UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA UFBA
INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR EM SADE
CAMPUS ANSIO TEIXEIRA
PROGRAMA MULTICNTRICO DE PS-GRADUAO
EM CINCIAS FISIOLGICAS - SBFIS
RAIMUNDO NONATO FARIA
AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO
EXTRATO ETANLICO DA FOLHA DE Phanera flexuosa
(MORIC.) L. P. QUEIROZ (CAESALPINIOIDEAE) E DA
INIBIO DE FATORES DE VIRULNCIA DE Staphylococcus
aureus RESISTENTES A ANTIBITICOS.
Vitria da Conquista - BA
2012
RAIMUNDO NONATO FARIA
AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO
EXTRATO ETANLICO DA FOLHA DE Phanera flexuosa
(MORIC.) L. P. QUEIROZ (CAESALPINIOIDEAE) E DA
INIBIO DOS FATORES DE VIRULNCIA DE
Staphylococcus aureus RESISTENTES A ANTIBITICOS.
Dissertao apresentada ao Programa Multicntrico de
Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas/Sociedade
Brasileira de Fisiologia para a obteno do ttulo de
Mestre em Cincias Fisiolgicas.
Orientadora: Profa. Dra. Regiane Yatsuda
Co-Orientador: Prof. Dr. Lucas Miranda Marques
Vitria da Conquista - BA
2012
Biblioteca Universitria Campus Ansio Teixeira - UFBA
Faria, Raimundo Nonato
Avaliao da atividade antimicrobiana do extrato etanlico da folha
de Phanera
flexuosa (Moric.) L. P. Queiroz (Caesalpinioideae) e da inibio
de fatores de virulncia
de Staphylococcus aureus resistentes a antibiticos / Raimundo
Nonato Faria - 2012.
129 f. : il.
Orientadora: Profa. Dr
a Regiane Yatsuda; Co-orientador: Prof. Dr. Lucas Miranda
Marques.
Dissertao (mestrado) Universidade Federal da Bahia, Programa
Multicntrico de
Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas, 2012.
1. Plantas Medicinais Phanera flexuosa (Moric.). 2.
Farmacorresistncia Bacteriana - Staphylococcus aureus - MRSA. I.
Universidade Federal da Bahia. Programa Multicntrico de Ps-Graduao
em Cincias Fisiolgicas. II. Ttulo.
CDU 633.88
Dedico este trabalho aos meus pais, Pedro Paulo de Farias e
Margarida Maria de Farias,
que sempre me proporcionaram as melhores condies possveis para o
aprendizado, o
desenvolvimento do carter e da honestidade e permitir uma vida
de tantas alegrias.
A Deliene Martins de Carvalho, por ser minha companheira amada,
meu porto seguro e a
fora que me aconselha e sustenta nos momentos difceis, mo anam
cara.
Ao meu filho Joo Pedro de Carvalho Faria, a luz que ilumina meu
horizonte e me faz
querer voltar pra casa a cada dia, te amo.
Aos meus sogros Newton Rodrigues Carvalho e Hermelina Martins de
Carvalho, pois sei
o quanto torceram por mim e o quanto regojizam-se com esta
conquista.
Sonaly Martins de Carvalho Arajo, Ana Clara Carvalho Arajo e
Newton Cleber
Martins de Carvalho por existirem e serem uma continuidade da
minha famlia.
Aos professores Regiane Yatsuda e Lucas M. Marques por suas
presenas, amizade e
orientaes constantes.
AGRADECIMENTOS
A Deus, Jhav, Alah, que tem sempre colocado nos caminhos
trilhados por mim, pessoas
maravilhosas que me acolheram, orientaram e tornaram-se blsamo
nos momentos de
dificuldade.
Agradeo s Instituies financiadoras, Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientfico
e Tecnolgico (CNPq UNIVERSAL 014/2008; 13389/2010-0), Fundao de
Amparo
Pesquisa e Inovao Tecnolgica do Estado da Bahia (FAPESB/PPSUS
0008/2009).
O ingresso no mestrado me abriu um grande horizonte de
conhecimentos, de oportunidades e,
sem dvida alguma, um imenso prazer. Hoje tenho a certeza que
ningum caminha sozinho,
sempre existe algum em quem se apoiar nos momentos de fraqueza,
ou compartilhar os
momentos de alegria. para elas que apresento meus mais sinceros
agradecimentos e carinho.
A Universidade Federal da Bahia Instituto Multidisciplinar em
Sade Campus
Ansio Teixeira (UFBA- IMS/CAT), por trazer aos rinces do estado
baiano a oportunidade
e oferta de cursos de graduao e ps-graduao primando pela
excelncia e qualidade.
Em especial, a minha professora orientadora, Dra. Regiane
Yatsuda, pela imensa pacincia,
dedicao, amizade e pela confiana em me aceitar em seu
laboratrio, pelos valiosos
ensinamentos, e por seu exemplo nico de pesquisadora.
A meu co-orientador de corao, o professor Dr. Lucas Miranda
Marques, que sempre se
mostrou solcito no auxlio em momentos de dificuldade e que abriu
as portas da sua famlia
para proporcionar vivncias enriquecedoras pessoais e
acadmicas.
s heroicas professoras Dra. Amlia Cristina Mendes de Magalhes,
Dra. Telma de Jesus
Soares e Dra. Najara de Oliveira Belo, por todo empenho, zelo e
perseverana para fazer
com que o Programa Multicntrico em Cincias Fisiolgicas da UFBA,
continue como um
projeto para a gerao de profissionais qualificados e
comprometidos com a qualidade
acadmica.
A todos os docentes do Departamento de Fisiologia e Farmacologia
da UFMG, em especial
queles que participaram mais diretamente da minha formao
acadmica e cientfica: Prof.
Dr. Andr Klein, Prof. Dr. Steyner Cortes, Profa. Dra. Miriam T.
P. Lopes, Profa. Dra.
Janetti N. Francischi, Prof. Dr. Fabrcio Moreira, Profa. Dra.
Daniele Aguiar, Prof. Dr.
Jorge Pesquero e Prof. Dr. Igor Dimitri Gama Duarte.
Ao Prof. Dr. Jorge Timenetsky, Aricelma Pinheiro Franca, Denise
Jaqueto, Carlos
Augusto Scachetti Almeida, Profa. Dra. Glucia Maria Machado
Santelli, Beatriz A.
Cortez, Roberto Cabado M. Junior, Profa. Dra. Dolores rsula
Mehnet, Telma Alves
Monezi, Angelita M. O. Gusmo dos Santos e demais amigos e
professores do ICB-USP
que nos receberam carinhosamente e permitiram a realizao dos
experimentos necessrios ao
sucesso dessa dissertao.
Aos colegas discentes do programa de ps-graduao em Fisiologia e
Farmacologia do
ICB/UFMG, por proporcionarem um ambiente acadmico acolhedor,
compartilhando
convvio edificante e descontrado que minimizaram as saudades e a
distncia dos entes
familiares na minha estadia em Belo Horizonte-MG: Pedro Henrique
Gobira Nunes, Ana
Flvia Santos Almeida, Thrcia Guedes Viana, Giovane Galdino de
Souza, Raphael
Gomes Ferreira, Viviane Saito, Lindisley Ferreira Gomides,
Danielle Bernardes,
Alessandra de Castro Montandon, Amilton Cerqueira de Andrade,
Rogrio Pereira
Bilheiro, Paulo Marcelo de Andrade Lima, Lukas Miranda Cangussu
Gomes Oliveira,
Rosria Dias Aires, Cynthia Dela Cruz, e tantos outros que pude
conviver neste perodo.
Aos pesquisadores Dr. Marcelo H. Napimoga, Dra. Juliana T.
Clemente-Napimonga, Dr.
Humberto M. Spindola, Dra. Mary Ann Folgio, Dr. Pedro Luiz
Rosalen e Msc. Avaldo
de Oliveira S. Filho pelo amparo, auxlio, suporte tcnico e
disponibilidade para a pesquisa.
rika Pereira de Souza e Joseline Cezrio Duarte, por sua amizade,
conversas,
ensinamentos, convivncia e por serem meus guias nos primeiros
passos no convvio no
grupo de pesquisa e na rotina do laboratrio.
Ao esquadro dourado, que com tanto afinco e dedicao ajudou-me na
rotina exaustiva dos
experimentos realizados, em especial a Gladistone Correia
Messias e Geysa Silva Santos,
assim como a Mrcio Augusto Meira Santana, Mssio Piraj Mattos e
Tiara Oliveira
Castro.
Aos amigos e companheiros do laboratrio de Farmacologia:
Andressa Arajo Oliveira,
Camila Brito Cardoso, Cassya Maviony Fiuza Andrade, Daniel Dias
Sampaio,
Emanuella Gomes Maia, Keila Silva de Jesus, Maiana Ferraz
Andrade, Mahala Correia
Cludio, Monique Dutra Fonseca, Naira Kelle Barbosa Ribeiro,
Priscila Silva
Cunegundes, Rafael Santos Dantas Miranda Drea, Roberta Alves
Mota, e Vincius
Saboia Meireles por toda amizade e ajuda do transcorrer desta
conquista. Nem tenho palavras
para agradecer a todos vocs pelo carinho e pelo cuidado que
tiveram comigo. Mostrando que
realmente temos uma equipe, que sabemos trabalhar em grupo e
isso uma lio que
levaremos para toda a nossa vida, um grande ensinamento, alm de
muitos outros, que se
insere neste grande universo que a nossa pesquisa. Saibam que eu
fui apenas porta-voz de
um trabalho desenvolvido com muito empenho de todos, e que se
hoje tenho um ttulo eu
ofereo todo o reconhecimento a vocs.
Aos amigos e companheiros de laboratrio do Programa de Educao
Tutorial (PET):
Aparecido Almeida Conceio, Andressa Rodrigues de Oliveira Sousa,
Aracely Vieira
de Melo, Deivid Alan Luz Santos, Iaquine Santos Da Silva, Jeisa
Zielle de Souza
Rodrigues, Manoel Neres Santos Junior, Marcelly Machado Santos,
Nayara Silva de
Macedo, Pedro Aldo Silva Cunegundes, Qeren Hapuk Rodrigues
Ferreira e Saulo
Rocha Sales, que apesar de estarem no projeto mais recentemente,
puderam contribuir de
forma relevante para a consecuo de nosso trabalho at o presente
instante, e que com
certeza iro fazer mais ainda no futuro. Os mritos tambm so de
vocs.
Aos amigos e companheiros do laboratrio de Microbiologia: Danilo
Cordeiro Cariri da
Silva, Guilherme Barreto Campos, Simone Gomes de Souza, Daniel
Santos Sousa,
Verena Macedo e Aline Amorim, que propiciaram os alicerces sobre
o qual nosso projeto se
desenvolveu e que sempre se mostraram receptivos, cuidadosos e
atenciosos em todos os
momentos em que foram solicitados. Que nossa amizade e
companheirismo estendam-se alm
dos limites do tempo e do espao. Obrigado!
