UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS EBE CHRISTIE DE OLIVEIRA AVALIAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO LINFOCITÁRIO EM CARCINOMAS HEPATOCELULARES DE FÍGADOS CIRRÓTICOS E NÃO CIRRÓTICOS, ATRAVÉS DE ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO CAMPINAS 2017
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
EBE CHRISTIE DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO LINFOCITÁRIO EM
CARCINOMAS HEPATOCELULARES DE FÍGADOS CIRRÓTICOS E NÃO
CIRRÓTICOS, ATRAVÉS DE ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
CAMPINAS 2017
EBE CHRISTIE DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO LINFOCITÁRIO EM
CARCINOMAS HEPATOCELULARES DE FÍGADOS CIRRÓTICOS E NÃO
CIRRÓTICOS, ATRAVÉS DE ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos para obtenção do título
de Doutora em Ciências Médicas, Área de Concentração Anatomia
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA EBE CHRISTIE DE OLIVEIRA E ORIENTADA PELA PROF. DRA. CECILIA AMÉLIA FAZZIO ESCANHOELA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca
examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data da defesa: 31 de agosto de 2017
DEDICATÓRIA
Aos meus filhos, Matteo e Sophie, e ao meu esposo, Vanderlei, que enchem minha vida de significado e motivação.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Cecilia A. Fazzio Escanhoela, professora e amiga, que compreendeu como ninguém os percalços que enfrentei ao longo destes anos e que me motivou a prosseguir, a despeito de qualquer dificuldade. Ao meu esposo, Vanderlei Segatelli, pela contribuição neste trabalho, mas, sobretudo, pela presença forte e constante em minha vida, desde o instante em que decidimos trilhar o caminho juntos. À minha mãe, Lurdes, sempre uma fonte de inspiração pela força na luta diária e pela resiliência incomparável. Ao Prof. Dr. Paulo Roberto Merçon de Vargas, por me apresentar, ainda nos anos da graduação, o universo único e instigante da Anatomia Patológica. À funcionária Ana Claudia S. Piaza, pelo trabalho de execução das reações imuno-histoquímicas deste trabalho. À secretária Maria do Carmo, pela gentileza constante e pelo auxílio. A todos os funcionários do Departamento de Anatomia Patológica da UNICAMP, pela contribuição nas diversas etapas de execução deste projeto.
RESUMO
O carcinoma hepatocelular (CHC) destaca-se como uma das formas mais comuns
de câncer no mundo, correspondendo a aproximadamente 80% das neoplasias
malignas primárias do fígado, sendo a cirrose seu principal fator de risco. Assim
como em neoplasias do trato gastrointestinal, pele, trato genital feminino e mama, a
presença de pronunciado infiltrado linfocitário associado ao CHC tem se relacionado
a melhor prognóstico, sendo interpretado como uma manifestação do sistema imune
do hospedeiro contra o tumor. Relatos recentes têm documentado o padrão
imunofenotípico do infiltrado linfocitário associado ao CHC, todavia sem destaque
para os CHCs originados em fígados não cirróticos. Nosso objetivo principal foi
realizar uma avaliação comparativa da intensidade e do imunofenótipo do infiltrado
linfocitário tumoral, através de estudo imuno-histoquímico, em CHCs originados em
fígados cirróticos e não cirróticos. Comparamos também as características desse
infiltrado com alguns aspectos macro e microscópicos da lesão: tamanho, graduação
histológica e presença de êmbolos neoplásicos. Selecionamos 40 blocos de parafina
referentes a 20 casos de CHC com cirrose e 20 casos de CHC sem cirrose,
diagnosticados em produtos de ressecção cirúrgica ou transplantes hepáticos,
independentemente do fator etiológico, sexo, cor, idade ou grupo étnico. Em todos
os casos, realizamos o seguinte painel imuno-histoquímico: CD3, CD20, CD4 e CD8.
A partir de imagens digitalizadas, realizamos a contagem das subpopulações de
linfócitos em três áreas de maior número de células (hot spots). O infiltrado tumoral
mostrou-se composto predominantemente por linfócitos T nas duas populações, com
maior contagem dessas células nos CHCs de fígados não cirróticos (81,7 ± 68,2).
Observou-se maior número médio de linfócitos T CD4+ intratumorais, principalmente
nos CHCs originados em fígados não cirróticos, contudo sem diferença
estatisticamente significativa entre os grupos. No grupo de fígados não cirróticos,
observou-se maior número de linfócitos B e T entre os CHCs de grau histológico 2,
quando comparados aos de grau 1. Não se evidenciou correlação entre a
quantidade de células das subpopulações de linfócitos com a presença de êmbolos
Figura 1. Representação esquemática do microambiente tumoral e seus constituintes celulares 20 Figura 2. O conceito da imunoedição tumoral 22 Figura 3. Interações entre o microambiente imune e células tumorais 24 Figura 4. Contagem do número de linfócitos T CD8+ intratumorais por campo de grande aumento (400x) com o programa de processamento de imagens ImageJ®. 34 Figura 5. Linfócitos T intratumorais em CHC originado em fígado Cirrótico (marcador CD3; X400) 40 Figura 6. Linfócitos B intratumorais em CHC originado em fígado Cirrótico (marcador CD20; X400) 40 Figura 7. Linfócitos T intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (marcador CD3; X400) 41 Figura 8. Linfócitos B intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico cirrótico (marcador CD20; X400) 41 Figura 9. Linfócitos T CD8+ intratumorais em CHC originado em fígado cirrótico (marcador CD8; X400) 42 Figura 10. Linfócitos T CD4+ intratumorais em CHC originado em fígado cirrótico (marcador CD4; X400) 43 Figura 11. Linfócitos T CD8+ intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (marcador CD8; X400) 44 Figura 12. Linfócitos T CD4+ intratumorais em CHC originado em fígado não cirrótico (marcador CD4; X400) 44
LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS
Página
Gráfico 1: Fatores etiológicos associados aos CHCs originados em fígados cirróticos 36 Gráfico 2: Fatores etiológicos associados aos CHCs originados em fígados não cirróticos 37 Gráfico 3: Avaliação do infiltrado linfocitário intratumoral em CHCs originados em fígados cirróticos 42 Gráfico 4: Avaliação do infiltrado linfocitário intratumoral em CHCs originados em fígados não cirróticos 43 Gráfico 5: Comparativo da contagem dos subtipos de linfócitos do ILT em CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos 45 Gráfico 6: Taxa de incidência/detecção de hepatites virais segundo agente etiológico e ano de notificação 49 Gráfico 7: Taxa de detecção de hepatite C segundo sexo, razão de sexos e ano de notificação. Brasil, 2002 a 2015 50 Tabela 1: Sumário dos aspectos clínicos da amostra 38 Tabela 2: Fatores de risco para CHC e achados do parênquima peritumoral no grupo 2 (14 entre 20 casos de CHC
