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Universidade Federal da Bahia
Instituto de Cincias da Sade Programa de Ps-Graduao em Processos
Interativos dos rgos e Sistemas
TATIANE DE OLIVEIRA TEIXEIRA
EFEITOS IMUNOMODULATRIOS DO EXTRATO DE ALLIUM CEPA L. E DA
QUERCETINA
SOBRE A PRODUO DE MEDIADORES INFLAMATRIOS E A OSTEOCLASTOGNESE
IN VITRO
Salvador 2015
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TATIANE DE OLIVEIRA TEIXEIRA
EFEITOS IMUNOMODULATRIOS DO EXTRATO DE ALLIUM CEPA L. E DA
QUERCETINA
SOBRE A PRODUO DE MEDIADORES INFLAMATRIOS E A OSTEOCLASTOGNESE
IN VITRO
Salvador 2015
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Processos
Interativos dos rgos e Sistemas, Instituto de Cincias da Sade,
Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obteno
do ttulo de Doutor em Processos Interativos dos rgos e Sistemas.
rea de Concentrao: Distrbio dos rgos e Sistemas.
Orientadora: Prof. Dr. Camila A. Viana de Figueiredo
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T266p
Teixeira, Tatiane de Oliveira. Efeitos imunomodulatrios do
extrato de Allium cepa L. e da quercetina sobre a produo de
mediadores inflamatrios e a osteoclastognese in vitro / Tatiane de
Oliveira Teixeira. Salvador: 2015. 96f.: Il.; 30cm.
Orientadora: Profa. Dra. Camila Alexandrina Viana de Figueiredo
Tese (Doutorado) - Programa de Ps-Graduao em Processos Interativos
dos rgos e Sistemas do Instituto de Cincias da Sade da Universidade
Federal da Bahia. 1. Allium cepa L. Quercetina. Perda ssea.
Citocinas. Inflamao. Osteoclastos. . I. Figueiredo, Camila
Alexandrina Viana de. II. UFBA. IV. Ttulo. CDU 615-053.2
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TATIANE DE OLIVEIRA TEIXEIRA
EFEITOS IMUNOMODULATRIOS DO EXTRATO DE ALLIUM CEPA L. E DA
QUERCETINA
SOBRE A PRODUO DE MEDIADORES INFLAMATRIOS E A OSTEOCLASTOGNESE
IN VITRO
Aprovada em ________________________
Comisso Examinadora Camila Alexandrina Viana de Figueiredo
(Orientadora)___________________________ Doutora em Farmacologia
pela Universidade Estadual de Campinas, Brasil (2005) Professor
Adjunto IV da Universidade Federal da Bahia (UFBA) Gabriela Botelho
Martins_____________________________________________________
Doutora em Odontologia pela Pontifcia Universidade Catlica do Rio
Grande do Sul, Brasil (2004) Professor Adjunto da Universidade
Federal da Bahia (UFBA) Tercio Carneiro
Ramos_______________________________________________________ Doutor
em Farmacologia pela Universidade Federal do Cear, Brasil (2000)
Professor Adjunto da Universidade do Estado da Bahia (UNEB) Karina
Carla de Paula
Medeiros_______________________________________________ Doutora em
Produtos Naturais e Sintticos Bioativos pela Universidade Federal
da Paraba, Brasil (2009) Professor Adjunto II da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) Luciana Lyra Casais e
Silva___________________________________________________ Doutorado
em Cincias (Fisiologia Geral), pela Universidade de So Paulo,
Brasil (2001) Professor Adjunto da Universidade Federal da Bahia
(UFBA)
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Processos
Interativos dos rgos e Sistemas, Instituto de Cincias da Sade,
Universidade Federal da Bahia, como requisito para obteno do ttulo
de Doutor em Processos Interativos dos rgos e Sistemas. rea de
Concentrao: Distrbio dos rgos e Sistemas.
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Dedico este trabalho minha famlia, sempre muito presente e
essencial em minha vida.
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6
AGRADECIMENTOS
A toda a minha famlia, por ter acreditado em mim, permitindo que
eu tenha mais um sonho realizado.
minha me, Tnia Lcia, e ao meu pai, Gilberto, pelo apoio e amor
incondicional.
s minhas irms Tnzia e Thasa, pela compreenso, e aos meus
sobrinhos Pedro, Jlia e minha afilhada Clara, pela alegria e
coragem transmitidas, que me deram fora para superar o cansao e as
limitaes.
minha av Dilza, pelos ensinamentos da vida e pelo carinho.
Ao meu noivo Gabriel, pelo apoio incondicional, companheirismo e
amor.
Aos meus amigos, por compreenderem as minhas ausncias e me
apoiarem.
Profa. Camila Figueiredo, minha orientadora, exemplo de coragem,
perseverana e sucesso, pela confiana, pelo incentivo e pela
insistncia na busca da excelncia que um trabalho cientfico
exige.
Profa. Anuradha Prakki, por ter me apoiado e acolhido, cujos
ensinamentos e estmulo cientfico foram fundamentais.
A Getlio Nogueira-Filho, pela confiana e oportunidade.
Profa. Neuza Alcntara Neves, pelo aprendizado que me propiciou e
pela colaborao.
Aos meus colegas do Laboratrio do Imunofarmacologia e Biologia
Molecular (IMUNOBIO), pelo apoio e incentivo.
A todos aqueles da University of Toronto (UofT) que me
dispensaram carinho e colaborao durante meu estgio no Canad,
especialmente os meus colegas de laboratrio e amigos Carlos Brito,
Carolina Ferreira e Terry Stavroullakis, que atravessaram comigo
essa fase importante, com companheirismo e pacincia principalmente
nos momentos difceis.
Aos meus colegas de turma do doutorado, pelo inestimvel
companheirismo.
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7
AGRADECIMENTO INSTITUCIONAL
Fapesb, pelo financiamento durante o doutorado no Brasil (Bolsa
de Doutorado) e no exterior (Bolsa Doutorado Sanduche).
Universidade Federal da Bahia e ao programa de Ps-Graduao em
Processos Interativos dos rgos e Sistemas, por me proporcionarem
aprendizado e crescimento cientfico.
University of Toronto, na qual o presente trabalho foi
desenvolvido.
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8
Have the courage to follow your heart and intuition. They
somehow already know what you truly want to become.
Everything else is secondary. Steve Jobs
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9
TEIXEIRA, Tatiane de Oliveira. Efeitos imunomodulatrios do
extrato de Allium cepa L. e da quercetina sobre a produo de
mediadores inflamatrios e a osteoclastognese in vitro. 96f. : Il.
2015. Tese (Doutorado) - Instituto de Cincias da Sade, Universidade
Federal da Bahia, Salvador, 2015.
RESUMO
Introduo: A periodontite uma doena inflamatria que afeta a
insero do tecido conjuntivo e do osso de suporte que rodeia os
dentes. Os osteoclastos esto implicados na homeostasia do tecido
sseo em situaes patolgicas, como na doena periodontal. O
desequilbrio na remodelao ssea pela induo de inflamao e perda ssea
mediada pelos osteoclastos pode ser desencadeado pelo LPS de P.
gingivalis (PgLPS). Alguns fatores e frmacos podem restaurar a
homeostase do osso, com a regulao de mediadores inflamatrios como o
extrato metanlico de Allium cepa L. (AcE) e a quercetina (Qt), que
tm demonstrado possuir propriedades anti-inflamatrias. Objetivos:
Nossos objetivos foram analisar os efeitos imunomoduladores in
vitro do AcE e da Qt na osteoclastognese em condies inflamatrias
(PgLPS-induzida). Mtodos: Clulas precursoras de osteoclastos (RAW
264.7) foram diferenciadas com 30 ng/mL de RANKL, coestimuladas com
PgLPS (1 g/mL) e tratadas com AcE (50-1000 g/mL) ou Qt (1,25, 2,5
ou 5 M). Ensaios de reduo da resazurina e ensaio para mensurao de
protena total foram utilizados para avaliar a viabilidade celular.
Ensaio de fosfatase cida resistente ao tartarato (TRAP) foi
utilizado para determinar a quantidade de p-nitrofenol libertado; e
colorao de TRAP foi utilizada para avaliar o nmero e o tamanho dos
osteoclastos multinucleados. Os nveis de citocinas foram
quantificados por ELISA em sobrenadantes de cultura celular.
Utilizando-se ensaios de Western blot, foi avaliada a fosforilao e
a degradao do IB. Resultados: Foram determinadas concentraes no
citotxicas de AcE e de Qt em culturas celulares. A osteoclastognese
foi modulada negativamente nas concentraes testadas de AcE e de Qt
em comparao com o controle. Todas as concentraes de AcE e de Qt
diminuram significativamente o nmero de osteoclastos grandes,
presumivelmente mais ativos, e as concentraes de AcE a 1000 g/mL M
reduziram o nmero de osteoclastos pequenos. Observou-se um
decrscimo da produo de IL-6 e IL-1 e um aumento da produo de IL-3 e
IL-4. Alm disso, tanto o AcE quanto a Qt regularam negativamente a
via do NF-B. Concluso: Esses resultados sugerem que o AcE e a Qt
podem ser inibidores de osteoclastognese em condies inflamatrias,
por meio da diminuio da ativao da via do NF-B induzida por PgLPS e
RANKL. Mais estudos so necessrios para apoiar o uso do AcE e da Qt
para tratar doenas que envolvam perda ssea patolgica, incluindo-se
a periodontite. Palavras-chave: Allium cepa L. Quercetina. Perda
ssea. Citocinas. Inflamao. Osteoclastos.
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10
TEIXEIRA, Tatiane de Oliveira. Immunomodulatory effects of
Allium cepa L. extract and quercetin on the production of
inflammatory mediators and osteoclastogenesis in vitro. 96f. : Il.
2015. Thesis (PhD) - Instituto de Cincias da Sade, Universidade
Federal da Bahia, Salvador, 2015.
ABSTRACT
Introduction: Periodontitis is an inflammatory disease that
affects connective tissue attachment and the supporting bone that
surrounds the teeth. Osteoclasts are implicated in normal bone
remodeling and bone loss. P. gingivalis LPS (PgLPS) can cause an
imbalance in the remodeling by inducing inflammation and
osteoclast-mediated bone loss. Allium cepa L. (AcE) and quercetin
(Qt) have been shown to possess anti-inflammatory properties.
Objectives: Our aims were to examine the in vitro modulatory
effects of AcE and Qt on osteoclastogenesis under inflammatory
conditions (LPS-induced). Methods: RAW 264.7 cells were
differentiated with 30ng/mL of RANKL, co-stimulated with PgLPS
(1g/mL) and treated with AcE (50-1000 g/mL) or Qt (1.25, 2.5 or 5
M). Resazurin reduction and total protein content assays were used
to detect cell viability. Tartrate-resistant acid phosphatase
(TRAP) assays were used to determine the amount of released
p-nitrophenol that indicates the degree of differentiation in
RANKL-stimulated cells; and TRAP staining was used to evaluate the
number and size of TRAP-positive multinucleated osteoclast cells.
Cytokine levels were measured using ELISA on osteoclast precursor
cell culture supernatants. Using western blot analysis IB
phosphorylation and IB degradation were evaluated. Results: Both
AcE and Qt did not affect cell viability. Osteoclastogenesis was
significantly affected by AcE and Qt when compared to control.