Aos meus colegas de jornada Anna Carolina Sade Dantas, Daniela
de Oliveira Gusmo,
Everaldo Nery de Andrade, Gleisy Kelly Neves Gonalves,
Jacqueline Pereira da Silva,
Leda Maria de Castro Coimbra, Liliany Souza de Brito Amaral,
Samira Itana de Souza
e Thiago Henrique Caldeira de Oliveira. Tambm aos novos colegas:
Erika Pereira de
Souza, Luciano E. dos Santos, Jussara A. Silva, Grazielle P. L.
dos Santos e Clarissa L.
S. e Souza que enfretaro as lutas e batalhas por que passamos,
mas que apesar de difceis,
so extremamente engrandecedoras e gratificantes. Fora
sempre!
A Ndia Mariza Ledo Costa e Juliana Ledo Costa por abrirem seu
lar e me acolherem na
minha estadia em Belo Horizonte-MG; permitindo um ambiente de
conforto e descontrao
durante os momentos difceis do afastamento do lar.
A Alexandre Pereira Flores, colega e amigo especial que me
acolheu inicialmente em
Vitria da Conquista, e sua companheira Janana Santos Albuquerque
que permitiram
minha adaptao a esta maravilhosa cidade, que apesar de fria em
clima exulta calor no
corao.
Aos meus ex-alunos e amigos da Faculdade Guanambi, que sempre
foram e sero a razo
precpua do meu ingresso na vida acadmica e na busca da
qualificao contnua neste
objetivo; e que mesma na ausncia nunca deixaram de manifestar
apreo, carinho e desejo de
compartilharmos outras vivncias.
"Educar crescer. E crescer viver. Educao , assim, vida no
sentido mais autntico da
palavra."
Ansio Spnola Teixeira.
(1900-1971)
FARIA, Raimundo Nonato. Avaliao da atividade antimicrobiana do
extrato etanlico
da folha de Phanera Flexuosa (Moric.) L. P. Queiroz
(CAESALPINIOIDEAE) e da
inibio dos fatores de virulncia de Staphylococcus aureus
resistentes a antibiticos. Dissertao (Mestrado) Instituto
Multidisciplinar em Sade, Universidade Federal da Bahia,
Vitria da Conquista, 2012.
RESUMO
O Staphylococcus aureus um patgeno envolvido em infeces
noscomiais e comunitrias.
O objetivo deste estudo foi analisar in vitro a atividade
antimicrobiana do extrato etanlico da
folha de Phanera flexuosa (Moric) L.P.Queiroz (EFPF), conhecida
como escada de macaco,
coletada na Floresta Nacional Contendas do Sincor (BA), sobre o
crescimento bacteriano e
sobre alguns fatores de virulncia de Staphylococcus aureus
resistentes a antibiticos
(MRSA), isolados de ambientes hospitalares de Vitria da
Conquista (BA). O EFPF foi
testado nas concentraes entre 4000 a 125 g/mL na determinao de
concentrao inibitria
mnima (CIM) e concentrao bactericida mnima (CBM). Foram
estudados Staphylococcus
aureus ATCC 43300 e 31 isolados resistentes a oxacilina em
antibiograma e que
apresentaram o gene mecA em reao de PCR. Na CIM, as placas foram
incubadas a 37C,
24h, sendo interpretadas de acordo com o crescimento bacteriano
e confirmado com o corante
ressazurina. Como controle dos experimentos, foi utilizado o
veculo, etanol (10%, v/v).
Verificou-se a inibio de formao do biofilme de MRSA em 3, 5, 7 e
24 h, aps a exposio
ao EFPF, avaliou-se a formao de biomassa total com cristal de
violeta, viabilidade celular
com MTT e morfologia do biofilme usando microscopia confocal aps
24 h (isolados clnicos
16A e 92). Foi realizada curva de crescimento de MRSA avaliando
a absorbncia e
viabilidade da cultura bacteriana suplementada com 1% glicose, e
tratada com o veculo ou
EFPF em concentrao subinibitria (CIM50). Nos tempos de 5 e 24 h
de exposio ao EFPF,
da curva foi analisada a expresso gnica de -hla, PVL, sea, seb,
spa, icaA, icaB, icaC,
icaD, icaR dos isolados 16A e 112. Foram realizadas 03
triplicatas para cada experimento e
anlise estatstica. Todos os isolados testados e a cepa ATCC
apresentaram CIM ente 125 e
4000 g/mL, sendo resultados relevantes de CIM (125 g/mL) foram
obtidos para a cepa
ATCC 43300 e para os isolados 27A, 27B, 28, 29, 33A, 43.1, 47.1,
52, 76, 85.1, 85.2, 92 e
113. Quanto ao CBM, ocorreu para os isolados 47.1 e 92 (4000
g/mL), isolado 12D (1000
g/mL), e isolado 29 (500 g/mL). Na inibio de formao de biofilme,
os resultados em
reduo de clulas viveis e formao da biomassa total ocorreram nos
tempos de 7 e 24h,
sendo que na concentrao 5000 g/mL foi efetiva no biofilme de 24
h. Quanto curva de
crescimento, a atividade antimicrobiana de EFPF ocorreu na fase
final exponencial e
estacionria inicial avaliada pela reduo de absorbncia, e tambm a
reduo da viabilidade
celular do EFPF em relao ao veculo nas cepas testadas. Houve
diminuio da expresso de
PVL do isolado 16A tratado com EFPF (p
FARIA, Raimundo Nonato. Evaluation of the antimicrobial activity
of ethanolic leaf
extract of Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz
(CAESALPINIOIDEAE) and
inhibition of the virulence factors of Staphylococcus aureus
resistant to antibiotics Thesis
(MsC) - Multidisciplinary Health Institute, Federal University
of Bahia, Vitria da Conquista,
2012.
ABSTRACT
Staphylococcus aureus is a pathogen involved in nosocomial and
community infections. The
aim of this study was to analyze in vitro antimicrobial activity
of ethanol extract of leaf
Phanera flexuosa (Moric) L.P. Queiroz (EFPF), known as monkey
ladder, collected in the
National Forest Contendas Sincor (BA) on bacterial growth and on
some virulence factors of
antibiotic-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), isolated from
hospital environments of
Vitoria da Conquista (BA). The EFPF was tested at concentrations
between 4000 to 125
g/mL in the determination of minimum inhibitory concentration
(MIC) and minimum
bactericidal concentration (MBC). We studied Staphylococcus
aureus ATCC 43300 and 31
isolates resistant to oxacillin in sensitivity and that had the
mecA gene in PCR. In the MIC,
the plates were incubated at 37C, 24 are interpreted according
to the bacterial growth and
confirmed with the dye ressazurin. As control experiments, we
used the vehicle, ethanol (10%
v/v). There was inhibition of biofilm formation of MRSA 3, 5, 7
and 24 h after exposure to
EFPF evaluated to complete the formation of biomass with crystal
violet, with MTT cell
viability and morphology of the biofilm using microscopy
confocal after 24 h (16A and 92
clinical isolates). Growth curve was performed by evaluating the
absorbance of MRSA and
viability of bacterial cultures supplemented with 1% glucose,
and treated with vehicle or in
EFPF subinihibtory concentration (MIC50). In times of 5 and 24 h
of exposure to EFPF, the
curve was analyzed the gene expression of hla-, PVL, sea, seb,
spa, icaA, icaB, icaC, icaD icaR in isolates 16A and 112. 03
triplicates were performed for each experiment and statistical
analysis. All isolates and ATCC strains showed MIC being 125 and
4000 g/mL, with
relevant results from CIM (125 g/mL) were obtained for strain
ATCC 43300 and isolates
27A, 27B, 28, 29, 33A, 43.1 , 47.1, 52, 76, 85.1, 85.2, 92 and
113. As to the CBM was
isolated for the 47.1 and 92 (4000 g/ml) isolated 12D (1000
g/mL), 29 and isolated (500
g/mL). Inhibition of biofilm formation, results in reduced
formation of viable cells and total
biomass of the 7 and 24 times, and the concentration 5000 g/mL
was effective in the biofilm
24 h. The growth curve, the antimicrobial activity of EFPF
occurred at the end of exponential
and stationary initial absorbance measured by the reduction, and
also the reduction of cell
viability versus vehicle EFPF the strains tested. There was
decreased expression of PVL
treated with isolate 16A EFPF (p
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz. Folhas e caule
em seu habitat na
Floresta Nacional (FLONA) de Contendas do Sincor-
BA............................
40
Figura 2A Inibio da formao do biofilme de S. aureus ATCC 43300
resistente a
antibiticos pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
(Moric.)
L.P. Queiroz
EFPF........................................................................................
53
Figura 2B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus ATCC
43300 resistente a
antibiticos MRSA pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
53
Figura 3A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a
antibiticos
MRSA (isolado 16A) pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
54
Figura 3B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus
resistente a antibiticos
MRSA (isolado 16A) pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
54
Figura 4A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a
antibiticos
MRSA (isolado 29) pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
55
Figura 4B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus
resistente a antibiticos
MRSA (isolado 29) pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
55
Figura 5A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a
antibiticos
MRSA (isolado 92) pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
56
Figura 5B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus
resistente a antibiticos
MRSA (isolado 92) pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
57
Figura 6A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a
antibiticos
MRSA (isolado 112) pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
58
Figura 6B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus
resistente a antibiticos
MRSA (isolado 112) pelo extrato etanlico da folha de Phanera
flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz
EFPF..........................................................................
58
Figura 7 Micrografia dos biofilmes do isolado S. aureus 16A
tratados com veculo
ou o extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa (Moric.) L.P.
Queiroz
(EFPF) pela microscopia confocal a
laser.......................................................
60
Figura 8 Micrografia dos biofilmes do isolado S. aureus 92
tratados com veculo ou
o extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa (Moric.) L.P.
Queiroz
(EFPF) pela microscopia confocal a
laser........................................................
61
Figura 9 Determinao da liberao da interleucina IL-1por macrfagos
J774
estimulados com endotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou
veculo
(Etanol 10%,
v/v).............................................................................................
62
Figura 10 Determinao da liberao da interleucina IL-6por
macrfagos J774
estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou
veculo
(Etanol 10%,
v/v).............................................................................................
63
Figura 11 Determinao da liberao da interleucina IL-10por
macrfagos J774
estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou
veculo
(Etanol 10%,
v/v).............................................................................................
64
Figura 12 Determinao da liberao da interleucina TNF-por
macrfagos J774
estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou
veculo
(Etanol 10%,
v/v).............................................................................................
65
Figura 13 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico das
folhas de Phanera
flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico de S. aureus
ATCC
43300.
