio, liberando
a glicose no
sangue56.
Por conta das características dos α e β aminoácidos, estes estão
sendo
estudados para formação de complexos com os metais Ru2+ e Ru+3
.
Compostos de coordenação com outros metais de transição como,
Pt2+ 57,
Zn2+ 58 e Cu2+ 59, ligados à aminoácidos e bases nitrogenadas
estão sendo
sintetizados e caracterizados ampliando a utilização de íons
metálicos em
sistemas biológicos. Complexos formados com aminoácido
possuem
características físico químicas que beneficiam o tratamento de
células
tumorais, pois possuem solubilidade em água, na temperatura e no
valor de
pH biológicos60; além de, se liberados no organismo, não
apresentarem riscos
ao sistema que possui eficientes mecanismos de degradação.
Ensaios
biológicos com compostos de rutênio e ligantes aminoácido
apresentam
citotoxidade frente as linhagens celulares S-18061, Erlich62 e
L92962, com
valores significativos de IC50, portanto pode-se atribuir a
efetividade em
relação aos outros ligantes não aminoácidos. Compostos de
rutênio com
ligante glicina apresentam no espectro de absorção na região do
UV-VIS
absorção máxima em 290 nm que indica a interação LMCT entre o
oxigênio
do grupo carboxílico e o íon metálico. É possível também
observar bandas
de transição internas do ligante glicina próximos a 230 nm63,64.
Tem-se
observado que em analises de espectroscopia na região do
infravermelho
médio que os complexos de rutênio com ligante glicina possuem
as
frequências referente ao estiramento assimétrico do grupo
(COO-)
aumentando em relação ao ligante glicina livre e o estiramento
simétrico do
mesmo grupo tendem a diminuir em relação ao ligante glicina
livre65. Como a
-
23
glicina pode apresentar estrutura de zwitterion, quando na forma
não
ionizada, seu grupo (COO-) apresenta banda de vibração próximo a
1710 cm-
1 e quando está em sua forma ionizada, apresenta vibrações
próximo a região
de 1610 cm-1. Em complexos, quando o grupo carboxilato da
glicina coordena
ao metal de forma monodentada, a diferença entre o número de
onda
referente a banda de estiramento assimétrico e simétrico (aCOO-1
-
sCOO-) é maior do que observado para compostos ligados de
forma
bidentada ao metal.
O RMN de 13C do aminoácido glicina livre é identificado para
grupo COO- o
deslocamento químico em 175 ppm em solvente D2O e em estado
sólido o
deslocamento químico para este grupo é identificado em 176,20
ppm. No
sinal referente ao grupo –CH2 é 43,50 ppm em estado sólido, e em
solvente
D2O este mesmo grupo apresenta deslocamento químico em 43,40
ppm. A
glicina por possuir uma cadeia pequena e com vários sítios de
ligação, seu
grupo –CH2 torna-se mais vulnerável ao efeito do campo
magnético66,67.
O deslocamento químico do grupo –CH2 do aminoácido glicina livre
no
espectro de RMN 1H é observado em 3,80 ppm68. Para o grupo NH2
da
glicina, por conta da ressonância entre o par de elétrons não
ligante do
nitrogênio consequentemente sem liberdade para girar, os dois
sinais de
hidrogênios ligados ao nitrogênio não são equivalentes, e quanto
maior for o
momento de quadrupolo do nitrogênio, os hidrogênios terão um
alargamento
de sinal e a redução da intensidade69. No espectro de RMN 1H de
grupos
carboxílicos –COOH em aminoácidos apresentam deslocamentos
químico
entre 11,00 ppm e 12,00 ppm69.
O ácido desoxirribonucleico (DNA) responsável pelo armazenamento
do
código genético, é responsável também pela transmissão de
informações
genéticas o que garante a construção celular de sistemas
biológicos. A
estrutura da molécula do DNA foi descoberta por Watson e
Crick70, onde é
-
24
considerado um polímero orgânico de nucleotídeos constituído por
açúcar,
grupo fosfato (PO4-3) e bases nitrogenadas, representadas na
figura 8. O
código genético está baseado em interações intermoleculares
entre as bases
pirimídicas (Timina, Uracila, e Citosina) e púricas (Adenina e
Guanina)71. É a
partir das ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas
que o código
genético é decifrado70.
Figura 8 Estruturas das bases nitrogenadas Púricas e
Pirimídicas
As bases púricas são compostos heterocíclicos e possuem um
anel
pirimidínico e anel imidazólico; baixa solubilidade em água em
pH neutro
porém em soluções aquosas com pH elevado aumentam sua
solubilidade
Cada base nitrogenada do DNA faz ligação com outras bases
nitrogenadas
específicas. A guanina faz ligações de hidrogênio com a citosina
e a adenina
faz ligações de hidrogênio com a timina72.
A interação de cátions metálicos ou complexos metálicos com o
DNA é
extremamente importante nas funções estruturais, regulatórias
das
expressões gênicas e reações catalíticas do DNA73. Eichhorn e
Shin74
-
25
mostraram que a afinidade dos metais catiônicos pelo grupo
fosfato do DNA
obedece à sequência Mg2+ > Co2+ > Ni2+ > Mn2+ > Zn2+
> Cd2+ > Cu2+
(sequência de Irving-Willians). No entanto, alguns compostos
de
coordenação, dentre eles o Ru2+/3+, tem preferência em se ligar
em regiões
específicas de bases nitrogenadas. Os possíveis sítios de
ligação são entre
os pares de bases intercalados em diferentes nucleotídeos75.