Small (less active) osteoclast counts were decreased by AcE (1000
g/mL) and Qt (2.5 and 5 M), while all concentrations of AcE and Qt
significantly decreased the number of large and presumably active
osteoclasts. We observed lower production of IL-6 and IL-1 and an
increased production of IL-3 and IL-4. Also both AcE and Qt
downregulated NF-B pathway. Conclusion: These findings suggest that
AcE and Qt may be inhibitors of osteoclastogenesis under
inflammatory conditions (LPS-induced) via attenuation of RANKL/
PgLPS-induced NF-B activation. Further studies are needed in other
to support the use of AcE and Qt to treat diseases involving
pathological bone loss including periodontitis. Keywords: Allium
cepa L. Quercetin. Bone loss. Cytokines. Inflammation.
Osteoclasts.
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11
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7
Figura 8 Figura 9 Figura 10
Efeito do Allium cepa L. na proliferao de clulas RAW
264.7...........................
Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na morfologia e na
contagem celular em clulas RAW 264.7 coradas com
DAPI................................................ Efeito do
Allium cepa L. e da quercetina na apoptose em clulas RAW
264.7..............................................................................................................
Efeito do Allium cepa L. na viabilidade celular de clulas RAW 264.7
estimuladas com
LPS..............................................................................................
Efeito do Allium cepa L. nos nveis de protena total de clulas RAW
264.7 estimuladas com
LPS..............................................................................................
Efeito do Allium cepa L. na morfologia e na contagem celular em
clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS coradas com
DAPI.......................................... Efeito do Allium
cepa L. e da quercetina na viabilidade celular na osteoclastognese
induzida por RANKL e estimulada com PgLP.........................
Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na osteoclastognese
induzida por RANKL e estimulada com
PgLPS...................................................................
Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na atividade de reabsoro
osteoclstica............................................................................................................
Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na ativao da via de
sinalizao do NF-B em clulas RAW 264.7 estimuladas com RANKL e
PgLPS.................
45 46 47 48 49 50 51 53 55 59
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Efeito do Allium cepa L. e da quercetina na produo de
citocinas durante a osteoclastognese e a atividade dos
osteoclastos....................................................
57
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13
LISTA DE ABREVIATURAS, NOTAES E SIGLAS
AcE AP-1 ATCC CD4+ CD8+
Cel Cel/Ctrl Ctrl DAPI DMEM DMSO DP Ecoli ELISA ERK HPLC IFN IgE
IKK IB IL iNOS JNK LPS MAPK M-CSF MCP-1 MMP MTT NFATc1 NF-B NK
OD
Extrato metanlico de Allium cepa L. Ativador de protena 1
American Type Culture Collection Linfcitos T auxiliares com
grupamento de diferenciao 4 Linfcitos T auxiliares com grupamento
de diferenciao 4 Grupo controle apenas com clulas Grupo controle
negativo Grupo controle 4,6-diamidino-2-fenil-indol Meio Eagle
modificado por Dulbecco Dimetilsulfxido Doena periodontal
Escherichia coli Enzyme-Linked Immunosorbent Assay- Ensaio
imunoenzimtico Quinase regulada pelo sinal extracelular
Cromatografia lquida de alta eficincia Interferon Imunoglobulina
tipo E Quinase de c-Jun N-terminal Inibidor da quinase kappa B
Interleucina xido ntrico-sintase induzida Quinase de c-Jun
N-terminal Lipopolissacardeo Protena cinase mitgeno ativada Fator
de estimulao de colnias de macrfagos Protena quimiottica de
moncitos-1 Metaloproteinases de matriz brometo de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazlio Fator nuclear de
clulas T ativas c1 Fator de transcrio nuclear kappa B clulas
natural killer Densidade ptica
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14
OPG PBS Pg PG pH PI3K Qt RANK RANKL RAW 264.RIPA RPM SFB Th1 Th2
TIB-71 TLR TNF TRAP
Osteoprotegerina Soluo fosfato tamponada bissdica Porfiromonas
gingivalis Prostaglandina Potencial de hidrognio inico
fosfatidilinositol-3-cinase Quercetina Receptor ativador do fator
de transcrio NF-B Ligante do receptor ativador do NF-B Linhagem
celular de macrfagos/moncitos murinos Radio-Immunoprecipitation
Assay (soluo tampo) Rotaes por minuto Soro Fetal Bovino Linfcito T
auxiliar do tipo 1 Linfcito T auxiliar do tipo 2 Nmero de catlogo
da linhagem celular RAW 264.7 Toll-like receptors Fator de necrose
tumoral Fosfatase cida resistente ao tartarato
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15
SUMRIO
1 INTRODUO 16
2 REVISO DE LITERATURA 20 2.1 RESPOSTA IMUNOLGICA
........................................................................................................
21 2.2 FISIOPATOLOGIA DA DOENA PERIODONTAL
....................................................................
23 2.3 TECIDO SSEO E OSTEOCLASTOGNESE
.............................................................................
25 2.4 PRODUTOS
NATURAIS................................................................................................................
30
2.4.1 Allium cepa L. 30 2.4.2 Quercetina 32
3 OBJETIVOS 33 3.1 OBJETIVO GERAL
........................................................................................................................
34 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
...........................................................................................................
34
4 MATERIAIS E MTODOS 35 4.1 REAGENTES
..................................................................................................................................
36
4.1.2 Extrato metanlico de Allium cepa L. (AcE) 36 4.2 CULTURA
CELULAR....................................................................................................................
37 4.3 ENSAIO PARA DIFERENCIAO DOS OSTEOCLASTOS
...................................................... 37 4.4
ENSAIOS DE VIABILIDADE CELULAR
....................................................................................
38
4.4.1 Ensaios de reduo da resazurina e de concentrao de protena
total 38 4.4.2 Anlise de imagem e contagem de clulas coradas por
DAPI 39 4.4.3 Ensaio de Caspase 3/7 39
4.5 ENSAIO DE FOSFATASE CIDA RESISTENTE AO TARTARATO (TRAP)
.......................... 40 4.6. ENSAIO DE REABSORO DE
HIDROXIAPATITA (colorao de Von Kossa) .................... 40 4.7
ENSAIO PARA MENSURAR A SECRECO DE CITOCINAS
.................................................. 41 4.8 ENSAIO DE
WESTERN BLOT PARA ANLISE DA INIBIO DA VIA DO NF-B ............. 41
4.9 ANLISE ESTATSTICA
..............................................................................................................
42
5 RESULTADOS 43 5.1 Allium cepa L. E QUERCETINA NO INDUZEM
EFEITOS TXICOS EM CLULAS RAW 264.7 NA PRESENA OU NA AUSNCIA DE
RANKL e pgLPS ....................................................
44 5.2 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A OSTEOCLASTOGNESE
INDUZIDA POR RANKL ESTIMULADA POR PgLPS EM CLULAS RAW 264.7
.................................................... 52 5.3 Allium
cepa L. E QUERCETINA MODULAM A REABSORO DOS OSTEOCLASTOS ...... 54
5.4 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A PRODUO DE CITOCINAS
DURANTE A OSTEOCLASTOGNESE E A ATIVIDADE DOS OSTEOCLASTOS
............................................. 56 5.5 Allium cepa L.
E QUERCETINA INIBEM A ATIVAO DA VIA DE SINALIZAO DO NF-B EM CLULAS
ESTIMULADAS POR RANKL E PgLPS
.............................................................
58
6 DISCUSSO 60
7 CONCLUSO 66
REFERNCIAS 68
APNDICES 77
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16
1 INTRODUO
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17
No processo inflamatrio, o organismo reage a uma agresso e capaz
de deflagrar
uma resposta no especfica contra padres de agresso previamente
definidos, sendo o
sistema imune capaz ainda de identificar e reagir a agentes
agressores especficos, segundo
seu potencial antignico. Respostas inflamatrias normais so
rigorosamente controladas e
autolimitantes. A inflamao crnica, no entanto, pode causar um
aumento anormal da
atividade osteoclstica promovendo a reabsoro ssea excessiva,
como observado na
osteoporose, na artrite reumatoide e na doena periodontal (DP)
(SOUZA; LERNER, 2013;
YANG et al., 2013). Na remodelao ssea fisiolgica, precursores de
osteoclastos se tornam
ativados e se diferenciam em osteoclastos (osteoclastognese),
que iniciam o processo de
reabsoro ssea. Os osteoblastos esto envolvidos na formao da
matriz ssea, garantindo a
manuteno da massa ssea (RAM et al., 2015).
Na DP, a ativao excessiva do sistema imunolgico por bactrias e
seus produtos
estimulam a produo e a secreo de diversas molculas regulatrias,
como as citocinas,
quimiocinas, fatores de transcrio e molculas coestimuladoras,
resultando na sequncia de
eventos que provocar a destruio do tecido conjuntivo e do osso
alveolar (LIU; LERNER;
TENG, 2010; ZHAO; IVASHKIV, 2011). Assim sendo, pode-se observar
que produtos
bacterianos e citocinas inflamatrias constituem as principais
causas subjacentes da perda
ssea caracterizada pela quebra de equilbrio entre a diferenciao
e a atividade de
osteoclastos e osteoblastos (LIU; LERNER; TENG, 2010). No
processo que caracteriza a
osteoclastognese, est bem estabelecida a importncia da estimulao
de progenitores de
osteoclastos mononucleares pelo fator de estimulao de colnias de
macrfagos (M-CSF) e a
ativao do fator de transcrio nuclear kappa B (NF-B) por RANKL
(KAJIYA et al., 2010).
O RANKL liga-se ao seu receptor RANK e induz a diferenciao de
precursores de
osteoclastos ao longo da linhagem osteoclstica e a sua fuso em
osteoclastos maduros,
clulas que reabsorvem a matriz ssea, ao passo que a
osteoprotegerina (OPG) previne a
ligao RANK-RANKL por inibio competitiva. Na periodontite, o
aumento da
concentrao de citocinas pr-inflamatrias pode afetar diretamente
a perda ssea
aumentando os nveis de RANKL e ativar osteoclastos, alm de
inibir a atividade de OPG
(KAJIYA et al., 2010).
Alguns fatores e frmacos podem promover homeostase do osso. A
regulao da
secreo de citocinas pr-inflamatrias e anti-inflamatrias pode
modular a
osteoclastognese, diminuindo a reabsoro ssea e reduzindo a perda
ssea clnica (SINGH
et al., 2012). Frmacos como os bifosfonatos, que so moduladores
da diferenciao e da
atividade dos osteoclastos, tm sido estudados como substncias
adjuvantes da terapia
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18
periodontal de raspagem e alisamento radicular (RAR) na
tentativa de diminuir a inflamao e
a perda ssea associada a essa patologia (LANE et al., 2005).
Contudo, efeitos adversos
(osteonecrose de maxilares) tm sido relacionados com o uso do
bisfosfonato alendronato
(NICOLATOU-GALITIS et al., 2011).
Recentemente, a importncia do uso de produtos naturais tem
aumentado, bem como o
interesse pela descoberta de novas drogas seguras e eficazes
para o tratamento de condies
inflamatrias (JOO, 2014). Estudos tm investigado o uso de
produtos naturais no tratamento
de vrias doenas inflamatrias, tais como asma (DOURADO et al.,
2014), colite ulcerativa
(GONG et al., 2012), doena de Crohn (KREBS; OMER; OMER, 2010) e
perda ssea em
estados inflamatrios, como na periodontite (KAJIYA et al.,
2010).
Flavonoides contidos em frutas e vegetais tm sido estudados como
agentes anti-
inflamatrios (SATU et al., 2013). O principal flavonoide
encontrado no Allium cepa L.