66
Figura 14 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico das
folhas de Phanera
flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico do isolado S.
aureus
112...
67
Figura 15 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico das
folhas de Phanera
flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico do isolado S.
aureus
16A...
68
Figura 16 Influncia do extrato etanlico das folhas de Phanera
flexuosa (EFPF)
sobre a expresso do gene sea na formao do biofilme de 24 h de S.
aureus
ATCC
43300....................................................................................................
69
Figura 17 Influncia do extrato etanlico das folhas de Phanera
flexuosa (EFPF)
sobre a expresso dos genes -hla, PVL, sea, seb e spa na formao
do
biofilme de 24 h do isolado de S. aureus
112..................................................
70
Figura 18 Influncia do extrato etanlico das folhas de Phanera
flexuosa (EFPF)
sobre a expresso do gene -hla, PVL e spa na formao do biofilme
de 24
h do isolado de S. aureus
16A........................................................................
71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Sequncia dos primers utilizados na amplificao das
regies promotoras dos
genes
.................................................................................................................
49
Tabela 2 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico da folha
de Phanera flexuosa
(Moric.) L.P. Queiroz - EFPF na determinao da concentrao
inibitria
mnima (CIM) e na concentrao bactericida mnima (CBM) de S.
aureus
resistentes a antibiticos
(MRSA).....................................................................
51
Tabela 3 Avaliao da presena dos genes de virulncia dos S. aureus
(MRSA) pelo
mtodo de
PCR.....................................................................................................
68
Tabela 4 caractersticas dos isolados selecionados para avaliao
dos fatores de
virulncia............................................................................................................
88
Tabela 5 Protocolos de ciclos das reaes de
PCR...........................................................
89
Tabela 6 Protocolo das quantidades de reagentes por tipo de PCR
(x1).......................... 90
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
agr Acessory gene regulator
AIP Autoinducing peptide
ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
ANOVA Anlise de varincia
BHI Brain Heart Infusion
CA-MRSA Community-Acquired Methicilin resistant S. aureus
CBM Concentrao Bactericida Mnima
CDC Center for Disease Control and Prevention
cDNA cido desoxirribonuclico complementar
ClfA/B Clumping factor A/B
CIM Concentrao Inibitria Mnima
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e
Tecnolgico
Dr. Doutor
Dra. Doutora
D.P. Desvio padro
EDTA cido etileno diamino tetra actico
EFPF Extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ensaio imuno-enzimtico
em
fase slida
FAPESB Fundao de Amparo Pesquisa e Inovao Tecnolgica do
Estado da Bahia
FDA Food and Drug Administration
fnb Fibronectinas estafiloccicas
FLONA Floresta nacional Contendas do Sincor
CAPES Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel
Superior
EPI Efllux Pump inihibtors
g Gramas
h Horas
HA-MRSA Hospital-Acquired Methicilin resistant S. aureus
ica Intercelular adhesin lcus
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos
Naturais
Renovveis
IH Infeco Hospitalar
IL-1 Interleucina-1
IL-10 Interleucina-10
IL-1 Interleucina-1
IL-2 Interleucina-2
IL-6 Interleucina-6
LTA cido lipoteicico
M Molar
Min Minutos
MHC II Molcula do complexo principal de histocompatibilidade do
tipo II
mL Mililitros
MRSA Methicilin resistant Staphylococcus aureus
MS Ministrio da Sade
MSCRAMM Microbial surface components recognizing adhesive
matrix
molecules
NaCl Cloreto de sdio
NCBI National Center for Biotechnology Information
NO xido Ntrico
OD Densidade ptica
OMS Organizao Mundial da Sade
PBP Penicilin Binding Protein
PBS Salina tamponada com fosfatos
PCR Polymerase Chain Reaction
PEG Peptdeoglicano
PNSG Polissacardeo Poli-N-succinil--1,6-glicosamina
pH Potencial hidrogeninico
PIA Polyssacaridic intercelular adhesin
PVL Leucocidina de Panton-Valentine
RNA cido ribonuclico
SarA Staphylococcal acessory regulator
SCCmec Staphylococcal cassete chromosome mec
Sea Enterotoxina estafiloccica tipo A
Seb Enterotoxina estafiloccica tipo B
Sec Enterotoxina estafiloccica tipo C
Sed Enterotoxina estafiloccica tipo D
Spa Protena A estafiloccica
TAE Tampo TRIS-cido actico EDTA
TLR2 Tooll Like Receptor tipo 2
TNF-
TSB
Fator de necrose tumoral-alfa
Triptone soy broth
TSST-1 Toxina da Sndrome do choque txico 1
UFBA Universidade Federal da Bahia
UESB Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
UFC Unidade Formadora de Colnia
UTI Unidade de Terapia Intensiva
UNESCO Organizao das Naes Unidas para Educao, Cincia e
Cultura
VRE Vancomycin resistant Enterococcus faecium
v/v Relao entre volume e volume
M Micromol
L Microlitros
g Microgramas
VISA Vancomycin intermediate resistant Staphylococcus aureus
VRSA Vancomycin resistant Staphylococcus aureus
WHO World Health Organization
SUMRIO
1
INTRODUO....................................................................................................
17
2 FUNDAMENTOS
TERICOS..........................................................................
19
2.1 AVALIAO DA ATIVIDADE BIOLGICA DE PLANTAS
MEDICINAIS.......................................................................................................
.
F
19
2.1.1
Antibioticoterapia.................................................................................................
20
2.2 RESISTNCIA MICROBIANA E INFECES HOSPITALARES............
24
2.2.1 Resistncia
Microbiana..........................................................................................
24
2.2.2 Infeces
Hospitalares............................................................................................
25
2.3 STAPHYLOCOCCUS
AUREUS.........................................................................
28
2.3.1 Staphylococcus
aureus............................................................................................
28
2.3.2 Fatores de virulncia de S.
aureus........................................................................
32
2.4 BIODIVERSIDADE
BRASILEIRA..................................................................
37
2.5 Phanera flexuosa (MORIC.) L. P.
Queiroz........................................................
39
2.5.1 Caractersticas Botnicas e de localizao da Phanera
flexuosa..................... 39
2.5.2 Composio qumica e usos
medicinais..............................................................
40
3
OBJETIVOS.........................................................................................................
42
3.1 OBJETIVO
GERAL...........................................................................................
42
3.2 OBJETIVOS
ESPECFICOS.............................................................................
42
4 MATERIAL E
MTODOS.................................................................................
43
4.1 COLETA E IDENTIFICAO DA ESPCIE
VEGETAL............................ 43
4.2 PREPARO DOS
EXTRATOS............................................................................
43
4.3 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EFPF................
43
4.3.1
Microrganismos....................................................................................................
44
4.3.2 Teste de Concentrao Inibitria Mnima (CIM) e Concentrao
Bactericida Mnima (CBM) do extrato etanlico da folha de P.
flexuosa
(EFPF) contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina
(MRSA)........
57
57
44
4.4 AVALIAO DA ATIVIDADE DO EFPF SOBRE OS FATORES DE
VIRULNCIA DE S.
AUREUS.....................................................................................
47
45
4.4.1 Inibio da formao do
biofilme.........................................................................
45
4.4.2 Avaliao da morfologia do biofilme tratado com
EFPF.................................. 46
4.4.3 Ensaio de liberao de fator de necrose tumoral alfa (TNF-)
e interleucinas
(IL-1, IL-6 e IL-10) por macrfagos J774 estimulados com
exotoxinas de S. aureus tratados com
EFPF.............................................................................................
60
56
47
4.4.4 Avaliao da expresso gnica dos fatores de virulncia do S.
aureus............. 48
4.5 ANLISE
ESTATSITCA...................................................................................
50
5
RESULTADOS.....................................................................................................
51
5.1 TESTE DA CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA (CIM) E DA
CONCENTRAO BACTERICIDA MNIMA (CBM) DO EFPF CONTRA S.
aureus................................................................................................................................
63
53
51
5.2 INIBIO DA FORMAO DE BIOFILME POR
EFPF............................. 52
5.3 AVALIAO DA MORFOLOGIA DO BIOFILME TRATADO COM
EFPF.................................................................................................................................
61
59
5.4 ENSAIO DE LIBERAO DE FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA
(TNF-) E INTERLEUCINAS (IL-1, IL-6 E IL-10) POR MACRFAGOS J774
ESTIMULADOS COM EXOTOXINAS DE S. aureus TRATADOS COM EFPF...
63
63
61
5.5 AVALIAO DA EXPRESSO GNICA DOS FATORES DE
VIRULNCIA......................................................................................................
65
6
DISCUSSO.........................................................................................................
72
7
CONCLUSO.......................................................................................................
87
8
ANEXOS...............................................................................................................
88
REFERNCIAS...................................................................................................
91
17
1 INTRODUO
A Organizao Mundial da Sade (OMS), denomina como plantas
medicinais todas as
espcies silvestres ou cultivadas, quando utilizadas como recurso
para prevenir, aliviar, curar,
modificar um processo fisiolgico normal ou patolgico ou quando
estas so fontes de
frmacos ou de seus precursores (ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD,
2000). Em
1978, a OMS reconheceu os medicamentos de origem vegetal como
recurso teraputico
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2001) e recomendou aos pases que
executassem
levantamentos regionais e identificao botnica de espcies
vegetais usadas na medicina
popular tradicional; estimulassem e indicasse o uso das plantas
medicinais com eficcia e
segurana comprovadas e contraindicassem o emprego das prticas
medicinais populares
consideradas inteis ou prejudiciais (CAVALCANTE, 2010).
A busca de alternativas teraputicas complementares
farmacoterapia tradicional
converteu-se recentemente numa diretriz importante no contexto
da sade pblica.
Atualmente, a pesquisa de plantas medicinais eixo fundamental
nas polticas de sade
implementadas pelas esferas governamentais como parte da Poltica
Nacional de Prticas
Integrativas e Complementares do Sistema nico de Sade (BRASIL,
2006).
As plantas medicinais participam de forma fundamental no aumento
do mercado de
medicamentos, particularmente no desenvolvimento de fitoterpicos
e na identificao de
novas molculas ou prottipos bsicos para gerao de novos
medicamentos sintticos
(YATSUDA, 2004), visto que muitos constituintes de plantas e/ou
seus derivados
semissintticos constituem uma parcela aprecivel dos frmacos de
ponta recm-introduzidos
no mercado. Trata-se de um mercado poderoso, por isso, h a
necessidade de buscar novas
molculas para assegurar a competitividade na produo de novos
medicamentos patenteados.
Alm disto, tambm representam a oportunidade de elaborar os
medicamentos denominados
fitoterpicos, que so extratos vegetais padronizados e validados
do ponto de vista da sua
eficcia, segurana e qualidade (BHATTARAM; GRAEF; KOHLERT,
2002).