Estudos
experimentais e teóricos comprovaram que a interação dos
complexos de
Ru2+/3+ com nucleotídeos purínicos do DNA da célula provoca a
apoptose
celular. Estas interações ocorrem nos sítios de ligação dos
ligantes ou
coordenadas diretamente ao metal através da guanina constituída
no DNA
das células, como reportado na figura 9 76,11.
Figura 9 [Ru(NH3)5(GUA)]3+ a) Coordenado através do sítio N7 b)
coordenado
através do sítio N9
Sundberg77 e outros reportaram espectros eletrônicos na região
do UV-VIS
de aminas de rutênio com ligantes imidazólico, onde é
identificado picos de
-
26
absorção máxima na região de 255 nm, 299 nm e 311 nm. Estes
resultados
são semelhantes aos observados em aminas de rutênio com ligante
guanina,
onde é observado bandas de absorção máxima na região de 320 nm
atribuída
a bandas de transferência de carga entre o do grupo purínico da
guanina ao
metal Ru3+, em 335 nm é atribuído a transferência de carga do
metal para o
ligante, além de banda de transferência de carga centrada no
metal Ru3+ na
região de 570 nm. Na década de 1960, Angell78 reportou uma
investigação
espectroscópica na região do infravermelho dos constituintes de
ácidos
nucleicos. Pode-se destacar neste estudo o espectro da guanina,
onde duas
bandas intensas, em 1701 e 1681 cm-1 referente ao estiramento
simétrico do
grupo (C=O) e vibrações de deformação do grupo (NH2)
respectivamente.
Também é indicado os picos em 1567 e 1555 cm-1 referente a
deformação
angular simétrica do grupo (NH2) da guanina. Bandas de
intensidade
considerável no espectro da guanina em 1477 e 1375 cm-1 indicam
vibrações
simétricas e assimétricas do seu anel imidazol, e na região de
785 e 775 cm-
1 referente a vibrações do grupo (C-H) do anel imidazol fora do
plano.
Compostos de rutênio contendo guanina como ligante, pode
apresentar uma
variação do pico referente ao grupo (NH2) da guanina livre, em
1670 cm-1,
indicando que este grupo está protonado ou ligado ao metal.
Outros grupos
da guanina podem ser avaliados para indicar os possíveis sítios
de ligação
ao metal, como os picos referentes ao grupo (N7-H) em 2680 cm-1
e (N9-H)
em 1024 cm-1, do anel imidazol da guanina, onde quando ocorre
o
desaparecimento de um desses picos indicam um possível sítio
de
coordenação.
-
27
4. Materiais e Métodos
4.1 Síntese do complexo de Ru3+ com glicina
4.1.1 Materiais
Para a síntese do complexo foram utilizado os compostos de
padrão
analítico, sendo eles: RuCl3.3H2O, glicina (NH2CH2COOH)
Sigma-Aldrich
Brasil Ltda. Foram utilizados como solventes água destilada,
éter etílico
(C4H10O) e álcool absoluto (C2H6O).
4.1.2 Síntese
300,0 mg (1,14 mmol) de RuCl3.3H2O foram solubilizados em 9,0 mL
de
água destilada, em seguida 1000 mg (13,32 mmol) de glicina
foram
adicionados à mistura sob agitação constante, protegidos da luz.
Após a
solubilização deixou-se a solução sob refluxo à 40 °C durante 4
horas. A
solução foi mantida a 7 °C por 24 horas para a precipitação. Os
precipitados
obtidos foram filtrados, lavados com etanol, éter e seco em
pressão reduzida.
A solução mãe foi novamente resfriada para obter maior
rendimento do
precipitado. O sólido foi lavado com etanol, éter e seco sob
pressão reduzida.
Rendimento 33,58 %.
4.2 Síntese do Complexo de Ru3+ com guanina
4.2.1 Materiais
Para a síntese do complexo foram utilizado o complexo
sintetizado
[RuCl3(H2O)2Gly], Guanina (C5H5N5O) 98% de pureza e solução NaOH
0,10
mol.l-1. Foram utilizados como solventes água destilada, éter
etílico (C4H10O)
e álcool absoluto (C2H6O).
4.2.2 Síntese
Solução aquosa de Guanina 0,08 mol L-1 em NaOH 0,10 mol L-1; a
solução
foi aquecida (50 °C) por 10 minutos. Foi adicionado na solução
de guanina
-
28
preparada 0,0300g (0,095 mmol) do complexo [RuCl3(H2O)2Gly]. A
solução
foi mantida sob aquecimento (50 °C) e agitação constante durante
4 horas. A
solução foi mantida sob ambiente resfriado por 24 horas para a
precipitação.
Os precipitados obtidos foram filtrados, lavados com etanol,
éter e seco em
pressão reduzida. A solução mãe foi novamente resfriada para
obter maior
rendimento do precipitado. O sólido foi lavado com etanol, éter
e seco sob
pressão reduzida.
4.3 Instrumentação
Para as análises de espectroscopia UV-VIS e FTIRmed foram
utilizados os
equipamentos da empresa Perkin Elmer®, modelos Lambda 25 UV VIS
e
Spectrum-100 com sistema de ATR. Para as análises de UV-VIS foi
utilizado
2 mL das soluções a 1 . 10-4 mol L-1, utilizando faixa de
varredura nos
cumprimentos de onda (200-700 nm). Para as análises de FTIRmed
foi
utilizado quantidade necessária para completar o porta amostra
de sólido
previamente pulverizado, e prensado em suporte de ATR,
utilizando faixa de
varredura nos números de onda (4000-600 cm-1).
Para as análises de TG/DTG e TG -DTA foi utilizado o equipamento
SDT
2960 da TA Instruments®. Para as análises de TG/DTG e TG - DTA
foi
utilizado 6,6204 mg do complexo em cadinho de α-alumina de 90
µL, a
amostra foi aquecida até 800 ºC com razão de aquecimento de 20ºC
min-1
sob atmosfera de ar seco com fluxo de 100 mL min-1.
