UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR CLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE ANTÍGENOS VISANDO À INDUÇÃO DE IMUNIDADE CONTRA TOXOPLASMA GONDII JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA ILHÉUS - BAHIA - BRASIL Fevereiro de 2016
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
CLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE ANTÍGENOS VISANDO À
INDUÇÃO DE IMUNIDADE CONTRA TOXOPLASMA GONDII
JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA
ILHÉUS - BAHIA - BRASIL
Fevereiro de 2016
ii
JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA
CLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE ANTÍGENOS
VISANDO À INDUÇÃO DE IMUNIDADE CONTRA TOXOPLASMA
GONDII
Tese apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como parte das exigências para
obtenção do título de Doutor em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e
Biologia Molecular
ILHÉUS - BAHIA - BRASIL
Fevereiro de 2016
S474 Sena, Jamilly Azevedo Leal. Clonagem e expressão heteróloga de antígenos visando à indução de imunidade contra Toxoplasma gondii / Jamilly Azevedo Leal Sena. – Ilhéus, BA: UESC, 2017. xiii, 79 f. : il. Orientador: Carlos Priminho Pirovani. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Gené- tica e Biologia Molecular. Inclui referências e apêndice.
1. Toxoplasma gondii. 2. Toxoplasmose. 3. Siste- ma imunológico. 4. Antígenos. I. Título. CDD 616.016
iii
JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA
CLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE ANTÍGENOS VISANDO À
INDUÇÃO DE IMUNIDADE CONTRA TOXOPLASMA GONDII
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte das
exigências para obtenção do título de Doutor
em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia
Molecular
APROVADA: 24 de fevereiro de 2016
Dr. Arlindo Gomes Macêdo Junior Dra. Luciana Debortoli Carvalho
(UFOB) (UESC)
Dra. Sara Pereira de Menezes Dra. Tahise Magalhães de Oliveira
(UESC) (UESC)
Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani
(Orientador - UESC)
iv
"Se não houver frutos, valeu a beleza das flores;
Se não houver flores, valeu a sombra das folhas;
Se não houver folhas, valeu a intenção da semente".
Henfil
v
À minha avó Jardelina Azevedo Leal,
nossa matriarca, exemplo de sabedoria,
humildade, perseverança e fé.
DEDICO
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela bondade suprema, dando-me fé e saúde e por me sustentar nos
momentos mais difíceis. A Ele, toda gratidão!
À minha família, minha base e meu suporte, pelo apoio nas minhas decisões e
pelo incentivo sempre. Pelos momentos de união, alegria, carinho e
compreensão. Meus pais sempre dedicados à minha formação, incentivando-
me nas minhas decisões. Minha irmã Fernanda, que carinhosamente sempre
demonstra orgulho da irmã aqui.
Ao meu sobrinho Arthur, que chegou para abrilhantar nossa família. E à Júlia
Laert, a quase sobrinha que tanto sentiu minha falta nesses últimos anos.
Ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani, pela orientação,
confiança, preocupação, ensinamentos e incentivo constantes.
À Profa. Dra. Jane Lima, pela contribuição ao trabalho e pelo incentivo
oferecido sempre. E às alunas do Laboratório de Imunobiologia, por sempre
estarem dispostas a ajudar.
Às alunas de iniciação científica Thaíse Rocha e Nancy Trindade, por tornarem
a luta diária menos árdua, sempre comprometidas, ajudando na realização dos
experimentos.
Às amigas-irmãs Laís Freire, Luciana Cidade, Joise Hander, Cristina Martins.
Obrigada por tudo!
Aos colegas do Centro de Biotecnologia e Genética, dos laboratórios Cultura
de Tecidos, Proteômica, Genômica e Biologia Molecular. Em especial às
minhas amigas CBGets. Os momentos que compartilhamos experiências e
alegrias serão inesquecíveis.
vii
Aos demais colegas do CBG, em especial o técnico Horlei, pelos momentos de
descontração e sempre tão disposto a ajudar e dedicado em cumprir suas
tarefas.
Aos meus grandes amigos, por sempre acreditarem e compreenderem a minha
ausência e pela torcida sempre. Em especial, às minhas "Migas", que tanto
alegram meus dias, seja pelas resenhas ou pelos bons momentos
compartilhados.
Ao meu querido Gilter Ramos, um ser humano maravilhoso que Deus me
apresentou. Obrigada pelos momentos especiais e pela compreensão nos
momentos em que precisei me ausentar.
Aos meus tios e tias, pelo carinho e atenção sempre, em especial ao tio
padrinho Ito (in memorian). E a todos os meus primos, principalmente Jorginho
e Júnior, que são meus primos-irmãos.
À Profa. Dra. Fátima Alvim e Dr. Júlio Cascardo (in memorian), casal amigo
que me incentivou e ajudou a trilhar o caminho da ciência.
À Universidade Estadual de Santa Cruz e Programa de Pós-Graduação em
Genética e Biologia Molecular, pela oportunidade. E às secretárias do
programa por sempre estarem disponíveis e solucionando nossos problemas
sempre.
Aos professores doutores membros das bancas de qualificação e defesa
Arlindo Macêdo, Aurizângela Sousa, Luciana Debortoli, Sara Menezes e Tahise
Magalhães, pelas excelentes contribuições. Profa. Luciana, agradeço a linda
mensagem que tanto me emocionou.
À CAPES, CNPq e BNB, pela concessão da bolsa e pelos auxílios financeiros.
E a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para que este
doutoramento fosse possível.
viii
ÍNDICE
EXTRATO ..................................................................................................................... x
ABSTRACT ................................................................................................................. xii
antígeno de bradizoíto: BAG1 e p-ATPase. As linhagens clonais de T. gondii
apresentam diferenças na virulência e padrões epidemiológico, apresentando
três genótipos (tipo I, II, III), que são similares, com raros polimorfismos
(LEKUTIS et al., 2001; LYONS et al., 2002).
A patogenicidade e interação antígeno-anticorpo têm na invasão celular
seu principal episódio, semelhante ao que ocorre nos apicomplexa, envolve
receptores da superfície celular do hospedeiro liberando proteínas
consecutivas de micronomas, roptrias e grânulos densos, sumarizando esta
invasão: a) aderência primordial dos parasitos na célula é aleatória, envolve
imunógenos de superfície imunodominantes, pela reorientação parasitaria,
promove na extremidade exterior exclusão da conóide, invaginando e formando
o vacúolo parasitóforo (VP) (local de secreção de proteínas micronemas
parasitarias); b) segue liberação do interior do (VP, de proteínas de roptrias,
estendendo suas membrana (MVP) para associar as organelas celular do
hospedeiro, posicionando as mitocôndrias e retículo endoplasmáticos
adjacentes ao VP (BÉLA, 2008).
Na resposta imunitária, as imunoglobulinas da classe M (IgM), indicam
infecção recente (não de re-infecção), presente nos primeiros sete dias até
nove a doze meses, com o transcorrer das infecções as IgM apresentam
elevada avidez. As IgG aparecem de uma a duas semanas após a infecção,
com baixa avidez para antígenos correspondentes. Os anticorpos de alta
avidez de IgG são úteis como marcadores para exclusão de infecção recente
(BÉLA et al., 2008).
