universidade de cuiabá

UNIVERSIDADE DE CUIABÁ Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal

ANGELITA DOCIATTI STRITAL PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI-Toxoplasma gondi EM

POPULAÇÃO HOSPITALAR DE CÃES ATENDIDOS NO MUNICÍPIO DE CUIABÁ- MT

Cuiabá, 2015

ANGELITA DOCIATTI STRITAL

PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI-Toxoplasma gondi EM UMA POPULAÇÃO HOSPITALAR DE CÃES ATENDIDOS NO MUNICÍPIO DE

CUIABÁ-MT

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito para parcial para obtenção do título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Silvio Henrique de Freitas

Cuiabá, 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

Bibliotecária:

ANGELITA DOCIATTI STRITAL

PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI-Toxoplasma gondi EM UMA POPULAÇÃO HOSPITALAR DE CÃES,ATENDIDOS NO MUNICÍPIO DE

CUIABÁ-MT

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito para parcial para obtenção do título de Mestre. Orientador Prof. Dr. Silvio Henrique Freitas

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________ Prof. Dr. Silvio Henrique de Freitas (UNIC)

______________________________________________ Profa. Dra. Michelle Igarashi

(UFMT)

______________________________________________ Prof. Dr Alexandre Mendes Amude

(UNIC)

Cuiabá, 10 de Abril de 2015.

Conceito Final: _____________

RESUMO

STRITAL, D. A. PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI-Toxoplasma gondi EM UMA POPULAÇÃO HOSPITALAR DE CÃES ATENDIDOS NO MUNICÍPIO DE CUIABÁ-MT. 2015 Dissertação (Mestrado Biociência Animal) – Universidade de Cuiabá. A toxoplasmose é uma zoonose causada por um parasita coccídio intracelular obrigatório, de distribuição mundial denominado Toxoplasma gondii,. O gato doméstico (felis catus) e outros membros da família felidae são os únicos hospedeiros definitivos conhecidos enquanto que diversas espécies de mamíferos e aves são os hospedeiros intermediários. O objetivo deste trabalho foi identificar a prevalência de anticorpos anti-T. gondi em cães atendidos na rotina hospitalar do Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá. Analisaram-se 386 amostras de soro sanguíneo de cães pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Foram encontrados anticorpos anti-T. gondi em 26 cães (7%) com titulações que variaram de 1:16 e 1:4096. Somente as variáveis ingestão de vísceras, animais de origem rural e contato com bovinos apresentaram valores significativos com p<0,05. Os resultados indicam uma baixa prevalência em cães, contudo alto títulos de anticorpos em cães podem revelar infecções recentes e sintomatologia neurológicas como a convulsão. Palavras-chave:Toxoplasmose; Cães; Sorologia; Hospitalar.

ABSTRACT

LISTA DE TABELAS Tabela 1-Frequência de anticorpos Anti-Toxoplasma gondii em cães hospitalares do município de Cuiabá-MT e análise de associação com diferentes variáveis estudadas.................................................................................................................53

LISTA DE ABREVIATURAS SMF...................................Sistema mononuclear Fagocitico SNC...............................................Sistema Nervoso Central FCR...............................................Fluido Cefalo Raquidiano T.gondii....................................................Toxoplasma gondii.

LISTAS DE FIGURAS

Figura1:Taquizoíto ............................................................................... 23 Figura 2 Bradizoíto ....................................................................................................24 Figura 3 Oocisto.........................................................................................................27 Figura 4 Ciclo epidemiológico da Toxoplasmose.......................................................28

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................. 18 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Capitulo ɪ .............................................. 19 2.1 Histórico ........................................................................................ 20 2.2 Etiologia ........................................................................................ 20 2.3 Ciclo Evolutivo ............................................................................... 27 2.4 Epidemiologia ................................................................................ 29 2.5 Sintomatologia Canina .................................................................... 32 2.6 Diagnostico .................................................................................... 34 2.7 Tratamento .................................................................................... 36 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA...............................................................................38. 3.OBJETIVO... ..................................................................................... 46 3.1 OBJETIVO ESPECIFICOS ............................................................. 47 4. ARTIGO 1 Capitulo ɪɪ ....................................................................... 48 4.1 INTRODUÇÃO ................................................................................ 50 4.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 52 4.2.1 AMOSTRAS......................................................................................................53 4.2.2 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCENCIA..........................................................53 4.3 RESULTADOS.................................................................................54 4.4 DISCUSSÃO .................................................................................. 57 4.5 CONCLUSÃO ................................................................................. 57

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1. INTRODUÇÃO A toxoplasmose é causada pelo protozoário Toxoplasma gondii

(ETTINGER e FELDAMAN, 1997), trata-se de uma coccídiose dos felídeos e uma das parasitoses mais comuns que afetam os animais homeotérmicos em todo o mundo, inclusive o homem, constituindo uma importante zoonoses (LAGONI et al. 2001).

É um parasito de várias espécies animais, incluindo o homem, que se localiza intracelularmente em orgãos e tecidos provocando várias lesões patológicas e podendo, em alguns casos, levar a óbito. Os felídeos são importantes no ciclo de vida do T. gondii por serem hospedeiros definitivos e portanto os únicos que podem contaminar o meio ambiente com oocistos (DUBEY, 2004).

