UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-PPGCB GRADIENTE SUCESSIONAL, SAZONALIDADE, E FATORES EDÁFICOS NA COMPOSIÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DE RIZOBACTÉRIAS DO SOLO EM UMA FLORESTA ESTACIONAL DECIDUAL Cláudia Maria da Silva Montes Claros - MG Agosto/2013
62
Embed
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS Programa de Pós-Graduação em ... · Montes Claros - Minas Gerais . AGRADECIMENTOS À Deus por estar sempre no controle da minha vida e tornar
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-PPGCB
GRADIENTE SUCESSIONAL, SAZONALIDADE, E FATORES EDÁFICOS NA COMPOSIÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DE
RIZOBACTÉRIAS DO SOLO EM UMA FLORESTA ESTACIONAL DECIDUAL
Cláudia Maria da Silva
Montes Claros - MG Agosto/2013
Cláudia Maria da Silva
GRADIENTE SUCESSIONAL, SAZONALIDADE, E FATORES EDÁFICOS NA COMPOSIÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E BIOQUÍMICA DE
RIZOBACTÉRIAS DO SOLO EM UMA FLORESTA ESTACIONAL DECIDUAL
Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério
Montes Claros - MG Agosto/2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Montes Claros como requisito necessário para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.
S586g
Silva, Cláudia Maria da. Gradiente sucessional, sazonalidade, e fatores edáficos na composição e caracterização morfológica e bioquímica de rizobactérias do solo em uma floresta estacional decidual [manuscrito] / Cláudia Maria da Silva. – 2013. 58 f. : il. Bibliografia: 44-53. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Montes Claros - Unimontes, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas/PPGCB, 2013. Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério. 1. Floresta tropical seca. 2. Rizobactéria. 3. Sazonalidade. 4. Gradiente sucessional. 5. Promoção de crescimento vegetal. I. Valério, Henrique Maia. II. Universidade Estadual de Montes Claros. III. Título.
Catalogação Biblioteca Central Professor Antônio Jorge
Cláudia Maria da Silva Gradiente sucessional, sazonalidade, e fatores edáficos na composição e caracterização morfológica e bioquímica de rizobactérias do solo em uma floresta estacional decidual
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Ciências
Biológicas da Universidade Estadual de Montes Claros, como requisito necessário para
obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas, avaliada e aprovada pela banca
Prof. Dr. Luc Felicianus Marie Rouws- Embrapa Agrobiologia
Data de aprovação: ___/___/2013
Montes Claros - Minas Gerais
AGRADECIMENTOS
À Deus por estar sempre no controle da minha vida e tornar tudo possível.
À toda a minha família, em especial aos meus queridos pais, meus melhores
amigos, por me proporcionarem um grande tesouro: o estudo. À minha irmã, Djenane,
meus irmãos Daniel e Marcelo, e a minha avó Alzira, por terem me incentivado e por
estarem sempre torcendo por minha vitória. E aos meus sobrinhos por me
proporcionarem tanta alegria.
Ao meu amor, Cleiton, por sua dedicação, paciência e por ter me acompanhado e
me ajudado durante a coleta e em muitos outros momentos da realização deste trabalho.
A todos os estagiários do Laboratório de Microbiologia Ambiental, em especial
a Fran e Jéssica pela amizade, disposição e ajuda durante o experimento, e à Luiz pelo
apoio sempre que precisamos.
Aos colegas de Mestrado em especial a Polly, Fá, Comis, Betys, Mi, Nanda,
Carols, Alex, Paulinho e Ani por ter compartilhado vários momentos e por me
privilegiar com suas amizades. À Fá e Comis, agradeço, também, pelo auxílio nas
análises estatísticas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas e a todos os professores
que contribuíram para minha formação profissional.
À CAPES pela concessão de bolsa, ao projeto SISBIOTA pelo apoio financeiro
e ao IEF pelo apoio nas coletas.
Ao pessoal da Embrapa Agrobiologia, em especial ao Prof. Dr. Luc Felicianus
Marie Rouws, pelo apoio.
Ao meu orientador Prof. Dr. Henrique Maia Valério por ter me recebido em seu
laboratório, pelo apoio e orientação.
À equipe do laboratório de Métodos Analíticos (em especial à Prof. Dr. Elytânia,
Cleide e Leide) por ter permitido a utilização dos equipamentos.
Ao pessoal do laboratório de Fitopatologia (Departamento de Ciências Agrárias)
da Unimontes-Campus Janaúba, em especial a Leandro (Pardal), Leandro, Acleide,
Gleika, pelo apoio e a Prof. Dr. Regina e Prof. Dr. Adelica por permitirem que eu
acompanhasse a rotina do laboratório.
Aos membros da banca por aceitaram o convite.
E a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para este trabalho tornar-se
realidade, o meu MUITO OBRIGADA!
“Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte não temerei mal nenhum, porque Tu estás comigo (...).”
(Salmo 23.4)
SILVA, Cláudia Maria, Mcs., Universidade Estadual de Montes Claros, Agosto de 2013, Gradiente sucessional, sazonalidade, e fatores edáficos na composição e caracterização morfológica e bioquímica de rizobactérias do solo em uma floresta estacional decidual. Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério.