9
Nesse processo, participam células T CD4+, T CD8+ e macrófagos, além
de células natural killer (NK). Na fase aguda, os macrófagos infectados
produzem IL-12, estimulam as NK a produzir IFNγ (principal mediador de
resistência). Este interferon é mediador na formação dos cistos e crítico para a
sobrevivência do hospedeiro. A IL-10 é uma citocina na resposta imune que
tem efeitos inibitórios na atividade microbicidas dos macrófagos advindos do
IFNγ, assim a regulação da IL-10 na infecção por T. gondii é importante para a
sobrevivência do hospedeiro (BÉLA et al., 2008; AIGNER, 2008).
Macrófagos e polarização fenotípica
Macrófagos são células fagocitárias da imunidade inata que
desempenham funções essenciais para mecanismos de defesa,
desenvolvimento de tecidos e homeostase (SICA et al., 2015). Quando
ativados, liberam citocinas e apresentam antígenos aos linfócitos, além de
fagocitar e destruir micro-organismos (MARTINEZ, GORDON, 2014). Possuem
uma heterogeneidade funcional caracterizada por diferentes fenótipos, agindo
na proteção da integridade e na cicatrização de tecidos ou sendo destruidores
de tecidos em inflamações crônicas, por exemplo, devido à produção de
citocinas inflamatórias (MANTOVANI et al., 2013; BISWAS et al., 2013).
Os macrófagos protagonizam o processo inflamatório e cicatrização.
Primeiramente, a inflamação ocorre como resposta natural à presença de
corpos estranhos, produzindo citocinas pró-inflamatórias, como fator de
necrose tumoral (TNFα) e interleucinas (IL-1), que alertam o sistema imune a
nível local e sistêmico e recrutam células como neutrófilos e monócitos para o
microambiente (ALVAREZ et al., 2016). Em geral, os macrófagos permanecem
na interface do tecido e tornam-se mediadores chave na inflamação, e agem
fagocitando o material exógeno. Dependendo do tipo de estímulo liberado, eles
são ativados e podem se modificar, adquirindo fenótipos induzidos por
diferentes estados de polarização, relacionados aos perfis M1 e M2.
Macrófagos M1 referem-se a ativação de forma clássica em estágios iniciais da
infecção, exibindo um perfil pró-inflamatório, enquanto os macrófagos M2 são
ativados de maneira alternativa em estágios tardios, configurando um perfil
10
anti-inflamatório (CHÁVEZ-GALÁN et al., 2015; SPILLER et al., 2015) (Figura
2).
Células M1 exercem atividades citotóxica e anti-proliferativa, como
consequência da produção de óxido nítrico (NO) e algumas citocinas, sendo
TNFα e IL-1β as duas proeminentes que são superexpressas na maioria das
doenças inflamatórias (MANTOVANI et al., 2005; MURRAY et al. 2014). Além
disso, macrófagos M1 medeiam a resistência a patógenos intracelulares e a
destruição de tecidos.
Por outro lado, a via alternativa apresenta característica de macrófagos
predominando a cascata da enzima arginase ativada, inibindo a resposta
inflamatória, e envolvidos na limpeza de detritos, reparo e remodelação de
tecidos (HESSE et al., 2001). Macrófagos polarizados em M2 geralmente estão
envolvidos na resistência a parasitos e regulação da imunidade. Possuem
níveis reduzidos de citocinas inflamatórias e liberam quantidades elevadas de
moléculas anti-inflamatórias como IL-10 e TGFβ. Além disso, exercem função
imunosupressora, inibindo a proliferação de células-T (KONG et al., 2015).
No início da infecção por T. gondii, ocorre a liberação de IL-12 e TNFα
por macrófagos, células dendríticas e neutrófilos estimulados. A IL-12 induz
células natural killer na produção de interferon-gama (IFNγ), que agem
conjuntamente com TNFα e aumentam a atividade fagocítica dos macrófagos,
induzindo a proliferação de linfócitos T produtores de IFNγ, sendo também
essas células importantes no controle da infecção aguda e crônica por T. gondii
(GAZZINELLI, 1994; YAP, SHER, 1999). Todavia, apesar de IFNγ induzir
mecanismos potentes, os parasitos não são eliminados completamente (YAP,
SHER, 1999).
Protozoários como Toxoplasma e Leishmania geralmente elicitam
polarização inicial de macrófagos M1 que contem a parasitemia e controla a
doença, seguido de uma mudança parcial de M1 para M2 que limitam os danos
causados no tecido durante o processo inflamatório, mas sustentando uma
infecção crônica (RAES et al., 2007). Sendo assim, um leve equilíbrio
inflamatório entre M1 e M2 reforça o controle de doenças. Em suma, ambos
macrófagos M1 e M2 são requeridos em diferentes tempos durante o processo
de infecção e cicatrização de tecidos (SICA et al., 2015).
11
Figura 2: Polarização de macrófagos. Macrófagos não ativados são polarizados em fenótipos distintos por agentes indutores específicos, mostrando mudanças típicas na expressão de genes. Nota-se que não há inclusão de todos os agentes e o perfil de expressão para diferentes macrófagos M2 pode diferir dependendo da natureza da indução (Fonte: FERRANTE et al., 2012).
Plantas como biorreatores na produção de antígenos e vacinas
Antígenos proteicos específicos podem ser produzidos em plantas que
induzirão uma resposta imune quando utilizadas como alimento por animais ou
humanos (STREATFIELD & HOWARD, 2003) (Tabela 1). O uso da tecnologia
recombinante tem mostrado boa eficácia na produção de vacinas comestíveis
(ou oral) na proteção de animais e humanos contra patógenos. Em alguns
casos, a proteção tem sido melhor com as vacinas comestíveis do que com as
vacinas comercialmente disponíveis (LAMPHEAR et al., 2002).
12
Tabela 1: Proteínas expressas em plantas utilizadas como vacinas
Espécie alvo Proteína Planta Nível de expressão
Resultado
E. coli enterotoxigênica
(humanos)
Toxina Lt (subunidade)
Batata 0,19% proteína total
Imunogênica quando administrada oralmente
E. coli enterotoxigênica
(humanos)
Toxina Lt (subunidade)
Milho Não mostrado Imunogênica e protetora quando administrada
oralmente Vibrio cholerae
(humanos) Toxina B do
cólera Batata 0,30% proteína
total Formas da proteína
intactas, protetora quando administradas oralmente
Vírus da raiva (humanos)
Glicoproteína Tomate 1,00% proteína total
Proteína intacta
Febre aftosa (animais)
VP1 Alfafa Não mostrado Imunogênica e protetora quando administrada
oralmente e por injeção Coronavírus da gastroenterite transmissível
(porco)
Glicoproteína S
Milho <0,01% peso fresco
Protetora quando administrada oralmente
Fonte: DANIELL et al., 2001.
As plantas são diferenciados sistemas de expressão, viabilizando
atender a atual demanda mundial por novas proteínas terapêuticas,
solucionando questões de interesses industriais. Esta engenharia genética
atrelada a Molecular Farming desponta enquanto alternativa economicamente
atraente para a produção de biofármacos (vacinas, anticorpos, proteínas
recombinantes e outros), oferecendo maior biossegurança e menores custos
em seus processos (COUTINHO, 2005; MODOLO, 2009).