O uso de fitoterpicos no Brasil constitui um mercado de US$ 400
milhes, e ainda
so recomendadas pela Organizao das Naes Unidas, que reconheceu o
uso de plantas
medicinais por 2/3 da populao da Terra (BARATA, 2010). Estima-se
que o Brasil possui
aproximadamente 55 mil espcies vegetais catalogadas, das quais
apenas 8% foram estudadas
para identificao de molculas bioativas e, quatro mil so
reconhecidas como plantas
medicinais (BRASIL, 2004).
18
A populao brasileira utiliza as plantas medicinais como
antimicrobianos, uma forma
alternativa para tratamento de diversas infeces. As doenas
infecciosas so a segunda causa
de morte no mundo e terceira causa de morte em pases em
desenvolvimento (FAUCI, 2001).
Atualmente, a presso de seleo de microrganismos resistentes
pelos antimicrobianos
consequente no s do uso indiscriminado dos antimicrobianos na
comunidade e no ambiente
hospitalar, ao uso teraputico ou profiltico destas drogas em
medicina e odontologia
humanas, como tambm de seu emprego em medicina veterinria, na
conservao de
alimentos, no combate a elementos biolgicos daninhos aos seres
humanos e na engorda de
animais destinados alimentao. Atualmente, os microrganismos
multirresistentes so uma
preocupao global, acarretando prejuzos financeiros e sociais
estimados em 25.000 mortes e
gasto com custos hospitalares por volta de 1,5 bilho de euros na
Europa e 35 bilhes de
dlares nos Estados Unidos ao ano, gerando um significativo
aumento dos custos totais para o
sistema de sade (LEUNG et al., 2011).
Devido ao rpido aumento mundial da resistncia microbiana aos
antibiticos
disponveis no mercado, necessria a pesquisa por novos
antimicrobianos contra essas cepas
resistentes. Paradoxalmente, a busca por novos agentes
antimicrobianos tem declinado nos
ltimos anos, sendo que as grandes companhias farmacuticas tm
extinguido ou diminudo
seus programas de pesquisa (SPELLBERG et al., 2004).
Assim, importante estudar plantas da caatinga como a Phanera
flexuosa, conhecida
popularmente como escada de macaco, uma planta ainda pouco
estudada apesar do seu uso
pela populao do semirido. Tambm importante avaliar a atividade
antimicrobiana da
Phanera flexuosa, principalmente frente os microrganismos
multirresistentes, no intuito de
descobrir novos antimicrobianos, assim como, avaliar a influncia
desse extrato sobre os
fatores de virulncia de Staphylococcus aureus, um dos principais
patgenos resistentes
envolvidos nas infeces hospitalares.
A descoberta de novos produtos de origem natural ou compostos
qumicos isolados
com atividade biolgica de grande interesse cientfico, ambiental,
tecnolgico e econmico
para o Brasil, principalmente considerando o possvel
desenvolvimento de novos fitoterpicos
e fitofrmacos, alm da gerao de patentes. Deste modo, o presente
trabalho tem como
objetivo avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanlico
das folhas de Phanera
flexuosa (Moric.) L.P.Queiroz (Caesalpinioideae) contra
Staphylococcus aureus resistentes a
antibiticos, e sua influncia sobre os fatores de virulncia
desses isolados de ambientes
hospitalares de Vitria da Conquista BA.
19
2 FUNDAMENTOS TERICOS
2.1 AVALIAO DA ATIVIDADE BIOLGICA DE PLANTAS MEDICINAIS
As plantas medicinais tm formado a base dos cuidados em sade em
todo o mundo,
desde os primrdios da humanidade at os dias atuais, sendo que so
de grande importncia
no comrcio internacional. O reconhecimento de seu valor clnico,
farmacutico e econmico
continua a crescer, embora isso varie muito entre os pases. As
plantas so importantes fontes
para a investigao farmacolgica e desenvolvimento de
medicamentos, no s quando
fitocompostos bioativos so usados diretamente como agentes
teraputicos, mas tambm
como matrias-primas para a sntese de drogas ou como modelos para
os compostos
farmacologicamente ativos (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003).
O valor dos produtos naturais claramente reconhecido na
descoberta de novos
compostos bioativos, sendo que, das novas drogas aprovadas pelo
FDA desde 1983 at 1994,
28% procedem inteiramente de produtos naturais, 39% so derivados
de produtos naturais e
33% so drogas de origem sinttica (NEWMAN; CRAGG; SNADER,
2003).
As espcies vegetais apresentam a capacidade de produzir,
transformar e acumular
inmeras substncias que no esto necessariamente relacionadas de
forma direta com a
manuteno da vida da planta, mas garantem vantagens para a sua
sobrevivncia e para a
perpetuao da espcie, sendo chamados de metablitos secundrios. A
sua produo
determinada por necessidades ecolgicas e possibilidades
biossintticas. Assim, os
metablitos secundrios, por serem fatores de interao entre
organismos, frequentemente
apresentam atividades farmacolgicas importantes (SANTOS,
2007).
Os fitofrmacos, molculas com aes teraputicas de origem vegetal
representam
uma alternativa tecnolgica e econmica em relao ao elevadssimo
custo de
desenvolvimento de um novo medicamento realizado atravs da
anlise combinatria e
sntese de molculas a partir de moldes biolgicos que apresentam
diversos efeitos
indesejveis, tais como a prpria dificuldade de adaptao ao
receptor biolgico (LASTRES
et al., 2001).
Alm disso, as preparaes vegetais tm uma caracterstica muito
especial que as
distinguem de drogas qumicas: uma nica planta pode conter um
grande nmero de
fitocompostos bioativos e ainda mais em uma combinao de plantas.
Essa complexidade
um dos desafios mais importantes para a tentativa de identificar
um nico composto bioativo
no universo enorme que inclui um nico extrato bruto
(MENDONA-FILHO, 2006).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Newman+DJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Cragg+GM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Snader+KM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Newman+DJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Cragg+GM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Snader+KM%22%5BAuthor%5D
20
A avaliao do potencial teraputico de plantas medicinais e seus
metablitos
secundrios, tais como alcalides, esterides, triterpenos,
taninos, saponinas, flavonides,
lignanas (ARRUDA, 2008), tm sido objeto de constante estudo que
inclui a investigao da
atividade farmacolgica e toxicolgica de substncias isoladas,
fraes e extratos totais da
droga vegetal (ZANETTI, 2002).
2.1.1 Antibioticoterapia
Desde os primrdios da existncia humana, o homem vem sendo
acometido por
doenas de origem microbiana (CLEVELAND et al., 2001; RILEY;
WERTZ, 2002). Embora
na histria da humanidade, a luta contra infeces causadas por
microrganismos existe h
mais de 50.000 anos, s recentemente foi descoberta a natureza
infecciosa de algumas
doenas. No incio, utilizando-se de conhecimentos empricos,
buscava-se na natureza a cura
para todos os tipos de doenas, onde inclusive, se usava extratos
vegetais e venenos de
animais (WHITE, 2002; PAGES, 2004).
Em 1910, Paul Ehrlich, um mdico alemo, aps testar centenas de
substncias
encontrou um agente quimioterpico efetivo no combate da sfilis,
chamado salvarsan, um
derivado de arsnico (MCDERMOTT et al., 2003). Em 1929, o
primeiro antibitico, a
penicilina G, foi descoberta por Fleming, seguido pelo
surgimento de derivados
sulfonamdicos na dcada de 30 e novas classes de antibiticos nos
anos seguintes (CHOPRA
et al., 2002; BUYNAK et al., 2004).
A penicilina liga-se s protenas de ligao de penicilina (PBP
penicilin binding
protein) e possui 04 isoformas (PBP1, 2, 3 e 4), distintamente
expressas pelo microrganismo.
Ao ser internalizado pelo microrganismo, o frmaco atua ao inibir
a atividade de
transpeptidase realizada por estas PBPs, responsvel pela ligao
cruzada entre a N-acetil-
glucosamina e o cido N-acetil-murmico, que formam o arcabouo da
rede do
peptideoglicano, principal constituinte da parede celular
bacteriana. O evento final a
inativao do agente inibidor de enzimas autolticas da parede
celular bacteriana, levando a
clula lise (TIPPER, 1985; RANG et al., 2007)
A introduo da benzilpenicilina teve um efeito marcante nas taxas
de mortalidade
provocada por S. aureus. Desde ento, inmeros pacientes foram
curados de infeces
potencialmente fatais usando-se um ou mais esquemas teraputicos
com antibiticos. Porm,
o uso indiscriminado de tais drogas resultou no aparecimento de
patgenos resistentes, o que
tornou necessrio o emprego cada vez maior de novos frmacos
(FALCO et al., 2002).
21
A evoluo das cepas de bactrias resistentes e multirresistentes
atravs da histria
tem sido rpida e preocupante. Em 1944, foram descritas as
primeiras cepas produtoras de
penicilinase em ambiente hospitalar, at ento raramente
encontradas (ERSON, 2005;
ROLAIN; RAULT, 2005). O aumento da prevalncia de S. aureus
resistentes a
benzilpenicilina foi inicialmente superado pela introduo das
penicilinas semissintticas, e
dcadas mais tarde, pelas penicilinas sintticas (CHAMBERS,
2001).
Em 1959, a meticilina foi introduzida para o tratamento das
infeces causadas por S.
aureus resistentes a penicilinas. No entanto, em 1961, no Reino
Unido, ocorreram os
primeiros relatos de cepas isoladas de S. aureus resistentes a
meticilina (MRSA methicilin
resistant S. aureus), que rapidamente apareceram em outros pases
europeus, com surtos
hospitalares provocados por estes organismos. Rapidamente, houve
relatos de MRSA isolados
no Japo, Austrlia, Estados Unidos e na Amrica Latina (POWERS,
2004). A resistncia
meticilina e oxacilina se deve a alterao na expresso das
protenas de ligao a penicilina
(PBPs), onde uma variante mutante, a PBP2a tem menor afinidade
pelos antibiticos -
lactmicos, mantendo suas funes na fisiolgica do microrganismo,
garantindo sua
multiplicao (MALOUIN; BRYAN, 1986).
Uma vez que a grande maioria dos clones de MRSA,
internacionalmente disseminados
nos hospitais, apresentava frequentemente multirresistncia a
drogas, a vancomicina tornou-se
o antibitico de escolha para o tratamento das infeces causadas
por esses microrganismos.