RESUMO
As Florestas Tropicais Secas são biomas dominados por espécies vegetais
decíduas, com ampla distribuição no continente Sul Americano. Nelas, a variação
sazonal, os estágios sucessionais, além dos fatores físico-químicos do solo influenciam
fortemente sua estrutura e função e, com isso, a diversidade microbiana do solo pode ser
alterada. Neste contexto, as Rizobactérias Promotoras de Crescimento em Plantas são
interessantes alvos de estudo. O objetivo deste trabalho foi testar as seguintes hipóteses:
riqueza, abundância e atividade bioquímica bacteriana são influenciadas pela estação; e
riqueza, abundância e atividade bioquímica bacteriana são influenciadas pelos estágios
sucessionais de regeneração. Para verificar esses efeitos, bactérias isoladas do solo
foram caracterizadas morfologicamente e bioquimicamente. A produção de ácido indol-
3-acético, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio foram avaliadas.
As variáveis riqueza e abundância responderam à primeira hipótese testada, visto que
foram maiores no período chuvoso. A riqueza e abundância não variaram ao longo do
gradiente sucessional. A variável ácido indol-3-acético, a solubilização de fosfato e
Fixação Biológica de Nitrogênio não corresponderam às hipóteses testadas. A
morfologia, coloração de Gram e o teste de catalase mostraram que os isolados possuem
características morfológicas e fenotípicas muito próximas. Esses devem ser submetidos
a técnicas moleculares para serem identificados filogenéticamente. As características da
cobertura vegetal, através dos dados de fitossociologia, não influenciaram a distribuição
das morfoespécies, porém os fatores edáficos foram importantes.
SILVA, Cláudia Maria, Mcs., Universidade Estadual de Montes Claros, Agosto de 2013, Successional gradient, seasonality, and edaphics factors in the composition and morphological and biochemical characterization of rhizobacteria of soil in a Tropical Dry Forest. Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia Valério.
ABSTRACT
The Tropical Dry Forests are biomes dominated by deciduous plant species,
widely distributed in the South American continent. In them, the seasonal, the
successional stages, beyond the soil physical-chemicals properties influence their
structure and function and, therefore, the microbial diversity of the soil can be changed.
In this context, the Growth Promoting Rhizobacteria in Plants are interesting targets of
study. The aim of this study was to test the following hypotheses: richness, abundance
and bacterial biochemical activity are influenced by the station; and richness, abundance
and bacterial biochemical activity are influenced by successional stages of regeneration.
For this, bacteria isolated from soil were characterized morphologically and
biochemically. The production of indole-3-acetic acid, phosphate solubilization and
Biological Fixation of Nitrogen has been verified. The Variables richness and
abundance responded the first hypothesis tested, since were higher during the rainy
season. The richness and abundance did not vary along of the successional gradient. The
variable indole-3-acetic acid, the phosphate solubilization and Biological Fixation of
Nitrogen did not correspond to the hypotheses tested. The morphology, Gram and
catalase show that the strains have characteristics very similar. These isolates must be
submitted to molecular techniques to be identified phylogenetically. The characteristics
of the vegetation, through of the data of phytosociology, did not influence the
distribution of morphospecies. But the edaphic factors were important.
plana plana plana plana plana plana plana plana plana
Produção de muco não não não não não não não não sim
33
O agrupamento das morfoespécies permitiu verificar que existe uma alta similaridade
entre as morfoespécies de cada grupo, indicando que provavelmente são muito próximas.
Quanto à resposta a coloração de Gram (Figura 11) e teste de catalase, a maioria dos
isolados foi positivo (Figura 12) (Tabela 7). É necessário submeter os isolados deste estudo á
análise molecular para verificar de quais rizobactérias se tratam.
Figura 11. Microscopia óptica dos isolados JE22B-93 (A) e JE12A-28 (B) de Florestas Tropicais Secas em
aumento de 1000x.
Figura 12. Resultado do teste de catalase dos isolados 2LE12B-586 (A) e JI34B-86 (B) de Florestas Tropicais
Secas.
34
Tabela 7. Relação da forma e coloração das morfoespécies encontradas em Florestas tropicais Secas.
Morfoespécie
Forma Gram Catalase
Morfo1
cocos positivo positivo
Morfo2 cocos positivo negativo
Morfo3
estreptobacilos positivo negativo
Morfo4 bacilos positivo negativo
Morfo5
estreptobacilos positivo negativo
Morfo6 bacilos positivo positivo
Morfo7
bacilos positivo positivo
Morfo8 bacilos negativo positivo
Morfo9
cocos
positivo
positivo
3.2 Efeito da estação e do estágio sucessional na atividade bioquímica de rizobactérias
3.2.1 Produção de AIA por rizobactérias
A equação para o cálculo da concentração de AIA foi obtida através do preparo de
uma solução com o hormônio sintetizado conforme metodologia citada (Figura 13) e posterior
construção da curva padrão (Figura 14).
35
Figura 13. Amostras preparadas a partir do hormônio sintetizado (Sigma, 98% de pureza), para a construção da
curva padrão, onde A, B, C, D, E, F e G são 0, 1, 3, 5, 7, 10, 25, 50, 100 e 150 µg.mL-1, respectivamente.