(cebola) a quercetina (Qt), potente inibidor in vitro da
diferenciao dos osteoclastos
(WATTEL et al., 2004), que exibe diversas propriedades
farmacolgicas, tais como efeitos
anti-inflamatrios e antioxidantes (CHENG et al., 2010;
YAMAGUCHI; WEITZMANN,
2011; GUO et al., 2012). O Allium cepa L. tambm tem sido testado
tanto para o tratamento
de condies inflamatrias, como a asma (KAISER et al., 2009;
OLIVEIRA et al., 2015),
quanto para desordens no metabolismo sseo, como na reabsoro ssea
induzida por
ovariectomia em ratos (HUANG et al., 2008), e na modulao da
osteoclastognese induzida
por RANKL em clulas de ratos precursoras de osteoclastos, por
meio da inibio das vias de
sinalizao de ERK, p38 e NF-B (TANG et al., 2009). A modulao da
diferenciao e da
funo dos osteoclastos uma estratgia promissora para o tratamento
de doenas
inflamatrias e sseo-destrutivas (KIM, H. et al., 2014).
Diante do exposto e considerando-se a relevncia do estudo de
substncias com
propriedades imunomodulatrias, as abordagens propostas neste
trabalho podem ajudar a
desvendar os possveis benefcios do Allium cepa L. e do seu
flavonoide quercetina sobre os
osteoclastos e seus precursores, em condies normais e de perfil
inflamatrio induzido por
LPS. Na tentativa de explorar o potencial teraputico dessas
substncias, a osteoclastognese
e a atividade dos osteoclastos foram observadas por meio da
modulao de mediadores
inflamatrios e da interferncia na via de sinalizao do NF-B em
clulas precursoras de
osteoclastos, estimuladas ou no por PgLPS e RANKL. Almeja-se que
as substncias testadas
possam se tornar drogas para compor o arsenal teraputico para
tratar doenas inflamatrias
que envolvam perda ssea patolgica, incluindo-se a
periodontite.
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19
O trabalho de pesquisa e a elaborao da tese durante o doutorado
geraram a produo
de dois artigos. O primeiro j foi publicado: OLIVEIRA, Tatiane
et al. Effect of Allium cepa
L. on lipopolysaccharide-stimulated osteoclast precursor cell
viability, count, and morphology
using 4, 6-diamidino-2-phenylindole-staining. International
Journal of Cell Biology, New
York, v.2014, Aug. 2014 (APNDICE A). O segundo artigo, OLIVEIRA,
Tatiane et al.
Allium cepa L. and quercetin inhibit RANKL/Porphyromonas
gingivalis LPS-induced
osteoclastogenesis by downregulating NF-B signaling pathway, foi
submetido revista
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine e aceito
para publicao
(APNDICE B).
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20
2 REVISO DE LITERATURA
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21
2.1 RESPOSTA IMUNOLGICA
A inflamao uma resposta protetora para que seja restabelecida a
homeostase em
situaes de desafios extremos ao organismo, tais como infeco,
estresse e leso tecidual.
um processo dinmico, com uma sequncia de reaes ordenadas que se
iniciam com uma
atividade aguda, podendo evoluir para um processo crnico. A fase
aguda da inflamao
relativamente curta e desencadeia, na rede vascular, em resposta
s agresses, a vasodilatao
e o aumento da permeabilidade, que possibilitam a transmigrao
celular, predominantemente
de neutrfilos (DAMBROSIO; PANINA-BORDIGNON; SINIGAGLIA,
2003;
SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
Citocinas, quimiocinas, aminas biognicas e eicosanoides
produzidos e liberados
caracterizam e modulam o processo inflamatrio, podendo
desencadear simples respostas
locais ou aquelas capazes de gerar alteraes em todo o organismo.
A inflamao aguda pode
evoluir para a fase crnica, na tentativa de eliminar a infeco e
de estabelecer o reparo
tecidual. Nessa fase, mais longa, ocorre o recrutamento de
macrfagos, linfcitos e
plasmcitos, a proliferao de vasos sanguneos, a fibrose e a
necrose tecidual. Apesar da
complexidade e da diversidade de funes, as atividades dos sinais
inflamatrios objetivam o
reparo tecidual e o restabelecimento do equilbrio dos vrios
sistemas do organismo
(FINKELMAN, 2010; KOTAS; MEDZHITOV, 2015).
A primeira linha de defesa de nosso organismo coordenada pelo
sistema imune inato
que monta a resposta inicial ao tecido invadido. A vasodilatao,
o aumento da
permeabilidade vascular e a infiltrao celular so, inicialmente,
geradas nessa fase inata. Os
componentes celulares primrios do sistema imune inato so os
macrfagos, clulas
dendrticas, clulas natural killer (NK) e neutrfilos. A esses
componentes celulares, os
macrfagos acrescentam, por exemplo, citocinas pr-inflamatrias,
quimiocinas e xido
ntrico, que amplificam a resposta inflamatria e ativam a cascata
de coagulao. Outros
fatores frequentemente ativados durante a resposta inata incluem
o sistema complemento, os
eicosanoides e o fator de ativao plaquetria (PAF) (DAMBROSIO;
PANINA-
BORDIGNON; SINIGAGLIA, 2003; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY,
2004).
Os macrfagos e as clulas dendrticas tm a capacidade de responder
a uma variedade
de produtos microbianos por meio de receptores de reconhecimento
padro presentes nas suas
superfcies. Os receptores do tipo toll (TLRs) demonstraram ser
crticos para o
reconhecimento de padres moleculares e para a sinalizao biolgica
associada a agentes
-
22
patognicos, como os lipopolissacardeos (LPS) de bactrias
gram-negativas, lipoprotenas de
organismos gram-positivos e de DNA bacteriano (UNDERHILL, 2003).
Ligaes ao
complexo do TLR desencadeiam o recrutamento de protenas de
sinalizao intracelular que
so capazes de ativar o inibidor da cascata de NF-B (IkB),
resultando na degradao da
protena inibidora IkB e na libertao subsequente de NF-B
citoplasmtico. Em seguida, o
fator de transcrio NF-B transloca-se para o ncleo para ligar-se
a regies promotoras de
genes que regularo a codificao de mediadores pr-inflamatrios,
tais como o fator de
necrose tumoral (TNF), a interleucina 1-beta (IL-1), a
interleucina 6 (IL-6) (WARD;
LENTSCH, 2002).
A produo de citocinas geralmente autolimitada, embora algumas
dessas protenas
possam persistir na circulao durante longos perodos de tempo,
determinando a magnitude
da resposta inata e influenciando profundamente na imunidade
adaptativa (LIEW, 2003;
SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). No entanto, a resposta imune
adaptativa
principalmente induzida pela apresentao de antgenos estranhos s
clulas T CD4+ e CD8+.
Os subconjuntos melhor definidos de linfcitos T CD4+ so as
clulas do tipo T helper 1
(Th1) e T helper 2 (Th2), subconjuntos essencialmente definidos
pelo perfil de citocinas que
produzem. A induo da resposta Th1 promovida por macrfagos e
clulas dendrticas.
Vrus, bactrias intracelulares e seus produtos bacterianos
estimulam a produo de citocinas
com perfil Th1, promovendo a imunidade antimicrobiana mediada
por fagcitos
(SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Infeces helmnticas e doenas
alrgicas como
a asma desencadeiam o aumento do nmero de linfcitos CD4+ do tipo
Th2, que produzem
interleucinas como IL-4, IL-5 e IL-13, correlacionando-se, por
exemplo, no caso da asma,
com o grau de eosinofilia das vias areas. Alm disso, na asma
atpica, a polarizao Th2
estimula as respostas mediadas pela imunoglobulina E (IgE). Com
o aumento da IgE,
observa-se uma maior ligao desta com o receptor de alta
afinidade (FcRI) nos mastcitos
que, ativados, liberam mediadores inflamatrios e citocinas,
promovendo a eosinofilia
tecidual e a hiper-reatividade brnquica (FINKELMAN, 2010;
LAMBRECHT; HAMMAD,
2015).
A resposta inflamatria a uma infeco, a exposio ao antgeno ou a
leso no tecido
objetivam a eliminao dos agentes etiolgicos e potencializam o
reparo tecidual. A
inflamao excessiva pode, no entanto, causar leso do tecido,
descompensao fisiolgica,
disfuno de rgos e at mesmo levar morte (SHERWOOD;
TOLIVER-KINSKY, 2004).
A artrite reumatoide (SOUZA; LERNER, 2013), a doena inflamatria
do intestino (GONG
et al., 2012; JOO, 2014), a asma (HOLGATE et al., 2009) e a
periodontite (BOYLE;
-
23
SIMONET; LACEY, 2003) so doenas inflamatrias crnicas,
caracterizadas por durao
prolongada, nas quais a inflamao, a destruio tecidual e as
tentativas de reparao do
tecido ocorrem simultaneamente (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY,
2004).
2.2 FISIOPATOLOGIA DA DOENA PERIODONTAL
A doena periodontal (DP) causada por infeco por agentes
patognicos presentes
na placa dentria, biofilme constitudo por bactrias, protenas
salivares e clulas epiteliais
descamadas (ALVES et al., 2007); uma resposta imune bem
orquestrada que inclui
respostas inata e adaptativa (GEMMELL; SEYMOUR, 1998).
O processo inflamatrio que caracteriza a DP acomete o periodonto
gengiva,
ligamento periodontal, cemento radicular, e osso alveolar,
estruturas de suporte que envolvem
os dentes (BASCONES-MARTINEZ et al., 2011). A inflamao
periodontal ocorre em
resposta a antgenos bacterianos da placa dentria e inclui
processos inflamatrios que levam
ao surgimento da gengivite e da peridontite.
A gengivite caracterizada por hiperemia, edema e sangramento
gengival, quando
ainda no h alterao no nvel de insero do tecido conjuntivo ao
dente (ALVES et al.,
2007; CEKICI et al., 2014; HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015).
Quando a gengivite no
tratada precocemente, a inflamao pode tornar-se crnica,
evoluindo para a periodontite.
Durante a periodontite, a placa bacteriana se acumula entre o
epitlio de juno e o prprio
dente, resultando em inflamao que desencadeia a formao de bolsa
periodontal, perda da
insero do tecido conjuntivo ao dente, presena de sangramento ao
estmulo da sondagem,
abscessos, mobilidade dentria e at perda de unidades dentrias,
em decorrncia da
reabsoro excessiva do osso alveolar (ALVES et al., 2007;
BASCONES-MARTINEZ et al.,
2011; HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015).