A vancomicina um glicopeptdio conhecido desde 1956, mas no foi
utilizado anteriormente
devido o sucesso da meticilina, da oxacilina e de outras
isoxazolilpenicilinas (MAINARDI et
al.,1995). Os glicopeptdeos, como vancomicina e teicoplanina,
ainda constituem a
teraputica de escolha nas infeces por MRSA. Contudo, h relatos
de cepas de S. aureus
apresentando susceptibilidade reduzida aos glicopeptdeos,
isolados com resistncia
intermediria vancomicina (VISA) e os resistentes vancomicina
(VRSA) no Japo e nos
Estados Unidos (CENTERS FOR DISEASE CONTROL PREVENTION,
2002;
HIRAMATSU et al., 1997).
A resistncia a drogas de patgenos humanos e animais um dos casos
mais bem
documentados de evoluo biolgica e um srio problema, tanto em
pases desenvolvidos
como em desenvolvimento. Baquero e Blzquez (1997) relataram o
perigo do retorno a uma
era pr-antibitico, particularmente considerando que nenhuma nova
classe de antibitico foi
descoberta nos ltimos anos, apesar das intensas pesquisas das
indstrias farmacuticas. Em
vista do presente cenrio, a busca por novas substncias
antimicrobianas a partir de fontes
22
naturais, como as plantas, tem ganhado importncia nas companhias
farmacuticas
(DUARTE, 2006).
Entre os anos 1980-2000, as principais ferramentas utilizadas
para a busca de novos
antibiticos foram a genmica e as triagens de colees de
compostos, em detrimento s
triagens de produtos naturais microbianos. Porm, houve uma reduo
dramtica na
identificao de novos prottipos antibiticos, ao mesmo tempo em
que ocorreu um aumento
na incidncia de resistncia bacteriana (GUIMARES et al., 2010).
Dentre as razes que
justificam a necessidade urgente do surgimento de novos agentes
antibiticos podemos
destacar: as doenas infecciosas que so a segunda maior causa de
mortalidade do mundo; as
altas taxas de resistncia microbiana em ambientes hospitalares;
o decrscimo constante
observado no nmero total de novos agentes antimicrobianos
aprovados pelo FDA; e a
necessidade de agentes que atuem por mecanismos de ao diferentes
aos atuais frmacos em
uso, com maior seletividade e menor toxicidade (GUIMARES et al.,
2010).
As plantas podem contribuir na descoberta de novos antibiticos
na medida em que
possvel que metablitos secundrios com atividade antimicrobiana
sejam biossintetizados
para prevenir e/ou combater o ataque de microrganismos
patognicos s plantas. Gibbons
(2004) cita vrios exemplos de metablitos isolados de plantas
frente Staphylococcus sp. As
plantas so possuidoras de vrias vias metablicas que do origem a
compostos, tais como,
fenis, terpenos, alcalides, lecitinas, polipeptdios e
poliacetilenos. Alm dessas classes,
outras substncias de origem vegetal mostram certa atividade
antimicrobiana, como:
poliaminas, isotiocianatos, tiossulfinatos e glicosdeos
(NOGUEIRA, 2000). Os vegetais ricos
em taninos, flavonides, leos essenciais e poli fenis esto entre
os extratos mais avaliados
para esta atividade (COUTINHO et al., 2008). Deste modo, a
diversidade de molculas
encontradas nas plantas faz das mesmas promissoras fontes de
novos agentes antimicrobianos
(COUTINHO et al., 2008).
Os trabalhos relacionados atividade atimicrobiana de plantas
tiveram incio na
dcada de 1940. Em 1943, Osborn pesquisando a atividade de 2300
plantas superiores contra
S. aureus e Escherichia coli, verificou que as plantas
pertencentes a 63 gneros continham
substncias que inibiam o crescimento de um ou de ambos os
microrganimos (PEDERSON;
FISHER, 1984). No Brasil, as pesquisas sobre substncias
antimicrobianas de origem vegetal
iniciaram-se com Cardoso e Santos (1948) que avaliaram extratos
de 100 diferentes plantas
indicadas em teraputica popular como anti-inflamatrios ou
cicatrizantes/antimicrobianos.
Destas plantas, cinco extratos apresentaram atividade contra S.
aureus, Escherichia coli e
Proteus X-19 (SANDERS; WEATHERWAX; MCCLUNG, 1945).
23
O estudo cientfico de plantas medicinais usados na medicina
tradicional essencial
para diminuir os riscos de efeitos adversos para a populao,
comprovar a atividade biolgica
das plantas e perpetuar o conhecimento tradicional sobre essas
plantas medicinais. Tambm
importante que sejam realizados estudos para garantir que estes
frmacos naturais sejam
seguros, estveis, padronizados e mais seletivos quanto a sua
atividade biolgica.
Os produtos naturais so responsveis diretamente ou indiretamente
por cerca de 40%
de todos os frmacos disponveis na teraputica moderna e, se
considerarmos os usados como
antibiticos e antitumorais, esta porcentagem pode chegar a
aproximadamente 70%
(PHILLIPSON, 2001; YUNES; CALIXTO, 2001). Os compostos isolados
de plantas so
substncias com estruturas qumicas bem diferenciadas dos
antimicrobianos obtidos a partir
de bactrias, leveduras e fungos. Tais produtos podem atuar no
metabolismo intermedirio
ativando enzimas no nvel nuclear ou ribossomal, provocando
alteraes nas membranas ou
interferindo no metabolismo (ESTEVAM, 2006).
No Brasil, a investigao sobre produtos naturais com atividade
antimicrobiana contra
MRSA tambm aumentou significativamente nos ltimos anos. Machado
et al. (2003)
estudando 14 extratos de plantas usadas tradicionalmente no
Brasil para tratamento de
doenas infecciosas, verificaram que Punica granatum (rom) inibiu
linhagens de S. aureus
sensveis e resistentes (MRSA) a meticilina, concluindo que esta
substncia apresenta
potencial como agente no tratamento de infeces causadas por
MRSA. Silva et al. (2007)
avaliaram a ao antimicrobiana do extrato hidroalcolico da casca
do caule de Anacardium
occidentale (cajueiro) sobre MRSA e obtiveram Concentrao
Inibitria Mnima (CIM) de
6,25 mg/mL do extrato, para 4 amostras MRSA. A atividade
antimicrobiana positiva do
extrato do cajueiro frente a amostras de S. aureus, pode ser
devido presena de compostos
como taninos (compostos polifenlicos) e alcalides previamente
encontrados na planta, uma
vez que estes compostos tm comprovada ao antimicrobiana, e que
compostos fenlicos
possuem uma ao inespecfica sobre o microrganismo, rompendo a
parede celular bacteriana
e inibindo os sistemas enzimticos para a formao da mesma
(HASLAM, 1996; JORGE et
al., 1996; AKINPELU, 2001).
Agente modificador de resistncia ou da atividade antibitica um
termo usado para
substncias que modulam ou mesmo revertem resistncia bacteriana a
certos antibiticos, ou
seja, potencializam a atividade de um antibitico contra uma cepa
resistente (DE MARCO;
CUSHING; FREMPONG-MANSO, 2007; GIBBONS, 2004). Dentre esses
modificadores,
destacamos vrios produtos naturais de origem vegetal (extratos e
fitoconstituintes) que
alteram a susceptibilidade microbiana aos antibiticos por inibio
de bombas de efluxo
24
(GIBBONS, 2004). A reserpina um composto isolado da planta
Rawolfia serpentina
conhecida como inibidora de bomba de efluxo (EPI - efllux pump
inhibitors), em vrios
microrganismos multirresistentes, incluindo S. aureus (GIBBONS;
OLUWATUYI; KAATZ,
2003; STAVRI et al., 2007; OLUWATUYI; KAATZ; GIBBONS, 2004).
Entretanto, a
toxicidade da reserpina e seus efeitos adversos em seres
humanos, mesmo em baixas
concentraes (MASHOUR; LIN; FRISHMAN, 1998), limitou o seu uso,
justificando-se
assim a busca de EPIs alternativas. Mohtar et al. (2009) avaliou
o potencial de 13 alcalides
como inibidores e/ou agentes modificadores da resistncia atravs
da inibio da bomba de
efluxo contra S. aureus sensvel meticilina (MSSA) e em cinco
outros MRSA isolados,
apresentando diferentes nveis de susceptibilidade vancomicina. A
notvel atividade
inibitria de efluxo foi detectada pelo quinino, piperina e
harmalina, usando a reserpina como
controle positivo. Os resultados deste estudo sustentam a opinio
de que um grande nmero
de fitocompostos possui potencial farmacolgico e ainda no foram
descobertas.
2.2 RESISTNCIA MICROBIANA E INFECES HOSPITALARES
2.2.1 Resistncia microbiana
O uso indiscriminado dos antimicrobianos na comunidade e tambm
no ambiente
hospitalar um fator de risco importante para aparecimento e
disseminao da resistncia
microbiana (ANVISA, 2005). A presso de seleo de microrganismos
resistentes pelos
antimicrobianos consequente no s ao uso teraputico ou profiltico
destas drogas em
medicina e odontologia humanas, como tambm de seu emprego em
medicina veterinria, na
conservao de alimentos, no combate a elementos biolgicos
daninhos aos seres humanos e
na engorda de animais destinados alimentao. Em geral, bactrias
tm a habilidade
gentica de transmitir e adquirir resistncia a drogas usadas como
agentes teraputicos
(NASCIMENTO et al., 2000), pois so frequentes os relatos sobre
isolamentos de bactrias
que eram reconhecidamente sensveis as drogas de uso na rotina,
mas que se tornam
resistentes a todos, ou a quase todos, frmacos disponveis no
mercado (SAKAGAMI;
KAJAMURA, 2002).
25
As bactrias podem desenvolver resistncia aos antibiticos por
meio de alguns
mecanismos bioqumicos j bem difundidos na literatura (JACOBY,
2005; HOOPER, 2005;
BOMONO; SZABO, 2006; MIN et al., 2007). Esses mecanismos
incluem:
a) modificao qumica do antibitico, atravs de enzimas
especficas;
b) alterao do stio de ligao do antibitico;
c) substituio do stio de ligao da droga;
d) diminuio da permeabilidade ao antibitico;
e) aumento da sntese de substrato com o qual a droga
compete;
f) efluxo do antibitico, por intermdio de transporte ativo
(ROUVEIX, 2007)
g) sntese de protenas protetoras dos ribossomos.
Esses mecanismos podem coexistir em uma mesma cepa bacteriana
que, ainda pode
desenvolver resistncia cruzada contra distintos antibiticos
(NEU, 1992; GOLD;
MOELLERING, 1996; RUSSEL, 2002; CHOPRA et al., 2002). A
resistncia pode ser
consequncia da ao de outros fatores, como o stio de infeco onde
se encontra a cepa
bacteriana e a concentrao do antibitico.