Figura14. Curva padrão do ácido indolacético a partir do hormônio sintetizado (95%) utilizada para o cálculo da
concentração do AIA produzido pelas rizobactérias de Florestas Tropicais Secas. Absorvância medida em
nanômetros e concentração em µg/mL-1.
A produção de AIA pela cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 (Figura 15
A) foi de 123µg.mL-1. Dos isolados analisados três (SE33A-312, SE32A-316 e SI23B-377)
não produziram ácido indolacético. Esses três isolados pertencem às amostras da estação
úmida. A produção de ácido indolacético variou de 0.05 (produzido pelos isolados LI24A-204
e 2JT13B-823) a 134 µg.mL-1 (produzido pelo isolado ST33A-345) (Figura 15 B).
36
Figura 15. (A) Resultado para AIA da cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 (R1-R3= repetições e
B=branco) e (B) resultado para AIA, onde A é o isolado ST33A-345, B é o isolado ST12A-355, C é o isolado
SE32B-402 e B é o branco.
A estação do ano não afetou a produção de ácido indolacético (p<0,05). Entretanto, o
estágio sucessional afetou significativamente a produção de ácido indolacético por
rizobactérias (p<0,001). Adicionalmente, a análise de contraste mostrou que a produção de
ácido indolacético por bactérias encontradas nos estágios iniciais e intermediários foi menor
do que a produção encontrada nos estágios tardios. Além disso, essa não foi significativa entre
os estágios iniciais e intermediários (Figura 16).
Figura 16. Produção de ácido indol-3-acético (AIA) em µg/mL-1 por rizobactérias em função do estágio
sucessional em uma Floresta Tropical Seca. No gráfico barras com mesma letra indica que os valores não foram
significativos (p>0,05) e com letra diferente foi significativo (p<0,05) pela Análise de Contraste.
37
3.2.2 Solubilização de fosfato por rizobactérias A solubilização de fosfato foi observada somente para 25 dos 180 isolados analisados
e para a cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 (IS=3,8) (Figura 17 A). O maior IS
observado foi 1,88 para o teste com o isolado 2LT22A-646 (Figura 19 B). De acordo com a
classificação, os IS’s obtidos pela solubilização de fosfato são considerados baixos, pois todos
os IS’s foram menores que 2.
Figura 18. Solubilização de fosfato, após 15 dias de crescimento, (A) pela cepa padrão Burkholderia cepacia
ATCC 25416 e (B) pelo isolado 2LT22A-646 de rizobactéria de Floresta Tropical Seca.
As análises mostraram que a estação afeta significativamente a solubilização de
fosfato (p<0,001), tendo sido maior na estação seca. Esse resultado não corrobora com a
primeira hipótese deste estudo, visto que se esperava que o estresse hídrico observado nos
solos tropicais, sobretudo nos locais amostrados durante a estação seca, afetasse
negativamente a atividade bacteriana. Quanto ao estágio sucessional, este não afeta a
solubilização de fosfato pelas rizobactérias (p>0,05) (Figura 18).
38
Figura 18. Solubilização de fosfato por rizobactérias em função da estação seca e úmida em uma Floresta
Tropical Seca. A solubilização está expressa em Índice de solubilização (diâmetro do halo (mm)/diâmetro da
colônia (mm)). No gráfico barras com letra diferente indica que os valores foram significativos pela Análise de
Variância (p<0,05).
3.2.3 Fixação Biológica de Nitrogênio por rizobactérias
A sazonalidade e o estágio sucessional não afetaram significativamente a Fixação
Biológica de Nitrogênio pelas rizobactérias estudadas (p>0,05). A cepa padrão e a maioria
dos isolados foram positivas para a Fixação Biológica de Nitrogênio (Figura 18 A e B,
respectivamente).
39
Figura 18. (A) Fixação de nitrogênio pela cepa padrão Burkholderia cepacia ATCC 25416 e (B) pelo isolado de
rizobactéria JI13A-12 de uma Floresta Tropical Seca.
40
4 DISCUSSÃO
4.1 Efeito da estação e do estágio sucessional na riqueza e abundância de rizobactérias
Neste trabalho, o conhecimento da diversidade morfológica dos microrganismos
estudados foi considerado e, através da separação das colônias em morfoespécie, foi possível
analisar a riqueza e abundância em função dos estágios e da estação. Muitos trabalhos ainda
são realizados considerando a classificação de bactérias em gênero ou ainda considerando
apenas os aspectos morfológicos para identificação (Ribeiro & Cardoso, 2011; Silva &
Melloni, 2011).
A hipótese que considerou o efeito da estação sobre a riqueza e abundância de
rizobactérias foi corroborada. Flutuações na disponibilidade de água são freqüentemente
observadas nos solos tropicais, com ciclos de seca e encharcamento, que resultam em baixa
sobrevivência dos microrganismos diazotróficos (Mary et al., 1994). Resultados semelhantes
a este trabalho foram encontrados para actinobactérias em que foi relatada uma maior
diversidade de espécies de actinobactérias para a estação úmida em todos os locais
amostrados (Nimnoi et al., 2011).