O T. gondii possui três estágios infectantes, podendo ser transmitido por meio de fezes (oocistos), pela via transplacentária (taquizoítos) e pelo carnivorismo (cistos com bradizoítos) (FREYRE, 1989; DUBEY, 2004).

Os gatos tem por habito caçar pequenos mamíferos ou pássaros, e estes muitas vezes acham se infectados na forma de cistos teciduais (TENDER et al. 2000).

Os felinos podem eliminar cerca de 360 milhões de oocistos em um dia, sendo extremamente resistentes às influencias do meio ambiente, podendo esporular e sobreviver na água do mar por vários meses (DUBEY 2002; LINDSAY et al. 2003).

O objetivo do presente trabalho foi apresentar a soroprevalência de anticorpos anti-T. gondii em uma população hospitalar de cães atendidos na rotina da clinica medica de pequenos animais da Universidade de Cuiabá, visto que os cães servem de sentinela para o controle da toxoplasmose humana.

19 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 HISTÓRICO

A toxoplasmose é uma doença causada por um parasita

coccídio intracelular obrigatório de distribuição mundial, denominado Toxoplasma gondii, constituindo-se numa das mais importantes zoonoses (DUBEY; BEATTIE, 1988).

O T. gondii é um dos parasitas mais bem estudados devido à sua importância médica e veterinária, e a sua adequação como um modelo para a biologia celular e estudos moleculares com o organismo unicelular (Dubey, 2008; DUBEY; BEATTIE 1988;).

O T. gondii infecta o homem e um grande numero de animais domésticos e selvagens. A infecção já foi registrada em mais ou menos 300 espécies de mamíferos (carnívoros, herbívoros, insetívoros, roedores e primatas) e 30 espécies de aves (FORTES, 2004).

Nicolle e Manceaux (1908) encontrou um protozoário em tecidos de um roedor norte africano Ctenodacttylus gundi, que estava sendo usado para pesquisa de leishmaniose no laboratório de Charles Nicolle, no Instituto Pasteur de Tunis. Nicolle inicialmente acreditava que o parasita seria um piroplasma, em seguida, Leishmania, mas logo percebeu que tinha descoberto um novo organismo e nomeou-o T. gondii com base na morfologia (toxon=arco, plasma=forma) e o hospedeiro (Nicolle e Manceaux 1909).

Splendore (1908) descobriu o mesmo parasita em um coelho no Brasil, também erroneamente identificando-o como leishmania, mas ele fez não nomeá-lo. Para os próximos 30 anos, os organismos semelhantes T. gondii foram encontrados em vários outros hospedeiros, especialmente espécies de aves (DUBEY, 2002a), mas viável T. gondii foi isolado pela primeira vez por Sabin e Olitsky (1937) e provou ser idêntico T. gondii de humano (DUBEY; CIMERMAN, 2008).

A partir da sua descoberta T. gondii implicado em varias infecções animais, por Mello & Carini no cão (1911), por Carini no

20 pombo (1913), por Sangiori no camundongo (1916), por Carini & Migliano na cobaia (1916) (CIMERMAN 2008).

Embora T. gondii tenha distribuição mundial e, talvez a gama de hospedeiro mais vasto de qualquer parasita, existe apenas uma espécie, gondii no gênero toxoplasma (DUBEY, 2008). 2.2 ETIOLOGIA.

T. gondii é um protozoário de ciclo de vida facultativamente

heteróxeno e infecta todas as espécies animais homeotérmicos, incluindo mamíferos, aves e o homem (SILVA et. al. 2003). É um parasito intracelular obrigatório, pertencente à família Toxoplasmatinae, ordem Coccidia. Os gatos domésticos e outros felídeos são os únicos hospedeiros definitivos, mas muitas espécies vertebrados servem como hospedeiros intermediários (MARTINS & VIANA, 1998; HILL et al. 2005).

T. gondii é um protozoário que apresenta organelas citoplasmáticas características do Filo Apicomplexa, classe Sporozoa, subclasse Coccidea, ordem Eucoccidiida, subordem Eimeriina e Família Sarcocystidae, gênero Toxoplasma e espécie Toxoplasma gondii (DUBEY, 1977; LEVINE, 1985).

O parasito apresenta três estágios infectantes, os taquizoítos livres ou pseudocisto em diversos órgãos, os bradizoítos nos cistos teciduais e os esporozoítos nos oocistos esporolados. Todas estas formas são infectantes tanto para hospedeiros definitivos como para hospedeiros intermediários (FRENKEL et al. 1970; DUBEY, 2002b; DUBEY, BEATTEI 1988).

O gênero provêm da palavra grega Toxon (arco) referencia ao formato do parasita, e plasma (molde) devido ao seu formato encurvado e crescente (NICOLLE & MANCEAUX. 1908).

Taquizoítos

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Os taquizoíto são a forma encontrada durante a fase aguda da infecção, sendo também denominada de forma proliferativa, que causa danos aos tecidos e dissemina a infecção nos tecidos do hospedeiro é a forma livre ou trofozoítos. Foi a primeira forma descrita é facilmente encontrada em líquidos biológicos, e seu aspecto morfológicos, em forma de arco (toxon=arco) deu o nome ao gênero. Apresenta-se com forma a grosseira de banana ou meia lua, com uma das extremidades mais afiladas e a outra arredondada, medindo cerca de 2 x 6µm, com o núcleo em posição mais ou menos central (CIMERMAN, 2008; BOWMAN et al. 2002; NEVES, 2005).