A colonizao por S. aureus, especialmente envolvendo amostras
multirresistentes, em
pacientes hospitalizados e profissionais de sade, representa um
srio problema para a sade
pblica (SCOTT; BLOOMFIELD, 1990). O Ministrio da Sade (MS), na
portaria n 2.616
de 12/05/1998, define infeco hospitalar (IH) como a infeco
adquirida aps a admisso do
paciente na unidade hospitalar e que se manifesta durante a
internao ou aps a alta, quando
puder ser relacionada com a internao ou procedimentos
hospitalares. So tambm infeces
hospitalares aquelas manifestadas aps 72 horas da internao,
quando associadas a
procedimentos diagnsticos e/ou teraputicos, realizados durante
este perodo (BRASIL,
1998).
2.2.2 Infeces hospitalares (IH)
As infeces hospitalares constituem atualmente um problema de
sade pblica.
Inferncias epidemiolgicas as colocam como uma das principais
causas de
morbimortalidade, alm de constiturem significativa carga social,
emocional e econmica
para os pacientes e para todo o sistema de sade. No Brasil,
mesmo com a legislao vigente
no pas, os ndices de IH permanecem altos, em torno de 15,5%, o
que corresponde a 1,18
episdios de infeco por paciente internado nos hospitais
brasileiros. Alm disso, considera-
se mais um agravante, o fato das instituies pblicas de sade
possurem a maior taxa de
26
prevalncia de IH no pas, com 18,4% (PRADE, 1995). Uma infeco
hospitalar acresce, em
mdia, 5 a 10 dias ao perodo de internao. Alm disso, os gastos
relacionados a
procedimentos diagnsticos e teraputicos da infeco hospitalar
fazem com que o custo do
tratamento dos clientes com IH seja trs vezes maior que o custo
dos clientes sem infeco.
Dados da literatura internacional demonstram, por exemplo, que
as unidades de terapia
intensiva so propcias ao aparecimento e disseminao da resistncia
microbiana. Os
pacientes mais vulnerveis para adquirirem bactrias
multirresistentes so os internados em
setores crticos do Hospital, como Unidades de Terapia Intensiva,
Berrio de neonatos, Setor
de Dilise e Transplantados, ou que necessitem de observao mais
rigorosa e utilizao de
procedimentos teraputicos invasivos (RICHARDS et al., 1999;
2000). Os pacientes desses
ambientes esto em estado mais grave e so submetidos aos vrios
procedimentos invasivos
que regionalmente utilizam antibiticos de amplo espectro de ao.
Alguns locais e materiais
reutilizados nos hospitais so descritos na literatura como
fatores de risco para a aquisio de
microrganismos antibitico-resistentes, para o surgimento de
infeces nosocomiais e a
disseminao destes como algumas cepas de estafilococos e bacilos
Gram-negativos.
Outra caracterstica, que contribui para a sua persistncia em
hospitais, a capacidade
dessas cepas de sobreviver por longos perodos de tempo fora do
corpo humano (KRAMER;
SCHWEBKE; KAMPF, 2006). Estudos sobre as caractersticas do
biofilme formado pelos S.
aureus revelaram que essas cepas so capazes de persistir por at
7 meses sobre superfcies
inanimadas secas (SCOTT; BLOOMFIELD, 1990; WAGENVOORT; PENDERS,
1997;
NEELY; MALEY, 2000), principalmente se essas superfcies forem
plsticas (KRAMER;
SCHWEBKE; KAMPF, 2006). As superfcies inanimadas e os
equipamentos so possveis
fontes de bactrias, principalmente as resistentes (DREES et al.,
2008; KAYABAS et al.,
2008). No raramente apontada a contaminao de equipamentos,
superfcies e solues de
limpeza por microrganismos de importncia epidemiolgica. Estes
dados se tornam
extremamente relevantes em hospitais, onde as superfcies esto
frequentemente
contaminadas com patgenos nosocomiais e em contato com as mos,
representam
importantes vetores de transmisso cruzada.
Alguns locais e materiais reutilizados nos hospitais so
descritos na literatura como
fatores de risco para a aquisio de microrganismos
antibitico-resistentes, para o surgimento
de infeces nosocomiais e a disseminao destes como algumas cepas
de estafilococos e
bacilos Gram-negativos. Amrutkar et al. (2006) citam que existem
vrios outros fatores de
risco que podem colocar os pacientes em risco de candidemia e
bacteremia, como o uso de
materiais termossensveis que so desinfetados e reutilizveis,
incluindo-se cateteres
27
intravenosos, instrumentos para nutrio parenteral, ventilao
mecnica, entre outros
materiais como mscara de nebulizadores (CATHERINE et al., 2007;
KIKUCHI et al., 2007).
Os profissionais da sade tambm tm sido apontados, por meio de
suas mos, como
importantes fatores de disseminao do MRSA no ambiente
hospitalar. Estes profissionais
adquirem transitoriamente o microrganismo atravs do contato com
o paciente infectado, ou
mesmo, colonizado, ou ainda pelo contato indireto, atravs do
ambiente, via reservatrios
inanimados (BOYCE; POTTER-BYNOE; CHENEVERT, 1997).
No Brasil, a frequncia de isolamento de S. aureus MRSA e sua
relao com infeces
hospitalares atingem valores elevados. Em muitos hospitais
brasileiros, a prevalncia de
isolamento de cepas de MRSA varia de 40 a 80% (OLIVEIRA et al.,
2001; TRINDADE et
al., 2005). Um estudo realizado no Hospital Espanhol em Salvador
(BA) demonstrou que em
9 anos a prevalncia dessas bactrias resistentes
meticilina/oxacilina foi de 28%, sendo que
os lugares com maior deteco dessas bactrias foram a UTI (59%), a
unidade de hemodilise
(43%), unidade de doenas infectocontagiosas (34%), unidade
neonatal (18,5%) quando
comparados com os outros locais do hospital (BRITES et al.,
2006). Foram relatados por
Souza e Figueiredo (2008), 68 casos de infeces atribudas ao S.
aureus resistente oxacilina
entre fevereiro de 2003 a janeiro de 2006 no Hospital
Universitrio Regional de Maring. A
avaliao de diferentes materiais clnicos detectou maior
prevalncia de isolamento em pontas
de catter (39,2%) e em secrees orotraqueais (34,2%).
Cepas de S. aureus resistentes meticilina, enterococos
resistentes vancomicina e
bastonetes Gram negativos multirresistentes esto tornando
prevalentes tambm em hospitais
infantis (BIZARRO; GALLAGHER, 2007). A vancomicina era o nico
antibitico efetivo
contra os MRSA, mas, em 1997, foram descritos S. aureus com
resistncia vancomicina e
teicoplanina. Estafilococos com resistncia aos glicopeptdeos
foram recentemente
encontrados no Brasil. Registrou-se o isolamento de S. aureus
com resistncia intermediria
vancomicina no Rio de Janeiro, em So Paulo e Porto Alegre e de
estafilococos coagulase
negativos resistentes vancomicina e teicoplanina em So Paulo
(OTLIA; 1999;
MAMIZUKA; OLIVEIRA, 2000).
Assim, a aquisio de MRSA pode levar a consequncias adversas
graves para os
pacientes, alm de ampliar o tempo de hospitalizao e aumentar os
custos relacionados com
a assistncia mdico-hospitalar (HUANG; PLATT, 2003). Deste modo,
nos ltimos anos, as
indstrias farmacuticas tm sido motivadas para o desenvolvimento
de novas drogas
antimicrobianas, especialmente em funo da ocorrncia de
resistncia microbiana a tais
medicamentos.
28
2.3. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
2.3.1 Staphylococcus aureus
Os microrganismos do gnero Staphylococcus pertencem famlia
Micrococcaceae e
apresentam forma de coco, tendendo a formar agrupamentos
semelhantes a cachos de uva.
So gram positivos, possuindo dimetro variando entre 0,5 e 1,5 m,
imveis e no formam
esporos. Possuem metabolismo fermentativo e respiratrio, neste
ltimo, vindo a produzir
catalase (VARNAN; EVANS, 1991; KLOOS; BANNERMAN, 1999). Crescem
em meios
comuns, pH 7, temperatura de 37C. O gar manitol-sal um meio
seletivo para essa
espcie, devido capacidade desse microrganismo fermentar o
manitol com produo de
cido ltico. As colnias formadas, aps 18-24 horas de incubao, so
arredondadas, lisas e
brilhantes. A cor da colnia varia do acinzentado ao
amarelo-ouro. Na cultura em gar sangue
caracterstica a formao de um halo de beta hemlise ao redor das
colnias (KONEMAN et
al., 2001).
Staphylococcus spp. possui uma distribuio ubiquitria, sendo seu
reservatrio
primrio a pele e membranas mucosas, especialmente a regio
nasofarngea de mamferos e
aves (ATANASSOVA; MEINDL; RING, 2001). Atualmente, o gnero
composto por 38
espcies e 24 subespcies (EUZBY, 2005), sendo que algumas so
frequentemente
associadas a uma ampla variedade de infeces de carter
oportunista, tanto em seres
humanos como em animais (TRABULSI; TEIXEIRA; BUERIS, 2004).
Dentre estas espcies,
destaca-se S. aureus como a mais envolvida em doenas em seres
humanos (KONEMAN et
al., 2001).
Os S. aureus so normalmente encontrados colonizando a pele e
membranas mucosas
de humanos. Elevadas concentraes desse microrganismo podem estar
colonizando as axilas,
poro anterior das narinas e o perneo. Porm, essas bactrias tambm
podem estar
distribudas em outros nichos, como orofaringe, boca, vagina,
trato intestinal e glndulas
mamrias (WERTHEIM et al., 2005). A capacidade de um patgeno de
superar as defesas do
organismo humano, conseguir coloniz-lo e manifestar a sua
patogenicidade so os fatores
responsveis pela variao no quadro de sinais e sintomas que
caracterizam as patologias
(CARDOSO et al., 2007; ROUVEIX, 2007). A patogenicidade das
bactrias determinada
29
pelo desenvolvimento de mecanismos que contribuem para o aumento
de sua capacidade de
infeco e que ajudam a burlar o sistema imunolgico do hospedeiro
(CHOPRA et al., 2002).
O S. aureus tambm o principal patgeno envolvido em uma grande
variedade de
manifestaes clnicas, tais como infeces de feridas, pneumonia,
septicemia e endocardite
tanto em pases desenvolvidos como os Estados Unidos, e tambm
aqueles em
desenvolvimento. um microrganismo nico quando comparado a outros
clinicamente
relevantes, pois apresenta trs caractersticas fundamentais:
apresenta uma srie de fatores de
virulncia, apresenta capacidade crescente de desenvolver
resistncia a antibiticos, e
responsvel por infeces nosocomiais e comunitrias (JACOBSSON,
2009). Agentes
antimicrobianos -lactmicos, como a penicilina, so os frmacos de
escolha para o
tratamento das infeces graves por S. aureus. Contudo, a partir
da introduo dos mesmos a
partir da dcada de 1940, rapidamente surgiram cepas resistentes,
por meio da produo de -
lactamases (penicilinases), enzimas que inativam tais frmacos. A
seguir, foram introduzidas
novas drogas resistentes ao das -lactamases, tais como a
meticilina no uso clnico,
surgindo posteriormente o S. aureus resistente meticilina.