Os experimentos de RMN 1H e 13C foram feitos em um aparelho
VARIAN®,
modelo MERCURY 300 de 300MHz e as amostras foram processadas
e
software VNMRJ. Nos experimentos de RMN 1H foi utilizado
frequência de
300 MHz e para análise de 13C 75MHz, sendo que todas as amostras
foram
preparadas em soluções saturadas de solvente D2O (água
deuterada), até
atingir o volume aproximado de 750mL.
Para as análises de difração de raios X, foi utilizado o
aparelho D8 Advance
da Bruker®. As análises de DRX foram preparadas com a amostra
sólida em
-
29
pó sendo distribuída em porta amostra uniformemente, em
temperatura
ambiente 25°C/298K, com emissão de raio X com placa de Cu e
filtro de Kα,
tempo passo de 0,1 segundos, número de passos 0,001, com ângulos
2θ
entre 5° a 80°, 40 KV e 40 mA de corrente.
A caracterização dos novos compostos sintetizados foram
realizadas no
Laboratório de Estudos de Materiais (LEMAT), sob a
responsabilidade do
Prof. Dr. Wagner B. dos Santos, da Universidade Federal de Mato
Grosso
Campus Araguaia; Laboratório de Caracterização de Novos
Materiais, sob a
responsabilidade do Prof. Dr. Ailton José. Terezo na
Universidade Federal de
Mato Grosso Campus Cuiabá.
4.4 Ensaio de viabilidade celular pelo método do MTT
Para os ensaios biológicos foram utilizadas a linhagem tumoral
de
camundongo S-180 (Sarcoma murino ATCC® # TIB-66), tumor ascítico
de
Ehrlich e D-17 (Osteossarcoma Canino ATCC® # TIB-66). Como
célula
normal, foi utilizada a linhagem estabelecida de fibroblasto de
pulmão murino
L-929 (Fibroblasto de mama murino ATCC® # CCL-1T). As linhagens
S-180
e Ehrlich foram mantidas em cultura a 37 °C, 5% de CO2 em meio
Roswell
Park Memorial Institute (RPMI 1640) e as linhagens D-17 e L929
em meio
Dulbecco’s Modified Eagle Médium (DMEM - Alta Glicose 1X)
(SIGMA-
ALDRICH CO. LLC., St. Louis, Missouri, USA), suplementado com
10% de
soro bovino fetal (SFB) (GIBCO®, INVITROGEN, Carlsbad,
California, USA),
100 U mL-1 de penicilina, 100 µg mL-1 de estreptomicina e 0,25
µg mL-1
Anfotericina B. (SIGMA-ALDRICH Co. LLC., St. Louis, Missouri,
USA)
segundo protocolo estabelecido pela American Type Culture
Collection
(ATCC, Rockville, Maryland, USA). Para a realização dos
ensaios,
previamente a linhagem aderente em fase de crescimento
logarítmico foi
removida dos frascos de cultura celular pela adição de 1 mL de
tripsina 0,5%
em solução tampão Fosfato 0,01 mol L-1, pH 7,2 em solução salina
0,9%. Em
-
30
seguida, foram adicionados meio cultura completo para
neutralizar a tripsina
e transferidos para tubo Falcon para realizar a quantificação
celular.
Para avaliar a atividade citotóxica do complexo
[RuCl3(H2O)2Gly], foi
utilizado o método colorimétrico do MTT
(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-
Brometo de Difenil Tetrazol)79. O princípio deste método
descrito por
Mosman79 consiste em medir indiretamente a viabilidade celular
pela
atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Para o
teste do MTT,
1.105 células S-180, 2,5.103; 1,0.106 de células Ehrlich e
células de D-17; e
1.104 células L-929, foram semeadas em microplacas de 96 poços
na
ausência ou presença do complexo de rutênio solubilizado em
tampão fosfato
salino com concentrações (0,2; 2,0; 20,0; 50,0; 100,0 e 200
µmol.L-1). Após
tratamento, as células foram incubadas no período de 48 horas,
em estufa a
37°C com atmosfera contendo 5% de CO2. Ao final do período de
incubação,
o meio de cultura é descartado e aos poços adicionado 40 μL de
solução
tampão fosfato-salino seguido da adição de 10 μL de MTT
(concentração de
5 mg mL-1). A placa é incubada em estufa CO2 a 37 °C por 3h e em
seguida
é adicionado 50 μL do detergente Dodecil sulfato de sódio (SDS)
a 10%
diluído em HCL 0,01N. Após 24h é realizada a leitura da
densidade óptica
(DO) em espectrofotômetro (Awareness Technology INE/ Stat Fax
2100).
A porcentagem de viabilidade celular foi determinada a partir da
seguinte
fórmula:
% Viabilidade =Absorbância do tratamento
Absorbância do controle negativo ∗ 100
Os valores de IC50 (concentração em µmol.L-1 que inibe 50% da
viabilidade
celular) foram determinados pela curva dose resposta utilizando
o programa
estatístico GraphPadPrism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA,
USA).
-
31
A análises de viabilidade celular e citotoxidade dos compostos
foram
realizadas no Laboratório de Genética Molecular e Citogenética
(LGMC) da
Universidade Federal de Goiás no Instituto de Ciências
Biológicas em Goiânia
sob a responsabilidade da Profa. Dra. Elisângela Silveira
Lacerda.
-
32
5. Resultados e Discussões
5.1 [RuCl3(H2O)2Gly].