originados em fígados não cirróticos) 39 Tabela 3: Relação entre subtipos de linfócitos do ILT e tamanho do tumor (correlação de Spearman) 46
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CHC: Carcinoma Hepatocelular
DHGNA: Doença Hepática Gordurosa Não-Alcoólica
DAB: Diaminobenzidina
DM: Diabetes Mellitus
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
DP: Desvio-Padrão
EHNA: Esteato-Hepatite Não Alcoólica
FCM: Faculdade de Ciências Médicas
FD: Focos Displásicos
FDA: Food and Drug Administration
FRSM: Fator de Risco para Síndrome Metabólica
HAS: Hipertensão Arterial Sistêmica
HDL: High Density Lipoprotein
HE: Hematoxilina-Eosina
ILT: Infiltrado Linfocitário Tumoral
IL-2: Interleucina 2
IL-4: Interleucina 4
IL-6: Interleucina 6
IL-10: Interleucina 10
LDL: Low Density Lipoprotein
µm: Micrômetro
ND: Nódulos Displásicos
NIH: National Institute of Health
PBS: Phosphate Buffer Saline
PKB: Protein Kinase B
SM: Síndrome Metabólica
Treg: Célula T reguladora
TMA: Tissue Microarrays
TNF-α: Fator de Necrose Tumoral-α
UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas
VHB: Vírus da Hepatite B
VHC: Vírus da Hepatite C
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO 14
1.1. Aspectos epidemiológicos 14
1.2. Hepatocarcinogênese 15
1.3. Microambiente e imunoedição tumoral 19
1.4. Infiltrado linfocitário associado ao CHC 25
2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO 29
3. OBJETIVOS 30
4. MATERIAIS E MÉTODOS 31
4.1. Desenho do estudo e casuística 31
4.2. Tissue microarrays 31
4.3. Critérios de exclusão 32
4.4. Reações imuno-histoquímicas 32
4.5. Análise das reações imuno-histoquímicas 33
4.5.1. Análise qualitativa 33
4.5.2. Captura de imagens e análise quantitativa 33
4.5.3. Metodologia estatística 34
4.6. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa 35
5. RESULTADOS 36
5.1. Aspectos clínicos 36
5.2. Achados anatomopatológicos 38
5.2.1. Aspectos macro e microscópicos 38
5.2.2. Achados imuno-histoquímicos 40
5.2.3. Correlação entre achados imuno-histoquímicos e 45
aspectos morfológicos
6. DISCUSSÃO 47
7. CONCLUSÕES 51
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52
9. ANEXOS 60
9.1. Anexo 1: Protocolo de realização da técnica imuno-histoquímica 60
do Laboratório de Imuno-histoquímica da Pós-graduação
do Departamento de Anatomia Patológica da Unicamp
9.2. Anexo 2: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da 62
Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP
14
INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos epidemiológicos
O câncer primário do fígado é a sexta neoplasia maligna mais frequente e
a segunda maior causa de morte por câncer no mundo. O carcinoma hepatocelular
(CHC) é o tipo histológico mais frequente e corresponde a 80% dos tumores
malignos primários do fígado. A incidência do CHC é bastante variável, sendo que
as mais altas taxas de incidência estão na Ásia e na África. Cerca de 75% dos
cânceres hepáticos ocorrem na Ásia, sendo a China o país com mais de 50% dos
casos do mundo (1). Em estudos epidemiológicos internacionais, o Brasil é
considerado um país de prevalência baixa a intermediária de CHC, e, segundo
dados nacionais, esse tumor não figura entre as dez neoplasias mais frequentes em
nosso país (2). Os estados brasileiros que registram as maiores incidências de CHC
são Bahia e Espírito Santo (3).
O desenvolvimento do CHC depende, dentre outros, de fatores
ambientais e socioeconômicos, sendo que as variações de incidência nas diferentes
regiões geográficas no mundo estão relacionadas à exposição a diversos fatores de
risco que causam agressão hepática crônica e a diferentes vias moleculares
associadas à carcinogênese hepática.
Nos países da África subsaariana e sudeste da Ásia, observam-se altos
índices de infecção pelo vírus da hepatite B (VHB), colocando essa forma de
hepatite na posição de causa mais comum de CHC, responsável por estimados 54%
dos casos desse tipo tumor em todo mundo (4).
No mundo ocidental e no Japão, prevalece a infecção pelo vírus da
hepatite C (VHC), que é o segundo maior fator de risco para o desenvolvimento do
CHC, responsável por cerca de 10-25% de todos os casos de CHC no mundo (4).
Taxas de incidência específicas por idade diferem significativamente entre
regiões no mundo, e há maior prevalência masculina no desenvolvimento de
CHC(1).
No Brasil, assim como na maioria do mundo ocidental, VHC é o principal
agente causador de hepatite crônica, cirrose e CHC. Dados publicados por Carrilho
15
et al. (5) relataram que, nas regiões Sul e Sudeste, a infecção pelo VHC
correlaciona-se com mais de 55% dos casos de CHC. Nas regiões Norte e Nordeste,
embora o VHC fosse a principal causa do CHC, ele correspondeu a menos da
metade dos casos, e a segunda causa mais frequente, o VHB, tinha prevalência
proporcionalmente mais alta do que nas regiões Sul e Sudeste (22-25%). No Centro-
Oeste brasileiro, a infecção pelo VHB foi identificada como a etiologia mais comum,
correspondendo a 40% dos casos, seguido do VHC (30%).
Embora seja incomum, o CHC pode se originar em fígado não cirrótico. A
proporção desses casos varia entre 7% e 54% em diferentes regiões geográficas, e
essa variação certamente está associada a diferentes fatores de risco para a
hepatocarcinogênese (6,7). No Ocidente, entre 15 e 20% dos CHCs são
diagnosticados em fígados não cirróticos. Nesses casos, o CHC tem uma
distribuição por faixa etária bimodal, com picos na 2ª e na 7ª década de vida (8). No
primeiro pico, há um equilíbrio na incidência da doença entre homens e mulheres,
sendo que esse grupo inclui grande parte dos carcinomas hepatocelulares
fibrolamelares, uma variante rara de CHC que ocorre quase que exclusivamente em
fígados não cirróticos de pacientes com idade inferior a 40 anos (6). No segundo
pico, encontram-se, principalmente, os portadores de hepatites virais, dada a
elevada prevalência de infecção por VHB e VHC em regiões específicas do mundo.
Contudo, o crescimento mundial alarmante das taxas de obesidade, diabetes
mellitus (DM) do tipo 2 e síndrome metabólica (SM) tem incluído cada vez mais
nesse grupo pacientes portadores de doença hepática gordurosa não alcoólica
(DHGNA) decorrente desses distúrbios, mesmo na ausência de cirrose (9). O típico
paciente portador de esteato-hepatite não alcoólica (EHNA) sem cirrose associada
que se apresenta com CHC é um indivíduo do sexo masculino, de faixa etária mais
elevada e que preenche critérios para um ou mais achados da SM (10).