A cavidade oral humana abriga uma enorme carga de espcies
microbianas (CEKICI
et al., 2014). As bolsas periodontais, aprofundamentos
patolgicos do sulco gengival
formadas a partir da migrao e da proliferao de clulas do epitlio
juncional, se tornam um
nicho favorvel para a continuao da colonizao dos diversos tipos
de patgenos
bacterianos (BASCONES-MARTINEZ et al., 2011; HUSSAIN; STOVER;
DUPONT, 2015).
relevante o conhecimento sobre a microbiota subgengival para que
se compreendam
as suas implicaes na patognese da DP e se conhea o eventual
impacto dos resultados do
-
24
tratamento sobre esses microrganismos. Socransky e outros (1998)
estudaram as relaes
entre as bactrias subgengivais em amostras de microfilme
bacteriano de 185 indivduos, e as
espcies encontradas foram classificadas de acordo com o
envolvimento na iniciao e na
progresso da DP e distribudas em cinco grandes complexos
marcados por cores. O primeiro
deles, denominado complexo vermelho, constitudo por
Porphyromonas gingivalis,
Treponema denticola e Tannerella forsythia, e as espcies
individuais desse grupo foram
fortemente associadas com formas graves da DP, relacionadas com
a profundidade da bolsa e
com o sangramento sondagem. O segundo grupo, complexo laranja,
composto por
Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Prevotella
nigrescens, Peptostreptococcos
micros, Streptococcus constellatus, Eubacterium nodatum,
Campylobacter showae,
Campylobacter gracilis e Campylobacter rectus, mostrou-se
intimamente relacionado com o
complexo vermelho e envolvido na iniciao e na progresso da
periodontite crnica. No
terceiro grupo, complexo amarelo, esto includos Streptococcus
sanguis, Streptococcus
oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus gordonii e
Streptococcus intermedius. Fazem parte
do complexo verde, o quarto grupo, composto por Campylobacter
concisus, Eikenella
corrodens e Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo a. Ao
quinto grupo, complexo
violeta, foram adicionados Veillonella parvula e Actinomyces
odontolyticus. Outras espcies
encontradas nos biofilmes analisados foram a A.
actinomycetemcomitans serotype b,
Selenomonas noxia e Actinomyces naeslundii genospecies 2 (A.
viscosus), que apresentaram,
porm, pouca relao com os cinco grupos supracitados (SOCRANSKY et
al., 1998; GATTO
et al., 2014).
Alguns mecanismos estariam implicados na produo de danos sseos
mediados pela
presena de bactrias e seus produtos que, sozinhos ou em
conjunto, desencadeariam o
desequilbrio entre osteoclastos e osteoblastos. A ativao direta
e indireta da reabsoro
ssea osteoclstica pode ocorrer por uma variedade de produtos
txicos biologicamente ativos
a exemplo das endotoxinas de bactrias gram-negativas P.
gingivalis conhecidas como
lipopolissacardeos (LPS), que esto fortemente associadas com a
perda ssea patolgica que
caracteriza a DP (NAIR, 1996; HENDERSON; NAIR, 2003; LIU;
LERNER; TENG, 2010;
HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015).
Na DP, sabe-se que produtos bacterianos como o LPS e citocinas
inflamatrias
constituem as principais causas subjacentes da perda ssea. As
citocinas pr-inflamatrias
foram identificadas como molculas fundamentais na induo e na
regulao positiva para a
destruio dos tecidos periodontais, incluindo a IL-1, o TNF, a
interferon-gama (IFN-), a IL-
6 e, principalmente, o RANKL, que, em contraste com as outras
citocinas pr-inflamatrias,
-
25
induzem diretamente a diferenciao de osteoclastos
(osteoclastognese) (KAJIYA et al.,
2010).
2.3 TECIDO SSEO E OSTEOCLASTOGNESE
O osso composto de matriz extracelular e clulas. A matriz
extracelular subdivide-se
em parte orgnica principalmente constituda pelo colgeno tipo I
(aproximadamente 95%)
e inorgnica. A matriz inorgnica participa como reservatrio dos
ons clcio e fosfato,
aparecendo como cristais de hidroxiapatita depositados na matriz
de colgeno. Os ostecitos
so clulas do tecido sseo que atuam como mecanossensores,
regulando a estrutura ssea por
meio da comunicao de seus processos dendrticos no tecido sseo,
regulando a massa e a
estrutura ssea. Juntamente com os osteoblastos responsveis pela
deposio de tecido
sseo essas clulas garantem a formao, a manuteno e a remodelao da
matriz ssea.
Os osteoclastos so clulas responsveis pela reabsoro da matriz
ssea (COWIN, 2002;
SINGH et al., 2012).
O osso um tecido metabolicamente ativo e sofre remodelao
contnua. Em
indivduos normais, existe o equilbrio entre o processo mediado
pela atividade dos
osteoclastos e dos osteoblastos (CEKICI et al., 2014). A
remodelao ssea fisiolgica
normal imprescindvel para a manuteno da resistncia ssea e para a
integridade do
sistema esqueltico, uma vez que qualquer desequilbrio pode levar
ao aumento ou
diminuio da massa ssea. A remodelao assegura o restabelecimento
de microdanos e a
integridade mecnica do sistema esqueltico, e regula a liberao de
clcio e fsforo a partir
dos ossos para o sangue (SINGH et al., 2012).
Os osteoblastos sintetizam a matriz orgnica rica em colgeno e
permitem condies
ideais para a mineralizao, uma vez que secretam protenas da
matriz ssea e
metaloproteinases de matriz (MMPs) (COWIN, 2002; SINGH et al.,
2012). Os osteoclastos
so clulas gigantes multinucleadas, de origem hematopoitica, que
derivam das clulas de
linhagem moncito-macrfago, sendo as nicas clulas capazes de
degradar o tecido sseo
mineralizado (UDAGAWA et al., 1990). Os osteoclastos formam
lacunas, conhecidas como
lacunas de Howship, ambiente cido decorrente da liberao do
contedo dos vacolos
acidoflicos citoplasmticos, o que desencadeia a rpida dissoluo
de cristais de
hidroxiapatita (SINGH et al., 2012).
-
26
A reabsoro ssea est sujeita influncia de vrios fatores locais e
sistmicos.
Muitos deles interagem e alteram o metabolismo das clulas sseas,
como, por exemplo,
prostaglandinas (PG) E2 e leucotrienos, mediadores inflamatrios
metablitos do cido
araquidnico; alteraes hormonais causadas, por exemplo, na falta
de estrognio em
osteoporose ps-menopausa; glicocorticoides em excesso como na
doena de Cushing;
excesso de hormnio da paratireoide ou hormnios da tireoide em
hiperparatireoidismo e
tirotoxicose, respectivamente; ou como consequncia de tratamento
farmacolgico (LIU;
LERNER; TENG, 2010). Pesquisas mostram que a vitamina D ativada,
isto , o calcitriol ou a
1,25 hidroxivitamina D (1,25(OH)2 D) tambm pode exercer
influncia sobre a dinmica da
remodelao ssea (KITAZAWA et al., 2003; HA et al., 2006; SINGH et
al., 2012). A
1,25(OH)2 D induz a absoro intestinal de clcio e fsforo, inibe a
proliferao de clulas da
paratireoide e modula negativamente a sntese do hormnio
paratireideo (inibindo o
hiperparatireoidismo e a perda ssea), modula a sensibilidade ao
clcio e aumenta a
transcrio do receptor sensvel ao clcio (CANAFF; HENDY,
2002).
Um dos mecanismos responsveis pela patognese de doenas
inflamatrias que
afetam o sistema sseo parece ter influncia sobre a diferenciao e
a ativao descontrolada
de osteoclastos (CEKICI et al., 2014).
A osteoclastognese, processo de diferenciao dos osteoclastos,
essencial para a
manuteno da homeostasia do tecido sseo, est tambm presente na
patognese de diversas
patologias caracterizadas pela atividade osteoltica. Ela
coordenada pela interao de trs
membros da superfamlia do fator de necrose tumoral (TNF): o
RANKL, ligante do receptor
ativador do fator de transcrio nuclear kappa B (NF-B), o RANK,
receptor ativador do
NF-B, e a osteoprotegerina (OPG). A diferenciao de clulas
osteoclsticas depende de um
sistema central de controle relacionado com a ligao de molculas
RANKL/RANK
(BAUDHUIN et al., 2007). A identificao e a caracterizao de
RANKL, seu receptor
RANK, e o receptor osteoprotegerina chamariz solvel (OPG)
contriburam, de forma
significativa, para a compreenso do mecanismo de remodelao
esqueltica, na qual a
diferenciao de osteoclastos fundamental. A OPG regula
negativamente a
osteoclastognese, inibindo a interao entre RANK e RANKL por ser
um antagonista natural
de RANKL (KAJIYA et al., 2010). A ligao do RANKL ao RANK no s
induz a
osteoclastognese, mas tambm promove a sobrevivncia e a ativao de
osteoclastos. Porm,
quando a concentrao de OPG mais elevada em relao ao nvel de
RANKL expresso, a
ligao de OPG a RANKL impede a sua ligao a RANK. Essa inibio da
ligao de
RANKL e RANK mediada pela OPG diminui a velocidade e a
intensidade da
-
27
osteoclastognese e promove a apoptose de osteoclastos
anteriormente diferenciados e
ativados, reduzindo-se, assim, o processo de reabsoro ssea
(IKEDA et al., 2004; KAJIYA
et al., 2010).
Os osteoblastos e os fibroblastos gengivais e periodontais tambm
so considerados
fontes de RANKL e OPG no tecido periodontal. Alm disso, os
fibroblastos do ligamento
periodontal desempenham papis cruciais na regulao da homeostase
do ligamento
periodontal, que liga o osso do processo alveolar ao cemento
radicular (KAJIYA et al., 2010).
A induo da diferenciao osteoclstica, alm da presena e da ligao
do RANKL
com o RANK, requer o fator estimulador de colnias de macrfagos
(M-CSF). Essa citocina,
produzida por clulas vizinhas do estroma e dos osteoblastos,
induz a fuso de pr-
osteoclastos em osteoclastos, que sero secundariamente ativados
em osteoclastos maduros
pelo prprio RANKL (IKEDA et al., 2004; BAUD'HUIN et al., 2007).
A ativao do RANK
pelo RANKL seguida da sua interao com membros associados famlia
do receptor TNF
(TRAF). O TRAF6 leva expresso de genes especficos responsveis
pela diferenciao e
ativao osteoclstica, e seus alvos incluem as protenas cinases
(MAPKs) como as vias das
cinases p38, a quinase de c-Jun N-terminal (JNK), cinase
regulada por sinal extracelular
(ERK) e a fosfatidilinositol-3-cinase (PI3KA) / protena cinase B
alm de fatores de
transcrio como o NF-B, a protena ativadora transcripcional
(AP-1) e o fator nuclear de
clulas T ativas c1 (NFATc1), considerado como regulador mestre
da osteoclastognese.
Essas ativaes permitem que os osteoclastos expressem marcadores
especficos tais como a
fosfatase cida resistente ao tartarato (TRAP), a catepsina K,
receptores de calcitonina e
receptores de integrina (BAUDHUIN et al., 2007; LIU; LERNER;
TENG, 2010; PEREIRA
et al., 2011; SINGH et al., 2012; SOUZA; LERNER, 2013).
Alm da importncia na osteoclastognese, o RANKL tem um papel
no
desenvolvimento imunitrio. Exerce ativao da JNK nas clulas T,
atua em clulas
dendrticas inibindo a apoptose e induz a produo de citocinas
pr-inflamatrias, tais como
TNF, IL-1, IL-1b e IL-6 (PEREIRA et al., 2011; SINGH et al.,
2012).
Diversos hormnios e citocinas exercem, direta ou indiretamente,
seus efeitos sobre a
osteoclastognese pela regulao da produo de clulas do
estroma/osteoblsticas de OPG e
RANKL, como, por exemplo: o estrognio aumenta a produo de OPG; o
PTH e os
glicocorticoides aumentam a produo de RANKL e diminuem a produo
de OPG; e a 1,25
dihidroxivitamina D3 aumenta a produo de RANKL (BAUDHUIN et al.,
2007; PEREIRA
et al., 2011).