Por serem organismos eucariotos, as plantas possuem a capacidade de
processar diversos tipos de proteínas de mamíferos com altos níveis de
expressão e além disso, muitas proteínas sofrem glicosilação em humanos, o
que não ocorre em bactérias (DANIELL et al., 2001). Enquanto biorreatores,
apresentam outras vantagens como: podem ser produzidas em larga escala,
não necessitam da etapa de purificação, já que servem de alimento, e os riscos
de contaminação por patógenos de humanos são minimizados (CRAMER et
al., 1999; DANIELL et al., 2001).
Uma vacina ideal deve ser termoestável, fácil de administrar, sem efeitos
colaterais, potente e eficaz (LAMPHEAR et al., 2002). Estes são requisitos
importantes para vários segmentos socioeconômico, industrial e
biossegurança, sendo assim, as vacinas comestíveis representam uma ótima
13
alternativa, pois os antígenos bioencapsulados em células vegetais eliminam o
alto custo com purificação, transporte e estocagem a frio e esterilidade, pois
são livres de injeções (LAMPHEAR et al., 2002; UVAROVA et al., 2013).
Considerando isto, os EUA já estudam 390 moléculas recombinantes,
referendando que o custo de produção de proteínas no sistema vegetal é
vantajoso (RICHTER, 2001; VILANNI, 2009).
A comercialização de proteínas recombinantes purificadas a partir de
sementes do milho demonstram o seu potencial na produção de proteínas em
larga escala, pois a integridade e a atividade biológica das proteínas são
mantidas. A toxina Lt-B, causadora da diarreia provocada por E. coli, foi
expressa em sementes transgênicas e resultou numa aumentada resposta
imune de mucosas e demonstraram uma alternativa potente, estável e de baixo
custo para a vacina recombinante (STREATFIELD et al., 2002). Também tem-
se confirmado a efetividade com o antígeno de superfície do vírus da Hepatite
B, comprovadamente induzida em tabaco e experimentada em camundongos,
desde a década de 90 (TWYMAN, 2003).
Estudos desenvolvidos com tomates transgênicos como vacina oral
indicam a sua viabilidade. A proteína VP1, referente ao Enterovirus71 ou EV71,
causador de uma infecção viral em crianças, foi produzida em tomates
transgênicos e camundongos da linhagem BALB/c foram imunizados oralmente
com extratos de folhas de plantas do tomateiro. Observou-se que o soro dos
animais alimentados com os tomates contendo VP1 pôde neutralizar o EV71 e,
então, a imunidade protetora desejada foi alcançada (CHEN et al., 2006).
A toxina b do cólera não patogênico (subunidade CTB) foi produzida em
batata e tomate e inoculados oralmente em camundongos. O sistema imune de
mucosa produziu anticorpos cólera-específicos, que respaldaram um grau de
proteção imunológica importante (ARAWAKA et al., 1998; RICHTER, 2001).
Plantas de cenoura expressando o antígeno HIV-1 p24 (human
immunodeficiency virus type 1) foram usadas como biorreatoras para a
produção de uma vacina HIV-1, devido à depleção de células CD4+ nos tecidos
gastrointestinais (GALT). Os resultados preliminares indicaram a indução da
resposta imune humoral, principalmente em doses mais baixas do antígeno na
planta (LINDH et al., 2014).
14
CAPÍTULO 1
The SAG2A antigen modulates differentially the IL-1β expression with
peritoneal cells of mice resistant and susceptible to Toxoplasma gondii
Jamilly Azevedo Leal Sena1, Jane Lima dos Santos1, Thaise Anne Rocha
dos Santos1, Edson Mário de Andrade1, Tiago Mendes2, Jair Pereira da
Cunha-Júnior3, Tiago Wilson Patriarca Mineo3, José Roberto Mineo3,
Carlos Priminho Pirovani1*.
1Centro de Biotecnologia e Genética, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA, Brasil,
2Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil, 3Universidade Federal de
Uberlândia, Uberlândia, MG.
15
The SAG2A antigen modulates differentially the IL-1β expression with
peritoneal cells of mice resistant and susceptible to Toxoplasma gondii
Jamilly Azevedo Leal Sena1, Jane Lima dos Santos1, Thaise Anne Rocha
dos Santos1, Edson Mário de Andrade1, Tiago Mendes2, Jair Pereira da
Cunha-Júnior3, Tiago Wilson Patriarca Mineo3, José Roberto Mineo3,
Carlos Priminho Pirovani1*.
1Centro de Biotecnologia e Genética, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA, Brasil,
2Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil, 3Universidade Federal de
Uberlândia, Uberlândia, MG.
ABSTRACT
The cell surface of Toxoplasma gondii is covered by antigens (SAGs) from the
SRS family anchored by glycosylphosphatidylinositol (GPI), and includes
antigens from the SAG2 family, among which there is the SAG2A surface
antigen that shows great potential in activating the humoral response and has
been used in the characterization of the acute phase of infection, as well as in
the serological diagnosis of toxoplasmosis. In this study we aimed to evaluate
the rSAG2A-induced proteins in mice macrophages susceptible and resistant to
T. gondii and to evaluate the phenotypic polarization induced in the process. To
this end, we treated peritoneal macrophages of mice resistant and susceptible
to Toxoplasma gondii with rSAG2A to analyze the proteomic profile using mass
spectrometry and systems biology, and we also carried out the expression of
genes from these cells via RT-qPCR using the phenotypic markers M1 and M2.
The results of this study showed differences in the expression of the proteins
involved in the inflammatory process in both lineages and that macrophages
were preferentially induced to a pro-inflammatory immune response (M1) by the
overexpression of IL-1β in mice susceptible to this parasite. These data suggest
the SAG2A antigen induces macrophages to be phenotypically and classically
activated in the two lineages of mice in the acute phase of the disease.
INTRODUCTION
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that causes the
toxoplasmosis disease, affecting a large number of people from different
geographical regions around the world. Definitive hosts are felids such as
16
domestic cats that house the sexual form of this protozoan in their intestinal
tract, which becomes a worsening factor for pregnant and immunosuppressed
individuals [1, 2].
The protozoan’s cell surface is covered by SAG antigens from the SRS
family anchored by glycosylphosphatidylinositol (GPI), also including antigens
from the SAG2 family, among which there is the SAG2A surface antigen [3, 4].
This protein is involved in the modulation of the immune response and in the
attenuation of parasite virulence. Despite also being involved in parasite
protection to survive in the environment [3], it shows great potential to activate
the humoral response [5] and has been used in the characterization of the acute
phase of infection, as well as in the serological diagnosis of toxoplasmosis [5,
6].
The modulation of the cellular immune response by T. gondii varies
according to the immune status of the host, thus affecting the infection course
that occurs similarly in humans and animal models [7]. BALB/c and C57BL/6
mice infected with the parasite present distinct inflammatory responses. In the
beginning of the infection, T. gondii stimulates macrophages and dendritic cells
to release different proinflammatory cytokines such as IL-1β, IL-2, IFN-γ, TNF-
α, and IL-12 that act together to increase the phagocytic activity of these cells,
leading to the host’s strong and protective defense and showing an immune
response to Th1 [8, 9, 10, 7]. Thus, resistant lineages (BALB/c) survive the
infection in contrast to susceptible strains (C57BL/6), which present early
mortality [11].