5.1.1 Técnicas termoanalíticas Curvas TG/DTG e TG - DTA
As curvas TG/DTG e TG - DTA apresentadas na figura 10, mostram
a
decomposição térmica do complexo em 5 etapas consecutiva
-
33
Figura 10 a) Curvas TG/DTG do complexo b) Curva TG – DTA do
complexo. Complexo: [RuCl3(H2O)2Gly].
A primeira etapa indica a saída de H2O (TG=12,18%; Calcd=11,32%)
com
pico endotérmico em 115 ºC. Em compostos de aquaminorutênio
complexados com glicina apresentam a perda de água na região de
126 à
129ºC que pode ser considerado próximo ao observado na
análise
realizada83. A variação de saída de água nos complexos de
rutênio é devido
aos diferentes ligantes que diminuem ou aumentam a estabilidade
térmica do
complexo. As etapas seguintes indicam a decomposição térmica até
665 ºC
e formação do resíduo RuClO (TG= 41,11%; Calcd=40,81%). As
últimas três
etapas são caracterizadas por picos exotérmicos em 230 ºC, 307
ºC, 440 ºC
e 563 ºC devido à decomposição oxidativa da glicina.
A partir da caracterização térmica e de testes qualitativos com
a observação
da saída de água, em tubo de ensaio, e a observação da possível
formação
-
34
do resíduo de RuClO, confirmada pelos cálculos de perda de massa
na curva
TG, pode ser sugerido a estequiometria do complexo
[RuCl3(H2O)2Gly].
Devido as etapas de decomposição térmica terem ocorrido em
etapas
consecutivas sem formação de patamar, e sem identificação dos
gases
liberados durante a análise, não foi possível sugerir o
mecanismo de
decomposição térmica do composto.
5.1.2 Espectroscopia eletrônica UV-VIS
A figura 11, mostra o espectro UV-Vis do composto sintetizado em
água
destilada onde se pode observar a presença de máx em 290 nm (=
1685 L
cm-1 mol-1).
Figura 11 Espectro UV-VIS do complexo [RuCl3(H2O)2(Gly)], 2 x
10-4 mol L-1 (290
nm 1686L cm-1 mol-1)
-
35
Na figura 12, mostra o espectro UV-VIS do ligante glicina na em
forma de
zwitterion (pH=6,62), onde pode-se observar a presença de máx em
194 nm
(13129 L cm-1 mol-1) que é característica de transições internas
entre seus
orbitais -*.
Figura 12 Espectro UV-VIS do composto glicina 2 x 10-4 mol L-1
(194 nm =13 129 L cm-1 mol-1)
A figura 13, mostra o espectro UV-VIS do composto RuCl3 x 3H2O,
onde
pode-se observar a presença de máx em 325 nm (2542,5 L cm-1
mol-1) e
em 415 nm (1990 L cm-1 mol-1).
-
36
Figura 13 Espectro UV-VIS do composto (RuCl3 x 3H2O) 2 x 10-4
mol L-1 em 325
nm (2542,5 L cm-1 mol-1) e em 415 nm (1990 L cm-1 mol-1)
A figura 14 apresenta a sobreposição dos espectros UV-VIS dos
compostos
de partida para a síntese (NH3+CH2COO-) e RuCl3 x 3H2O) e o
complexo
sintetizado para observar as mudanças que influenciam na
formação do
produto.
-
37
Figura 14 Sobreposição UV-VIS de [RuCl3(H2O)2(Gly)],
(NH3+CH2COO-) e (RuCl3
x 3H2O)
Na tabela 1 pode-se comparar as bandas observadas que evidenciam
a
coordenação entre o ligante e o metal. Compostos de
rutênio-glicina
apresentam absorção na região de 290 nm onde indica a interação
LMCT
entre o oxigênio do grupo carboxílico e o íon metálico63,64. É
possível também
observar o aparecimento de bandas referentes a transições
internas do
ligante que possuem interações -* principalmente por volta de
230 nm, que
é evidenciado em meio neutro.
-
38
Tabela 1 UV-VIS experimental dos grupos avaliados nas
análises
Bandas atribuídas (nm)
Sistema Composto λ1 λ2
Livre(aq) (NH3+CH2COO-) 194 -
Livre(aq) (RuCl3 x 3H2O) 325 415
Complexo(aq) [Ru(Cl)2(H2O)2Gly] 230 290
5.1.3 Espectroscopia FTIRmed
O espectro de absorção na região do infravermelho médio foi
utilizado para
caracterizar os ligantes coordenados ao metal segundo a energia
de suas
vibrações. Na figura 15 é representado o espectro FTIRmed do
complexo
[RuCl3(H2O)2Gly].
-
39
Figura 15 Espectro de FTIRmed do complexo [RuCl3(H2O)2(Gly)]
Na figura 16 é representado a sobreposição dos espectros FTIRmed
dos
compostos glicina e [RuCl3(H2O)2Gly] onde foi possível comparar
as bandas
de vibrações.
-
40
Figura 16 Sobreposição dos espectros FTIRmed dos compostos e
[RuCl3(H2O)2Gly] e glicina
Na tabela 2 são mostra os valores identificados aos grupos
vibracionais e
seus respectivos números de onda, onde é comparado os
espectros
vibracionais experimentais da glicina livre e do complexo de
Ru3+.
-
41
Tabela 2 FTIRmed experimental e dos grupos identificados nas
análises.