O polo anterior do taquizoíto é mais afilado e apresenta em sua extremidade o complexo apical (característico do filo Apicomplexa ao qual o protozoário pertence) e é composto de róptias, micronemas, conóide e anel polar. O polo posterior, mais arredondado, geralmente apresenta o núcleo, que pode ser mais central, e possui organelas celulares. Ele apresenta ainda uma película composta por três membranas com um arranjo subpelicular de microtúbulos compostos por uma rede de 22 feixes que se juntam ao conóide e envolvem toda a célula, dando-lhe a forma habitualmente vista (CIMERMAN, 2008).

A película apresenta orifícios ao nível do conóide relacionado com as róptrias e também um orifício lateral, a micrópila. Outras organelas celulares são o aparelho de golgi (de posição intermediaria entre o núcleo e o complexo apical), reticulo endoplasmático rugoso abundante (geralmente perinuclear), mitocôndrias e grânulos densos (DUBEY, 1977).

O taquizoítos (Figura 1) quando corado pelo método de Giemsa apresenta o citoplasma azulado e o núcleo vermelho. É uma forma móvel, de multiplicação rápida (tachos=rápido), por processo denominado endodiogenia, encontrado dentro do vacúolo parasitóforo de várias células, como nos líquidos orgânicos, excreções, células do SMF, células hepáticas, pulmonares, nervosas, submucosas e musculares exceto hemácias. Dentro de cada vacúolo parasitóforo, encontram-se em número de 8 a 16 organismos que são formas moveis e também podem estar livres nos fluidos e órgãos. Está forma também desempenha um papel fundamental na transmissão vertical

22 do T. gondii, porém são muito sensíveis as condições ambientais e normalmente não sobrevivem fora do hospedeiro. Segundo a maioria dos autores os taquizoítos são sensíveis à ação do suco gástrico no qual são destruídos em pouco tempo eles também são eliminados por pasteurização e aquecimento (URQUART et al. 1996; TENTER et al. 2000; COURA, 2005; NEVES, 2005; DUBEY, 2010).

Figura 1. Morfologia geral da forma taquizoíta de Toxoplasma gondii. (A) Representação esquemática. O esquema foi construído a partir de corte aleatórios do parasito observados em microscopia eletrônica de transmissão. (B) Corte longitudinal onde várias das estruturas representadas em (A) estão assinaladas: N - núcleo, c - conóide, R - róptrias, A - apicoplasto, CG - Complexo de Golgi, g - grânulo denso, seta - micronema, VP - vacúolo parasitóforo. Barra: 1μm.

Bradizoítos Os bradizoítos é a forma de resistência nos tecidos do T.

gondii que possuem cisto contendo bradizoítos (CIMERMAN, 2008). Ela é a forma encontrada em vários tecidos, musculares, esqueléticos e cardíacos, nervoso e retina, geralmente na fase crônica da infecção, também denominadas cistozoítos (NEVES, 2005).

Alguns taquizoítos ao penetrarem na célula hospedeira em vez de proliferarem rapidamente por processo multiplicativo que caracteriza os taquizoítos eles promoverem a ruptura desta célula, realizam um metabolismo mais lento, (brady=lento), embora de proliferação inicial, em velocidade extremamente lenta que é

23 característica peculiar da forma bradizoítos. Ele se reproduz também por endodiogenia ou endopoligenia, lenta dos bradizoítos, representa uma forma evolutiva do ciclo iniciada independentemente do controle da infecção pelo sistema imune do hospedeiro, mas que juntamente com esta resposta imunológica, resultara na formação de grandes aglomerados parasitários que segregam envoltórios císticos. (CIMERMAN, 2008; NEVES, 2011).

Os bradizoítos são encontrados dentro do vacúolo parasitóforo de uma célula, cuja membrana forma a capsula do cisto tecidual que é resistente, são separadas da célula hospedeira por uma fina (menos 0,5µm) e elástica parede que isola os bradizoítos da ação dos mecanismos imunológicos do hospedeiro (DUBEY, 2006; NEVES, 2011).

Eles medem cerca de (10 a 100µm) de diâmetro, podendo conter de 10 a centenas ou milhares de bradizoítos (URQUART et al. 1996; CIMERMAN, 2008). O tamanho do cisto é variável dependendo da célula parasitada e do número de bradizoítos no seu interior, podendo atingir ate 200µm (NEVES, 2011).

Morfologicamente os bradizoítos são similares aos taquizoítos, diferenciados quanto as moléculas de estagio especifico em sua membrana, enzimas e proteínas de choque térmico (COURA, 2005).

Os taquizoítos apresentam maior deposito de açúcar sob forma de grânulos de glicogênio, alguns vacúolos e um núcleo localizado mais proximamente ao polo posterior, segundo Dubey (1977) (CIMERMAN, 2008).

As proteínas produzidas pelo bradizoítos diferem das produzidas pelo taquizoítos o que, através de pesquisas poderia resultar numa vacina que eliminasse cistos teciduais (CIMERMAN, 2008).