1.2. Hepatocarcinogênese
A extensa heterogeneidade de alterações genéticas e epigenéticas
presentes nos CHCs, associada à incidência relativamente baixa de cada uma delas,
sugere que lesões hepáticas pré-malignas e CHC sejam consequências de
alterações que comprometam mais de uma via regulatória.
16
Já foram demonstradas alterações em mais de onze vias moleculares
diferentes em CHCs, sugerindo que existem múltiplas rotas de iniciação e
progressão para esta neoplasia (11). As vias mais comumente mutadas no CHC são
as vias Wnt/β catenina, Hedgehog, p53 e a JAK/STAT-dependentes (12).
O maior fator de risco para o desenvolvimento de CHC é a cirrose
hepática que se desenvolve por agressão hepática crônica, como ocorre nas
hepatites virais B e C, obesidade, doença alcoólica, DHGNA, hemocromatose e ação
de compostos tóxicos como as aflatoxinas (4).
O microambiente do fígado cirrótico pode ativar vias oncogênicas através
de múltiplos mecanismos. Em primeiro lugar, o comprometimento do fluxo sanguíneo
associado à cirrose prejudica a resposta imune e induz a um fenótipo mais
tolerogênico das células imunes residentes e do infiltrado inflamatório. Isso não
apenas inibe o clearance dos vírus das hepatites crônicas, prolongando, assim, a
inflamação hepática, como também permite que hepatócitos pré-neoplásicos
escapem da imunovigilância. A redução da distribuição de oxigênio e nutrientes para
os hepatócitos desencadeia, ainda, agressões metabólicas e oxidativas que causam
inflamação cíclica, necrose, regeneração compensatória e um turnover aumentado
de hepatócitos que, no decorrer de muitos anos, leva ao acúmulo de erros genéticos
e mutações, como mutações de ponto, deleções nos genes TP53, AXIN1 e
CTNNB1, assim como leva à ativação de proto-oncogens como RAS-MAPK e β-
catenina, resultando na formação de populações monoclonais de hepatócitos
displásicos (4). Vale lembrar ainda que células estromais modificadas produzem
sinais pró-oncogênicos para os hepatócitos, como a liberação de TGF-β (12).
O CHC associado aos seus principais fatores causais (VHB e VHC)
usualmente apresenta mutações e transcrições alteradas em várias vias
moleculares, que causam, por exemplo, desregulação no ciclo celular, ativação da
via da PKB (protein kinase B) ou AKT e inativação da via AXIN1 (12).
A base estrutural genômica do VHB é uma molécula de DNA circular. Nas
infecções crônicas, a integração do DNA do VHB ao genoma do hospedeiro induz
nesse uma ampla variedade de alterações genéticas, incluindo deleções
cromossômicas, translocações, fusão de transcritos, amplificação do DNA celular e
instabilidade cromossômica generalizada (13), que levam ao descontrole da
proliferação celular. A integração do DNA viral ao genoma do hepatócito pode
também codificar produtos, como a proteína HBx, que leva ao desenvolvimento de
17
CHC por meio de uma grande variedade de mecanismos, como ativação ou
inativação de vias de sinalização, redução ou inibição de vias de reparo do DNA,
indução de vias de stress oxidativo, inibição de vias apoptóticas, mutações genéticas
e eventos epigenéticos, como metilações e acetilações (14).
O VHC é um vírus RNA monofilamentar que tende a causar infecção
crônica em 70-80% dos indivíduos, enquanto o VHB induz cronicidade em apenas
10% dos indivíduos infectados (4). Cerca de 20% dos indivíduos persistentemente
infectados pelo VHC desenvolverão cirrose hepática no prazo de 20 a 30 anos, e,
uma vez estabelecida a cirrose, o risco de desenvolvimento de CHC é de 1-6% ao
ano (12). A carcinogênese do VHC é mediada por fatores induzidos pelo próprio
vírus e pela resposta imunológica do hospedeiro. Sua ação não envolve integração
com o genoma da célula hospedeira (4). A infecção crônica por VHC induz uma
reação imune persistentemente ativada e direcionada para os hepatócitos infectados
pelo próprio vírus. Em adição a essa inflamação crônica, o VHC causa alterações
maciças nos hepatócitos infectados, incluindo reprogramação metabólica, resposta
prolongada ao estresse, produção de radicais livres e alterações em importantes
vias de sinalização (12). Estudos atuais demonstram que proteínas virais
específicas, como as proteínas core, NS3, NS4B e NS5A, atuam como agentes
importantes na hepatocarcinogênese viral. A proteína core, por exemplo, altera a via
de sinalização MAPK, afetando a proliferação celular (4), bem como altera a
homeostase de lipídios no parênquima hepático, o que resulta na esteatose típica da
hepatite induzida por esse vírus, e que está associada a um risco aumentado de
desenvolvimento de CHC (12). A proteína NS5A inibe a via do P53 que afeta o ciclo
celular, a proliferação celular e mecanismos antitumor (4).
A infecção crônica por VHC ou VHB também é o principal fator de risco
para o desenvolvimento de CHC em fígados não cirróticos (6). Ambos os vírus são
capazes de ativar a carcinogênese hepática, independentemente do
desenvolvimento de cirrose (6,15). Na infecção por VHB, a integração do genoma do
vírus pode levar a microdeleções no DNA do hospedeiro e a proteína genotóxica
HBx pode alterar a atividade transcricional por modificar a expressão de vários
genes controladores do crescimento (6). Além disso, há evidências de que o
acúmulo de mutações no core basal promotor do vírus e a elevada carga viral (104-5
cópias/ml) são fatores preditores de desenvolvimento de CHC, mesmo na ausência
de cirrose (16).
18
Na infecção por VHC, acredita-se que o surgimento do CHC deva-se mais
ao processo necroinflamatório mantido nos pacientes cronicamente infectados do
que ao potencial oncogênico direto do vírus (6). Um grupo de pacientes com hepatite
crônica por VHC sem cirrose hepática que sabidamente apresenta risco aumentado
para o desenvolvimento de CHC é aquele de indivíduos que alcançaram resposta
viral sustentada após o uso de terapia antiviral. Sabe-se que as principais terapias
(interferon/ribavirina) para hepatite C crônica reduzem consideravelmente, mas não
anulam o risco de CHC nesses pacientes. Estudo recente de El-Serag HB et al.
relata um risco relativamente alto (0,33% ao ano) de surgimento de CHC em
pacientes curados de hepatite do pelo VHC (17). Alguns CHCs se desenvolvem
mesmo em pacientes com discreta fibrose hepática, vários anos após a resposta
viral sustentada. Há evidências de que nesses pacientes o diabetes mellitus (DM) e
a elevado índice FIB4 são importantes fatores de risco que sobrepostos, concorrem
para o desenvolvimento de CHC (18).