A comunidade microbiana da rizosfera pode ter sua estrutura e composição de
espécies diversificada em função não apenas de uma variável, mas do tipo de solo, espécie de
plantas, estado nutricional, idade, estresse, entre outros fatores ambientais (Cardoso &
Nogueira, 2007). A presença de plantas pioneiras pode reduzir a diversidade de diazotróficas
de vida livre e, diretamente ou indiretamente, influencia a estrutura da comunidade (Duc et
al., 2009). Considerando o tempo de regeneração natural e a estação diversos trabalhos
relatam que eles afetam a estrutura e sucessão de comunidades de diazotróficas em diferentes
ambientes (Rastetter et al., 2001; Nemergut et al., 2006) e, ainda, a diversidade filogenética
tende a aumentar com a idade em cada estágio (Mosberger & Lazzaro, 2008). Nas sucessões
em comunidades, se não houver nenhuma perturbação adicional às que geralmente ocorrem
41
em um ambiente, o número de espécies inicialmente aumenta devido à colonização,
decrescendo posteriormente devido à competição. Este padrão está bem estabelecido para
plantas, mas os poucos estudos sobre sucessão animal indicam, ao menos, um aumento
paralelo na riqueza de espécies nos estágios iniciais de sucessão. Entretanto, para muitas
generalizações, podem ser encontradas exceções importantes, e para a maioria delas as
explicações atuais não são inteiramente adequadas, sendo baseadas em estimativas
(estimadores) de riqueza pouco precisas (consistentes) (Begon et al., 2007).
Os efeitos sazonais são importantes reguladores das comunidades de diversos
organismos em florestas tropicais (Neves et al., 2010; Oliveira et al., 2011), sendo que a
umidade pode afetar positivamente a diversidade no caso da microbiota do solo (Shishido &
Chanway, 1998).
O tipo de solo é o fator mais importante na determinação da comunidade microbiana
da rizosfera (Xu et al., 2009). Esse impacto gerado em comunidades de rizobactérias varia em
relação às propriedades edáficas, tais como a textura, pH e teor de matéria orgânica e
porcentagem de argila (Nimnoi et al., 2011). Solos de argila são relatados como os que
exercem uma maior influência sobre as comunidades microbianas e geralmente suportam
maiores densidades populacionais do que solos arenosos (Marschner et al., 2004; Xu et al.,
2009).
A análise dos genes amplificados e seqüenciados de rDNA 16S se tornou a abordagem
mais importante para estudos de diversidade bacteriana. As novas tecnologias permitem
sequenciar várias amostras em uma única corrida e o custo-benefício é dividido (Lemos et al.,
2011). A abordagem morfológica utilizada neste trabalho ainda é importante para se dar início
aos estudos de diversidade de microrganismos (Ribeiro & Cardoso, 2011; Silva & Melloni,
2011). Análises filogenéticas podem contradizer expectativas que se baseiam apenas em
propriedades fenotípicas dos organismos. Como exmplo, a classificação fenotípica tradicional
42
considera Chromatium vinosum, espécie fotossintética, diferente de Escherichia coli que é
heterotrófica. No entanto, a análise filogenética baseada em rDNA 16S, e outras sequências,
mostrou que os dois organismos são semelhantes, e mesmo que utilizem diferentes fontes e
estratégias de obtenção de energia, compartilham a natureza de algumas vias biossintéticas e
mecanismos de regulação gênica (Hugenholtz & Pace, 1996).
4.2 Efeito da estação e do estágio sucessional na atividade bioquímica de rizobactérias Os resultados para produção in vitro de AIA não confirmaram nenhuma das hipóteses
testadas. Com relação à maior produção de AIA por bactérias encontradas no estágio tardio
não foi encontrado nenhum dado na literatura que corroborasse a diferença acentuada com
relação à produção pelas bactérias do estágio tardio.
Em solos de sucessão inicial o efeito da rizosfera de manchas de plantas de
Leucanthemopsis alpina (Asteraceae) pode influenciar o número de células bacterianas e
atividades fisiológicas intrínsecas não só dentro da zona de raiz, mas até mesmo, a 20 cm de
distância da planta (Miniaci et al., 2007). Plantas vasculares de estágios iniciais podem
aumentar a disponibilidade de C e N na sua zona de raiz e criar um efeito caracterizado por
um aumento acentuado do grau de culturabilidade da comunidade microbiana e uma mudança
nas populações bacterianas dominantes (Edwards et al., 2006).
O AIA é um importante fitormônio natural encontrado, em baixas concentrações, em
plantas (Pelzer et al., 2011) e está envolvido na regulação dos processos de crescimento e
desenvolvimento (Sanches et al., 2009). Quando produzido em altas concentrações, pode ter
efeito contrário, inibindo o crescimento da planta (Boiero et al., 2007). A avaliação da síntese
desse fitormônio por rizobactérias pode proporcionar mais um critério a ser utilizado na
seleção de cepas boas produtoras (Chagas Jr. et al., 2009). Para isso, muitos trabalhos
evidenciam a síntese de AIA por rizobactérias usando o L-triptofano como precursor
43
(Hameed et al., 2004; Sottero, et al., 2006). Diferenças significativas já foram observadas na
variação da produção de AIA, em diferentes concentrações de L-triptofano, com produção
acima de 100 µg.mL-1 (Chagas Jr. et al., 2009). Em outro caso, o nível mais elevado de
produção de AIA foi de 127 µg.mL-1 (Goudjal et al., 2013). Este valor foi menor que o
produzido pelo isolado mais produtivo no presente trabalho (134 µg.mL-1, produzido pelo
isolado ST33A-345).