Não há um consenso geral sobre a duração de vida do cisto ate sua ruptura e liberação dos bradizoítos, mas acredita-se que pode chegar a décadas (CIMERMAN, 2008). Cistos podem permanecer latentes e nunca causar doença durante toda a vida do hospedeiro (DUBEY, 1977; DUBEY et al. 1998; LYONS et al. 2002).

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Os bradizoítos são muito mais resistentes a tripsina e à pepsina do que os taquizoítos, e podem permanecer viáveis nos tecidos por vários anos. Apesar de serem mais frequentemente encontrados na fase crônica, em algumas cepas, os bradizoítos podem ser encontrados na fase aguda da infecção toxoplásmatica (NEVES, 2011).

Um dos aspectos importantes dos cistos é uma possível reativação de infecção causada pela liberação de bradizoítos, que se transformam em taquizoítos e promovem uma nova infecção aguda, local, com lesões focais usualmente vistas em imunodeprimidos. Isto foi proposto por Frankel e Cols (1975), sendo geralmente aceito pela constante de resposta humoral. Mais recentemente, Hofflin e Remington (1985) postularam que não somente a reativação é focal, mas também pode ocorrer distancia em outros focos, como observado na presença de múltiplas lesões de encefalite em pacientes com AIDS (CIMERMAN, 2008).

Os cistos (Figura 2) tornam-se inviáveis quando submetidos à temperatura de congelamento de 0°C por sete dias, ou instantaneamente quando expostos à -12,4°C. A inviabilização dos cistos também pode ocorrer pelo aquecimento a 58°C por 10 minutos. Assim o congelamento e o cozimento completo da carne são algumas das formas de controle na transmissão da toxoplasmose (KOTULA et al. 1991; HILL et al. 2002).

Figura 2: Cisto

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Oocisto O oocisto (Figura 3) é a forma infectante produzida nas células

intestinais de felídeos não-imunes e eliminado junto com as fezes (NEVES, 2011). Após uma infecção aguda no gato, os oocistos são liberados em grandes quantidades pelas fezes, podendo chegar a bilhões por dia segundo Dubey e Frenkel (1972) (CIMERMAN, 2008).

Os oocistos medem de 10 a 12µm e o esporozoítos, de 2 a 6µm por 8µm. Os esporozoítos contidos dentro de oocistos são formas exclusivas do hospedeiro definitivo. Podem ser eliminados nas fezes dos gatos e outros felinos, após ingerirem qualquer um dos três estágios infectantes, porém a excreção ocorre em uma frequência maior de animais que ingerem numero maior de organismos após ingestão de cistos teciduais. Os oocistos esporulam no ambiente após um a cinco dias da excreção, e após a sua maturação é viável por vários meses ate anos, desde que em condições razoáveis de umidade relativa. Cada oocisto contem dois esporocistos com quatro esporozoítos cada, sobrevivem no ambiente por ate 18 meses e têm elevada resistência aos desinfetantes (CIMERMAN, 2008; TENTER et. al. 2000).

O período pré-patente da infecção adquirida a partir de cistos teciduais é mais curto de 3 a 10 dias, quando comparado ao período pré-patente de infecção derivadas de ingestão das outras formas biológicas. Durante o período de eliminação, a quantidade de oocistos pode exceder 10 bilhões de unidade (DA SILVA et. al. 2009).

Os felídeos, principalmente os gatos domésticos, desempenham papel fundamental na transmissão do T. gondii para o homem e outros animais (LAGONI et. al., 2001), são importantes no ciclo de vida do T. gondii por serem hospedeiros definitivos e, portanto, os únicos que podem contaminar o meio ambiente com oocistos DUBEY et al. 2004)

Segundo Alves (2008) os felídeos são ponto-chave da epidemiologia da toxoplasmose, sendo os únicos hospedeiros da forma sexuada do parasita e, por eliminarem oocistos nas fezes, são a principal fonte de infecção dos animais

26 herbívoros.

Para Oliveira et. al. (2003) os cistos teciduais tem grande importância na contaminação oral, pois permanecem viáveis e são infectantes para os gatos e para os outros hospedeiros intermediários como, por exemplo, o homem e o cão, sendo que neste último, a infecção geralmente pode acontecer pela ingestão de oocistos presentes no solo ou alimentos de origem vegetal, ou de carne com cistos presentes nos tecidos de carne com cistos tissulares.

De forma geral, segundo Lucas et. al. (1999), os gatos domésticos domiciliados são infectados pela ingestão de cistos presentes nos tecidos de carne crua ou mal cozida; e os semidomiciliados ou selvagens, pela ingestão de cistos presentes nos tecidos de pequenas presas, como pássaros e roedores, que representam importantes vias de infecção. Outros animais podem se infectar pela ingestão de água e alimentos contaminados com fezes de gatos contendo oocistos ou pela ingestão de cistos de animais infectado.