-
28
A ativao das clulas T, direta e indiretamente, por
lipopolissacardeos (LPS), entre
outros, aumenta a expresso do RANKL, induzindo diretamente a
osteoclastognese (LIU;
LERNER; TENG, 2010; SINGH et al., 2012). Alm disso, diversas
citocinas com perfil Th1 e
Th2 foram identificadas como estimuladores diretos ou indiretos
da diferenciao,
sobrevivncia e atividade dos osteoclastos. As citocinas modulam
as respostas inflamatrias e
ativam diferentes vias intracelulares que iniciam a diferenciao
de osteoclastos (GEMMELL;
SEYMOUR 1998; GARLET, 2010; BRAUN; ZWERINA, 2011). A IL-1 e o
TNF induzem
a expresso de outros mediadores que amplificam a resposta
inflamatria, tais como as
prostaglandinas, e levam produo de enzimas lticas e produo de
quimiocinas, ativando
a diferenciao de osteoclastos (KUDO et al., 2002; DEO; BHONGADE,
2010). A IL-1, a
IL-6 e a IL-7 tambm promovem, direta e indiretamente, a
osteoclastognese. Por outro lado,
outras citocinas, tais como o interferon gama (IFN-), a IL-3 e a
IL-4 podem atuar como
inibidores osteoclastognicos (SINGH et al., 2012).
indiscutvel que a perda ssea periodontal seja mediada por
citocinas, inclusive o
RANKL, e que os antgenos orais, incluindo bactrias
Gram-negativas e seus produtos,
interferem na produo e secreo desses mediadores inflamatrios
(KAJIYA et al., 2010). A
endotoxina LPS a principal componente da membrana exterior de
bactrias gram-negativas.
Moncitos humanos so extremamente sensveis ao LPS e respondem
expressando muitas
citocinas inflamatrias, exacerbando, assim, a reposta
inflamatria.
Propem-se, pelo menos, cinco mecanismos pelos quais as bactrias
ou seus produtos,
como o LPS, podem induzir danos em estruturas mineralizadas. A
capacidade de usar esses
diferentes mecanismos destrutivos depende da natureza da infeco
e da proximidade da
bactria com o local afetado. A destruio direta da matriz
inorgnica por bactrias ocorre
apenas em cries dentrias nas quais o cido produzido por bactrias
aderidas aos dentes, tais
como o Streptococcus mutans, solubiliza os componentes da matriz
calcificada da dentina e
do esmalte. Outros mecanismos potenciais esto relacionados com a
ativao direta e indireta
de osteoclastos por bactrias ou seus componentes. Diretamente, o
LPS bacteriano pode ativar
osteoclastos. Alm disso, esses componentes podem ativar a produo
de citocinas
osteolticas e ativar linfcitos T CD4+ sensibilizados para
expressar e secretar o RANKL
(HENDERSON; NAIR, 2003). A estimulao dos moncitos humanos por
LPS, por exemplo,
ativa vrias vias de sinalizao intracelular que incluem a quinase
IkappaB (IKK) da via
NF-B e trs ativadas por protena quinase ativada por mitgenos
(MAPK): quinases
reguladas por sinais extracelulares (ERK) 1 e 2, quinase de
c-Jun N-terminal (JNK) e p38. Por
meio do estmulo das diversas vias de sinalizao intracelular,
desencadeia-se a ativao de
-
29
uma variedade de fatores de transcrio que incluem o NF-B e o
AP-1, que coordenam a
induo de muitos genes codificadores de mediadores inflamatrios
(GUHA; MACKMAN,
2011).
Outro mecanismo j analisado a inibio direta ou indireta de
formao ssea
osteoblstica. A invaso dos osteoblastos por bactrias tambm vem
sendo pesquisada como
outro possvel mecanismo associado periodontite. A invaso
bacteriana a essas clulas pode
estar relacionada com a desregulao da remodelao ssea normal,
resultando na alterao
da funo das clulas e na apoptose das clulas sseas (ALEXANDER et
al., 2003;
HENDERSON; NAIR, 2003).
Moduladores da diferenciao e da atividade dos osteoclastos, como
os bifosfonatos,
tm sido apontados como substncias adjuvantes na terapia
periodontal de raspagem e
alisamento radicular (RAR) (LANE et al., 2005). Os bifosfonatos
so anlogos quimicamente
estveis do pirofosfato que regulam a mineralizao ssea por ligao
aos cristais de
hidroxiapatita e promovem ao quelante sobre o clcio. Alm disso,
seus efeitos
farmacolgicos clssicos parecem estar relacionados com efeitos
inibitrios sobre
osteoclastos. Os bifosfonatos so os principais frmacos para o
tratamento da osteoporose, e
as diferenas individuais entre eles, em termos de ligao mineral
e aes bioqumicas, se
refletem em seu comportamento clnico e em sua eficcia (RUSSELL
et al., 2008). Na doena
periodontal experimental, bifosfonatos como o alendronato sdico
preservam a reabsoro
ssea alveolar, tm atividade anti-inflamatria e antibacteriana
(MENEZES et al., 2005) e
potencial antirreabsortivo (KIMMEL, 2007). Contudo, o uso dessas
substncias tem sido
relacionado com diversos efeitos adversos, como a osteonecrose
de maxilares, constatada
aps a administrao oral do bifosfonato alendronato
(NICOLATOU-GALITIS et al., 2011).
Os frmacos empregados no tratamento da perda ssea possuem
vantagens
teraputicas inerentes, mas tambm desvantagens. As constantes
pesquisas buscam novos
frmacos que apresentem uma maior especificidade aliada a uma
diminuio dos efeitos
colaterais. Desse modo, os potenciais teraputicos de produtos
naturais tm sido avaliados
como estratgia farmacolgica segura e eficaz para a modulao do
metabolismo sseo.
-
30
2.4 PRODUTOS NATURAIS
Produtos naturais tm sido usados ao longo dos sculos para tratar
inmeras doenas.
Entre mais de 20 mil plantas medicinais disponveis aos seres
humanos, um nmero limitado
foi, at hoje, suficientemente analisado (AMIRGHOFRAN, 2012).
Alguns desses compostos
naturais tm sido utilizados em funo dos seus efeitos
imunomoduladores e promissores de
proteo para doenas que alteram o metabolismo sseo e desencadeiam
a perda ssea
patolgica, como a periodontite (BU et al., 2008; TANG et al.,
2009).
Muitos dos medicamentos hoje disponveis no mundo originaram-se
de trabalhos
elaborados a partir de produtos naturais usados tradicionalmente
na cultura popular
(AMIRGHOFRAN, 2012; YANG et al., 2013). A Organizao Mundial da
Sade, em 1978,
reconheceu oficialmente o uso de fitoterpicos. Em 1981, por meio
da poltica de plantas
medicinais e de fitoterpicos, foi definido, no Brasil, o estudo
das plantas medicinais como
uma das prioridades de investigao clnica (BRASIL, 2011).
Muitas reas como a etnobotnica e a etnofarmacologia vm
desenvolvendo pesquisa
e seleo de novas plantas medicinais e substncias oriundas de
plantas, que propiciam a
obteno de novos medicamentos com garantia de eficcia, segurana e
qualidade.
Dentre as espcies registradas em um inqurito popular realizado
por Costa e outros
(2010), no municpio de Salvador, o Allium cepa L. foi o segundo
produto de origem vegetal
mais citado (19,74%), sendo utilizado etnofarmacologicamente
para o tratamento de doenas
inflamatrias, tais como a asma (COSTA et al., 2010). Nesse
contexto, investigou-se o
potencial teraputico dessa substncia e de um dos seus
flavonoides, a quercetina, em modelo
murino de alergia respiratria (OLIVEIRA et al., 2015a). O
potencial imunomodulador
observado despertou o interesse para o conhecimento dos
mecanismos celulares e moleculares
responsveis pela ao dessas drogas e sua utilizao em outros
modelos experimentais.
2.4.1 Allium cepa L.
O Allium cepa L., nome cientfico para a cebola, uma planta
bulbosa que pertence
famlia Alliaceae. A cebola um ingrediente alimentar amplamente
utilizado e
comercialmente cultivado em todo o mundo (BHANOT; SHRI, 2010).
Diferentes tipos de
extratos de Allium cepa L. (aquoso, etanlico e hidroalcolico) e
seus compostos isolados
(polissacardeos e flavonoides) tm apresentado resultados
promissores, in vitro e in vivo,
-
31
tendo-se comprovado atividades antibacteriana, antioxidante,
anti-histamnica, anti-
inflamatria, podendo ainda inibir a reabsoro ssea (MHLBAUER;
LOZANO; REINLI,
2002; KAISER et al., 2009; TANG et al., 2009; MNAYER et al.,
2014).
Pesquisas in vitro e in vivo avaliaram o potencial
imunomodulador de alguns
compostos naturais e seus constituintes qumicos, inclusive do
Allium cepa L., e do
flavonoide quercetina em modelo de asma ao extrato do caro
Blomia tropicalis (BtE)
(CERQUEIRA-LIMA et al., 2010; DOURADO et al., 2014; OLIVEIRA et
al., 2015a). Nesse
modelo, induzida a polarizao Th2, como constatado na asma
atpica, desencadeando-se
respostas mediadas por anticorpos IgE, ativao de mastcitos,
liberao de mediadores e
citocinas, promovendo-se a eosinofilia tecidual e a
hiper-reatividade brnquica (BAQUEIRO
et al., 2010). O Allium cepa L. e um de seus metablitos, a
quercetina, reduziram efetivamente
parmetros imunolgicos no modelo experimental de asma induzida
pelo BtE. Houve uma
diminuio significativa no nmero total de clulas no lavado
broncoalveolar, na peroxidase
eosinoflica do pulmo, na densidade de clulas no pulmo e na
produo de muco ao serem
comparados os animais alrgicos tratados com Allium cepa L. e os
animais alrgicos no
tratados; alm disso, observou-se seu potencial broncodilatador
em ensaios com traqueia
isolada de camundongo. A reduo desses parmetros demonstrou a
capacidade e as
propriedades anti-inflamatria e imunomoduladoras desses
compostos naturais (OLIVEIRA
et al., 2015).
Tambm foi referido o potencial do Allium cepa L. em diminuir a
reabsoro ssea
induzida por ovariectomia em animais (TANG et al., 2009). Os
dados desse estudo sugerem
que a soluo do p bruto de Allium cepa L. em gua inibe a
osteoclastognese de coculturas
de clulas do estroma da medula ssea e de clulas de macrfagos por
meio da atenuao de
RANKL induzida por ERK, p38 e ativao de NF-B. No entanto, os
efeitos funcionais do
Allium cepa L. sobre os osteoclastos e osteoblastos cultivados
ainda so desconhecidos.
Tem-se constatado que vrios metablitos secundrios derivados de
plantas interferem
diretamente sobre molculas e em mecanismos como a mediao de
respostas e de atividade
de segundos mensageiros inflamatrios, assim como na expresso de
fatores de transcrio e
molculas pr-inflamatrias (ROGERIO et al., 2007). Os principais
compostos presentes no
extrato de Allium cepa L. (AcE) so os compostos sulfurosos e os
flavonoides (LANZOTTI,
2006; ROGERIO et al., 2007; LKKE et al., 2012; COLINA-COCA et
al., 2013).