A avaliação da produção de AIA foi realizada por meio da via dependente de L-
triptofano. Mas outros trabalhos consideram a avaliação dessa produção em relação à via não
dependente de L-triptofano. Noventa por cento do AIA produzido por Azospirillum
brasilense são sintetizados pela via não dependente de L-triptofano (Prinsen et al., 1993).
Mas, isolados de rizóbios são capazes de produzir AIA com ou sem a adição de triptofano
(Chagas Jr. et al., 2009).
A maior atividade bacteriana quanto à solubilização de fosfato observada na estação
seca pode ser explicada pelo fato de que, em situações de estresse hídrico, muitas reações no
solo ficam limitadas, o que consequentemente dificulta a absorção de alguns nutrientes pelas
plantas (Larcher, 2006). Diante disso, a ação das bactérias garante uma maior disponibilidade
de fósforo no solo, mantendo assim os benefícios oferecidos na associação entre planta e
microrganismos.
No período seco o pH do solo tende a ficar mais ácido e são liberados íons de Al, Fe e
Mn em excesso, o que precipita o fósforo, levando à diminuição da concentração de íons
PO43- (Larcher, 2006). Com isso, a absorção do fósforo é dificultada, uma vez que é associada
à atividade de microrganismos do solo como rizobactérias, que é baixa em solos ácidos como
os de FTS’s. Por outro lado, em solos alcalinos ocorre a formação de compostos de cálcio
cada vez mais insolúveis partindo do fosfato bicálcico (CaHPO4), primeiro mineral formado
pela reação do P com o Cálcio (Raij, 2004). A falta de dados consistentes em relação à
44
diferença na solubilização de fosfato por rizobactérias durante as estações nos permite inferir
pouco sobre o assunto. Por isso, o que se pode afirmar é que os microrganismos do solo
desempenham papel relevante na retenção e disponibilização desse nutriente em ecossistemas
naturais (Gallardo & Schlesing, 1995), sobretudo no início da estação chuvosa em que o
fósforo pode representar em torno de 60% do retorno anual de serrapilheira através da
atividade microbiana (Campo et al., 1998). Nesse sentido, a umidade favorece a ação dos
microrganismos de forma que os minerais nutritivos como o fósforo permanecem
indisponíveis por pouco tempo e voltam a estar disponíveis para as plantas (Larcher, 2006).
Cepas dos gêneros Pseudomonas, Bacillus e Rhizobium estão entre as bactérias mais
eficientes na solubilização de P (Rodriguez & Fraga, 1999). O estudo sobre a eficiência
desses microrganismos em solubilizar fosfato pode levar à seleção de isolados com alto
potencial para utilização na inoculação em plantas (Souchie, 2005).
Os resultados encontrados neste trabalho não corroboraram as hipóteses testadas visto
que esperava-se uma maior Fixação Biológica de Nitrogênio por rizobactérias encontradas na
estação úmida e nos estágios intermediários de sucessão. A umidade do solo estimula a
atividade de decomposição microbiana, que regula principalmente a ciclagem do nitrogênio
no ecossistema (Larcher, 2006). Com relação aos estágios sucessionais, a maior quantidade de
leguminosas poderia contribuir para a maior Fixação Biológica de Nitrogênio. Rizobactérias
que vivem nesses locais podem viver em associação com essas plantas otimizando a
disponibilização de Nitrogênio (Dobbelaere et al., 2003).
O estudo do potencial de fixação de nitrogênio in vitro por rizobactérias deve ser
aprofundado. Os genes nifH de isolados podem ser sequenciados e a quantificação do
potencial de fixação de nitrogênio pode ser realizada pela redução de acetileno a etileno
(Lammel et al., 2013). O gene nifH codifica uma das enzimas do complexo nitrogenase, que é
conhecida por catalisar a reação de Fixação Biológica de Nitrogênio. Ele é também uma
45
ferramenta útil para analisar e compreender as comunidades diazotróficas, bem como
classificá-las (Mosberger & Lazzaro, 2008; Jorquera et al., 2013). As bactérias com alto nível
de Fixação Biológica de Nitrogênio podem ser inoculadas em espécies de plantas nativas para
uso em restauração e reflorestamento de áreas degradadas, o que pode refletir em maiores
níveis de crescimento e fitness das plantas.
46
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os parâmetros analisados sobre os fatores edáficos e cobertura vegetal da área
estudada poderiam contribuir para o entendimento da atividade de microrganismos oriundos
de diferentes estágios. Entretanto, a produção de AIA foi maior no estágio tardio e a
solubilização de fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio não teve diferença significativa. A
diferença entre os estágios, tanto para os fatores edáficos quanto para a cobertura vegetal, foi
significativa para os estágios iniciais de sucessão (p<0,05). Entretanto, dos nutrientes do solo,
somente o alumínio e H+Al foram significativos (p<0,05). Por isso, os resultados da análise
de solo e cobertura vegetal não serviram de parâmetros, nesse caso, para explicar a atividade
microbiana.
47
6 CONCLUSÕES
Vários estudos já foram realizados com o intuito de verificar a influência da
sazonalidade e do gradiente sucessional na riqueza e abundância de organismos em FTS’s.