Glicina Complexo Bandas atribuídas cm-1
3166 3093 s (N-H)
3118 - 2875 3035-2823 a (N-H) +sh (C-H)
2930 2869 (CH2)
2120 2167 sc(CH2)
1603 1664 a(COO-)
1408 1388 s(COO-)
1584 1571 (NH3+)
1525 1490 s(NH3+)
1436 1441 (CH2)
1332 1334-1322 w (CH2)
1130-1110 1155-1110 r(NH3+)
1030 1043 (C-N)(C-C)
910 927 r (CH2)
892 889 (CCN)
694 684 w (COO-)
603 607 (COO-)
a: Estiramento Assimétrico / s: Estiramento Simétrico / sh:
Estiramento do tipo
sholder / a Dobramento assimétrico / s: Dobramento simétrico /
w: Deformação
do tipo “wagging” / r: Deformação do tipo “rocking”
Com os valores analisados no espectro de FTIRmed, é possível
indicar que
o ligante glicina, por apresentar vibrações referentes ao íon
carboxilato
(COO-), na região de 1664 cm-1, indica que este grupo está na
forma ionizada.
Foi avaliado os resultados referentes aos estiramentos
simétricos (s(COO-))
e assimétricos (a(COO-)) do íon carboxilato (COO-) da glicina
livre e as do
complexo, para indicar a forma em que o íon está complexado.
Tem-se
observado que os complexos com o ligante glicina, que
possuem
-
42
características bidentadas diminuem, significativamente a
distância entre as
vibrações simétricas e assimétricas do grupo carboxilato (aCOO-
- s COO-
) e o oposto ocorre em compostos monodentados80,81. Como houve
o
aumento no número de onda do simétrico e assimétrico (aCOO- - s
COO-
), representados na figura 17, é possível indicar ligação
monodentada entre
o grupo COO- da glicina e o metal Ru3+ (M-O).
Figura 17 Variação do grupo (aCOO- - s COO
-), do composto Glicina e do complexo [RuCl3(H2O)2Gly]
É possível identificar os picos referentes aos dobramentos do
grupo (NH3+)
em, d(NH3+) 1571 cm-1 e s(NH3+) 1490 cm-1 onde indica o estado
de
ziwtterion da glicina no complexo, com o seu grupo amina
protonado, e
descarta a possibilidade de ligação entre o metal e este grupo
(M-N). O
deslocamento observado no estiramento simétrico do grupo C-N,
do
complexo comparado ao ligante glicina livre, é observado que não
há
variação significativa, (νs(CCN)gly 892 cm-1 – νs(CCN)complexo
889 cm-). As
vibrações referentes a dobramentos e torções do grupo (CH2) da
glicina no
-
43
complexo comparada a glicina livre, sofre poucas variações na
região de
(CH2) 1436 cm-1 e w(CH2) 1334 – 1322 cm-1. Em regiões
específicas, (CH2)
2869 cm-1 e sc(CH2) 2167 cm-1, é possível observar variações
consideráveis
em relação ao ligante livre, que podem ser atribuídas a
interações
intermoleculares entre a região do grupo (NH3+) e (COO-).
Pode-se sugerir
então a seguinte estrutura para o complexo [RuCl3(H2O)2Gly],
representada
na figura 18.
Figura 18 Representação estrutural plana do complexo
[RuCl3(H2O)2Gly]. ChemSketch™
.
5.1.4 Espectroscopia RMN 13C e 1H
Utilizando a caracterização por RMN de 1H e 13C pode-se
caracterizar a
estrutura do composto [RuCl3(H2O)2Gly] de acordo com os
sinais
característicos de seus prótons de carbono e hidrogênio
presentes.
No espectro de RMN 13C, foi observado dois sinais mais intenso
em 172,60
ppm e 41,69 ppm, representados na figura 19.
-
44
Figura 19 Espectro de RMN 13C do [RuCl3(H2O)2Gly], em D2O
O sinal em 172,60 ppm pode ser atribuído ao deslocamento química
do
grupo –COO-. O deslocamento químico referente ao grupo ligante
–COO- do
complexo sintetizado é diferente do sinal referente ao ligante
na forma livre
pois ao se coordenar com o metal por este grupo analisado, o seu
núcleo de
13C fica mais desprotegido e acaba sentindo mais o efeito do
campo
magnético, e desta forma indo para deslocamentos em campo mais
baixos69.
No espectro RMN 13C do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] o sinal
referente ao
grupo –CH2 do ligante glicina está em 41,69 ppm. A glicina por
possuir uma
cadeia pequena e com dois sítios de ligação proposto, seu grupo
–CH2 torna-
se mais vulnerável ao efeito do campo magnético. Este mesmo
efeito é
evidenciado no composto62 [Ru(Gly)(dppb)(bipy)]PF6.
No espectro de RMN 1H do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] foi
observado
apenas três sinais representados na figura 20, onde o sinal em
3,45 ppm pode
ser atribuído aos hidrogênios equivalentes no grupo –CH2 do
ligante glicina.
Um estudo mais afundo pode explicar a diminuição do deslocamento
químico
deste próton, pois possivelmente com estrutura proposta pelo
espectro de
FTIR, o grupo –CH2 do ligante glicina estaria desblindado, por
isso o
abaixamento do seu deslocamento químico.
-
45
Figura 20 Espectro de RMN 1H do [RuCl3(H2O)2Gly], em D2O
Em relação aos hidrogênios do grupo –NH3+ da glicina no
complexo
[RuCl3(H2O)2Gly] pode-se atribuir os deslocamentos químicos em
4,71 ppm
e 4,64 ppm, onde por conta das características deste grupo em
aminoácidos,
seus hidrogênios tornam-se não equivalentes.
Em espectros de RMN 1H, água de constituição em compostos de
coordenação geralmente possuem deslocamento químico entre 1,50 e
1,60
ppm76, porém não é possível observar este sinal no espectro RMN
1H do
complexo [RuCl3(H2O)2Gly] pois houve a troca do hidrogênio da
água por
deutério do solvente utilizado: [RuCl3(H2O)2Gly] + D2O →
[RuCl3(D2O)2Gly].