Em trabalhos anteriores, usando-se espectrometria de massa para
anlise direta de
compostos sulfurosos volteis, comprovou-se a presena de
propanotiol, dissulfeto dipropil e
tiossulfonatos. Os sulfxidos, a que se atribuem o sabor e o odor
da cebola, podem ser
-
32
tambm responsveis pela atividade biolgica do Allium cepa L. Alm
disso, os flavonoides,
compostos naturais fenlicos presentes em frutas e vegetais,
exibem diversas propriedades
farmacolgicas, tais como efeito anti-inflamatrio, antioxidante e
modulador da reabsoro
ssea patolgica. Dentre os flavonoides presentes no Allium cepa
L., destaca-se a quercetina
(PARK et al., 2009; GUO et al., 2012).
2.4.2 Quercetina
Os flavonoides so compostos polifenlicos que possuem um
esqueleto benzopirnico,
e suas caractersticas estruturais os distribuem em: flavonas,
isoflavonas, flavonis, flavanas,
flavanonas, antocianidinas e chalconas (BOOTS; HAENEN; BAST,
2008). A quercetina, que
pertence a uma subclasse dos flavonoides, classificada como um
flavonol e constituda por
um esqueleto de difenil propano (C6C3C6) com dois anis benznicos
ligados a um anel
pirano. Presente em diversas fontes vegetais, a quercetina
apresenta atividade inibitria de
ativao da cascata inflamatria e bloqueia a produo de TNF, a
ativao de NF-B e a
sntese de citocinas. Possui, ainda, a capacidade de inibir a
degranulao de neutrfilos e a
liberao de nions superxido, sendo tambm capaz de modular a
ativao de mastcitos
(DAS; RAM; GHOSH, 2003; MIN et al., 2007). Alguns autores
sugerem que a quercetina
modula o desenvolvimento e a atividade de osteoclastos in vitro,
porm se fazem necessrios
novos estudos que esclaream o preciso mecanismo de ao desse
composto em clulas de
reabsoro ssea (RASSI et al., 2005).
Nesse contexto, h considerveis evidncias do potencial do Allium
cepa L. e da
quercetina na inibio de mecanismos que desencadeiam a perda ssea
patolgica. Alm
disso, sabe-se que vrios frmacos usados atualmente na teraputica
foram obtidos a partir de
plantas ou de seus componentes bioativos. Assim sendo, mediante
a induo da
osteoclastognese e da avaliao da atividade osteoclstica,
busca-se investigar o potencial
teraputico do AcE e da quercetina em modelos in vitro e conhecer
o papel que desempenham
na terapia da perda ssea patolgica.
-
33
3 OBJETIVOS
-
34
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o potencial imunomodulador do extrato metanlico de
Allium cepa L. e do
flavonoide quercetina na osteoclastognese e na atividade dos
osteoclastos, em modelos in
vitro.
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Avaliar a citotoxicidade in vitro do extrato de Allium cepa L. e
do flavonoide
quercetina.
Determinar as concentraes in vitro do extrato de Allium cepa L.
e do flavonoide
quercetina, que inibem a osteoclastognese e a atividade dos
osteoclastos em culturas
celulares.
Avaliar o efeito do extrato de Allium cepa L. e do flavonoide
quercetina na
diferenciao de osteoclastos maduros e nos nveis de citocinas em
culturas de clulas RAW
264.7, ativadas por RANKL e PgLPS.
Avaliar o efeito do extrato de Allium cepa L. e do flavonoide
quercetina na
atividade de osteoclastos e nos nveis de citocinas em culturas
de clulas RAW 264.7 ativadas
por RANKL e PgLPS.
Avaliar o efeito do extrato de Allium cepa L. e do flavonoide
quercetina na via de
sinalizao (NF-B) relacionada com a diferenciao e a funo dos
osteoclastos ativados por
RANKL e PgLPS.
-
35
4 MATERIAIS E MTODOS
-
36
4.1 REAGENTES
Macrfagos murinos (RAW 264.7) foram obtidos da American Type
Culture
Collection (ATCC), catlogo no.TIB-71. O Meio Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM), o
Meio Essencial Mnimo de Eagle-modificao alfa (MEM-) e o Soro
Fetal Bovino (SFB),
foram adquiridos na Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Os
kits de ensaio
imunoenzimtico (ELISA) para dosagem das citocinas IL-3, IL-4,
IL-6, IL-1 e TNF foram
adquiridos na NeoBioscience Technology Co., Ltd. (BD) (China), e
o LPS derivado de P.
gingivalis (Pg), na Cedarlane (33277, Ontrio, Canad). Para o
ensaio de viabilidade celular o
Alamar Blue (resazurina) foi adquirido na Invitrogen (DAL 1025,
Grand Island, NY) e a
quantificao total de protenas foi determinada pelo mtodo do cido
bicinconnico (kit
BCA Protein Assay), Thermo Scientific Pierce (23225, Rockford,
EUA). RANKL derivada
de rato; dimetilsulfxido (DMSO) 99,5%; penicilina
G-estreptomicina; kits de fosfatase
cida resistente ao tartarato (TRAP); 4,6-diamidino-2-fenil-indol
(DAPI) para colorao
DAPI; quercetina 98% (2 - (3,4-Di-hidroxifenil)
-3,5,7-tri-hidroxi-4H-1-benzopiran-4-ona,
3,3, 4, 5,6 - entahydroxyflavone), com massa molecular de 302.24
g/mol; e os outros
produtos qumicos utilizados neste trabalho foram obtidos a
partir de Sigma Aldrich (St.
Louis, MO, EUA).
4.1.2 Extrato metanlico de Allium cepa L. (AcE)
O extrato metanlico de Allium cepa L. foi obtido de acordo com o
padro descrito por
Oliveira e outros (2015). Resumidamente, as amostras foram
descascadas, cortadas, e a
extrao foi realizada por macerao, permanecendo em lcool metlico
(CH3OH) a 99,8%
durante 7 dias. Aps filtrao, o extrato foi concentrado por
evaporao sob presso reduzida,
utilizando-se um evaporador rotativo. A seguir, o solvente foi
removido e, aps secagem na
estufa, o AcE foi mantido em -20oC at seu uso durante a fase
experimental. A normalizao
do extrato de Allium cepa L. foi realizada por cromatografia
lquida de alta eficincia
(HPLC). A porcentagem mdia calculada de Qt no extrato de AcE foi
de 2,5% (OLIVEIRA et
al., 2015). Foram testadas as diferentes concentraes de AcE
(100, 500 ou 1000 g/mL) e de
Qt (1,25, 2,5 ou 5 M). As concentraes de AcE foram selecionadas
com base em um estudo
anterior (OLIVEIRA et al., 2014) no qual no foi observado efeito
txico das concentraes
de AcE testadas em culturas celulares de precursores de
osteoclastos, estimuladas ou no com
-
37
LPS. Como estmulos inflamatrios foram usados LPS de
Porphyromonas gingivalis (Pg),
bactria comumente associada DP (HUSSAIN; STOVER; DUPONT, 2015),
e de
Escherichia coli (Ecoli), utilizada como padro para desencadear
a resposta inflamatria em
diversos modelos de inflamao (SHADDOX et al., 2013).
4.2 CULTURA CELULAR
A linhagem celular de moncito/macrfago de camundongo RAW 264.7
foi utilizada
como precursora de osteoclastos. As culturas celulares foram
mantidas em frascos de cultura
contendo DMEM, 10% SFB, 100 g/mL de penicilina e 100 g/mL de
estreptomicina a 37C
com 5% de CO2. O meio DMEM foi trocado a cada 3 dias.
4.3 ENSAIO PARA DIFERENCIAO DOS OSTEOCLASTOS
Para avaliar os efeitos dos compostos testados na atividade dos
osteoclastos e na
osteoclastognese em condies inflamatrias, as clulas da linhagem
RAW 264.7 foram
plaqueadas em microplacas de 96 poos (5x103 clulas/poo),
contendo meio -MEM, 10%
SFB, 2 mM de L-glutamina e 100 g/mL de
penicilina/estreptomicina. Aps 24h de
incubao, a fim de simular a diferenciao de clulas e,
simultaneamente, uma infeco, as
clulas foram tratadas na ausncia e na presena de 30 ng/mL de
RANKL e 1 g/mL Pg LPS.
As concentraes testadas de Qt 1.25g/mL (Qt 1.25), 2,5 g/mL (Qt
2.5), 5 g/mL
(Qt5), de AcE 100g/mL (AcE 100), AcE 500g/mL (AcE 500), AcE
1000g/mL (AcE
1000) foram tambm adicionadas aos poos, durante 5 dias, com
troca do meio no terceiro
dia. As amostras foram dissolvidas em DMSO, e a concentrao final
de DMSO no excedeu
0,05%, no causando efeitos txicos em clulas RAW 264.7. Essa
concentrao de DMSO foi
a mesma usada no grupo controle negativo (Cel/Ctrl).
-
38
4.4 ENSAIOS DE VIABILIDADE CELULAR
Foram realizados ensaios para definir as concentraes no txicas
de AcE e de
quercetina sobre clulas da linhagem RAW 264.7, usadas sob
diferentes condies nos
protocolos experimentais. Inicialmente, foi avaliado o efeito do
AcE (10-8000g/mL) sobre a
proliferao celular e o efeito do AcE e da Qt na contagem de
clulas viveis coradas por
DAPI e na induo de apoptose. Alm disso, foi avaliado o efeito do
AcE nas clulas RAW
264.7, sob a induo de condies inflamatrias (usando-se LPS de Pg
e Ecoli) in vitro
utilizadas neste trabalho. Sob essas condies, a viabilidade
celular foi avaliada por meio dos
mtodos de reduo da resazurina e de concentrao de protena total.
A contagem de clulas
viveis precursoras de osteoclastos (RAW 264.7) foi realizada com
as clulas coradas por
DAPI. Adicionalmente, foram feitos ensaios de viabilidade para
definir as concentraes no
txicas de AcE e de quercetina sob condies inflamatrias (LPS de
Pg) e de induo da
osteoclastognese (RANKL).
4.4.1 Ensaios de reduo da resazurina e de concentrao de protena
total
Ensaio de reduo de resazurina (Alamar Blue) foi realizado para
analisar as clulas
precursoras de osteoclastos viveis com o metabolismo ativo na
proliferao celular e na
osteoclastognese em condies normais e inflamatrias, como
previamente descrito
(KARTNER et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2014). Para tanto,
clulas da linhagem RAW
264.7 foram cultivadas na ausncia e na presena de RANKL e LPS, e
na presena e na
ausncia de AcE (10-8000g/mL), incluindo-se as concentraes de AcE
(100, 500 ou 1000
g/mL) ou de Qt (1,25, 2,5 ou 5 M), durante 5 dias. Em todos os
testes de viabilidade, o
DMSO (50%) foi usado como o controle positivo. As culturas foram
colocadas em meio
contendo 10% de Alamar Blue. Aps 4h de incubao, 100 l do meio
foi transferido para as
cavidades de uma placa de 96 poos, e a densidade ptica (OD) foi
medida a um comprimento
de onda de 570 nm e 600 nm, utilizando-se um leitor de
espectrofotometria (BioRad 3550). A
porcentagem de citotoxicidade foi calculada em relao ao grupo
controle.
A mensurao da concentrao de protena total foi utilizada para
confirmar o efeito
no citotxico do AcE e da Qt sobre a viabilidade celular. A
concentrao de protenas totais,
em todas as amostras testadas, foi comparada com uma curva padro
preparada por diluio
da soluo padro de protena fornecida no kit. Nesse ensaio, como
descrito por Kartner e
-
39
outros (2010), as clulas foram lavadas com PBS e lisadas com
tampo de lise (citrato
trissdico 90 mM, NaCl 10 mM, 0,1% de Triton X-100, pH 4,8). A OD
foi medida a um
comprimento de onda de 562 nm, utilizando-se um leitor de
espectrofotometria (BioRad
3550), e os nveis de protena total foram mensurados.