Entretanto, este é o primeiro que teve por objetivo investigar a influência desses fatores na
riqueza, abundância, produção de AIA, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de
Nitrogênio de rizobactérias em FTS’s.
O conhecimento de qual é a estação e o estágio sucessional em que as rizobactérias
são mais eficientes para a produção de AIA, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de
Nitrogênio permite que sejam definidos o momento e o local de coleta para selecionar as
espécies mais promissoras. As análises desses parâmetros permitem afirmar que as bactérias
obtidas neste estudo são potenciais para a produção de AIA e FBN, que são caracteres
fenotípicos importantes na escolha de microrganismos mais eficientes para a recuperação de
áreas degradadas e revegetação com espécies de plantas nativas.
Os resultados para a morfologia, coloração de Gram e para o teste de catalase mostram
que os isolados possuem características muito próximas. Esses isolados devem ser submetidos
às técnicas moleculares e identificados para verificar se revelam novos Taxa de rizobactérias
bem como para confirmar aquelas já descritas.
Finalmente, estudos que visam identificar o padrão de distribuição, a atividade
bioquímica e a caracterização filogenética de rizobactérias em FTS’s contribuem para o
conhecimento desses microrganismos, que podem ser indicados para o uso na recuperação de
áreas degradadas e compor um banco de germoplasma ativo para estudos futuros e de
referência.
48
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ahmad F, Ahmad I and Khan M S (2008). Screening of free-living rhizospheric bacteria for
their multiple plant growth promoting activities. Microbiological Research 163: 173-
181.
Antunes F (1994). Caracterização-Caatinga do Estado de Minas Gerais. Inf. Agro 17: 15–19.
Baldani J I, Baldani V L D (2005). History on the biological nitrogen fixation research in
graminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience. Anais da
Academia Brasileira de Ciências 77:549-579.
Begon M, Townsend C R & Harper J L (2007). Ecologia: de indivíduos a ecossistemas. São
Paulo, Editora Artmed, 4ª edição. 740 p.
Berraqueiro F R, Baya A M, Cormenzana A R (1976). Establecimiento de índices para el
estudio de la solubilizacion de fosfatos por bacterias del suelo. ARS Pharmacéutica,
Granada 17: 399-406.
Boiero L. et al. (2007). Phytohormone production by three strains of Bradyrhizobium
japonicum and possible physiological and technological implications. Applied
Microbiology and Biotechnology, Berlin 74 (4): 874-880.
Campo J, Jaramillo V J and Maass J M (1998). Pulses of Soil Phosphorus Availability in a
Mexican Tropical Dry Forest: Effects of Seasonality and Level of Wetting. Oecologia
115 (1): 167-172.
Cardoso E J B N & Nogueira M A (2007). Microbiota do solo e qualidade ambiental.
Campinas: Instituto Agronômico.
Chagas Jr, Freitas A, Oliveira L A, Oliveira A N (2009). Produção de ácido indolacético por
rizóbios isolados de Caupi. Rev. Ceres, Viçosa 56(6): 812-817.
Clements F E (1916). Plant succession: an analysis of the development of vegetation.
Carnegie Institution of Washington, Washington p.512.
49
Coelho M S, Almada E D, Quintino A V, Fernandes G W, Santos R M, Sánchez-Azofeifa G
A & Espírito-Santo M M (2012). Floristic composition and struct ure of a tropical dry
forest at different successional stages in the Espinhaço mountains, southeastern Brazil.
Interciência 37 (3): 190-196.
Crawley M J: The R book. John Wiley & Sons; 2007.
Da Silveira E L (2004). Identificação de comunidades bacterianas de solo por sequenciamento
do gene 16S rDNA. Jaboticabal, Universidade Estadual Paulista, 75p (Dissertação de
mestrado).
Dobbelaere S, Vanderleyden J, Okon Y (2003). Plant growth-promoting effects of
diazotrophs in the rhizosphere. Critical Reviews in Plant Sciences 22: 107-149.
Döbereiner J, Baldani V L D & Baldani, J I (1995). Como isolar e identificar bactérias
diazotrotóficas de plantas não leguminosas. Rio de Janeiro: EMBRAPA-CNPAB, 60p.
Duc L, Noll M, Meier B E, Bürgmann H & Zeyer J (2009). High Diversity of Diazotrophs in
the Forefield of a Receding Alpine Glacier. Microbial Ecology 57: 179–190.
Dufrêne M & Legendre, P (1997). Species assemblages and indicator species: The need for a
Neves M C P, Rumijanek NG (1998). Ecologia das bactérias diazotróficas nos solos tropicais.
In: Melo IS, Azevedo JL (Ed.). Ecologia Microbiana. São Paulo: Jaguariúna, cap.1:
15-60.
54
Nimmoi P, Pongsilp N & Lumyong S (2011). Actinobacterial community and diversity in
rhizosphere soils of Aquilaria crassna Pierre ex Lec assessed by RT-PCR and PCR-
DGGE. Biochemical Systematics and Ecology 39: 509–519.
Oliveira V H F, Souza J G M, Z. Vaz-de-Mello, F Z, Neves F S & Fagundes M (2011).
Variação na fauna de besouros rola-bosta (Coleoptera: Scarabaeinae) entre habitats de
cerrado, mata seca e mata ciliar em uma região de transição Cerrado - Caatinga no
norte de Minas Gerais. MG.BIOTA, Belo Horizonte 4 (4): 4-16.