Macrophages provide many necessary functions to protect the host
during infections with T. gondii. When classically activated (M1), they show a
high ability to present antigens and induce the production of nitric oxide (NO),
considered the main effector molecule in what concerns cytotoxicity [12]. On the
other hand, alternatively activated macrophages (M2) are frequently produced
by Th2 cells and show high levels of arginase (Arg-1), in addition to the
synthesis of proline and polyamines capable of stimulating cell growth and
tissue repair [13, 14]. Despite SAG2A of T. gondii being involved in innate and
adaptive responses [15], it is unclear if SAG2A polarizes the macrophage
phenotype in lineages susceptible and resistant to T. gondii. To clarify this
17
polarization is important to intervene in the immune response directed to the
protection against toxoplasmosis.
Proteomics and gene expression studies with the T. gondii parasite can
contribute to the understanding of mechanisms of the immune system in hosts
[15]. Proteomics has been widely used to analyze the profile of protein
accumulation in cells, keeping reliability under certain conditions [16]. This
technique can be used to compare variations in protein accumulation in cells
and tissues, helping to elucidate cytotoxicity effects or target-drugs [16, 17]. In
the present study, we analyzed gene expression in mice macrophages BALB/c
and C57BL/6 submitted to treatment with SAG2A of T. gondii to verify the
phenotypic polarization. We also characterized the protein profile of
macrophages using the 2D-SDS/PAGE, followed by mass spectrometry,
resulting in the identification of proteins related to phenotypic responses. We
predicted an interaction network of comparative proteins among mice
genotypes, reinforcing the differential responses of such genotypes.
MATERIAL AND METHODS
Production of the recombinant SAG2A protein
Both expression and purification of the recombinant SAG2A protein
(rSAG2A) were held from the clone previously obtained [15]. Induced extracts of
Escherichia coli BL21 (DE3) and purification fractions of the rSAG2A protein
were observed in 12.5% of SDS-PAGE, and protein concentration was
determined by the Bradford method [18].
Preparation of mice peritoneal macrophages
Female mice of BALB/c and C57BL/6 with six weeks of age were
obtained from the Central Vivarium of the Federal University of Minas Gerais
(UFMG), Belo Horizonte, Brazil, and maintained according to the institutional
guide to animal ethics approved by the Animal Ethics Committee of the State
University of Santa Cruz, under Protocol 04/2011. Peritoneal macrophages
were harvested 4 days after intraperitoneal (i.p.) injection of 2.0 mL of 3%
thioglycollate medium to 8 week-old BALB/c and C57BL/6 mice. The cells were
18
plated in RPMI 1640 medium (SIGMA) supplemented with 10% Fetal Bovine
Serum (FBS) (GIBCO) and 50 mg.mL-1 gentamicin (GIBCO). Concentrations of
1 x 105, 5 x 106 and 1 x 107 cells/well were used in MTT assays, RT-qPCR and
protein extraction, respectively. The cells were incubated for 24 h at 37°C in an
atmosphere of 5% CO2.
Cell viability assay
Cell viability upon treatment with the rSAG2A protein was verified by the
JPCJ. Contributed reagents/material/analysis tools: CPP, JLS, EMA, TM. Wrote
the paper: JALS, JLS, CPP.
31
REFERENCES
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aSpot ID corresponding to the position in the 2D gel according to Figure 2A and B. bProtein accession number conforming NCBI database (http://www.ncbi.org) cTheorical and experimental masses of identified proteins (kDa). dTheorical and experimental pIs of identified proteins. eMascot score of the homology annotated in NCBI non-redundant (NCBInr). fExpression levels, presented as the % normalised volume, in the macrophages control (C) and macrophages with rSAG2A (T). Vertical bars corresponding to mean ± SE. gFold change (macrophages incubed-rSAG2A normalised volume/macrophages control normalised volume): bold: increased protein abundance; italic: decreased abundance; ∞: present in one treatment.
41
Table 3. Identification of proteins from C57BL/6 mice after treatment with rSAG2A
99 Synaptic vesicle membrane protein vat-1 homolog
gi|33859662 43/50 5.95/8.0 85 ∞
105 Elongation factor 1-alpha 1
gi|148694454 38/54 9.13/4.82 236 ∞
110 Cytosolic non-specific dipeptidase
gi|12697592 53/56 5.43/5.5 164 ∞
118 Pyruvate kinase pkm isoform x1
gi|31981562 58/59 7.18/8.19 439 ∞
119 Pyruvate kinase pkm isoform x1
gi|31981562 58/59 7.18/8.0 173 ∞
43
145 Heat shock protein hsp 90-beta
gi|40556608 83/92 4.97/5.16 233 ∞
153 Annexin a3
gi|2437840 36/33 5.33/8.18 73 ∞
154 Annexin a2
gi|6996913 38/45 7.55/6.14 335 ∞
aSpot ID corresponding to the position in the 2D gel according to Figure 3A and B. bProtein accession number conforming NCBI database (http://www.ncbi.org) cTheorical and experimental masses of identified proteins (kDa). dTheorical and experimental pIs of identified proteins. eMascot score of the homology annotated in NCBI non-redundant (NCBInr). fExpression levels, presented as the % normalised volume, in the macrophages control (C) and macrophages with rSAG2A (T). Vertical bars corresponding to mean ± SE. gFold change (macrophages incubed-rSAG2A normalised volume/macrophages control normalised volume): bold: increased protein abundance; italic: decreased abundance; ∞: present in one treatment.
44
FIGURES
Figure 1: Bacterial expression of the recombinant SAG2A protein and MTT
assay. (A) SDS-PAGE (12.5%) analysis of bacterial expression and purification
of the protein representing the (1) total extract of pET28A vector, (2) total
extract of SAG2A, (3) soluble fraction of pET28A vector, (4) soluble fraction of
SAG2A, (5) insoluble fraction of pET28A vector, (6) insoluble fraction of
SAG2A, and purified SAG2A. (B) Cell viability of mice’s peritoneal macrophages
interacting with different concentrations of SAG2A using the MTT assay.
45
Figure 2: Analysis of 2-DE of BALB/c mice’s peritoneal macrophages
under controlled conditions (A) and treated with rSAG2A (B) and C57BL/6
under controlled conditions (C) and treated with rSAG2A (D). Spots
indicated with arrows were the differentially expressed ones, while the marked
in red are the ones exclusive of each lineage.
46
Figure 3: Functional classification of proteins of mice’s peritoneal cells
with different accumulation in response to rSAG2A. In A, functional
classification of proteins that presented significant different levels in BALB/c. In
B, proteins that presented significant differences concerning abundance in
C57BL/6.
47
Figure 4: Protein-protein interaction network of differently expressed
genes in BALB/c and C57BL/6 mice. Network overview with protein
representations in more connected clusters. Two clusters correspond to
proteins involved in ribosome biogenesis; one cluster corresponds to the
biological process regulation; one is associated with receptors coupled to G
proteins; one includes proteins in mRNA processing; one cluster with cellular
signaling proteins; one cluster involving proton transport proteins; one cluster
corresponds to cell contraction proteins and one cluster includes proteins that
regulate the immunological process .
48
Figure 5. Analysis of accumulation of specific genes M1 and M2
transcripts in peritoneal macrophages treated with rSAG2A. The
accumulation of cytokines transcripts were evaluated in the presence of the
protein for 6 h by real time-qPCR and used the 18S endogenous as a reaction
normalizer. We determined the relati e quantification of genes by comparing
RNA samples of treated macrophages with control samples. Data with mean ±
standard error of independent experiments (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001,
treated cells vs controls or between treatments, n=4).