4.4.2 Anlise de imagem e contagem de clulas coradas por DAPI
O ensaio foi realizado para confirmar que as clulas precursoras
de osteoclastos (RAW
264.7) apresentavam caractersticas morfolgicas normais sob as
concentraes testadas de
AcE ou de Qt sob condies normais ou inflamatrias induzidas por
LPS. Para tanto, as
clulas foram cultivadas em placas de 96 poos na presena e na
ausncia de LPS e das
concentraes teste de AcE (100, 500 ou 1000 g/mL) ou de Qt (1,25,
2,5 ou 5 M) durante 5
dias. O dimetilsulfxido (DMSO) a 50% foi utilizado como controle
positivo. Para a
aplicao da tcnica de microscopia de fluorescncia, utilizou-se o
corante DAPI (46-
diamidino-2-fenilindol). A anlise de imagem e a contagem de
clulas por colorao com
DAPI foram realizadas como anteriormente descrito (OLIVEIRA et
al., 2014). As clulas
foram coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), e aquelas
com ncleos fragmentados
ou condensados foram definidas como clulas apoptticas (XIONG et
al., 2011). Foram feitas
cinco imagens para cada grupo, usando-se o microscpio de
fluorescncia (Cytation 3, Biotek,
EUA), e as barras representaram 100 m. Cada amostra foi
analisada utilizando-se o software
Gen5 (Biotek, EUA).
4.4.3 Ensaio de Caspase 3/7
Objetivando-se avaliar quantitativamente sinais intracelulares
de ativao da apoptose,
foram verificados os nveis de caspases efetoras de apoptose
(Caspase 3/7), utilizando-se o
mtodo quimiluminescente de placas, com o kit de ensaio de
caspase-3/7 Glo (Pierce, EUA).
As clulas foram cultivadas na presena e na ausncia do AcE (100,
500 ou 1000 g/mL) ou
da Qt (1,25, 2,5 ou 5 M). Foi adicionado o reagente caspase-3/7
Glo e, aps misturarem-se
suavemente as clulas, foram incubadas temperatura ambiente
durante 1 h. A luminescncia
de cada amostra foi medida na placa de leitura de luminmetro
Cytation 3, Biotek (EUA).
-
40
4.5 ENSAIO DE FOSFATASE CIDA RESISTENTE AO TARTARATO (TRAP)
Para examinar-se o efeito inibidor do AcE e da Qt na
osteoclastognese induzida por
RANKL/PgLPS em RAW 264.7, medidas quantitativas e qualitativas
de TRAP foram
obtidas por meio de dois mtodos anteriormente descritos (CRASTO
et al., 2013). A
diferenciao dos osteoclastos foi medida por meio da quantificao
de clulas marcadas
positivamente pela TRAP. O nmero de osteoclastos multinucleados
TRAP+ por poo foi
determinado e foram distribudos em osteoclastos pequenos (2-5
ncleos) e grandes (>10
ncleos). As imagens digitais de clulas TRAP+ foram obtidas com
objetiva de 40X sob
microscopia de campo claro, usando-se um microscpio Leica DM
IRE2 e o software
OpenLab (Leica Microsystems). A anlise das imagens foi realizada
com o software NIH
ImageJ 1.46r. Alm disso, foi determinada a atividade da TRAP
total solvel. Utilizou-se um
tampo detergente acdico para que as clulas fossem
permeabilizadas e fosse possvel medir-
se a liberao de p-nitrofenol pelos osteoclastos. A quantidade de
p-nitrofenol liberado indica
o grau de diferenciao celular. Procedeu-se leitura da microplaca
a um comprimento de
onda de 405 nm utilizando-se um leitor de espectrofotometria
(BioRad 3550).
4.6. ENSAIO DE REABSORO DE HIDROXIAPATITA (colorao de Von
Kossa)
A acumulao mineral foi visualizada com a colorao histoqumica de
fosfato de
clcio Von Kossa. Ensaios de reabsoro em superfcie de placas de
24 poos, Corning Osteo
Assay (Corning Life Sciences, EUA) foram realizados como
descrito por Kartner e outros
(2010). Resumidamente, clulas RAW 264.7 foram diferenciadas em
osteoclastos e deixadas
a aderir s placas a 37 C com 100 L de meio contendo 30 ng/mL de
RANKL. No quinto
dia, as clulas RAW 264.7 foram transferidas para placas de
ensaio, e foram testadas as
concentraes de AcE (100, 500, 1000 g/mL) ou de Qt (1,25, 2,5 ou
5 M). Aps 24 h, as
clulas foram removidas das placas com a adio de 500 L de soluo
de hipoclorito de
sdio a 1,2% por 5 min. Em seguida, as placas foram aspiradas,
lavadas cuidadosamente com
gua e secadas antes da colorao. A colorao modificada de Von
Kossa foi usada para
aumentar o contraste do ensaio. A microscopia de campo escuro
mostrou a reabsoro nos
poos em 40X. A densidade ptica de uma rea preta completa (100%
de absorbncia) com a
-
41
matriz corada de Von Kossa sem nenhum osteoclasto foi utilizada
como controle. Para avaliar
com mais preciso as reas de reabsoro afetadas, elas foram
quantificadas e calculadas
usando-se o Image J 1.46r.
4.7 ENSAIO PARA MENSURAR A SECRECO DE CITOCINAS
Os nveis de citocinas foram medidos em sobrenadantes obtidos a
partir de clulas
RAW 264.7 na presena e na ausncia de RANKL (30 ng/mL)/PgLPS (1
g/mL), e de AcE
(100, 500 ou 1000 g/mL) ou de Qt (1,25, 5 ou 2,5 M) com kits de
ELISA disponveis
comercialmente. A secreo de IL-6, IL-3, IL-4, TNF e IL-1 foi
medida nos sobrenadantes
recolhidos durante a diferenciao de osteoclastos (aps 24 h, 3
dias e 5 dias), e, aps 24 h,
em placas de superfcie Osteo Assay para medir-se a atividade dos
osteoclastos. Os
sobrenadantes de cultura de clulas foram recolhidos e
centrifugados para remover os restos
celulares, e o ensaio foi realizado de acordo com as
especificaes do fabricante. A
absorbncia de cada amostra foi medida a 450 nm com um leitor de
espectrofotometria. Os
resultados foram comparados com a curva padro preparada por
diluio da soluo padro
fornecida no kit.
4.8 ENSAIO DE WESTERN BLOT PARA ANLISE DA INIBIO DA VIA DO
NF-B
Clulas RAW 264.7 foram cultivadas durante 2 horas e, durante 1
hora, foram pr-
tratadas na presena e na ausncia da concentrao tima do AcE (1000
g/mL) ou da Qt
(5 uM) juntamente com um controle no tratado. Em seguida, as
clulas foram estimuladas
com RANKL e PgLPS durante 30 minutos, conforme descrito por Xie
e outros (2012). As
clulas tratadas com os reagentes indicados foram lisadas em
soluo tampo para extrao de
protenas (RIPA) com protease e inibidores de fosfatase (Cell
Signaling, Danvers, MA). O
lisado celular foi centrifugado a 13.000 rpm durante 20 min para
remover os detritos
celulares. A transferncia de iguais concentraes de protenas foi
confirmada com o ensaio
que mensura a concentrao de protena total (Bio-Rad). O lisado
celular (10 g de protena)
foi separado por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo
dodecil sulfato de sdio e
-
42
transferido para uma membrana de nitrocelulose. Aps a
transferncia, a membrana foi
bloqueada com 5% de albumina srica bovina/soluo salina tamponada
com fosfato
contendo 0,05% de Tween-20, durante 2 h. A membrana foi ento
incubada com anti-IB,
anti-p-IB e anti--actina (utilizada como controle) durante 2 h.
Foram detectadas bandas
utilizando-se reagentes ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ,
EUA), de acordo com as
instrues do fabricante, que foram analisadas utilizando-se MyECL
Imager (Thermo
Scientific, Rockford, IL, EUA).
4.9 ANLISE ESTATSTICA
Para cada ensaio, a significncia estatstica foi determinada pela
anlise de varincia
(ANOVA), seguida do ps-teste de Tukey (p
-
43
5 RESULTADOS
-
44
5.1 Allium cepa L. E QUERCETINA NO INDUZEM EFEITOS TXICOS EM
CLULAS RAW 264.7 NA PRESENA OU NA AUSNCIA DE RANKL e pgLPS
Nos ensaios de viabilidade, clulas RAW 264.7 foram cultivadas,
durante 5 dias, na
presena e na ausncia de AcE nas concentraes de 10-8000g/mL, no
induzindo
proliferao celular (Fig. 1). Adicionalmente, o AcE e a Qt no
induziram toxicidade na
viabilidade celular avaliada por DAPI (Fig. 2) nem no ensaio de
induo de apoptose
(Caspase 3/7) (Fig. 3) em clulas RAW 264.7. Alm disso, no foram
observados efeitos
txicos nas culturas de clulas precursoras de osteoclastos, na
presena ou ausncia do AcE
ou da Qt sob induo inflamatria in vitro com LPS (Pg e Ecoli).
Sob essas condies, essas
clulas foram avaliadas nos ensaios de reduo da resazurina (Fig.
4), na mensurao da
concentrao de protena total (Fig. 5) e na contagem de clulas
viveis coradas por DAPI
(Fig. 6). Nesses experimentos, observou-se que o AcE e a Qt,
tanto no ensaio de reduo da
resazurina quanto na dosagem de protenas totais, no demonstraram
efeitos txicos na
osteoclastognese induzida por RANKL/PgLPS (Fig. 7).
-
45
Cel 10 50 100 200 250 500 1000 2000 4000 8000 DMSO0
50
100
150
***
AcE ( g/mL)
Pro
lifer
ao
cel
ular
(%)
Figura 1. Efeito do Allium cepa L. na proliferao de clulas RAW
264.7. Clulas foram cultivadas na presena e ausncia de AcE
(10-8000g/mL); clulas no tratadas (Cel) no foram expostas ao AcE; e
DMSO foi usado como controle positivo. Aps de 5 dias de exposio a
droga, a proliferao celular foi avaliada usando o ensaio de
resazurina (Alamar Blue). Os resultados foram expressos em mdia DP
de trs experimentos independentes. No houve signficncia estatstica
entre o controle (Cel) e as concentraes de AcE testadas. Houve
significncia estatstica entre o controle positivo (DMSO) e todas as
concentraes testadas. p
-
46
Ctrl DMSO0
50
100
150
AcE (g/mL) - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - 1.25 2.5 5
***
Con
tage
m c
elul
ar p
or D
API
(%)
Figura 2. Efeito do Allium cepa L. e quercetina na morfologia e
contagem celular em clulas RAW 264.7 coradas com DAPI. Clulas foram
cultivadas durante 5 dias na presena das concentraes testadas de
AcE e Qt. (A) Morfologia de ncleos das clulas foi observada (a)
Ctrl, (b) AcE 100 g / mL, (c) AcE 500 g / mL, (d) AcE 1000 g / mL,
(e) Qt 1.25M, (f) Qt 2,5 M, (g) Qt 5M, (h) DMSO; (B) Contagem de
clulas atravs de colorao DAPI utilizando um microscpio de
fluorescncia. Os resultados foram expressos em mdia DP de trs
experimentos independentes. No houve diferena significante entre
controle (Ctrl) e todas as concentraes testadas. Houve significncia
estatstica entre o controle positivo (DMSO), o Ctrl e todas as
concentraes testadas de AcE e Qt. p
-
47
Cel 1.25 2.5 50
2000
4000
6000
8000
Qt ( M)
B
Ativ
idad
e C
aspa
se 3
/7
Figura 3. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na apoptose em
clulas RAW 264.7. Em A e B, a atividade de caspase-3 e capase-7
foram avaliadas atravs do ensaio de caspase 3/7. Em A e B, os
resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos
independentes. No houve significncia estatstica entre o controle
(Cel) e as concentraes testadas de AcE e Qt. ANOVA-Tukey.