Os resultados de um estudo recente confirmam que oocistos de T. gondii eliminados no período pré-patente é estagio dependente (a ingestão de bradizoítos tem um período pré-patente encurtado em relação a ingestão de esporozoítos) e não dose dependente (DUBEY e COLS, 2006). Alem disso, a transmissão de de T. gondii é mais eficiente quando os gatos consomem cistos teciduais (carnivorismo) e quando o hospedeiro intermediário consome oocisto (transmissão oral-fecal). A infecção de roedores por T. gondii altera o comportamento das espécies de presas, tornado-as menos aversivas aos gatos, aumentando potencialmente a probabilidade de que o hospedeiro definitivo (felídeos) torne-se infectado e potencialize a fase sexuada do organismo (VYAS e COLS, 2007; COUTO, 2010).

Para Couto (2010) os felinos são muito fastidiosos e usualmente não permitem que suas fezes permaneçam em sua pele por períodos suficientes para permitir a esporulação dos oocistos.

Nenhuma associação entre a posse de um cão ou gato e a soroprevalência de T. gondii foi demonstrada em um grupo de homens infectados por HIV. Na maioria dos estudos os profissionais que trabalham com saúde veterinária não têm incidência maior de toxoplasmose comparado com a população em geral. Os gatos não precisam ser removidos dos lares com pessoas imunodeficintes ou mulheres grávidas por causa do risco de

27 adquirirem toxoplasmose.(http:www.cbc.gov/ncidod/dpd/para-sites/toxoplasmosis/toxowomen.pdf)

Figura: 3 oocisto 2.3 CICLO EVOLUTIVO

Os felídeos são considerados hospedeiros completos, são os únicos que eliminam oocistos do parasita, formas estas resultantes da fase sexuada do ciclo, pois atuam como hospedeiros definitivos e intermediários e os felídeos de modo geral o gato domestico, mantêm importante papel na epidemiologia da toxoplasmose, por eliminarem milhares de oocistos pelas fezes durante a primoinfecção (FERNANDES e BARBOSA, 2000; TENTER et al. 2000).

As condições climáticas são fundamentais para a esporulação dos oocistos no meio-ambiente e consequentemente, na propagação da infecção, por meio da contaminação de água e alimentos. Os demais animais desempenham o papel de hospedeiros intermediários, transmitindo a protozoose apenas quando sua carne serve para alimentação ou por via congênita (AMENDOEIRAS, COSTA, SPALDING, 1999).

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Figura 4: Ciclo epidemiológico da toxoplasmose Fonte Ferguson (2002)

T. gondii apresenta um ciclo de vida heteróxeno facultativo

(Figura 4) sendo os felídeos os hospedeiros definitivos onde destacam-se os gatos domésticos especialmente os mais jovens e, portanto, as únicas espécies nas quais ocorre o ciclo sexuado, sendo responsável pela eliminação de oocistos nas fezes. Varias espécies de mamíferos e aves se comportam como hospedeiros intermediários, inclusive os próprios felídeos, animais pet e de produção e o próprio homem, no qual ocorre a reprodução assexuada em tecidos extraintestinais (TENTER, 2001; COURA, 2005; MEIRELLES, 2001). Na fase assexuada, os cistos ou oocistos, após serem ingeridos e sob a ação das enzimas digestivas, têm as suas formas infectantes, bradizoítos e esporozoítos, liberados no lúmen intestinal, as quais rapidamente invadem as células, formando vacúolos parasitofóros, onde se multiplicam por endodiogenia e se interconvertem em taquizoítos. Em seguida, ocorre a disseminação dos taquizoítos pelo organismo, a partir do tecido linfoide associado ao intestino, sistemas linfáticos e sanguíneos, para praticamente todos os órgãos do corpo (BLACK e BOOTHROYD, 2000).

Após 10 a 14 dias da infecção com taquizoítos, estes se diferenciam em bradizoítos que formam os cistos, e que podem permanecer latentes durante toda vida do hospedeiro sem causar sintomatologia (LYONS et al. 2002).

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A fase sexuada, chamada de ciclo enteroepitelial, ocorre somente nos felídeos (DUBEY, 1977). Com a ingestão de cistos, oocistos ou até mesmo taquizoítos e liberação dos bradizoítos ou esporozoítos, estes penetram nas células epiteliais do intestino delgado e iniciam uma serie de gerações assexuadas (DUBEY, 1977; DUBEY et al. 1988). Os esporozoítos ou bradizoítos penetram no epitélio intestinal e se multiplicam por endodiogenia em merogonia (esquizogonia), dando origem a vários merozoítos. O conjunto desses merozoítos formados dentro do vacúolo parasitóforo da célula denominada meronte ou esquizonte maduro (DUBEY, 1977).

Os merozoítos penetram em novas células epiteliais e se transformam nas formas sexuadas masculinas e femininas, os gametócitos ou gamontes, que após um processo de maturação formam os gametas masculinos moveis – microgametas (com dois flagelos) e femininos imóveis macrogametas. Os macrogametas permanecem dentro de células epiteliais, onde são fecundados (DUBEY, 1977; BLACK e BOOTHROYD 2000).

Após fertilização uma parede se forma ao redor do gameta feminino (zigoto), originando o oocisto, o qual é eliminado na forma não esporulada nas fezes (DUBEY, 1977; 1998a). A grande dispersão do parasita pode ser determinado pela possibilidade deste apresentar vários mecanismos de transmissão (AMENDOEIRAS, 1995).