49
SUPPLEMENTAL FIGURE
S1 Fig. Venn diagram for proteins identified in peritoneal macrophages
from BALB/c and C57BL/6 mice in mass spectrometry. In A: Proteins
identified in the control cells of BALB/c (190), cells treated with rSAG2A (54)
and common (70). In B: Proteins identified in C57BL/6 controll (126), cells
treated with rSAG2A (3) and common (49).
50
JAMILLY AZEVEDO LEAL SENA
CAPÍTULO 2
Clonagem e expressão heteróloga de antígenos visando à indução de
imunidade contra Toxoplasma gondii.
51
RESUMO
A toxoplasmose é uma doença sistêmica infecciosa causada por um
protozoário intracelular, Toxoplasma gondii, que invade vários tecidos do
organismo humano e de várias espécies animais. Os gatos albergam o
protozoário no trato intestinal. Os roedores, suínos, bovinos, ovinos, caprinos e
outros mamíferos são hospedeiros intermediários do T. gondii. A toxoplasmose
é um importante problema para as criações de animais, causando prejuízos
agroeconômicos, como abortos e infertilidade. O desenvolvimento de sintomas
depende da condição imunológica do infectado e o tratamento não garante a
completa eliminação do parasito. Sendo assim, em parceria com
pesquisadores da Universidade Federal de Uberlândia, sequências referentes
aos antígenos de T. gondii foram obtidos e plantas transgênicas foram
utilizadas para a expressão de antígenos, visando à produção de vacina oral
futuramente. Com essa proposta, objetivou-se clonar e produzir antígenos
plantas transgênicas. Para tanto, os antígenos Sag2a e Sag2b do parasito
foram isolados e clonados nos vetores para expressão pBI426 (transformação
via biobalística) e pCAMBIA1390 (Agrobacterium tumefaciens). Então,
epicótilos e cotilédones de plantas de Lactuca sativa L. (alface) foram usados
como explantes para transformação genética via A. tumefaciens, seguindo
protocolos já estabelecidos. Na continuidade destas pesquisas, a confirmação
da inserção dos antígenos nas plantas será confirmada via PCR para
posteriores ensaios de imunização de cobaias com o material vegetal
transgênico. A produção de anticorpos no soro dos animais imunizados será
avaliada por ELISA. A proliferação de esplenócitos e a produção de citocinas
serão analisadas. A execução destas análises permitirá estabelecer condições
para a produção de vacina contra o T. gondii em plantas transgênicas e a
introdução em rações para promover proteção contra a toxoplasmose.
Palavras-chave: toxoplasmose, antígenos de T. gondii, SAG2, vacina oral.
52
ABSTRACT
Toxoplasmosis is a systemic infectious disease caused by an intracellular
protozoan Toxoplasma gondii invades various tissues of the human body and
various animal species. Cats harboring the parasite in the gastrointestinal tract.
Rodents, pigs, cattle, sheep, goats and other mammals are intermediate hosts
of T. gondii. Toxoplasmosis is an important problematic for the creations of
animals, causing damage agroeconomic as abortions and infertility. The
development of symptoms depends on the immune status of the infected and
the treatment does not completely eliminate the parasite. Thus, in partnership
with researchers from the Federal University of Uberlândia, sequences related
to T. gondii antigens were obtained and transgenic plants were used for the
expression of antigens, aiming at the production of oral vaccine in the future.
With this proposal aimed to cloning and producing antigens in transgenic plants.
To this, Sag2a and parasite Sag2b antigens were isolated and cloned in vectors
for expression pBI426 (biolistic transformation) and pCAMBIA1390
(Agrobacterium tumefaciens). Then, hypocotyl and cotyledon plants Lactuca
sativa (lettuce) were used as explants for genetic transformation by A.
tumefaciens, following established protocols. The continuity of research,
confirming the insertion of antigens in plants will be confirmed via PCR for
further mice immunization trials with transgenic plant material. The production of
antibodies in the serum of immunized animals will be evaluated by ELISA. The
splenocyte proliferation and cytokine production will be analyzed. Performing
these analyzes allowed to establish conditions for the production of vaccine
against T. gondii in transgenic plants and the introduction of feed to provide
protection against toxoplasmosis.
Keywords: toxoplasmosis, T. gondii antigens, SAG2, oral vaccine.
53
1. INTRODUÇÃO
Os parasitos intracelulares obrigatórios como Toxoplasma gondii são
causadores de infecções graves que afetam milhões de indivíduos a cada ano
(RODRIGUES et al., 2003). T. gondii é o agente causador da toxoplasmose,
uma doença considerada cosmopolita que atinge entre 10 a 80% da população
mundial (COSTA, 2008). Tendo em vista a problemática causada pela
toxoplasmose e apesar do padrão de transmissão e da mortalidade causada
por este parasito, uma vacina contra a infecção ainda não está disponível.
Nesse sentido, estratégias de controle e combate a esta doença são de grande
necessidade.
As plantas como alface, tomate, batata e cenoura são consideradas
atraentes para a produção de vacinas e têm sido consideradas excelentes
biorreatores para a produção de proteínas de interesse humano, por meio de
transgenia (ZHANG et al., 2010). Trata-se de um sistema de baixo custo que
pode resultar na produção de grande massa de material de interesse em
pequenas áreas de cultivos (MA et al., 2005). Além disso, esse sistema
envolve uma maquinaria de modificação e processamento de proteínas que é
conservada em diferentes espécies eucarióticas, podendo produzir proteínas
funcionais a partir de genes de diferentes origens (DANIELL et al., 2001).
Alface (Lactuca sativa L.) é uma planta comestível da família
Asteraceae, cultivada mundialmente, de ciclo curto, podendo ser colhida com
grande rendimento e qualidade em poucos meses após o plantio (CURTIS,
2006; KANAMOTO et al., 2006). Além disso, é adequada para produção de
vacina oral, pois seus explantes (tecidos) são altamente responsivos a
diversos meios na cultura de tecidos, e pode ser cultivada em ambientes
54
fechados padronizados, sob condições rigorosamente controladas (CURTIS,
2006; MATSUI et al., 2011).
Portanto, considerando o potencial das plantas como biorreatoras, a
escolha de espécies vegetais como ponto de partida para o desenvolvimento
de uma metodologia que venha a dar suporte para um futuro
desenvolvimento de vacina contra toxoplasmose, em planta transgênica,
pode assegurar o estabelecimento de novas estratégias de controle da
doença.
Este trabalho visou a clonagem e expressão de antígenos de
Toxoplasma gondii em plantas, candidatos à imunização oral. Os cassetes de
expressão foram inseridos em plantas de alface e a transformação genética
possibilitou a obtenção de brotos confirmados por PCR. As plantas de alface
transgênicas futuramente serão avaliadas quanto ao nível de expressão dos
genes inseridos por qPCR e servirão como material para ensaios em cobaias
em forma de ração (vacina comestível), a fim de verificar a indução de
imunização dos antígenos citados.