Peel M (2007). Updated world map of the Köppen-Geiger climate classification. Hydrology
and Earth System Science 11: 1633–1644.
Pelzer G Q, Halfeld-Vieira BA, Nechet K L, Souza G R, Zilli J E, Perin L (2011).
Mecanismos de controle da murcha-de-esclerócio e promoção de crescimento em
tomateiro mediados por rizobactérias. Tropical Plant Pathology 36 (2): 095-103.
Pezzinni F, Brandão D, Ranieri B, Espírito-Santo M M, Jacobi C & Fernandes G W (2008).
Polinização, dispersão de sementes e fenologia de espécies arbóreas no Parque
Estadual da Mata Seca. MG Biota 1: 37–45.
Philippot L, Spor A, Hénault C, Bru D, Bizouard F, Jones C M, Sarr A & Pierre-Alain Maron
(2013). Loss in microbial diversity affects nitrogen cycling in soil. The International
Society for Microbial Ecology 7: 1609–1619.
Princen E et al. (1993). Azospirillum brasilense Indol-3-Acetic Acid Biosynthesis: Evidence
for a Non-Tryptophan Dependent Pathway. Molecular Plat-Microbe Interactions, Saint
Paul, 6 (5): 609-615.
Quesada M et al. (2009). Succession and Management of Tropical Dry Forests in the
Americas: Review and new perspectives. Forest Ecology and Management 258: 1014-
1024.
55
Raij B V (2004). Fósforo no solo e interação com outros elementos. In: YAMADA, T.;
ABDALLA, S.R.S., eds. Fósforo na Agricultura Brasileira. Piracicaba, Potafos 107-
115.
Rastetter E, Vitousek P, Field C, Shaver C, Herbert D, Agren G (2001). Resource
optimization and symbiotic nitrogen fixation. Ecosystems 4: 369-388.
R Development Core Team (2009). R: A language and environment for statistical computing.
R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL
http://www.R-project.org.
Ribeiro C M & Cardoso E J B N (2011). Isolation, selection and characterization of root-
associated growth promoting bacteria in Brazil Pine (Araucaria angustifolia).
Microbiol Res (2011), doi:10.1016/j.micres.2011.03.003.
Rodrigues E P, Oliveira A L M, Vidal M S, Simões-Araújo & Baldani J I (2007). Obtenção e
seleção de mutantes Tn5 de Gluconacetobacter diazotrophicus (Pal 5) com alterações
na produção de auxinas. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 27, Embrapa,
Seropédica, Rio de Janeiro, 24p.
Rodriguez H & Fraga R (1999). Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth
promotion. Biotechonology Advances 17: 319-339.
Sanches S M, Martins R, Cordeiro P J M, Vaz L A A, Vieira E M (2009). Validação do
método para determinação do ácido-3-indolacético em água de rios por cromatografia
líquida de alta eficiência. Revista Ambiente & Água- An Interdisciplinary Journal of
Applied Science 4(1): 81-92.
Sánchez-Azofeifa G A, Quesada M, Rodríguez J P, Nassar J M, Stoner K E, Castillo A,
Garvin T, Zent E L, Calvo-Alvarado J C, Kalacska M E R, Fajardo L, Gamon J A and
Cuevas-Reyes P (2005). Research Priorities for Neotropical Dry Forests. Biotropica
37(4): 477–485.
56
Sevilha A C, Scariot A & Noronha S E (2004). Estado atual da representatividade de unidades
de Conservacão em Florestas Estacionais Deciduais no Brasil. In: Sociedade Brasileira
de Botânica (Eds.), Biomas Florestais - Annals of the 55th Congresso Nacional de
Botânica, Sociedade Brasileira de Botânica, São Paulo 1–63.
Shishido M & Chanway C P (1998). Storage effects on indigenous soil microbial
communities and PGPR efficacy. Soil Biology & Biochemistry 30: 939-947.
Silva Filho G N & Vidor C (2000). Solubilização de fosfato por microrganismos na presença
de fontes de carbono. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa 24: 311-319.
Silva H S A, Romeiro R S, Macagnan D, Halfeld-Vieira B A, Pereira M C B & Mounteerd A
(2004) Rhizobacterial induction of systemic resistance in tomato plants: non-specific
protection and increase in enzyme activities. Biological Control 29: 288–295.
Silva J O, Espírito-Santo M M & Melo G A (2011). Herbivory on Handroanthus ochraceus
(Bignoniaceae) along a successional gradient in a tropical dry forest. Arthropod-Plant
Interactions, DOI 10.1007/s11829-011-9160-5.
Silva T F & Melloni R (2011). Densidade e diversidade fenotípica de bactérias Diazotróficas
não simbióticas em solos da Reserva biológica serra dos Toledos. Itajubá (MG)
Revista Brasileira de Ciências do Solo, 35: 359-371.
Silveira, A P D & Freitas S (2007). Microbiota do solo e qualidade ambiental. Instituto
Agronômico, Campinas (SP), 317p.
Solano B R, Barriuso J & Gutiérrez-Mañero F J (2008). Physiological and molecular
mechanisms of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR). In: Ahmad I, Pichtel J,
Hayat S. Plant-Bacteria Interactions - strategies and techniques to promote plant
growth. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co p.41-54.