As três principais vias de transmissão do Toxoplasma gondii são a ingestão de carne crua ou mal cozida, contendo cistos tissulares de toxoplasma e raramente pelo consumo de leite cru de cabras contendo taquizoítos; leite não pasteurizado, ovos, ingestão de oocistos esporulados presentes no solo e areia, locais onde felídeos defecam, podendo ser disseminados por vetores mecânicos, bem como carreados pela água, contaminando os alimentos; e infecção transplacentária (BRASIL, 2002).

2.4 EPIDEMIOLOGIA A toxoplasmose é prevalente em muitas áreas do mundo sendo

considerado como a mais cosmopolita de todas as zoonoses (SILVA et al., 2003). Tem importância veterinária e medica por causa de abortamentos e doenças congênitas em varias espécies de hospedeiros intermediários. A

30 epidemiologia do parasitismo por T. gondii ainda não está totalmente esclarecida, há carência de pesquisa sobre o papel das aves na cadeia epidemiológica da doença. Contudo acredita-se que as aves têm grande importância na sua transmissão principalmente porque seus tecidos e ovos representam importante fonte de proteína na alimentação humana e de felinos em geral (MAROBIN et al., 2004).

Os gatos são o ponto chave da epidemiologia da toxoplasmose sendo os únicos hospedeiros definitivos do parasito e transmissores da forma sexuada (DAGUER et al., 2004).

Os animais de estimação cada vez mais interagem com seus proprietários e outros animais de companhia, ocupam importante presença em domicílios, servem como fonte de alegria e companherismo para seus proprietários porém em contrapartida vem com os riscos inerentes como transmissores de doenças para seus donos e outros animais domésticos (KRAVETZ e FEDERMAN, 2002).

A avaliação retrospectiva da infecção em amostras de soro de cães confirma a dispersão do T. gondii no ambiente, demonstrando o papel do cão como animal sentinela para toxoplasmose e a importância do monitoramento nas ações de saúde pública para o controle desta zoonose (VARANDAS et al., 2001; ULLMANN et al. 2008).

Não existem dados sobre a importância de diferentes hospedeiros intermediários como fontes de infecção para os cães. Analise multivariada dos fatores de risco revelaram que consumo de carne e vísceras cruas está associado aos títulos de anticorpos IgG, enquanto que alterações neurológicas estão associadas a ocorrência de anticorpos IgM (BRITO et al. 2002). As condições ambientais podem determinar o grau de propagação natural da infecção por T. gondii. A infecção é mais comum em climas frios e nas regiões montanhosas e em áreas úmidas do que em áreas secas, isto provavelmente relacionada com as condições que favorecem a sobrevivência e a esporulação dos oocistos no ambiente. A epidemiologia da infecção canina por T. gondii é desconhecida, sabe-se, no entanto que são indicadores de contaminação do meio ambiente devido à estreita relação com humanos (DUBEY, 2010).

A infecção da população canina é uma indicação do ambiente domestico contaminado pelo T. gondii com consequente risco de contaminação

31 para a população humana, ligado ao fato que tanto o homem quanto os cães estão expostos a um veiculo de contaminação comum representado pelo ambiente e hábitos alimentares (GERMANO et al. 1985; JACKSON et al. 1987). Nos países em desenvolvimento a exemplo do Brasil a sua ocorrência é grande e alem das questões mencionadas, citam-se também outras causas como climática, saneamento básico e leis efetivas que regem as responsabilidades e deveres dos proprietários e do Estado para com os animais de companhia que são falhas e não respeitadas. Todos estes fatores contribuem para o processo de desenvolvimento e transmissão do parasita no meio ambiente (DUBEY, 2006).

Devido ao elevado índice de animais naturalmente infectados por T. gondii, agente reconhecidamente oportunista e sua correlação com doenças imunossupressivas como a cinomose (MORETTI et al 2002). Deve-se atentar para a ocorrência desta enfermidade na espécie canina. O cão apesar de não ser hospedeiro definitivo, contribui na disseminação mecânica desta protozoose (SCHARES et al 2005).

A sua importância também esta ligada a patogenecidade em animais de produção e de companhia, e em animais silvestres como gambás, capivaras e canídeos, apontando para a ocorrência de um ciclo silvestre importante (YAI LEO et al. 2003).

A epidemiologia da toxoplasmose no Brasil varia bastante de acordo com a região, clima, as taxas de prevalência variam entre de 10% a 60%.

Estudos demonstram ampla variação na frequência de cães soropositivos em outras cidades como Cuiabá 10,3%, Natal 11,5%, Patos na Paraíba 15,6, Terezina no Piauí 18,0%, Botucatu 20,8%, Santa Catarina 22,3%, Ubatuba 25,4%, Lavras 60,7% e Salvador 63,55% (GIRARDI et al. 2014; DANTAS et al. 2013; DANTAS et al. 2014; LOPES et al. 2011; COIRO et al. 2011; MOURA et al. 2009; SILVA et al. 2010; GUIMARAES et al. 2009; BARBOSA et al. 2003). Dos autores citados observaram idade, acesso a rua e comida caseira como fontes de risco para a infecção da toxoplasmose.

32 2.5 Sintomatologia canina.