Quanto ao CHC associado à DHGNA, a maioria dos casos ocorre em
fígado cirrótico que provê um forte ambiente tumorigênico. Contudo, o CHC pode
complicar a DHGNA com fibrose mínima ou ausente (19). A patogênese do CHC em
fígados não cirróticos associado à DHGNA é distinta do CHC em fígado cirrótico,
pois a SM, a obesidade e a resistência à insulina dão suporte a uma série de
mecanismos únicos que promovem a tumorigênese. A resistência à insulina
associada à SM, DHGNA e DM leva à liberação de várias citocinas pró-inflamatórias,
incluindo fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 6 (IL-6), leptina e resistina,
além de reduzir os níveis de adiponectina. Esse conjunto de fatores favorece o
desenvolvimento de esteatose e inflamação hepática que precedem o
desenvolvimento de CHC (10).
O desenvolvimento de CHC na ausência de cirrose também pode estar
associado à exposição a agentes genotóxicos (toxinas, carcinógenos químicos
industriais, elementos radioativos, sobrecarga de ferro), doenças hereditárias
metabólicas (hemocromatose hereditária, deficiência de alfa-1-antitripsina,
glicogenose do tipo I), doenças congênitas como síndrome de Alagille e fibrose
hepática congênita, uso de hormônios sexuais (esteroides anabolizantes) e
transformação maligna de adenoma hepático (6,8).
19
1.3. Microambiente e imunoedição tumoral
Como exposto, as alterações genéticas, fundamentais para o
desenvolvimento de neoplasias, podem resultar da ação de fatores extrínsecos
como agentes infecciosos, agentes químicos, radiação e de fatores intrínsecos como
mutações genéticas herdadas ou erros aleatórios de replicação de DNA. A
tumorigênese é um processo de múltiplas etapas e essas etapas refletem alterações
genéticas que determinam a transformação progressiva das células envolvidas em
derivados neoplásicos malignos. Usualmente, ocorre uma série de mutações
genéticas que influenciarão na proliferação, diferenciação e morte celular. Hanahan
e Weinberg (20,21) propuseram uma série de alterações celulares elementares para
o surgimento de uma neoplasia, quais sejam: autossuficiência em sinais de
proliferação, insensibilidade a sinais antiproliferativos, capacidade de evasão da
apoptose, potencial replicativo ilimitado, angiogênese sustentada e capacidade de
invasão tecidual e metástase. Cada capacidade adquirida através de diferentes vias
moleculares representa uma estratégia de evasão dos diversos mecanismos
existentes contra o desenvolvimento tumoral, que envolvem não apenas as células
neoplásicas propriamente ditas, mas também outras células do ambiente em que
essas estão inseridas e células recrutadas para agir localmente. Desse modo, um
tumor maligno não se constitui apenas de uma massa de células neoplásicas
proliferadas, mas de um tecido complexo formado por diferentes tipos de células que
interagem entre si (20,22). O conjunto formado por células neoplásicas, vasos
sanguíneos e linfáticos, fibroblastos, pericitos, adipócitos e células do sistema imune
formam o microambiente tumoral (Figura 1). Um número crescente de estudos (23-
27) tem demonstrado que essas células não neoplásicas têm importante
participação em diversos processos de progressão tumoral, induzidas pelas células
neoplásicas que passam a determinar, nesse caso, uma nova dinâmica tecidual.
Dentre as células não tumorais desse microambiente, destaca-se o papel das
células do sistema imune e seus produtos, no desenvolvimento e progressão das
neoplasias malignas.
A iniciação causada por carcinógenos químicos ou virais envolve
alterações no DNA que são irreversíveis e podem permanecer indefinidamente no
tecido normal até a ocorrência de um segundo evento estimulador (promoção),
resultante da ação de agentes como: irritantes químicos, fatores liberados no local
20
da agressão, hormônios e inflamação. Muitos promotores induzem direta ou
indiretamente a proliferação celular, o recrutamento de células inflamatórias e o
aumento de formas reativas de oxigênio que levam ao dano oxidativo e reduzem o
reparo do DNA (28). A conhecida relação causal entre inflamação e neoplasia foi
descrita por Virchow em 1863 (29) quando ele aventou que o câncer surgisse em
sítios de inflamação crônica, em parte baseado na hipótese de que algumas classes
de irritantes, juntamente com a agressão tecidual e inflamação que eles
desencadeiam, estimulariam a proliferação celular.
Figura 1: Representação esquemática do microambiente tumoral e seus constituintes celulares. Fonte: Balkwill FR et al.J Cell Sci. 2012;125(22).
Além do papel promotor que a inflamação tem na gênese de muitas
neoplasias, outra ação exercida pelo sistema imune, essa em frente oposta, é a de
reconhecer e eliminar tumores em desenvolvimento, mesmo na ausência de
21
tratamentos. Esse processo, chamado de imunovigilância tumoral, é um tópico
vigente desde 1909, quando Erlich propôs que células nascentes transformadas se
originam continuamente em nosso organismo e que o sistema imune as detecta e as
erradica, antes que elas se manifestem clinicamente (30). Na década de 1950, a
hipótese da imunovigilância foi formalmente postulada ao se atribuir à imunidade
celular adaptativa um papel na eliminação de células transformadas (31,32). Hoje,
sabe-se que antígenos tumorais distinguem as células neoplásicas das células
normais saudáveis e que esses antígenos geram estímulos imunológicos capazes
de destruir (33,34) ou selecionar células neoplásicas (30). Essas atividades,
aparentemente opostas do sistema imune, estão integradas na chamada
imunoedição tumoral, que em sua manifestação mais completa é composta de três
fases sequenciais de eliminação, equilíbrio e escape tumoral (“os três Es”)
(30,35,36) (Figura 2).
A eliminação é uma interpretação mais moderna do antigo conceito de
imunovigilância em que as respostas imunes, inata e adaptativa, trabalham em
conjunto para detectar e destruir células transformadas, antes mesmo que elas se
tornem aparentes (37). Nessa fase, há completa obliteração das células tumorais por
linfócitos T (30). A fase de equilíbrio corresponde à fase subsequente, em que
variantes de células tumorais não são eliminadas, em virtude de sua reduzida
antigenicidade. Essas células estão mais capacitadas a sobreviver em um
hospedeiro imunocompetente, o que explica o aparente paradoxo do
desenvolvimento de um tumor em indivíduos com o sistema imune preservado (30).
Essa fase é a mais longa e pode ocorrer no decorrer de muitos anos. Na fase final, a
fase de escape, as células tumorais desenvolvem estratégias de evasão dos
sistemas de detecção e destruição do sistema imune, que podem corresponder à
perda de antígenos tumorais, secreção de citocinas inibidoras ou downregulation de
moléculas do complexo de histocompatibilidade maior (38). É nessa fase que a
neoplasia torna-se clinicamente aparente (37).
22
Figura 2: O conceito da imunoedição tumoral. Fonte: Schreiber et al. Science. 2011;331(6024):1565-70 (36). Legenda:CTLA-4: antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico, DC: célula dendrítica, IDO: idoleamina 2,3 dioxigenase, IFN-γ: interferon gama, IFN-α/ß: interferon alfa/beta, IL-6: interleucina 6, IL-10: interleucina 10, IL-12: interleucina 12, MDSC: células supressoras de linhagem mieloide, MHC: complexo principal de histocompatibilidade, Mø: macrófago, NK: célula natural killer, NKG2D: ligante da célula natural killer do grupo 2D, NKR: receptor de célula natural killer, NKT: célula T natural killer, PD-1: proteína de morte celular programada 1, PDL-1: ligante de proteína de morte celular programada do tipo 1, TGF-ß: fator de transformação de crescimento beta, TNF: fator de necrose tumoral, Treg: célula T reguladora, TRAIL: ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral.