57
Sottero N A, Freitas S S, Melo A M T, Trani P E (2006). Rizobactéria e alface: colonização
rizosférica, promoção de crescimento e controle biológico. Revista Brasileira de
Ciência do Solo 30: 225-234.
Souchie E L, Azcón R, Barea J M, Saggin-Júnior O J & Silva E M R (2005). Solubilização de
fosfatos em meios sólido e líquido por bactérias e fungos do solo. Pesquisa
Agropecuária Brasileira 40:1149-1152.
Spaepen S, Vanderleyden J & Okon O (2009). Plant growth-promoting actions of
rhizobacteria. Advances in Botanical Research 51: 283-320.
Stauffer M D, Sulewski G (2004). Fósforo-Essencial para vida. In: Yamada T, Abdalla SRS
Fósforo na agricultura brasileira. Potafos Piracicaba-SP 726p.
Towne E G (2000). Prairie vegetation and soil nutrient responses to ungulate carcasses.
Oecologia 122: 232-239.
Trabulsi L R & Alterthum (2005). Microbiologia. 4º ed., Atheneu, São Paulo.
Vessey J K (2003). Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil 255:
571-586.
Xu Y, Wang G, Jin J, Liu J, Zhang Q, Liu X (2009). Bacterial communities in soybean
rhizosphere in response to soil type, soybean genotype, and their growth stage. Soil
Boil. Biochem. 41: 919–925.
Zilli J E, Rumjanek N G, Xavier G R, Coutinho H L C, Neves M C P (2003). Diversidade
microbiana como indicador de qualidade do solo. Cadernos de Ciência & Tecnologia,
Brasília 20 (3): 391-411.
58
APÊNDICE
Tabela 8. Modelos lineares generalizados completos construídos para testar os efeitos da estação, estágio e interação estação*estágio na riqueza, abundância, produção de
AIA, solubilização de fosfato e Fixação Biológica de Nitrogênio em rizobactérias de Florestas Tropicais Secas em três unidades de conservação no norte de Minas Gerais.
Variável resposta Distribuição de erro Variável explicativa Df Deviance P Residual deviance
Riqueza Poisson
Estação
1 77,162 2,2x10-16 355,77
Estágio
2 0,379 0,8273 432,93
Estação*Estágio 2 2,111 0,3481 353,66
Abundância Quasipoisson
Estação
1 6267,9 2x10-16 21774
Estágio
2 132,7 0,4724 28042
Estação*Estágio 2 31,2 0,8385 21743
Ácido indol-3-acético Gaussian
Estação
1 47,9 0,75389 283388
Estágio
2 19250,3 2,64x10-9 264138
Estação*Estágio 2 3899,4 0,01830 2,60239
Solubilização de fosfato Gaussian
Estação
1 3,2089 0,000639 150,01
Estágio
2 0,0142 0,974596 149,99
Estação*Estágio 2 0,0678 0,884097 148,46
Fixação Biológica de Nitrogênio Quasibinomial
Estação
1 0,2959 0,7522 49,144
Estágio
2 11,3773 0,1471 49,440
Estação*Estágio 2 5,2310 0,4142 43,913
59
ANEXOS
Figura 2. Localização do Parque Estadual Lagoa do Cajueiro, Reserva Biológica Serra Azul e Reserva Biológica Jaíba, localizados nos municípios de Matias Cardoso e Jaíba,
no Vale do Médio Rio São Francisco.
60
Tabela 1. Composição química do meio de cultura LGIm utilizado para o teste da capacidade das rizobactérias em solubilizar fosfato.
Componentes Quantidade (g.L -1)
Glicose 100
Mg.SO4.7H2O 0,2
NaMoO4.2H2O 0,002
FeCl3.6H2O 0,018
K2HPO4 0,2
KH2PO4 0,6
Ca3 (PO4)2 5
Agar 15
* Adicionar 5mL de Azul de bromotimol (Solução 0,5% em KOH 0,2N). * Adicionar água destilada e ajustar o pH para 5,5.
61
Tabela 2. Composição química do meio de cultura NFb utilizado para o teste da capacidade das rizobactérias para a Fixação Biológica de Nitrogênio.
Componentes Quantidade (g.L -1)
Ácido málico 5,0
Mg.SO4.7H2O 0,2
NaCl 0,1
CaCl2.2H2O 0,02
K2HPO4 0,5
KOH 4,5
Agar 1,75
*Adicionar 2mL de solução de micronutrientes, 2mL de Azul de bromotimol (Solução 0,5% em KOH 0,2N), 4mL de FeEDTA (Solução 1,64%), 1mL de solução de vitaminas e água destilada. Ajustar o pH para 5,8.
62
Tabela 4. Valores médios (média ± EP) das características estruturais de árvores (altura, área basal e densidade) e o índice de complexidade de Holdrige (HCI) em três
estágios sucessionais em três unidades de conservação de FTS’s no Norte de Minas Gerais. Diferenças entre as características estruturais foram testadas através de modelos
lineares generalizados e letras diferentes indicam diferenças significativas.
Estágios sucessionais Características estruturais
Riqueza Altura (m) Densidade (ind/há-0.1) Área basal (m2/há) HCI