No entanto é possível identificar H2O no espectro FTIRmed.
5.2 [RuCl3(H2O)2Gly] + Gua
5.2.1 Espectroscopia eletrônica UV-VIS
Os espectros eletrônicos na região do UV-VIS do composto
[RuCl3(H2O)2Gly] + Gua é apresentado na figura 21, e a
sobreposição da
guanina livre e do complexo, é apresentado na figura 22.
-
46
Figura 21 Espectro UV-VIS do complexo [RuCl3(H2O)2(Gly)] + GUA
em solução aquosa.
-
47
.
Figura 22 Figura 23 Espectro UV-VIS sobreposição do complexo
[RuCl3(H2O)2Gly] + Guanina e Guanina.
O espectro UV-VIS do composto guanina foi avaliado em solução
0,1 mol.L-
1 NaOH onde pode-se observar 3 bandas referentes a transições
internas
características de bases purínicas82.
Tabela 3 UV-VIS experimental dos grupos avaliados nas
análises.
Bandas atribuídas
(nm)
Sistema Composto λ1 λ2 λ3
Livre Guanina 215 248 273
Complexo [Ru(Cl)2(H2O)2Gly]Cl + Gua 244 272 -
-
48
O espectro UV-VIS do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] + Guanina
sintetizado foi
obtido em solução aquosa, onde pode-se observar 2 bandas de
absorção em
λ1 e λ2 indicam uma possível sobreposição de bandas de transição
interna do
ligante guanina e transição de carga do ligante para o metal
(LMCT) do ligante
glicina para o íon Ru3+.
5.2.2 Espectroscopia FTIRmed
A sobreposição do espectros FTIRmed do complexo [RuCl3(H2O)2Gly]
+
Guanina e da Guanina estão representados na figura 23, onde foi
possível
observar suas interações vibracionais.
Figura 23 Sobreposição dos espectros de FTIRmed dos compostos:
(C5H5N5) e [RuCl3(H2O)2(Gly)] + Guanina.
Os valores atribuídos na região do infravermelho da base
nitrogenada
guanina na forma livre, representada na figura 24, e do complexo
estão
apresentados na tabela 4.
-
49
Figura 24 Estrutura plana do composto Guanina
Tabela 4 Valores experimentais dos grupos identificados nas
análises.
RuCl3(H2O)2(Gly) + Gua Guanina Bandas atribuídas cm-1
1672 1671 (NH2) + (N1-H)
1698 1693 s(C=O)
1119 1118 a(NH2)
1565-1551 1563-1550
s(NH2)
778 777 (CCN)
1435 1474 δs (N7 - N9)IMD
1260 1371 δa (N7 - N9)IMD
1069 1045 (N9-H)
- 2690 (N7-H)
865 876 out(C-H)IMD
a: Estiramento Assimétrico / s: Estiramento Simétrico / a
Dobramento
assimétrico / s: Dobramento simétrico / out: Dobramento fora do
plano
A base nitrogenada guanina na forma livre apresenta banda
intensa em
1693 cm-1 atribuído aos(C=O), e em 1563-1550 cm-1 pode-se
atribuir a
banda intensa (NH2)79. Apesar de alguns deslocamentos de banda e
a
diminuição de intensidade esperada, o complexo sintetizado
apresenta
bandas na região de 1698 cm-1 e 1565-1551 cm-1 que podem ser
atribuídas
ao estiramento s(C=O) e dobramento (NH2) respectivamente,
atribuído ao
-
50
ligante guanina presente no complexo. Em relação a presença do
grupo
(C=O) também no ligante glicina, pede-se identificar uma
sobreposição entre
as bandas 1560 e 1600 cm-1 referentes a vibrações assimétricas
do grupo
(C=O) do ligante glicina. A variação entre as bandas referentes
ao
dobramento simétrico e assimétrico NH2 da guanina, apresentados
na tabela
5, não foi significativo ( as/s (NH2)), pode-se indicar que não
houve ligação
ao metal por este grupo. Também na região em 1672 cm-1 é
referente a (N1-
H)) onde indica que este grupo está protonado, portanto não há
coordenação
ao metal por este sítio de ligação. As bandas atribuídas a
deformações
simétrica e assimétrica do grupo N7-N9 do anel imidazol foi
avaliado e pode-
se observar bandas entre 1474 cm-1 e 1371cm-1 para o ligante
guanina livre,
e no complexo apresentam as bandas entre 1435 cm-1 e 1260
cm-1.
Observando as variações entre as bandas referente aos
dobramentos
simétricos e assimétricos (∆ δas/s (N7 - N9) IMD obteve-se uma
variação
considerável, onde pode-se indicar que houve coordenação entre o
metal e o
ligante guanina através desse grupo avaliado. Também pode-se
observar no
espectro FTIR do complexo a presença do pico referente a (N9-H)
em 1069
cm-1 e não há presença do pico característico ao grupo (N7-H)
indicando a
presença de coordenação da guanina com o metal por este sítio de
ligação.
-
51
Tabela 5 FTIRmed experimental dos grupos identificados nas
análises e variação entre os grupos específicos.
Bandas (cm-1)
Composto s
(NH2)
a
(NH2)
a/s
(NH2)
s
(N7 -
N9)IMD
a
(N7 -
N9)IMD
a/s
(N7 -
N9)IMD
Guanina (Livre) 1563-
1550
1118 438 1474 1371 103
[RuCl3(H2O)2Gly]Cl +
Gua
1565-
1551
1119 439 1435 1260 175
a Dobramento assimétrico / s: Dobramento simétrico / a/s:
Variação entre o
dobramento simétrico e assimétrico.