A tradução histológica da ação do sistema imune sobre células
neoplásicas está na presença de infiltrado linfocitário tumoral (ILT), e a mais forte
evidência da imunoedição tumoral vem de relatos que correlacionam quantidade,
qualidade e distribuição desse infiltrado com a sobrevida dos pacientes (39-45). No
23
ILT, linfócitos T CD8+ citotóxicos exercem papel central na defesa imune contra o
câncer. Eles agem diretamente sobre células tumorais, causando a lise da
membrana e morte celular, assim como a morte das células do estroma que
possuem antígenos cruzados e, por meio da ação de citocinas, impedem a formação
do estroma e levam à rejeição tumoral. Ao lado de outras células do sistema imune,
como as células natural killer, os linfócitos T CD8+ são células efetoras no controle
do crescimento tumoral e requerem a ação de linfócitos T auxiliares CD4+do tipo
TH1 para exercerem sua função em plenitude (46). A figura 3 detalha a interação de
integrantes do sistema imune e as células neoplásicas.
Do ponto de vista prático, a caracterização do ILT (composição,
distribuição e quantidade) tem sido vista como um fator promissor no sentido de
fornecer informações adicionais aos já consolidados parâmetros macro e
microscópicos usados no estadiamento das neoplasias malignas. Peculiaridades do
microambiente tumoral, como os aspectos do ILT, poderiam eventualmente explicar
a evolução clínica diferente de pacientes portadores de tumor com mesmo tipo
histológico e mesmo estadiamento anatomopatológico, assim como o desfecho ruim
de pacientes com tumores precoces.
24
Figura 3: Interações entre o microambiente imune e células tumorais. Adaptado de: Dushyanthen et al. BMC
Med. 2015;13:202 (44). A resposta imune antitumor é dependente da produção de IFN-γ pelos linfócitos CD4+
(Th1) que por sua vez medeiam a expansão, diferenciação e ativação de linfócitos T CD8+
tumor-específicos. Células T citotóxicas CD8
+ induzem a lise celular via reconhecimento de antígenos tumorais-associados como
MHC, FAS e TRAILR na superfície das células neoplásicas/APCs. Similarmente, células T CD4+ tem a
capacidade de reconhecer MHC II nas APCs. Como resultado da formação deste complexo (TCR-MHC/peptídeo), níveis elevados de granzimas, IFN𝛾 e perforina são liberados pelos linfócitos T CD8
+ citotóxicos,
resultando na exocitose de grânulos e morte células via apoptose. Células NK e NKT com ajuda de linfócitos T CD4 Th1 tem a capacidade de reconhecer e eliminar células tumorais. No ambiente pró-tumor, CTLA-4, TIM-3 e PD-1 liberam sinais inibitórios como resultado da anergia/exaustão de células T causada por sua ativação prolongada. O CTLA-4 regula negativamente as células T na fase de ativação. O PD-1 expresso pelas células T na fase efetora de resposta destas células se combina ao seu ligante PDL-1, expresso dentro do microambiente tumoral. Isso resulta na inibição da atividade de células T (apoptose). Linfócitos Treg FOXP3+ exercem um papel crítico durante a seleção de células T CD8
+ reduzindo sua funcionalidade. Linfócitos Treg também tem ação
inibidora sobre APCs, células T CD8+, NKs e células T CD4
+ Th1. Tanto células Tregs e células tumorais
produzem adenosina que tem efeitos inibidores sobre células T. Células tumorais podem secretar citocinas e quimiocinas (pex, TGFβ, CCL2) que recrutam e estimulam células supressivas como Tregs, MDSCs e macrófagos M2. Macrófagos M2 e MDSCs inibem respostas de células T através do sequestro de nutrientes via geração de arginase, ROS e NOS, bem como pela interferência com o trânsito dentro do sítio tumoral. O upregulation de enzimas supressivas como IDO e arginase, cataboliza nutrientes essenciais requeridos para a ativação de células efetoras. Além disso, as células tumorais regulam negativamente a expressão de moléculas MHC, perdem a expressão de moléculas antigênicas e aumentam a expressão de moléculas inibidoras como PD-L1, levando à inibição do reconhecimento imune, permitindo o escape a progressão do câncer. Legenda: AMP: monofosfato de adenosina, ADP: difosfato de adenosina, APC: célula apresentadora de antígeno, ATP: trifosfato de adenosina, CCL-2: ligante 2 de quimiocina, CTLA-4: antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico, GAL-9: galectina 9, IDO: idoleamina 2,3 dioxigenase, IFN-γ: interferon gama, IL: interleucina, MDSC: células supressoras de linhagem mieloide, MHC: MHC: complexo principal de histocompatibilidade; NK: célula natural killer, NKT: célula T natural killer, NOS: óxido nítrico sintetase, PD-1: proteína de morte celular programada, PDL-1: ligante de proteína de morte celular programada do tipo 1, TCR: receptor de célula T, TRAIL: ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral, Treg: célula T reguladora, ROS: espécies reativas de oxigênio.
25
1.4. Infiltrado linfocitário associado ao CHC
Dados da literatura mostram que, em paralelo a uma série de trabalhos
que investigavam a relação entre o prognóstico de pacientes portadores de câncer e
seu estado imunológico via imunocompetência de seus linfócitos periféricos, muitos
estudos passaram a pesquisar a associação entre prognóstico e infiltração de
células mononucleares no tecido tumoral. Evidências crescentes constataram que os
linfócitos com a atividade antitumor mais potente se encontram dentro do próprio
sítio de crescimento neoplásico (47).
Como regra geral, os tumores sólidos são comumente infiltrados por
células do sistema imune, quais sejam linfócitos B e T, células NK, células NK-T,
células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e mastócitos. Linfócitos T
CD8+ são células essenciais na ação do sistema imune contra o câncer. No CHC, a
presença de linfócitos T CD8+ capazes de reconhecer epítopos tumorais já foi
observada (48). Essas células agem através de contato direto com as células
neoplásicas, causando a morte delas pela liberação de grânulos que causam a lise
da membrana citoplasmática, como perforina e granzima, assim como causam a
morte de células do estroma que apresentam antígenos cruzados com as células
tumorais (49). Além disso, citocinas liberadas pelos linfócitos T CD8+, incluindo
TNFα, IL-4 e IL10, contribuem para a rejeição tumoral por inibir a formação do
estroma tumoral (49).
Assim como já demonstrado em cânceres de ovário, pulmão, mama,
cólon-reto e melanoma (50-55), a presença de ILT proeminente associado ao CHC
está relacionada a um melhor prognóstico dos pacientes (56-64).