A taxa de infecção da toxoplasmose difere da atribuída à

doença, pois como a distribuição do agente é ampla no ambiente há grande risco da infecção (DUBEY; BEATTIE, 1998).Vários autores já demonstraram que a toxoplasmose esta difundida entre os cães no Brasil (NAVARRO et.al. 1997; GUIMARES et. al.2009; BRITO et. al. 2002). Segundo Navarro et al. (1997), a doença no cão é de difícil diagnostico, porque a enfermidade em geral é de evolução crônica; decorrente da alta infectividade e baixa patogenicidade do parasito (BRITO et al. 2002).

Para Moretti et al. (2002) o elevado índice de animais naturalmente infectados por T. gondii, agente reconhecidamente oportunista, e sua correlação com doenças imunossupressivas, como cinomose. Devemos atentar-se para a ocorrência desta enfermidade na espécie canina. O cão, apesar de não ser hospedeiro definitivo, contribui na disseminação mecânica desta protozoose FRENKEL; PARKER, 1996; LINDASAY et. al. 1997; SCHARES et. al. 2005). A doença clinica causada pelo T. gondii em cães não é frequente, mas duas formas de doença são relatadas multissistemica com alta taxa de mortalidade particularmente afetando cães jovens e outro localizado no sistema nervoso central e periférico (DUBEY; LAPPIN 1990). Para Bichard e Sherding (2003) a toxoplasmose clinica é reconhecida mais frequentemente nos gatos do que nos cães, mas o espectro de sinais é semelhante em ambas as espécies. São comuns sinais inespecíficos de anorexia, depressão, febre intermitente outros sinais são denominados pelo local da lesão a partir da disseminação extra- intestinal, sendo que os órgãos mais afetados são pulmão os olhos o cérebro o fígado e a musculatura esquelética.

Nos cães o aparecimento da doença e marcado por febre, com lassidão, anorexia, diarreia, pneumonia e manifestações neurológicas, pode ocorrer infecção com cinomose e vacinação contra cinomose (URQUHART et al. 1996).

33 As manifestações clinicas da toxoplasmose são muito variadas e comum a diversas enfermidades, com envolvimento de vários órgãos e sistemas incluindo o gastrintestinal o linfático o esplênico o hepático o pulmonar o osteomuscular o cardíaco o ocular e o nervoso (DUBEY,1977; DUBEY; LAPPIN 1998).

O tipo de sintomatologia clinica dependem da localização e grau de lesão tecidual, que se deve à ocorrência de necrose determinada pelo caráter intracelular do parasito (CORRÊA; CORRÊA, 1992; DUBEY e LAPPIN 1998).

Os sinais clínicos generalizados são observados com maior frequência em cães com menos de um ano de idade. No entanto nesta faixa etária os principais sinais clínicos são neuromusculares. Em infecção decorrente da ingestão cistos teciduais ou oocistos, ocorre diarreia e vomito decorrentes da necrose determinada pelos taquizoítos, principalmente no intestino e nos órgãos linfoides associados, em seguida, o dissemina-se por via hemática e ou linfática, determinando necrose focal em vários órgãos (DUBEY e LAPPIN, 1998).

O envolvimento linfático provoca linfadenopatia, referida como a manifestação clinica mais frequente na toxoplasmose adquirida nos cães (ABREU et al. 1999b).

Corrêa; Corrêa (1992) observaram lesões provocadas pelo agente em linfonodos ocasionam imunossupressão com diminuição de g globulinas. A lesão hepática determina hipoproteinemia, hipoglobulinemia, aumento das atividades séricas de alanina amino trasferase (ALT), fostase alcalina (FA) aumento nos níveis séricos de bilirrubina, icterícia e efusão peritonial (DUBEY; LAPPIN, 1998). Segundo Dubey (1997) toxoplasma gondii induz necrose pulmonar, levando a pneumonia e dispneia, embora muitos casos, a pneumonia seja decorrente da co-infecção com outros agentes especialmente o vírus da cinomose. As lesões musculares por toxoplasma gondii determinam hiperestesia à palpação, marcha rígida, claudicação e aumento da atividade sérica enzimática de creatinina quinase (DUBEY; LAPPIN, 1998).

34

Arritmias e insuficiência cardíaca também podem desenvolver-se devido ao envolvimento miocárdico (DUBEY; LAPPIN, 1998). Os sinais nervosos da toxoplasmose dependem da localização do parasito no cérebro e medula espinal. A multiplicação do agente leva a episódios convulsivos, déficits de nervos cranianos, hiperexcitabilidade, ataxia, tremores, paresia e paralisia DUBEY; LAPPIN, 1998; ABREU, 2001; WEBB e COLS, 2005).

Ocasionalmente ocorre mudança de hábitos com desenvolvimento de apatia ou agressividade. Entretanto os sinais nervosos predominantes da toxoplasmose são paresia e paralisia de membros posteriores (CORRÊA; CORRÊA, 1992). Em cães as lesões oftálmicas incluem uveíte anterior, iridociclite, hiperplasia do epitélio ciliar, retinite, coroidite, miosite extra-ocular, esclerite, episclerite e neurite óptica (ABREU et. al. 1999a; DUBEY; LAPPIN, 1998; MARTIN; STILES, 1998). Contudo sinais clínicos podem ocorrer a partir da infecção inicial, toxoplasmose aguda ou primaria, ou a partir da reativação de infecção encistada, toxoplasmose crônica ou secundaria (BICHARD e SHERDING, 2003). 2.6 DIAGNOSTICO. Segundo Ettinger et al. (2008) não há alterações clinicopatológicas ou radiográficas patognomônicas nos cães ou nos gatos com toxoplasmose clinica. Cantos et. al (2000) afirma que o diagnostico laboratorial da toxoplasmose é de grande importância, uma vez que a infecção, tanto no homem como nos animais domésticos e silvestres, pode assumir quadros clínicos facilmente confundidos com uma gama enorme de outras enfermidades, dificultando a tomada de medidas especificas de tratamento e controle. O diagnostico definitivo da toxoplasmose felina ou canina antes da morte pode ser obtido se o microrganismo for visualizado; contudo,