5.3 Análise DRX
A análise cristalográfica foi realizada por difração de raios x
pelo método do
pó representadas na figura 25, onde os dados obtidos indicam que
o
complexo em temperatura ambiente possui características
cristalinas.
-
52
Figura 25 Difratograma do complexo [RuCl3(H2O)2Gly].
O difratograma do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] + Gua foi analisado,
onde
observou-se que o mesmo manteve a cristalinidade do composto de
partida.
Porém como apresentado na figura 26, houve deslocamento dos
ângulos de
difração e o aparecimento de novos picos de difração, isso é um
indicativo
que a estrutura do composto [RuCl3(H2O)2Gly] foi modificado com
a interação
com o ligante guanina.
-
53
Figura 26 a) Difratograma do complexo [RuCl3(H2O)2Gly]. b)
Difratograma do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] + GUA.
A formação do monocristal das duas estruturas e a sua análise de
difração
de Raios-X podem identificar corretamente as distâncias e
ângulos de
ligação, porém ainda não foi desenvolvido um método eficiente
para obter-se
o monocristal dos complexos sintetizados.
-
54
5.4 Ensaios biológicos
A figura 27 apresenta o gráfico de viabilidade celular pra
células tumorais
sarcoma S-180.
Figura 27 Viabilidade celular em células S-180 em concentrações
0,2 - 200 μmol L-1 do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] em 48 horas de
incubação (DP = 25,92 e
E% = 3,00%).
Com a análise foi possível identificar que em concentrações do
complexo 2
μmol L-1 e 20 μmol L-1, onde não ocorreu diferença
estatisticamente
significante de viabilidade celular nas concentrações avaliadas.
Comparando-
se com o composto cisplatina® que apresenta IC50 64,83 +/- 0,17
mol L-1,
pode-se indicar mesmo em concentrações menores a cisplatina®
possui uma
maior eficiência do que o composto avaliado neste trabalho.
A figura 28 apresenta os gráficos de viabilidade celular para
células tumorais
de Ehrlich e D-17.
-
55
Figura 28 Viabilidade celular em concentrações 0,2 - 200 μmol
L-1 do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] em 48 horas de incubação (DP= 0,54
e E%= 3%). a) Ehrlich b)
D17
-
56
A análise do composto frente a células tumorais de Ehrlich (a) e
D-17 (b)
apresentaram um comportamento atípico, pois ocorreu um aumento
da
viabilidade celular de acordo com o aumento da concentração
aplicada no
ensaio. Este fator indica que para estes tipos de linhagem
celular o composto
sintetizado não é eficiente para atividade antitumoral. Pode-se
indicar o
aumento da viabilidade celular com o aumento da
concentração.
A figura 29 apresenta o gráfico de viabilidade celular para
células normais
L-929.
Figura 29 Viabilidade celular em células L-929 em concentrações
0,2 - 200 μmol L-1 do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] em 48 horas de
incubação. (DP= 0,37 e
E%= 3,00%)
Observa-se que no tratamento de células normais L-929 com o
complexo
não ocorreu diferença estatística sendo que o decaimento máximo
obtido foi
de 3,6% que não é significativo. O IC50 do composto cisplatina®
em células
L-929 é 29,05 +/- 1,88 mol L-1, onde pode-se indicar q a
cisplatina possui
-
57
uma toxicidade maior em relação ao composto avaliado frete a
células
normais L-929.
-
58
6. Conclusão
Com os estudos em técnicas termoanalítcas pode-se sugerir a
fórmula
mínima do composto [RuCl3(H2O)2Gly]. Nos resultados obtidos
por
espectroscopia indicam a ligação de forma monodentada da glicina
ao metal
onde houve transferência de carga LMCT entre o metal e os
ligantes. Os
espectros de RMN de 13C e 1H indicam a presença do ligante
glicina porém
não é possível observar os deslocamentos químicos referente à
agua de
constituição por conta do solvente utilizado. Com base nos
resultados, pode-
se propor a formação do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] e do
complexo
[RuCl3(H2O)2Gly] + Gua, através das sínteses realizadas. Com a
análise de
DRX é possível indicar que em temperatura ambiente o complexo
sintetizado
tem características cristalinas. Foi possível observar através
da
caracterização por espectroscopia que houve a coordenação
através do sítio
imidazólico N9 da guanina, base nitrogenada que constitui o DNA,
dando
início há um estudo sobre o mecanismo de ação do complexo
[RuCl3(H2O)2Gly] frente ao DNA da célula. Outras técnicas podem
confirmar
a formação dos complexos e suas decomposições térmicas
completas,
através de técnicas termoanalítcas acoplada a instrumentos
de
espectroscopia. Os refinamentos dos estudos de DRX podem
confirmar a o
retículo cristalino do monocristal dos complexo sintetizados. Os
estudos
biológicos do complexo [RuCl3(H2O)2Gly] realizados em células
tumorais S-
180, Ehrlich, D-17 e células normal L929, indicam que o complexo
não possui
atividade citotóxica efetiva frente as linhagens celulares
analisadas, porém os
estudos de síntese e caracterização do composto
[Ru(Cl)2(H2O)2Gly] + Gua
indica que pode haver interação com o DNA das células, no
entanto como
não houve citotoxidade, a interação do complexo com a célula
deve ser
melhor avaliada.
-
59
7. Referências Bibliográficas
1) ROSENBERG B, VAN CAMP L., TROSCO J. E., et al. Platinum
compounds: a new class of potent antitumor agents. Nature,
222,
1969, 385–3866.
2) JUCKETT, D. A.; ROSENBERG, B., Actions of c/s-
Diamminedichloroplatinum on Cell Surface Nucleic Acids in
Cancer
Cells as Determined by Cell Electrophoresis Techniques.