Em 1992, Kawata et al. cultivaram linfócitos isolados de infiltrado
associado a 17 CHCs de humanos e, posteriormente, demonstraram citotoxicidade
aumentada dessas células sobre células alogênicas da linhagem do CHC (65).
Nesse estudo experimental, a quantidade inicial de ILT por unidade de peso de
tumor foi maior no grupo de pacientes com melhor prognóstico, demonstrando que
ILT mais intenso parecia ser um marcador de evolução clínica melhor.
Na esteira dos estudos experimentais in vitro, seguiu-se uma série de
outros estudos em produtos de biópsia e ressecção tumoral, com o intuito de avaliar
a possível associação do prognóstico do CHC com a presença de ILT. Numa época
em que a maioria dos estudos acerca de fatores prognósticos do CHC enfatizava
26
parâmetros clínicos e poucos examinavam parâmetros anatomopatológicos em
detalhe, Ng IO et al. publicaram, em 1995, uma análise multivariada com ênfase em
aspectos patológicos de 278 pacientes submetidos hepatectomia para tratamento de
CHC primário (66). Nesse estudo, 20 parâmetros anatomopatológicos, incluindo a
análise quantitativa de infiltrado linfocitário tumoral, foram correlacionados com
dados da sobrevida dos pacientes e, dentre eles, encapsulamento e intenso ILT
estavam significativamente associados à taxa mais baixa de recorrência, enquanto
margens de ressecção negativa e intenso ILT foram fatores significativamente
associados a maior tempo de sobrevida dos pacientes.
Muitos estudos experimentais in vitro e trabalhos que usaram exame
imuno-histoquímico e/ou citometria de fluxo em espécimes cirúrgicos de variadas
neoplasias para análise qualitativa dos infiltrados atestam que o efeito antitumor do
ILT se dá, principalmente, via imunidade celular pela ação de linfócitos T e,
parcialmente, pela imunidade humoral, conferida pelos linfócitos B dos folículos
linfoides formados, assim como pela ação de citocinas produzidas pelas próprias
células tumorais (61). O mesmo se dá no caso do CHC. Sendo assim, a
caracterização do infiltrado de células T, determinando intensidade, distribuição nos
tumores (se agride as células tumorais, se é estromal ou se localiza na periferia da
neoplasia), distribuição no parênquima não neoplásico e seu imunofenótipo, é um
tema muito relevante na literatura atual sobre CHC.
Wada et al. (61) examinaram o produto de ressecção de 11 CHCs (6 em
fígados cirróticos e 5 em fígados não cirróticos) com menos de 3 cm de diâmetro e
marcado ILT em pacientes com sorologia positiva para VHC. Nesse estudo
quantitativo, o número de linfócitos foi contado em 10 áreas de 0,25 mm2 em
aumento de 400X e expresso em números absolutos. O conjunto da análise
quantitativa e qualitativa demonstrou que a maioria dos linfócitos do infiltrado era T e
que linfócitos B estavam localizados em folículos. Notou-se uma tendência de maior
contagem de linfócitos T CD8+ em relação aos linfócitos T CD4+, mas sem diferença
significativa (linfócitos T CD8+: 43,5±15,1; linfócitos T CD4+: 33,4±9,3; p= 0,735). A
análise clinicopatológica comparativa entre esses casos, e mais de uma centena de
casos do grupo-controle de CHCs sem ILT proeminente e sorologia positiva para
VHC, revelou que a taxa de recorrência foi significativamente maior no grupo
controle (47,5% contra 9,1%) e a taxa de sobrevida em 5 anos foi de 100% entre os
pacientes com marcado ILT e de 68,1% no grupo-controle.
27
Gal et al. (59) avaliaram, através de exame imuno-histoquímico, o ILT em
CHCs de 302 pacientes dispostos em tissue microarrays (TMAs). A contagem das
células linfoides foi feita em cinco campos microscópicos de 400X contendo infiltrado
linfocitário mais denso e o resultado expresso como a média do número de células
(± desvio-padrão) por campo de grande aumento (400X). Eles demonstraram que,
dentro da população de linfócitos CD3+, a quantidade de linfócitos T CD4+ era
significativamente mais alta nos TILs do que no infiltrado linfocitário presente no
tecido não neoplásico peritumoral. Por outro lado, a porcentagem de linfócitos T
CD8+ estava reduzida no ILT. Guo et al. (64) e Pang et al. (67) relataram resultados
semelhantes. Nesses estudos também foi avaliada a presença dos linfócitos T
reguladores (células Treg), subgrupo de linfócitos T CD4+ com função supressora,
caracterizada pela expressão da cadeia α do receptor de IL2 (CD25) e do fator de
transcrição regular FoxP3. As células Treg inibem a proliferação e a função de
muitos tipos diferentes de células do sistema imune, como linfócitos T CD8+, além de
linfócitos T CD4+, células NK, células NKT, células B, células dendríticas e
monócitos/macrófagos (62). Gal et al. e Guo et al. evidenciaram que o número
aumentado de Treg no ILT associado ao CHC está relacionado com a redução do
número de linfócitos T CD8+, o que resulta em supressão da imunidade antitumor
efetiva e progressão da neoplasia (68).
Unitt et al. (46) avaliaram 69 explantes de pacientes submetidos a
transplante hepático por CHC associado a diferentes hepatopatias e demonstraram
que a presença de ILT e a elevada proporção entre linfócitos T CD4+:CD8+ em
particular estavam associadas com risco reduzido de recorrência tumoral após o
transplante. Uma explicação possível para esse achado é a de que linfócitos T CD8+
dependem de linfócitos T helper CD4+ para obterem seu efeito máximo. Outra
possibilidade é a existência de linfócitos T CD8+ funcionalmente deficientes, que, por
exemplo, têm capacidade reduzida de expressar as proteínas indutoras de apoptose
perforina e granzima B, necessitando de uma forte resposta de linfócitos T helper
CD4+ para superar esses defeitos.
No estudo desenvolvido por An et al. (49), fez-se uma avaliação da
intensidade e distribuição dos linfócitos T CD4+ e CD8+ no parênquima e no estroma
de 86 casos de CHC em fígados cirróticos e não cirróticos. Para esse estudo, foram
selecionadas, de cada caso, áreas representativas do ILT associado ao CHC e
tecido peritumoral que, retiradas com punch de 3 mm, foram usadas para a
28
confecção de TMAs. A contagem dos linfócitos foi feita em 5 hot spots e os
resultados expressos em número médio de linfócitos T (CD4+ e CD8+). O número
médio de linfócitos T (CD4+ e CD8+) no estroma tumoral estava significativamente
aumentado em relação ao número dessas células no parênquima tumoral; além
disso, detectou-se um número médio de linfócitos T CD8+ no estroma e no
parênquima tumoral, significativamente mais alto do que linfócitos T CD4+. Vale
ressaltar que o número médio de linfócitos T CD8+ no estroma e no parênquima era
significativamente mais alto em tumores com diâmetro ≤ 5,0 cm de diâmetro do que
em tumores com diâmetro > 5,0 cm, sugerindo que as células T CD8+ que infiltram
estroma e parênquima tumoral possam estar envolvidas no controle do tamanho da
neoplasia.