O S. aureus resistente meticilina (MRSA) surgiu a partir de
1960, como importante
patgeno hospitalar em todo o mundo (CHAMBERS, 2009; DIEKEMA et
al., 2001;
HIRAMATSU et al., 2002). Inicialmente, restritas ao ambiente
hospitalar (hospital-acquired
methicillin resistant S. aureus, HA-MRSA), as cepas resistentes
tomaram um novo perfil a
partir da dcada de 1990, com infeces comunitrias
(community-acquired methicillin
resistant S. aureus, CA-MRSA) relevantes em indivduos saudveis e
no sujeitos aos fatores
de risco do ambiente hospitalar, tais como cirurgias,
imunossupresso e outros
(KOBAYASHI; DeLEO, 2009). O aumento da prevalncia de MRSA
tornou-se uma grande
ameaa para o setor da sade em todo o mundo, devido
principalmente sua virulncia,
opes teraputicas limitadas e sua distribuio em ambos os
ambientes, hospitalar e
comunidade (HULETSKY et al., 2004).
A resistncia dos S. aureus a meticilina causada principalmente
pela aquisio
exgena do gene mecA, que codifica uma protena de ligao
penicilina (PBP penicilin
binding protein) com baixa afinidade de ligao ao antibitico,
denominada por PBP2a ou
PBP2 (HIRAMATSU et al., 2001).
O gene mecA, confere a expresso da resistncia
meticilina/oxacilina em S. aureus.
O gene mecA carreado por um elemento gentico mvel de 26 a 67
kilobases, denominado
cassete cromossmico estafiloccico (staphylococcal cassette
chromosome mec - SCCmec)
30
(KURODA et al., 2001), responsveis por codificar a protena de
ligao alterada, resultando
no quadro de multirresistncia. O sequenciamento de vrias
linhagens de MRSA tem revelado
oito diferentes altipos de SCCmec, tipos I-V, todos carreando
dois componentes genticos
essenciais combinados, conhecidos como complexo gnico mec e o
complexo gnico cassete
cromossmico recombinase (ccr). Os isolados de MRSA associados ou
adquiridos na
comunidade (CA-MRSA) apresentam caractersticas fenotpicas e
genticas distintas, quando
comparadas s cepas tpicas isoladas nos hospitais (HA-MRSA). O
SCCmec tipo I (34 kb) foi
detectado na cepa NCTC 10442, o primeiro MRSA isolado em 1961,
no Reino Unido. O tipo
II (52 kb) foi identificado em uma cepa de MRSA, isolada no Japo
em 1982, denominada
N315, e o tipo III (66 kb) foi identificado em uma cepa de MRSA,
isolada em 1985 na Nova
Zelndia e foi denominada 82/2082.
Posteriormente, foi identificado em duas cepas associadas a
infeces comunitrias, o
menor elemento mec, o tipo IV (20 a 24 kb), que confere aos MRSA
um perfil de
sensibilidade diferente dos outros trs tipos, sendo sensvel s
outras classes de
antimicrobianos, que no os -lactmicos. (DUARTE; LENCASTRE, 2002;
OKUMA et al.,
2002). O mec tipo V (28kb) foi descrito a partir do cromossomo
de uma cepa de MRSA, de
origem comunitria, isolada na Austrlia, denominada WIS
(WBG8318). Este elemento foi
estruturalmente similar ao SCCmec tipo IV. (ITO et al., 2004).
No final de 2006, outro tipo
SCCmec foi proposto - o tipo VI. Cepas caractersticas deste tipo
possuem o complexo mecB,
o ccrAB altipo 4 e uma regio especfica J1. Quinze cepas de MRSA
contendo SCCmec
tipoVI foram inicialmente descritas no hospital Dona Estefnia
(Lisboa) e outras quatro cepas
foram encontradas em outros trs hospitais, sendo dois tambm
situados em Lisboa e outro em
Coimbra (OLIVEIRA; MILHEIRIO; DE LENCASTRE, 2006).
Em 2008, Higuchi et al.(2008) demonstrou a presena do SCCmec
tipo VII, em cepas
CA-MRSA pertencendo ao tipo de sequncia multilocus (ST) 59 de
Taiwan, tinha 41.347
pares de base em tamanho e flanqueado por 19 pares de bases de
sequncias attL e attR. A
regio central de 21.245 pares de bases contm o complexo mec
(C2b) e outro ccrC gene
(ccrC2), e era altamente homlogo ao SCCmecV, mas com
substituies, inseres e
rearranjos. A poro final do lado 3 apresentou uma sequncia nica
de 10.191 pares de
bases.
Os SCCmec tipos I, II e III esto associados a cepas de origem
hospitalar que tm
como caracterstica a resistncia a mltiplos antimicrobianos alm
dos -lactmicos como os
macroldeos, aminoglicosdeos, tetraciclinas, rifampicina,
cotrimoxazol e quinolonas
31
(HIRAMATSU et al., 1997). Muitos isolados de MRSA que apresentam
mltipla resistncia
so susceptveis apenas aos glicopeptdeos como a vancomicina. Os
SCCmec tipo IV e V no
possuem nenhum outro determinante de resistncia a
antimicrobianos alm do gene mecA, o
que explica uma das principais caractersticas dos isolados
comunitrios de MRSA, a
sensibilidade a diversos antimicrobianos no -lactmicos. (DUARTE;
LENCASTRE, 2002;
ENRIGHT et al., 2002; OKUMA et al., 2002; ITO et al., 2004).
O complexo gene mec corresponde s regies do gene mecA e dos
reguladores para a
expresso do mecA (mecR1 e mecI), e ainda o complexo gene ccr,
correspondendo regio
onde se encontram os genes para as recombinases, as quais so
responsveis pela mobilidade
do SCCmec. O gene mecA um segmento de DNA exgeno, ou seja, que
no nativo do S.
aureus, de 2,1 Kb, e controlado pelos genes mecR1 e mecI. O
produto do gene mecI reprime
a expresso do mecA ao se ligar ao operador, sendo esta represso
revertida pela presena
de meticilina ou qualquer outro -lactmico no meio (mecanismo de
induo). J a protena
mecR1, um produto do gene mecR1, uma protena de membrana
envolvida em um sistema
de transduo de sinal, a qual reconhece a presena de -lactmicos
atravs de seu domnio
extracelular ligador penicilina. Seu domnio citoplasmtico
apresenta atividade de protease e
degrada o mecI, permitindo assim a transcrio do gene mecA.
(McKINNEY et al., 2001).
Alm desses genes, outros elementos genticos tambm podem estar
presentes, dentre
eles os elementos de insero IS431 e IS257, os plasmdeos pUB110 e
pT181 e o transposon
Tn554, que carreia genes de resistncia eritromicina e
espectinomicina. Em adio, a
presena de mais de uma cpia do IS256 parece servir como hot spot
(regies de elevada
frequncia de recombinaes) para a insero de outros genes de
resistncia s drogas. Assim,
torna-se claro o porqu dos MRSA apresentarem, frequentemente,
mltipla resistncia aos
antimicrobianos associado presena do gene mecA (KATAYAMA; ITO;
HIRAMATSU,
2000).
O gene mecA regulado pelos genes mecI e mecR1, similarmente
regulao do blaZ
pelos genes blaI e blaR1 frente exposio penicilina. Na verdade,
mecI e mecR1 so
homlogos ao blaI e blaR1. A expresso dessa resistncia pode ser
homognea ou
heterognea. Na expresso homognea todas as colnias expressam
resistncia oxacilina e
na heterognea expressa apenas por parte das colnias apesar da
presena do gene mecA,
dificultando a interpretao do teste (ROSSI; ANDREZZI, 2006).
Alguns genes, denominados genes auxiliares ou fatores
essenciais, o gene fem (factor
essential for methicilin resistance), auxiliam o gene mecA a
expressar um alto nvel de
resistncia aos beta-lactmicos. Foram identificados muitos desses
genes fem, denominados
32
femA, femB, femC, femD, femE e femF (VANNUFFEL et al., 1995). O
gene femA essencial
para a expresso da resistncia dos MRSA e parece ser uma
caracterstica peculiar de S.
aureus, no sendo encontrado em outras espcies de estafilococos.
Outro importante
mecanismo de resistncia o efluxo em MRSA, sendo este
identificado como um dos
principais contribuintes para a resistncia de vrios antibiticos
estruturalmente
independentes. As bombas de efluxo so protenas integrantes da
membrana plasmtica
bacteriana e que tm sido responsabilizadas por diversos casos de
resistncia a drogas, as
quais so expelidas para fora da clula (PIDDOCK, 2006).
2.3.2 Fatores de virulncia de S. aureus
A capacidade de colonizao e patogenicidade de S. aureus so
provenientes de seus
fatores de virulncia. Tais fatores permitem sua aderncia s
clulas do hospedeiro ou
matriz extracelular, invadem as defesas imunolgicas e
proporcionam a invaso celular,
penetrao tecidual ou adeso a superfcies de catteres e prteses.
Esses diferentes
mecanismos de sobrevivncia, que partem dos constituintes de
parede celular e da produo
de enzimas e toxinas oferecem proteo ao microrganismo e permitem
sua disseminao
(VELZQUEZ-MEZA, 2005). As leses superficiais decorrentes de S.
aureus incluem
infeces cutneas como impetigo, foliculite, terol, furnculo,
carbnculo e mastite
(LEVINSON; JAWETZ, 2005). Em carter sistmico pode ocasionar
pneumonia, artrite,
endocardite e bacteremia (STAPLETON; TAYLOR, 2002). S. aureus
tambm esto
relacionados osteomielites. A expresso de adesinas que permitem
a fixao aos
componentes da matriz ssea, o fato de sobreviver
intracelularmente em osteoblastos e a
capacidade de formar biofilmes na superfcie de materiais
estranhos ao organismo como as
prteses, armam em conjunto, proteo contra o sistema imunolgico
do hospedeiro e tornam
essas cepas tolerantes ao dos antimicrobianos (DAVIS, 2005).
A formao do biofilme bacteriano tem sido descrita desde que Van
Leeuwenhoek
descreveu as placas bacterianas de seus prprios dentes no sculo
XVII. Entretanto, demorou
at 1978 para que houvesse o entendimento da importncia dessas
estruturas nos
ecossistemas, e seu significado mdico, por meio dos
conhecimentos obtidos para explicar sua
estrutura e relevncia. (DONLAN; COSTERTON, 2002).