55
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Clonagens de antígenos em vetores de expressão em plantas
As sequências dos antígenos foram obtidas a partir do banco de
dados de Toxoplasma gondii (NCBI) e isoladas via PCR (Polymerase Chain
Reaction). Oligonucleotídeos específicos (primers) das sequências referentes
aos antígenos Sag2a e Sag2b foram confeccionados (Tabela 1) e as
temperaturas de anelamento dos primers determinadas utilizando o DNA
genômico de T. gondii (cepa RH) como molde. As sequências amplificadas
foram inseridas no vetor intermediário pGEM-T Easy Vector (Promega, EUA)
para facilitar posteriores clonagens nos vetores de expressão.
As clonagens dos antígenos em vetores de expressão pBI426 e
pCAMBIA1390 foram realizadas de acordo com as técnicas estabelecidas por
Sambrook et al (1989) (Figura 1). Para a inserção de Sag2a e Sag2b no vetor
pBI426, foi realizada a amplificação destas sequências via PCR. Os produtos
da amplificação foram purificados com o Kit Illustra GFX PCR DNA and Gel
Band Purification (GE Healthcare) e inseridos nos sítios de clivagem XbaI e
BamHI do vetor, resultando nos clones pBI426:Sag2a e pBI426:Sag2b (estes
poderão ser utilizados futuramente para transformação de plantas via
bombardeamento).
Tabela 1: Sequências de oligonucleotídeos utilizados nas clonagens
Em seguida, os cassetes de expressão gerados foram retirados
juntamente com a região promotora duplicada CAMV35S do vetor pBI426 e
inseridos nos sítios de clivagem HindIII e BamHI do vetor pCAMBIA1390,
originando os clones 35S:Sag2a e 35S:Sag2b, para a realização da
transformação de plantas via Agrobacterium tumefaciens. Então,
transformações de E. coli (estirpe TOP10) e A. tumefaciens (LBA4404) foram
realizadas, seguidas da confirmação via PCR, para as etapas de
transformação genética de plantas.
Figura 1 – Esquema ilustrativo dos vetores pBI426 e pCAMBIA1390, utilizados para a inserção dos antígenos Sag2a e Sag2b de T. gondii.
57
2.2. Preparo e transformação de células competentes de Agrobacterium
tumefaciens (LBA4404)
Para o preparo das células eletrocompetentes LBA4404, uma colônia foi
inoculada em meio YEP com rifampicina 50 mg.L-1 e incubada por 48 horas à
28°C. Uma colônia isolada obtida foi inoculada em meio YEP com rifampicina e
incubada a 28°C, 220 rpm durante 48 horas. A colônia foi transferida para
250mL de meio YEP com rifampicina e a cultura foi mantida a 28°C, 220 rpm
até que atingisse absorbância a 600 ηm (A600ηm) entre 0,5 e 1,0. A cultura foi
então centrifugada a 5000 x g, durante 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi
descartado e o pellet bacteriano ressuspenso em H2O pura autoclavada, sendo
centrifugado e lavado por 3 vezes e o pellet foi então ressuspenso em 2 mL de
glicerol 10% estéril e gelado, sendo em seguida dividido em alíquotas de 20 μL
em microtubos, congelados em N2 líquido e armazenados a -80°C.
A transformação das células foi realizada por eletroporação e para isso,
alíquotas 20 μL de células competentes foram transferidas para cubeta de
eletroporação (Gene Pulser 0,2 cm) contendo DNA plasmidial de 35S:Sag2a e
35S:Sag2b previamente extraído. Um pulso elétrico de aproximadamente 2,5
kV foi realizado nas células em aparelho BioRad® (modelo MicroPulserTM).
Então, as colônias obtidas após a seleção em meio de cultura foram
submetidas à confirmação por PCR.
2.3. Transformação genética de Lactuca sativa L. (alface)
Sementes de Lactuca sativa L. foram desinfestadas em solução de
hipoclorito 0,5% por 15 minutos e em seguida, lavadas três vezes em água
destilada estéril. As sementes foram mantidas em meio contendo sais de MS
(Murashige & Skoog, 1962) na sala de crescimento do laboratório, sob
fotoperíodo 16 horas e temperatura de 27±2 °C. Após duas semanas, os
cotilédones foram usados como fonte de explantes para a transformação
genética, seguindo protocolo de Lovato et al. (1998).
Para tanto, os cotilédones foram excisados do nó cotiledonar das
plântulas e foram incubados, juntamente com fragmentos de epicótilos, por 15
minutos em solução de Agrobacterium LBA4404 contendo os insertos
35S:Sag2a e 35S:Sag2b, previamente crescida a 28°C sob agitação, contendo
antibiótico rifampicina (50 mg.L-1). Em seguida, os explantes foram mantidos
58
em meio de co-cultivo em placa de Petri acrescido dos reguladores de
crescimento ácido naftaleno acético (ANA) a 0,1 mg.L-1 e 6-benzilaminopurina
(BAP) a 0,5 mg.L-1 durante 5 dias no escuro. Após este período, os explantes
foram transferidos para novo meio de cultura contendo higromicina (10 mg.mL-
1) e cefotaxima (300 mg.mL-1) como antibióticos de seleção, além dos
reguladores citados, e mantidos sob fotoperíodo em sala de crescimento num
período de 15 a 25 dias, renovando o meio de cultura aos 15 dias.
Os brotos formados foram individualizados em meio de cultura MS
acrescido de reguladores de crescimento citados e mantidos nas mesmas
condições já citadas.
59
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Clonagem de antígenos para transformação genética de plantas
Os antígenos foram amplificados com primers específicos, sintetizados
para uso nas clonagens em vetores de expressão em plantas. O vetor pBI426
(DATLA et al., 1991) possui região promotora duplicada, sendo um vetor com
enhancer na expressão de genes, comumente usado para transformação
genética via biobalística, enquanto o pCAMBIA1390 é utilizado para
transformação de plantas via A. tumefaciens. A transformação genética de
plantas utilizando ferramentas como a transferência indireta de genes via
Agrobacterium ou direta através da biobalística é aplicada a mais de 120
espécies de plantas (AZEVEDO et al., 2013).
As sequências dos antígenos Sag2a e Sag2b tiveram suas
temperaturas de anelamento determnadas em 53°C via PCR, tendo como
molde o DNA genômico de T. gondii. O produto da amplificação dos
fragmentos gerados pode ser visualizado na Figura 2, confirmando os
tamanhos dos insertos.
60
Figura 2 – Amplificação das sequências referentes aos antígenos de T. gondii em temperaturas otimizadas. M1: 1 Kb Ladder (Fermentas); Amplificações a temperatura de 53ºC. Controle negativo: reação sem adição de DNA.
Os produtos obtidos após amplificação dos fragmentos dos antígenos
por PCR foram purificados e utilizados para a inserção no vetor intermediário
pGEM-T Easy, sendo em seguida propagados em E. coli (TOP 10), conforme
mostra a Figura 3, contendo amplificações das colônias resultantes. Clones
positivos foram utilizados para etapas seguintes de clonagens em vetores para
transformação genética de plantas.
Figura 3 – Clonagem de Sag2a (A) e Sagb (B) em pGEM-T Easy, propagado em E. coli (TOP10): Amplificação de DNA utilizando primers específicos para a região específica de cada antígeno. M: 1Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: reação sem adição de DNA. Em A, 1 a 8: colônias submetidas ao PCR diagnóstico; em B, 1 a 4: colônias submetidas ao PCR diagnóstico.