A avaliação de 65 pacientes portadores de CHC submetidos à ressecção
primária, realizada por Gabrielson et al (45), demonstrou que apenas 15% dos
pacientes que apresentavam elevada densidade de linfócitos T CD8+ no interior e
nas bordas infiltrativas do tumor apresentaram recorrência do tumor, contra 45%
daqueles com baixa densidade de células T CD8+.
Em suma, os achados dos estudos do ILT em CHC são semelhantes aos
que já foram observados em outras neoplasias malignas, como cânceres de mama,
trato gastrointestinal, ovário, pulmão e melanoma: a presença de ILT é um fator
prognóstico positivo (56-64), destacando-se o papel importante exercido pelas
células T CD8+, por seu efeito citotóxico direto sobre as células neoplásicas.
Ressalta-se dessa revisão da literatura que grande parte dos estudos já
publicados sobre esse tema incluem, em sua casuística, casos de CHCs originados
em fígados cirróticos e CHCs originados em fígados não cirróticos (45,59,61,64).
Contudo, não existem trabalhos que comparam as características do ILT nessas
duas subpopulações.
29
2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
Não existem relatos da comparação do ILT presente em CHCs originados
em fígados cirróticos e não cirróticos. A maioria dos estudos tem se dedicado a fazer
análises qualitativas e quantitativas do ILT em CHCs originados em fígados
cirróticos. Os CHCs originados em fígados não cirróticos são bem menos frequentes
e ora se constituem em uma população menor nos grupos de estudo.
O papel do ILT no controle e erradicação das neoplasias malignas é um
tema muito atual em oncologia, e os avanços dos estudos sobre esse tema em
relação aos CHCs, em geral, ainda estão em progressão. O conhecimento crescente
sobre a interação entre sistema imune e células neoplásicas do CHC é muito
relevante, pois fornece substrato para a instituição de novas modalidades
terapêuticas para esse tumor que tem opções de tratamento limitadas, sobretudo
para os pacientes com doença avançada.
CHCs originados em fígados não cirróticos são incomuns, e as hepatites
virais são importantes fatores de risco para essa neoplasia. Contudo, a epidemia de
obesidade e síndrome metabólica, que atualmente atinge todo o mundo, tem
elevado não só a prevalência e a incidência da doença hepática gordurosa não
alcoólica do fígado, mas também tem aumentado a incidência desta neoplasia. Há
que se confirmar se esses também são os principais fatores de risco para essa
doença em nosso meio.
30
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral: Avaliar, através de exame imuno-histoquímico, o infiltrado
linfocitário tumoral presente em CHCs originados em fígados cirróticos e não
cirróticos.
3.2. Objetivos específicos:
Avaliar as características imunofenotípicas do infiltrado linfocitário tumoral em
CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos;
Determinar a intensidade das subpopulações de linfócitos presentes no
infiltrado linfocitário tumoral nos dois grupos de CHCs: originados em fígados
cirróticos e não cirróticos;
Comparar as características (intensidade e imunofenótipo) do infiltrado
linfocitário tumoral em CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos;
Correlacionar as características do infiltrado linfocitário tumoral (intensidade e
imunofenótipo) com aspectos morfológicos relacionados ao prognóstico
(graduação histológica, tamanho do tumor e presença de êmbolos
neoplásicos), em CHCs originados em fígados cirróticos e não cirróticos;
Definir possíveis fatores etiológicos associados aos CHCs originados em
fígados não cirróticos e as eventuais alterações histológicas presentes no
parênquima não neoplásico deste subgrupo de tumores.
31
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Desenho do estudo e casuística
Foi realizado um estudo retrospectivo utilizando-se os arquivos de
biópsias do Departamento de Anatomia Patológica da Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP) no período de 2010 a 2014.
A partir de 2014, foram selecionados retrospectivamente 20 casos
consecutivos de CHC clássico oriundos de fígados sem cirrose e o mesmo número
de casos de CHC clássico em fígados cirróticos, provenientes de produtos de
ressecção cirúrgica: nodulectomia, hepatectomia total (explante) ou parcial,
independentemente de fator etiológico, sexo, cor, idade ou grupo étnico. De cada
caso, foi selecionado um bloco de parafina.
Tais casos foram divididos em dois grupos:
- Grupo 1: vinte (20) casos de pacientes com carcinoma hepatocelular e
cirrose;
- Grupo 2: vinte (20) casos de pacientes com carcinoma hepatocelular
sem cirrose.
As informações clínicas e características macroscópicas dos casos foram
adquiridas nos prontuários dos pacientes e nos laudos anatomopatológicos. A
graduação histológica dos tumores foi feita de acordo com o sistema de graduação
de Edmondson e Steiner (AJCC Cancer Staging Manual, 8ª edição)(69).
4.2. Tissue microarrays
De cada caso, realizou-se a punção do bloco de parafina correspondente
com um punch de 3 mm, e os cilindros obtidos foram transferidos para blocos de
parafina receptores que aprupavam: tissue microarray 1 (TMA 1), CHCs em fígados
cirróticos e tissue microarray 2 (TMA 2), CHCs em fígados não cirróticos. Os blocos
receptores de TMA foram colocados na estufa para derretimento e fusão das
parafinas. Posteriormente, realizaram-se cortes histológicos de 4 µm de espessura
que, submetidos à coloração de hematoxilina-eosina (HE), foram analisados para
garantir a representatividade do ILT distante de áreas de necrose e/ou hemorragia.
32
4.3. Critérios de exclusão
Foram excluídos casos cujos materiais biológicos nos blocos de parafina
não apresentavam condições para o estudo, como amostras insuficientes, fixação
inadequada ou predomínio de necrose tumoral secundárias ou não à alcoolização ou
à quimioembolização prévia. Também foram excluídos casos de carcinoma
hepatocelular fibrolamelar, um subtipo de carcinoma hepatocelular que ocorre em
pacientes jovens sem cirrose, com características peculiares clínicas e morfológicas.
Este estudo também não incluiu nenhum caso de CHC linfoepitelioma-like, uma rara
forma de carcinoma indiferenciado do fígado com abundante infiltrado linfoide
associado (70) e que aparentemente tem melhor prognóstico (71).
4.4. Reações imuno-histoquímicas
Os materiais previamente fixados em formalina 10% e emblocados em
parafina foram submetidos a cortes histológicos de 4µm de espessura, colocados
em lâminas silanizadas e submetidos a exame imuno-histoquímico usando o sistema
de detecção Advance (DAKO), conforme protocolo do Laboratório de Imuno-
histoquímica da Pós-graduação do Departamento de Anatomia Patológica da
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) (vide anexo 1).