Biofilmes so complexas comunidades microbianas fixadas em uma
superfcie e
embebidas em uma matriz extracelular. Estas comunidades podem se
fixar em uma grande
33
variedade de superfcies com composies qumicas diversas. Esforos
tm sido realizados
para compreender como se d o processo de adeso, desenvolvimento
e maturao dos
biofilmes, assim como a sua capacidade de desagregamento e
disperso, disseminando-se para
outras superfcies (BOLES; HORSWILL, 2011).
Do ponto de vista mdico, a formao de biofilmes representa um
importante
mecanismo de virulncia microbiano, pois ao aderir a superfcies e
produzir uma matriz
polissacardica, o microrganismo garante a continuidade do
processo infeccioso, assim como
maior resistncia aos mecanismos imunolgicos do hospedeiro e
tambm maior resistncia
aos antimicrobianos que as clulas planctnicas do mesmo agente
patognico (RODRGUEZ-
MARTNEZ; PASCUAL, 2008; BRYERS, 2008).
H uma clara percepo de que as clulas bacterianas em crescimento
nos biofilmes se
comportam distintamente das clulas com crescimento planctnico,
com alterao no padro e
na taxa de expresso gnica de molculas essenciais para seu
metabolismo, assim como de
fatores de virulncia (MACK et al., 2004). Nestas situaes, assume
papel preponderante um
sistema de intercomunicao celular conhecido como quorum sensing,
que constitudo por
pequenas molculas secretadas pelas clulas bacterianas (AIP-
autoinducing peptide)
moduladas pelo complexo gnico agr (acessory gene regulator) e
tambm pelos complexos
SarA e RNAIII, dentre outros (YARWOOD et al., 2004). Foi
demonstrado que nas populaes
bacterianas em biofilme existem variantes que expressam
distintamente fatores de
virulncia relacionados ao processo de adeso e crescimento
bacteriano dos prprios
biofilmes, como as adesinas, fibronectinas entre outros, e que
so geralmente modulados pelo
complexo agr (YARWOOD et al., 2007).
A formao do biofilme um processo dividido em etapas que depende
da aderncia
do microrganismo superfcie a ser colonizada, seguida da secreo
das molculas de adeso
intercelulares, secreo da matriz polissacardica, consolidao da
estrutura e em seguida o
destacamento de fraes ou pedaos que facilitam a disperso e
persistncia da infeco. O
fundamental neste processo a produo da adesina polissacardica
intercelular (PIA
polyssacaridic intercelular adhesin) que codificada pelo operon
ica (intercelular adeshin
locus) (FLUCKIGER et al., 2005) nos S. aureus.
Tal operon contm os genes icaA, icaB, icaC, icaD que produzem
enzimas
responsveis pela sntese do principal componente da PIA, o
polissacardeo poli-N-succinil--
1,6-glicosamina (PNSG), que apresenta resposta imunognica e tem
sido testado como
potencial alvo de vacinas; alm do gene icaR um modulador
negativo do sistema de expresso
(WILSON et al., 2011). O gene icaA responsvel pela produo de
protena transmembrana
34
com funo de N-acetil-glucosamina transferase, e que para a sua
tima atividade, requer a
co-expresso do produto do gene icaD. O polissacardeo produzido
alcana um tamanho
mximo de cerca de 20 resduos, sendo necessria a co-expresso do
produto do gene icaC
para obteno de estruturas de maior extenso. O produto do gene
icaC tambm est
envolvido na translocao do produto de sntese polissacardica para
a superfcie celular,
enquanto o produto do icaB responsvel pela desacetilao do
carboidrato que relevante
para os mecanismos de adeso intercelular e com as superfcies que
so substrato para a
instalao do biofilme (OGARA, 2007). O papel dos genes icaA e
icaD para formao de
biofilmes, tanto em S. aureus quanto S. epidermidis foi
demonstrado a partir do isolamento de
microrganismos de catteres urinrios de pacientes, apresentando
uma importante correlao
entre os isolados fortemente produtores de biofilme e a presena
de tais genes nas espcies
estudadas (GAD et al., 2009).
O produto do gene icaR membro da famlia TetR de protenas
regulatrias, e
localiza-se no mesmo locus, sendo divergentemente transcrito em
relao ao icaADBC. Ele
responsvel pela regulao negativa, ligando-se ao promotor 5 do
cdon de inicializao do
gene icaA. A transcrio de icaADBC tambm regulada positivamente
pelo regulador
global SarA e pelo fator SigB em condies de stress e por algumas
cepas (CUE et al., 2009)
Alm disso, estudos recentes tm demonstrado mecanismos
independentes do operon
ica e da presena de PIA para formao de biofilmes, pois isolados
que no possuem esses
genes, isolados defectivos, tm mantido esta propriedade
patognica. O papel dos reguladores
globais agr e SarA tm sido elucidado, atuando de formas
divergentes, enquanto o sistema
SarA est envolvido no ataque e adeso s superfcies, o sistema agr
parece estar envolvido
nos mecanismos de disperso (LAUDERDALE et al., 2009)
Anlise de isolados clnicos de S. aureus das infeces de prteses
articulares,
bacteremia, ou infeces relacionadas a cateteres demonstraram a
presena do locus ica na
maioria dos isolados, mas porcentagens variantes dessas cepas
apresentaram falta de produo
de PIA in vitro (ARCIOLA; BALDASSARRI; MONTANARO, 2001; CRAMTON,
1999,
2001; FOWLER, 2001; KNOBLOCH et al., 2002; MARTN-LPEZ et al.,
2002;
PEACOCK, 2002; ROHDE et al., 2001). Recentes publicaes
demonstram que outros
fatores influenciam a produo de PIA ou de biofilme, como glicose
e outros acares, alta
osmolaridade e anaerobiose (CRAMTON, 2001; GERKE et al., 1998;
KNOBLOCH et al.,
2001, 2002; MACK; SIEMSSEN; LAUFS, 1992; RACHID et al., 2000
).
As fibronectinas estafiloccicas (fnbA e fnbB) tm sido amplamente
investigadas pelo
seu papel de adeso as estruturas de clulas eucariticas in vitro
e in vivo, sendo que tais
35
adesinas exercem participao relevante no processo de fixao aos
tecidos colonizados e
internalizao por clulas fagocticas, e assim, contribuindo para o
desenvolvimento do curso
letal da infeco (SHINJI et al., 2011). De fato, as fibronectinas
estafiloccicas atuam como
MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive
matrix molecules), ou
seja, so molculas capazes de reconhecer protenas presentes no
plasma e na matriz
extracelular (fibronectina, fibrinognio e elastina) e expressam
variao genotpica e
fenotpica, funcionando como mecanismo de evaso as aes do sistema
imune (BURKE et
al., 2010).
Alm das fibronectinas, outros fatores de virulncia apresentam
importncia para a
adeso tecidual e invaso celular, destacando-se a Protena A
(Spa), o clumping factor A e B
(CflA e CflB), atuando tambm como mecanismos de evaso as
respostas imunolgicas do
hospedeiro, tanto humano quanto animal (STUTZ; STEPHAN; TASARA,
2011). A protena
A (Spa), presente na maioria das cepas de S. aureus, capaz de
interagir com diversos tipos
de receptores em clulas eucariticas, superfcies e plaquetas
(HENRY-STANLEY et al.,
2011; NGUYEN; GHEBREHIWET; PEERSCHKE, 2000; MERINO et al., 2009)
se liga a
poro Fc da molcula de IgG, alterando a ligao da imunoglobulina
com receptores de
macrfagos e outras clulas fagocticas, alm de componentes sricos
importantes pra defesa
imune, gerando efeitos anticomplementares, quimiotticos e
antifagocitrios, funcionado
como mecanismo de evaso resposta do hospedeiro (STUTZ; STEPHAN;
TASARA, 2011).
A capacidade de ligao da Spa com diversas estruturas contribui
para a aderncia de
S. aureus as variadas superfcies levando sua persistncia nas
infeces e a complicaes
dos quadros como endocardite (NGUYEN; GHEBREHIWET; PEERSCHKE,
2000),
formao de biofilmes em cateteres (HENRY-STANLEY et al., 2011) at
mesmo em
ausncia de PIA (MERINO et al., 2009). Pode ainda desencadear a
cascata pr-inflamatria
nas vias areas por ativao do receptor 1 de TNF- (DAVID; DAUM,
2010).
Os clumping factors A e B (CflA e CflB) so componentes da famlia
das
MSCRAMMs capazes de se ligar ao fibrinognio no plasma humano e
causar coagulao
intravascular. Ele tambm capaz de se ligar ao fator I, que
estimula a clivagem do fragmento
C3b na superfcie de clulas de S. aureus, para sua forma inativa
C3bi, que perde sua funo
de opsonina, com isso funcionando como um mecanismo de evaso da
resposta imune para o
microrganismo (WILSON et al., 2011). A capacidade de se ligar a
estruturas proteicas como
fibrinognio e outras protenas da matriz extracelular, alm de sua
imunogenicidade, tem
levado a realizao de estudos que visam definir o papel dos CflA
e CflB em patologias,
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como a septicemia (COLQUE-NAVARRO et al., 2000) e a artrite
sptica (JOSEFSSON et
al., 2001).
O S. aureus apresenta em sua parede celular, polissacardeos,
protenas antignicas e
molculas como o cido teicico, o glicanopeptdio, a protena A, alm
de cpsula e adesinas
que so capazes de induzir resposta imunolgica no hospedeiro
(OLIVEIRA et al., 2001). O
cido teicico capaz de ativar a via alternativa do complemento e
estimular a produo de
citocinas. O glicanopeptdio atua como agente quimiottico e induz
a produo de interleucina
1 (IL-1) e opsoninas, facilitando a fagocitose. A cpsula protege
o microrganismo da
fagocitose, tornando-o mais virulento e com maior capacidade de
invaso tecidual. A cpsula
uma estrutura polissacardica que envolve a parede celular da
maioria das cepas de S.
aureus, protegendo a bactria da fagocitose mediada pelo
complemento (C3b) por parte dos
neutrfilos polimorfonucleares, aumentando a virulncia e a
capacidade de invaso nos
tecidos e na corrente sangunea. As adesinas pertencem estrutura
gelatinosa do glicoclix e
promovem a aderncia s clulas do hospedeiro atravs da interao com
receptores qumicos
(VELZQUEZ-MEZA, 2005).
Alm disso, o S. aureus produz numerosas enzimas que favorecem a
invaso e
destruio tecidual do hospedeiro, assim como a disseminao para
demais stios anatmicos
(GORDON; LOWY, 2008). A mais conhecida a coagulase,
caracterstica do prprio S.
aureus, que coagula o plasma, ocasionando um emparedamento do
stio infectado, com o
objetivo de retardar a migrao de neutrfilos e dificultar a
fagocitose celular (LEVINSON;
JAWETZ, 2005). Outras enzimas incluem a catalase,
desoxirribonuclease (DNase),
hialu