61
Após obtenção das sequências de antígenos no vetor pGEM-T Easy,
os fragmentos liberados por reação de digestão de Sag2a e Sag2b foram
purificados e inseridos no vetor pBI426 para expressão, que poderão ser
utilizadas futuramente em transformações de plantas via bombardeamento. As
colônias obtidas após transformação de E. coli foram diagnosticadas por PCR e
a confirmação das amplificações das colônias 1 referente ao Sag2a e 5
referente ao Sag2b podem ser visualizadas em gel de agarose 1% (Figura 4).
A fim de obter clones dos antígenos para transformação genética das
plantas via A. tumefaciens, Sag2a e Sag2b foram isolados do vetor pBI426 e
inseridos no vetor pCAMBIA1390, nomeados 35S:Sag2a e 35S:Sag2b, para
posteriores etapas de transformação das plantas. Estes clones foram inseridos
em células eletrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens via eletroporação
e as colônias foram submetidas a PCR para diagnóstico, utilizando primers
específicos para cada sequência, conforme Figura 5.
Figura 4 – Clonagem das sequências de antígenos Sag2a (A) e Sag2b (B) em pBI426, propagados em E. coli (TOP10): Amplificação de DNA utilizando primers específicos para a região específica do antígeno, após clivagem deste do vetor pGEM-T Easy. M: 1Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: reação sem adição de DNA; 1: colônia submetida a PCR diagnóstico.
62
Figura 5 – Clonagem dos insertos 35S:Sag2a e 35S:Sag2b no pCAMBIA1390 e propagados em Agrobacterium tumefaciens (LBA4404): colônias submetidas a amplificação de DNA utilizando primers específicos para a região do antígeno Sag2a. M: 1Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: reação sem adição de DNA; 1 a 6: colônias usadas para a reação.
3.2. Obtenção de plantas transformadas de Lactuca sativa L. (alface)
Para obter plantas de alface contendo antígenos Sa2a e Sag2b de T.
gondii, transformações genéticas via A. tumefaciens foram realizadas. Após 25
dias de contato com meio de cultura seletivo acrescido de antibióticos e
reguladores de crescimento adequados, os explantes (cotilédones e epicótilos)
emitiram brotos possivelmente transformados (Figura 6). Estes foram
individualizados em meios de cultura para futura extração de DNA genômico e
confirmação da transformação por meio da PCR com primers referentes aos
antígenos de T. gondii.
As plantas são importantes fontes de propriedades medicinais e
nutricionais para o homem e tornou-se uma útil estratégia de produção de
proteínas recombinantes, devido às características desejáveis como alta
capacidade de produção, estabelecida transferência de genes e custos
reduzidos (MA et al., 2005). Atualmente, uma variedade de plantas é utilizada
para a produção comercial de proteínas, seja para produzir anticorpos,
citocinas, fatores de crescimento, hormônios e vacinas, tornando esse sistema
de expressão capaz de produzir moléculas heterólogas de maneira bem-
sucedida (TWYMAN et al., 2005).
As proteínas SAG2A e SAG2B pertencem a superfamília SAG,
expressas especificamente em taquizoítos, responsáveis pela invasão do
parasito nas células hospedeiras (LEKUTIS et al., 2000).
63
Então, as plantas transgênicas produzidas neste trabalho poderão ser
utilizadas em ensaios de imunização em cobaias e a produção de anticorpos
no soro dos animais imunizados avaliada por ELISA. A produção de citocinas
também poderá ser analisada por meio de dosagens por ELISA e qPCR em
tempo real. Isto permitirá estabelecer condições para a produção de vacina
contra o T. gondii em plantas transgênicas e a introdução em rações para
promover proteção contra a toxoplasmose.
Figura 6 – Brotos de alface obtidos em meio de cultura seletivo: cotilédones e epicótilos de alface foram submetidos à infecção por A. tumefaciens e após 25 dias em meio de cultura seletivo, os brotos possivelmente transformados com as sequências referentes aos antígenos Sag2a (A) e Sag2b (B) foram emitidos.
64
4. CONCLUSÕES
- A proteína SAG2A induziu preferencialmente um fenótipo de macrófago
ativado classicamente em linhagens de camundongos na fase aguda da
infecção por T. gondii.
- SAG2A induziu uma forte resposta inflamatória em camundongos,
exacerbando a expressão de IL-1β, associada a danos teciduais em
hospedeiros.
- As plantas de Lactuca sativa L. foram produzidas contendo as sequências
referentes aos antígenos Sag2a e Sag2b de Toxoplasma gondii.
- Como perspectiva, as plantas produzidas servirão para avaliar o efeito
imunológico destes antígenos em hospedeiros susceptíveis ao T. gondii, por
meio da introdução do material vegetal em forma de rações.
65
5. REFERÊNCIAS
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Neste trabalho, os antígenos recombinantes de T. gondii também foram
produzidos em bactérias para futura introdução em rações, juntamente com as
plantas transgênicas. Para tanto, SAG1, SAG2A, SAG2B, SAG5C (taquizoítos)
e BSR4 (bradizoítos) foram clonados em vetores da série pET e alguns já
purificados.
O uso de bactérias como a E. coli para a expressão de proteínas é
bastante difundido devido ao conhecimento de seu genoma e ao fácil cultivo e
manipulação, sendo também uma estratégia economicamente viável (BANEYX,
1999). Importantes aplicações desta tecnologia englobam sua utilização em
imunização, estudos bioquímicos, análise tridimensional da proteína, uso
biotecnológico e terapêutico e atualmente, o uso de proteínas recombinantes é
rotina tanto na pesquina quanto na indústria farmacêutica (PAVLOU &
REICHERT, 2004). Além disso, os vetores da série pET são amplamente
utilizados na expressão heteróloga, pois a produção da proteína fusionada a
uma etiqueta de poli-histidina possibilita a purificação da proteína em um passo
único por cromatografia de afinidade (MAKRIDES, 1996; BANEYX, 1999).
As proteínas SAG2A e SAG2B pertencem a superfamília SAG,
expressas especificamente em taquizoítos, responsáveis pela invasão do
parasito nas células hospedeiras (LEKUTIS et al., 2000). Além disso, SAG2A
tem sido indicada como ferramenta de diagnóstico para caracterizar a fase
aguda da infecção por T. gondii (BÉLA et al., 2008) e foi proposto por Priest et
al. (2015) que ensaios com a SAG2A recombinante podem fornecer uma uma
ferramenta conveniente em estudos epidemiológicos da prevalência mundial da
infecção por T. gondii, permitindo assim uma melhor estimativa dos riscos
causados pela infecção em gestantes.
A proteína SAG5C apresenta estrutura semelhante às proteínas da
família SAG1 (p30), que pertence a um grupo comum de antígenos
compartilhados pelas fases de taquizoítos e bradizoítos, sendo encontrados em
diferentes regiões do parasito, principalmente na superfície celular e está
relacionado com a indução de uma resposta imunoprotetora (SPANO, et al.,
2002; BOOTHROYD et al., 1998). Essas características apresentadas pelas
proteínas de superfície têm implicações importantes para a epidemiologia da
72
toxoplasmose humana e veterinária e podem ser importantes no entendimento
da evolução da virulência de T. gondii (ELSHEIKHA et al., 2008).