Foram utilizados os anticorpos primários CD20 (clone L26 Dako, diluição
1:300) para marcação dos linfócitos B, CD3 (clone F7.2.38 Dako; diluição 1:50) para
marcação dos linfócitos T, CD4 (clone 4B12 Dako; diluição 1:50) para marcação dos
linfócitos T CD4+ e CD8 (clone C8/144B Dako; diluição 1:50) para marcação dos
linfócitos T CD8+.
Para o controle das reações imuno-histoquímicas, utilizaram-se blocos de
parafina de tonsilas palatinas normais, concomitantemente submetidos a todo
procedimento acima descrito para os casos dos grupos de estudo.
33
4.5. Análise das reações imuno-histoquímicas
4.5.1. Análise qualitativa
Inicialmente, foi realizada uma leitura da reação imuno-histoquímica dos
quatro marcadores utilizados ao microscópico óptico, que foram considerados
positivos quando observada a expressão em membrana citoplasmática de linfócitos
intratumorais.
4.5.2. Captura de imagens e análise quantitativa
As lâminas dos TMAs foram digitalizadas no equipamento
AperioScanscope® AT Turbo(LeycaBiosystems). As áreas de interesse a serem
analisadas foram selecionadas no programa AperioImagescopev12.1.0.5029 (Aperio
Technologies, Inc). Para os 4 marcadores CD20, CD3, CD4, CD8, foram
selecionados, em maior aumento (X400), três (03) campos histológicos contendo
maior densidade de linfócitos positivos (hot spots). Cada hot spot foi fotografado e o
número absoluto de linfócitos tumorais positivos para cada marcador foi contado
com o auxílio do programa de processamento de imagens ImageJ® (ImageJ 1.51j8;
Java 1.8.0_122 64-bit) (Figura 4) desenvolvido pelo NIH (National Institute of Health)
e disponível em: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Posteriormente, calculou-se
o número médio de linfócitos tumorais positivos por campo de grande aumento
(X400).
34
Figura 4: Contagem do número de linfócitos T CD8
+ intratumorais por campo de grande aumento (X400) com o
programa de processamento de imagens ImageJ®.
4.5.3. Metodologia estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada com a colaboração de
profissional estatístico da FCM-UNICAMP.
Para descrever o perfil da amostra segundo as variáveis em estudo, foram
feitas tabelas descritivas das variáveis numéricas com valores de média, desvio
padrão, valores mínimo e máximo e mediana.
Para comparação das variáveis categóricas, utilizou-se o teste Qui-
quadrado e, quando necessário, o teste exato de Fisher.
Especificamente, para comparação do tamanho dos tumores, assim como
da contagem de células de cada subpopulação de linfócitos entre os dois grupos, foi
utilizado o teste de Mann-Whitney.
A análise comparativa da presença de êmbolos neoplásicos entre os
grupos 1 e 2 foi feita através do teste Qui-quadrado e a avaliação da relação entre a
35
quantidade de cada subtipo de linfócito, e a presença de êmbolos neoplásicos foi
feita através do teste de Mann-Whitney.
A relação entre a quantidade de cada subtipo de linfócito e o tamanho dos
tumores nos dois grupos foi analisada através da correlação de Spearman.
O estudo da relação entre a quantidade de cada subtipo de linfócito e o
grau histológico dos CHCs nos dois grupos foi feito através do teste de Kruskal-
Wallis/teste de Mann-Whitney.
A análise comparativa da quantidade de linfócitos T CD4+ e linfócitos T
CD4+ no grupo 2 foi feita com o teste de Wilcoxon para amostras pareadas.
O nível de significância adotado para este estudo foi de 5%.
Para a análise, foi utilizado o programa computacional The SAS System
for Windows (StatisticalAnalysis System), versão 9.4. SAS Institute Inc, 2002-2008,
Cary, NC, USA.
4.6. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade
de Ciências Médicas da UNICAMP – Plataforma Brasil, parecer número: 1.989.428
(Anexo 2).
Por se tratar de trabalho retrospectivo em material biológico proveniente
de arquivo de blocos de parafina, dispensou-se a utilização do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido.
36
5. RESULTADOS
5.1. Aspectos clínicos
Tanto no grupo de CHCs originados em fígados cirróticos (grupo 1)
quanto no grupo de CHCs originados em fígados não cirróticos (grupo 2), houve
predomínio absoluto de pacientes do sexo masculino (82,5%). Dentre os 20
pacientes portadores de CHCs originados em fígados cirróticos e 20 pacientes
portadores de CHCs originados em fígados não cirróticos, respectivamente 17 (85%)
e 16 (80%) eram homens. A idade dos pacientes variou entre 42 e 70 anos (média
de idade: 56,50 anos ± 7,45 DP) no grupo 1 e entre 31 e 77 anos (média de idade:
52,75 anos ± 13,55 DP) no grupo 2.
O grupo 1 era composto por 05 pacientes negros e 15 pacientes brancos
e o grupo 2, por 2 pacientes negros e 18 pacientes brancos.
No grupo 1, assim como o esperado para países ocidentais, o principal
fator etiológico associado à cirrose hepática foi infecção pelo VHC. Dezesseis
pacientes (80%) eram portadores de VHC e, dentre esses, 11 apresentavam uma ou
mais causas adicionais de hepatopatia crônica como infecção por VHB, etilismo e
fator(es) de risco para síndrome metabólica (SM). Dentre os quatro pacientes com
sorologias negativas, um apresentava hemossiderose hepática, dois eram etilistas e
um era etilista e apresentava ainda um fator de risco para síndrome metabólica
(FRSM) (gráfico 1).
Legenda: VHC= vírus da hepatite C, VHB= vírus da hepatite B, FRSM= fator de risco para síndrome metabólica
25%
5%
5% 25%
20%
5% 10% 5%
Gráfico 1: Fatores etiológicos associados aos CHCs originados em fígados cirróticos
VHC
VHC+VHB
VHC+VHB+Etilismo
VHC+Etilismo
VHC+Etilismo+FRSM
Hemossiderose
Etilismo
Etilismo+FRSM
37
No grupo 2, um número significativo de pacientes, 13 (65%), apresentava
um ou mais fatores de risco para SM e, nesse subgrupo, 3 pacientes apresentavam
ainda outra(s) causa(s) associada(s) ao desenvolvimento de CHC (porfiria em um
caso, etilismo em outro caso, VHC e etilismo no terceiro caso). Quatro pacientes
eram etilistas (20%) e 3 pacientes (15%) eram etilistas e portadores de VHC (gráfico
2).
Legenda: FRSM= fator de risco para síndrome metabólica, HAS= hipertensão arterial sistêmica, VHC= vírus da
hepatite C.
Os dados clínicos referentes aos dois grupos que compõem a amostra
estão sumarizados na tabela 1.
50%
5% 5% 5%
20%
15%
Gráfico 2: Fatores etiológicos associados aos CHCs originados em fígados não cirróticos
FRSM
FRSM+Etilismo
FRSM(HAS)+Etilismo+VHC
FRSM(DM2)+porfiria
Etilismo
Etilismo+VHC
38
Tabela 1. Sumário dos aspectos clínicos da amostra