Cancer
Research, 42, 1982, 3565-3573.
3) BRABEC, V.; NOVÁKOVÁ, O, DNA binding mode of ruthenium
complexes and relationship to tumor cell toxicity. Drug
Resistance
Updates, 9, 2006, 111–122. doi:10.1016/j.drup.2006.05.002
4) KATSAROS, N. ANAGNOSTOPOULOU, A., Rhodium and its
compounds as potential agents in cancer treatment. Critical
Reviews
in Oncology/Hematology, 42, 2002, 297–308
5) CLARKE, M.J. Ruthenium and other non-platinium metal
complexes
in cancer chemotherapy. Heidelberg, Germany: Springer, 1989.
6) VAN VLIET, P. M.; SARINTEN, M. S.; TOEKIMIN, S. M. S.
et.al.,
mer-[Ru(terpy)Cl3] shows biological activity, forms interstrand
cross-
links in DNA and binds two guanine derivatives in a trans
configuration. Inorg. Chim. Acta, 231, 1995, 57-454.
7) ALLARDYCE, C. S.; DORCIER, A.; SCOLARO, C.; DYSON, P. J.,
Development of organometallic (organo-transition metal)
pharmaceuticals. Appl. Organometal. Chem. 19, 2005, 1–10.
DOI:10.1002/aoc.725
8) LAKHAI, J. M. R.; BONGARD, D.; PLUIM, D.; et al., A Phase I
and
Pharmacological Study with Imidazolium-trans-
DMSO-imidazole-
tetrachlororuthenate, a Novel Ruthenium Anticancer Agent.
Clin
Cancer Res, 10, 2004, 3717-3727
-
60
9) GALLORI, E.; VETTORI, C.; ALESSIO, E.; et. al,. DNA as a
possible
target for antitumor ruthenium(III) complexes. Arch.
Biochem.
Biophys., 1, 2000, 156-162
10) SURIANO, G; YEW, S.; FERREIRA, P.; et al., Characterization
of a
Recurrent Germ Line Mutation of the E-Cadherin Gene:
Implications
for Genetic Testing and Clinical Management. Clin. Cancer Res.,
15,
2005, 5401-5409.
11) CLARKE, M. J., Ruthenium metallopharmaceuticals, Coord.
Chem.
Rev., 236, 2002, 209-233.
12) CLARKE, M. I.; BUCHBINDER, M., Binding of
Pentaammineruthenium(III) to Double-Helical and
Single-Stranded
DNA. Inorganica Chimica Acta, 21, 1978, 87-88.
13) GUPTA, G.; GLORIA, S.; NONGBRI, S. L.; et. al., Study of
complexes of platinum group metals containing nitrogen bases
derived from pyridine aldehydes: Interesting molecular
structures
with unpredicted bonding modes of the ligands. Journal of
Organometallic Chemistry, 696, 2011, 2014-2022.
doi:10.1016/j.jorganchem.2010.10.053
14) SAMPATH, K.; SATHIYARAJ, S.; JAYABALAKRISHNA, C.,
Synthesis, spectroscopic studies of binuclear ruthenium(II)
carbonyl
thiosemicarbazone complexes containing PPh3/AsPh3 as co-
ligands: DNA binding/cleavage. Bulletin of the Korean
Chemical
Society, 34, 2013, 367-373.
15) SILVEIRA-LACERDA, E. P.; VILANOVA-COSTA, C. A. S. T.;
SANTOS, W. B. et. al., Ruthenium Complex cis-
(Dichloro)tetraammineruthenium(III) Chloride Presents
Selective
Cytotoxicity Against Murine B Cell Lymphoma (A-20), Murine
Ascitic Sarcoma 180 (S-180), Human Breast Adenocarcinoma
(SK-BR-3), and Human T Cell Leukemia (Jurkat) Tumor Cell
Lines. Biological Trace Element. Research, 135, 2010, 98-111
-
61
16) KASTNER, M. E.; COFFEY, K. F.; CLARKE, M. J.; et. al.,
Structural
correlation and metal ion movement in stable
pentaammineruthenium(III)-hypoxanthine complexes. J. Am.
Chem.
Soc., 103, 1981, 5747-5752.
17) CARUSO, F.; MONTI, E.; MATTHEWS, J., Synthesis,
Characterization, and Antitumor Activity of Water-Soluble
(Arene)
ruthenium(II) Derivatives of
1,3-Dimethyl-4-acylpyrazolon-5-ato
Ligands. First Example of Ru(arene)(ligand) Antitumor
Species
Involving Simultaneous Ru−N7(guanine) Bonding and Ligand
Intercalation to DNA. Inorg. Chem., 53, 2014, 3668-3677.
DOI:10.1021/ic403170y
18) SEDDON, K. R. “The Chemistry of Ruthenium”, Coordination
Chemistry Reviews, 67, 1985, 171-242.
19) COTTON, F.A.; WILKINSON, G. - Adv. Inorg. Chem. Interscien.,
3°
ed, 1972, 745-802.
20) LEWIS, G. N.; ADAMS, E. Q.; LANMAN, E. H., Electrical
transference in amalgams. Journal of the American Chemical
Society, 37, 1915, 2656-62. DOI:10.1021/ja02177a008
21) MULLIKEN, R.S., A Comparative Survey of Approximate
Ground
State Wave Functions of Helium Atom and Hydrogen Molecule.
J.
Am. Chem. Soc. 74, 811-824, 1952.
22) SHRIVER, D.F.; STROPE, D., Generation of novel cationic
metal-
alkyl complexes via carbocation reagents. Journal of the
American
Chemical Society, 24, 1973, 8197.
23) PEARSON, R.G., Hard and Soft A