Cel 10 50 100 10000
2000
4000
6000
8000
AcE (g/mL)
A
Ativ
idad
e C
aspa
se 3
/7
-
48
Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0
50
100
150
Pg LPS (1g/mL) + + + + + +
AcE (g/mL)
F
***Via
bilid
ade
Cel
ular
(%
)
Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0
50
100
150
Ecoli LPS (1g/mL) + + + + + +
G
AcE ( g/mL)
***Via
bilid
ade
Cel
ular
(%
)
Figura 4. Efeito da Allium cepa L. na viabilidade celular de
clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS. Clulas foram cultivadas na
presena de Pg LPS (A, B e F) ou Ecoli LPS (C, D e G), e AcE; clulas
no tratadas com AcE e expostas ao DMSO, foram utilizadas como
controle positivo (DMSO). Aps 5 dias de exposio, a proliferao
celular foi avaliada pelo ensaio de resazurina (Alamar Blue). As
imagens mostradas representam resultados observados em mltiplas
imagens feitas dos seguintes grupos: Ctrl PgLps (A) e AcE 1000g/mL
(B); Ctrl EcoliLPS (C) e AcE 1000g/mL (D). Em F e G, os resultados
foram expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No
houve significncia estatstica entre o controle (Ctrl) e as
concentraes testadas de AcE. Houve significncia estatstica entre o
controle positivo (DMSO) e todas as concentraes testadas de AcE.
p
-
49
Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Pg LPS(1g/mL) + + + + +
AcE (g/mL)
A
***
Prot
ena
(mg/
mL)
Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Ecoli LPS (1g/mL) + + + + +
AcE (g/mL)
B
***
Prot
ena
(mg/
mL)
Figura 5. Efeito da Allium cepa L. nos nveis de protena total de
clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS. Em A e B, as clulas foram
cultivadas na presena de PgLPS (A) ou Ecoli LPS (B), e AcE; o grupo
controle (Ctrl) no foi exposto ao AcE e o DMSO foi usado como
controle positivo (DMSO). Aps 5 dias, foi realizado o ensaio para
quantificar os nveis de protena total. Os resultados foram
expressos em mdia DP de trs experimentos independentes. No houve
significncia estatstica entre o controle (Ctrl) e as concentraes
testadas de AcE. Houve significncia estatstica entre o controle
positivo (DMSO) e todas as concentraes testadas de AcE. p
-
50
Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0
50
100
150
AcE (g/mL)
Pg LPS (1g/mL) + + + + + +
F
***
Con
tage
m c
elul
ar p
or D
API
(%)
Ctrl 10 50 100 1000 DMSO0
50
100
150
Ecoli LPS (1g/mL) + + + + + +
AcE (g/mL)
G
***
Con
tage
m c
elul
ar p
or D
API
(%)
Figura 6. Efeito da Allium cepa L. na morfologia e contagem
celular em clulas RAW 264.7 estimuladas com LPS coradas com DAPI.
Clulas RAW 264.7 foram cultivadas na presena de Pg LPS (A, B e F)
ou Ecoli LPS (C, D e G), e AcE; o grupo controle (Ctrl) no foi
exposto ao AcE e o DMSO foi usado como controle positivo (DMSO). A
morfologia celular foi observada em A (Ctrl PgLPS) e B (AcE
1000g/mL); C (Ctrl EcoliLPS) e D (AcE 1000g/mL). Em F e G, as
clulas foram contadas depois de coradas com DAPI e foi usado um
microscpio de fluorescncia. Os resultados foram expressos em mdia
DP de trs experimentos independentes. No houve significncia
estatstica entre o controle (Ctrl) e as concentraes testadas de
AcE. Houve significncia estatstica entre o controle positivo (DMSO)
e todas as concentraes testadas de AcE. p
-
51
Ctrl 0
50
100
150
PgLPS (1g/mL) + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) + + + + + + +AcE
(g/ml) - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - 1.25 2.5 5
A
Viab
ilidad
e C
elul
ar (
%)
Ctrl 0.0
0.5
1.0
1.5
PgLPS (1g/mL) + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) + + + + + + +AcE
(g/ml) - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - 1.25 2.5 5
B
Prot
ena
(mg/
mL)
Figura 7. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na viabilidade
celular na osteoclastognese induzida por RANKL e estimulada com
PgLPS. As clulas foram cultivadas na presena de PgLPS, RANKL e AcE
ou Qt; clulas no tratadas (Ctrl) no foram expostas a AcE ou Qt. Aps
5 dias de exposio contnua, a viabilidade celular foi avaliada
utilizando o ensaio de resazurina (Alamar Blue)) (A) e os nveis de
protena total foram avaliados usando ensaio de protena (B). Os
resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos
independentes. No houve diferena estatisticamente significante
entre o controle (Ctrl) e as concentraes testadas de AcE e Qt.
ANOVA-Tukey.
-
52
5.2 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A OSTEOCLASTOGNESE
INDUZIDA POR RANKL ESTIMULADA POR PgLPS EM CLULAS RAW 264.7
Para determinar-se o efeito do AcE e da Qt na diferenciao de
clulas precursoras de
osteoclastos em osteoclastos maduros sob o estmulo de
RANKL/PgLPS, a colorao de
TRAP foi utilizada para avaliar o nmero e o tamanho dos
osteoclastos multinucleados por
poo. Na ausncia de LPS, RANKL, AcE e Qt, no se evidenciou a
presena de osteoclastos
(Fig. 8 Aa). Na presena de LPS e RANKL, houve aumento
estatisticamente significativo da
diferenciao de clulas RAW 264.7 em osteoclastos (Fig. 8 Ab).
Todas as trs concentraes
testadas de AcE (100, 500 ou 1000 g/mL) e de Qt (1,25, 2,5 ou 5
M) inibiram a
diferenciao de osteoclastos induzidos por RANKL/PgLPS (p
-
53
Cel Ctrl0
10
20
30
40
50
*** ***
***
B
PgLPS (1g/mL) - + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) - + + + + + + +AcE
(g/ml) - - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - - 1.25 2.5 5
*************** ***
***
N d
e c
lula
s gr
ande
s (T
RAP
posi
tivo)
(%)
Cel Ctrl0
20
40
60
**
C
PgLPS (1g/mL) - + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) - + + + + + + +AcE
(g/ml) - - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - - 1.25 2.5 5
* *N
de
clu
las
pequ
enas
(TRA
P po
sitiv
o) (%
)
Cel Ctrl 0.00
0.05
0.10
0.15
* *
D
***
PgLPS (1g/mL) - + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) - + + + + + + +AcE
(g/ml) - - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - - 1.25 2.5 5
* ** **
Secr
eo
de
p-ni
trofe
nol (
nM)
Figura 8. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na
osteoclastognese induzida por RANKL e estimulada com PgLPS. Em (A),
a colorao TRAP por microscpio de campo claro mostrou osteoclastos
diferenciados na presena de AcE ou Qt, aps 5 dias. As setas mostram
a diminuio do tamanho de osteclastos. Os osteoclastos foram
divididos em dois grupos diferentes de acordo com o nmero de ncleos
contados: osteoclastos pequenos (B) de 2-5 ncleos e osteoclastos
grandes (C) com 10 ou mais ncleos por clula. Em (D), a secreo de
PNP (nM) foi diminuda em todos as concentraes testadas de AcE e Qt
. Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experimentos
independentes. Houve significncia estatstica entre o controle
(Ctrl) e as concentraes testadas de AcE e Qt. * p
-
54
5.3 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A REABSORO DOS
OSTEOCLASTOS
A figura 9A mostra imagens do ensaio de colorao de Von Kossa.
Observa-se a
quantificao da superfcie parcialmente reabsorvida por
osteocastos induzidos por
RANKL/PgLPS (Ctrl), em comparao com o controle no tratado (Cel).
O tratamento com
as trs concentraes de AcE e de Qt reduziu significativamente os
efeitos da RANKL/PgLPS
sobre a atividade dos osteoclastos quando comparados com o
controle positivo (Ctrl)
(p
-
55
Cel Ctrl 0.0
0.5
1.0
1.5
******
***
B
PgLPS (1g/mL) - + + + + + + +RANKL (30 ng/mL) - + + + + + + +AcE
(g/ml) - - 100 500 1000 - - -Qt (M) - - - - - 1.25 2.5 5
***
*** ***rea
de
reab
sor
o re
lativ
a
Figura 9. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na atividade de
reabsorso osteoclstica. Em (A) clulas RAW 264.7 induzida por RANKL
foram diferenciadas em osteoclastos durante 5 dias e transferidas
para placas de ensaio Corning Osteo. As clulas maduras foram
testadas na presena de PgLPS, RANKL e AcE ou Qt durante 24 h e o
grupo no tratado (Ctrl) no foi exposto a AcE ou Qt. O ensaio de Von
Kossa foi realizado, onde as placas com as amostras foram secas
temperatura ambiente e fotografadas usando fotomicrografia de campo
digital. As imagens foram quantificadas e as reas sem reabsorso
apareceram pretas e as brancas foram as reabsorvidas. Em (B), a
quantificao de A. Os resultados foram expressos em mdia DP de trs
experimentos independentes. Houve significncia estatstica entre o
controle (Ctrl) e as concentraes testadas de AcE e Qt. *** p
-
56
5.4 Allium cepa L. E QUERCETINA MODULAM A PRODUO DE CITOCINAS
DURANTE A OSTEOCLASTOGNESE E A ATIVIDADE DOS OSTEOCLASTOS
O efeito do AcE e da Qt na produo de mediadores inflamatrios
produzidos por
osteoclastos induzidos por RANKL/PgLPS foi investigado por meio
da quantificao dos
nveis de citocinas durante a osteoclastognese e na atividade dos
osteoclastos. Durante a
diferenciao de osteoclastos no quinto dia, a secreo de IL-1 foi
modulada pelo AcE com
100 g/mL, 500 g/mL e 1000 g/mL (p
-
57
Tabela 1. Efeito da Allium cepa L. e quercetina na produo de
citocinas durante a osteoclastognese e a atividade dos
osteoclastos. O sobrenadante foi recolhido e as citocinas IL-1,
IL-6, TNF, IL-3 e IL-4 foram mensuradas durante a osteoclastognese
(24 horas, 3 dias e 5 dias) e a atividade dos osteoclastos (24
horas). Os resultados foram expressos em mdia DP de trs experincias
independentes. Houve significncia estatstica entre o controle (Cel)
e Ctrl # p
-
58
5.5 Allium cepa L. E QUERCETINA INIBEM A ATIVAO DA VIA DE
SINAL