Os estudos relacionados com proteína BSR4 são importantes para
entender como os bradizoítos (forma altamente infecciosa do T. gondii) estão
envolvidos na regulação da imunidade do hospedeiro, no estabelecimento da
fase crônica e na transmissibilidade do parasito às células naïve do hospedeiro
(LEKUTIS et al., 2001).
Clonagem e expressão de proteínas em bactérias
A amplificação das sequências dos antígenos de Toxoplasma gondii
Sag1 e Sag5c via PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizada utilizando
oligonucleotídeos anteriormente desenhados, a inserção dos fragmentos foi
feita nos sítios de clivagem de NdeI e XhoI do vetor pET28a, utilizando a
proporção de 3:1 (inserto:vetor). O sistema de ligação foi propagado em células
competentes de E. coli (estirpes TOP10 e Rosetta DE3) por choque térmico e o
DNA plasmidial extraído foi estocado a -20°C.
Os clones selecionados foram cultivados em meio de cultura LB
contendo os antibióticos kanamicina (50 mg.L-1) e cloranfenicol (34 mg.L-1) por
16 horas à 37°C, sob agitação (200 rpm). Em seguida, as culturas foram
concentradas e o pellet usado como inóculo para o meio Circlegrow 4%, com
kanamicina e cloranfenicol, sendo mantido a 200 rpm a 37°C, até atingir
absorbância a 600 ηm (A600ηm) entre 0,7 e 1,0. Em seguida, foi adicionado
isopropil-tio-β-galactosídeo (IPTG 0,4 mM de concentração final) para indução
da expressão das proteínas de Toxoplasma gondii. As culturas foram mantidas
a 37°C, 200 rpm por quatro horas (para SAG1) e a 18°C por 16 horas (para
SAG5C). A expressão das proteínas SAG2A, SAG2B e BSR4, previamente
clonadas, também foi induzida em bactérias a 37ºC para posteriores ensaios.
Após a obtenção das frações dos extratos bacterianos, a purificação
proteica foi realizada por cromatografia de afinidade em coluna de His-trap FF
crude (GE HealthCare), de acordo com as recomendações do fabricante. Os
extratos bacterianos bem como as frações purificadas das proteínas foram
visualizadas em SDS-PAGE 12,5% e corados com azul de Coomassie (G-250).
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RESULTADOS ALCANÇADOS
Expressão e purificação de proteínas em bactéria
A expressão das proteínas SAG2A, SAG2B e BSR4 por sistema
heterológo ocorreu em células de E. coli Rosetta (DE3) e a purificação por meio
de cromatografia em coluna contendo níquel, HisTrap FF crude. Os extratos
celulares foram analisados através de SDS-PAGE a 12,5% confirmando a
expressão das proteínas. A Figura 1 apresenta as proteínas diferencialmente
expressas nas frações solúvel e insolúvel do extrato bacteriano, bem como as
frações purificadas destas proteínas. A presença das bandas induzidas e
purificadas mostra o tamanho esperado para cada proteína, sendo 22 kDa para
SAG2A, 19 kDa para SAG2B e aproximadamente 45 kDa para BSR4,
correspondendo às massas teóricas de cada proteína. Isto revelou sucesso na
técnica de expressão adotada.
Figura 1 – Expressão das proteínas SAG2A (A), SAG2B (B) e BSR4 (C) clonadas em vetor pET28a: Vinte microlitros de extrato total (ET), frações solúvel (FS) e insolúvel (FI), além das frações purificadas a partir da fração solúvel, de cada amostra, foram aplicados em SDS-PAGE 12,5%. M= Unstained Protein Marker (kDa) (Fermentas).
Semelhante a este trabalho, Chen et al. (2012) usaram a proteína
recombinante BSR4 induzida e expressa em células de E. coli (BL21) e a
fração purificada foi avaliada quanto às suas características imunológicas. A
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BSR4 recombinante apresentou imunoreatividade e imunogenicidade
específicas da fase crônica em pacientes infectados com T. gondii.
As Figuras 2 e 3 mostram o diagnóstico, por PCR com primers
específicos, da inserção dos fragmentos da ORF de SAG5C (Figura 2) e SAG1
(Figura 3), ambos contendo 1000 pb no vetor pET28a, sendo após propagados
em células competentes de E. coli, estirpe TOP10, e posteriormente,
transferida para Rosetta (DE3) seguindo a etapa de indução e expressão das
proteínas.
Figura 2 – PCR diagnóstico das colônias obtidas após tratamento de pET28a:SAG5C em células de E. coli. Em A: estirpe TOP10 e em B: estirpe Rosetta (DE3). M: 1 Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: Reação sem adição de DNA; 1 a 3 (A) e 1 a 7 (B): colônias selecionadas.
Figura 3 – PCR diagnóstico das colônias obtidas após transformação de pET28a:SAG1 em células de E. coli (Rosetta DE3). M: 1 Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: Reação sem adição de DNA; 1 a 9: colônias selecionadas.
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Após a etapa de clonagem no vetor pET28a, as colônias obtidas foram
submetidas à indução da expressão de SAG5C e SAG1 (Figura 4). Géis de
poliacrilamida contendo frações solúvel e insolúvel, bem como o extrato total da
indução, com tamanho esperado para cada proteína, sendo 40 e 35 kDa,
respectivamente, mostram que a expressão das proteínas foi bem sucedida
ocorrendo na fração insolúvel do extrato bacteriano.
Figura 4 – Expressão das proteínas SAG5C (A) e SAG1 (B) clonadas em vetor pET28a: Vinte microlitros de extrato total (ET), frações solúvel (FS) e insolúvel (FI) foram aplicados em SDS-PAGE 12,5%. M= marcador PWM GE (kDa); ET de pET28a vazio e colônias positivas; FS de pET28a vazio e colônias positivas; FI de pET28a vazio e colônias positivas. Seta indica tamanho da proteína expressa na fração insolúvel do extrato bacteriano.
Clonagem de antígenos para transformação genética de plantas
Além de Sag2a e Sag2b, as sequências dos antígenos Sag5c, Sag1 e
Bsr4 também tiveram suas temperaturas de anelamento estabelecidas, sendo
53°C para Sag5c, Sag1 e de 55°C para Bsr4. O produto da amplificação dos
fragmentos gerados pode ser visualizado na Figura 5, confirmando os
tamanhos dos insertos.
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Figura 5 – Amplificação das sequências referentes aos antígenos de T. gondii em temperaturas otimizadas. M1: 1 Kb Ladder (Fermentas); Amplificações a temperatura de 53ºC. Controle negativo: reação sem acréscimo de DNA.
Figura 6 – Clonagem dos antígenos Sag1 (A), Sag2a (B), Sagb (C) e Sag5c (D) em pGEM-T Easy, propagado em E. coli (TOP10): Amplificação de DNA utilizando primers específicos para a região específica de cada antígeno. M: 1Kb Ladder (Fermentas); C+: DNA genômico de T. gondii; C-: reação sem adição de DNA; e colônias submetidas ao PCR diagnóstico.
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A conclusão da clonagem, posteriormente, desses antígenos nos
vetores de expressão em plantas, como o pCAMBIA1390, permitirão produzir
plantas transgênicas, para avaliar a indução de imunidade dos antígenos em
cobaias, em forma de rações (vacinas comestíveis).
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Tabela 1: Sequências de oligonucleotídeos utilizados nas clonagens para expressão em plantas
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