35 isto é raro, particularmente se a doença for crônica. Os bradizoítos ou taquizoítos raramente são detectados nos tecidos nas efusões, nos fluidos de lavado broncoalveolar no humor aquoso ou no FCR (NELSON et al. 2010).

Para vários autores a infecção por toxoplasma gondii pode ser diagnosticada indiretamente através de métodos sorológicos, e diretamente por reação em cadeia da polimerase (PCR), isolamento e imunoistoquímica (TENTER et. al. 2000; DUMETRE e DARDE, 2003; MONTOYA e LIESENFELD, 2004). O diagnostico da toxoplasmose em cães baseia-se em métodos diretos, que constituem na identificação do parasita em materiais dos animais infectados, e métodos indiretos, baseados na identificação de anticorpos específicos contra o toxoplasma gondii (GERMANO, 1985).

Entre os métodos diretos, a identificação do parasita pode ser realizada em esfregaços de secreção ocular corados pela técnica de Giemsa, em que se pesquisa a presença dos taquizoítos, com característica forma de meia-lua. O exame citológico pelo método de Giemsa também é útil em material de biopsia principalmente em punção de linfonodos e fígado assim como nos lavados traqueobrônquicos principalmente em gatos (SWANGO et al. 1992).

Segundo Davidson (2000) exames de sangue poderão mostrar toxoplasma gondii sob forma taquizoítos em macrófagos. A secreção nasal e ocular preparadas em esfregaço e coradas pelo Giemsa também poderão permitir diagnósticos. Na necropsia, os focos necróticos puntiformes no SNC, nos pulmões, fígados e linfonodos infartados são indicativos de toxoplasmose.

Existem inúmeras técnicas sorológicas para a detecção de anticorpos anti- toxoplasma gondii. Estes incluem o teste de Sabin-Feldman, o teste de Hemaglutinação indireta, a Imunofluorescência indireta, Testes de Aglutinação direta, Testes com Aglutinação no Latex, Immunosorbent Aggutinação Assay (ISAGA), Ensaio imunoenzimatico (ELISA), Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA) e Enzyme Linked Fluorescent Imuno-Assays (ELFA) (HILL & DUBEY, 2002).

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Para Hill e Dubey (2002) a realização do diagnostico sorológico dois testes comumentes utilizados: o teste do corante de Sabin-Feldman e o teste de imunofluorescência indireta (IFI). Independente o método usado é necessário o emprego de amostras colhidas com intervalos de duas semanas, para determinar a soroconversão, que é indicativo de infecção recente.

O teste de imunoadsorção enzimática (ELISA), mais moderno permite a detecção da resposta de IgM compatível com uma infecção ativa recente, já que a resposta de IgG é geralmente alta e pode persistir por vários dias, indica uma exposição anterior, ou seja indicativo de casos crônicos. Nos casos fatais, a histopatologia revela os taquizoítos e os cistos teciduais nos órgãos afetados (McCANDLISH, 2001).

2.7 TRATAMENTO O objetivo do tratamento é o controle dos sinais clínicos

reduzindo o desenvolvimento das formas proliferativas assegurando que a infecção seja tratada corretamente e para tanto é fundamental identificar e gerenciar todas as condições propícias ou doenças concomitantes que permitiram a evolução da doença. A taxa de mortalidade na toxoplasmose é elevada maior em neonatos e nos animais com imunossupressão e a escolha da droga a ser utilizada é baseada nas barreiras biológicas do organismo (BIRCHARD e SHERDING, 2003).

Os sinais clínicos que não envolvam o olho ou o sistema nervoso geralmente respondem ao tratamento e a melhora clinica é observada no segundo ou terceiro dia de tratamento, lesões oculares e neurológicas tendem a responder mais lentamente. Em casos de toxoplasmose pulmonar e hepática o prognostico é geralmente ruim particularmente em animais imunossuprimidos (HARTMANN et al. 2013).

O tratamento da toxoplasmose canina restringe a antibióticos como clindamicina, associações de sulfas com trimetroprim,

37 azitromicina, espiramicina e enrofloxacina (DUBEY et al. 2009; BARBOSA et al. 2012; HARTMANN et al. 2013).

A utilização de clindamicina e sulfonamidas com ou sem associação com trimetropim são mais comumente utilizadas (PTERSON e KUTZLER, 2011).

Os cuidados de suporte são fornecidos conforme o necessário (EETINGER, 2008; COUTO et al. 2010). O cloridrato de clindamicina (10 a 12 mg/kg VO q 12h) ou a combinação de trimetropin- sulfonamida (15mg/kg VO q 12h) administrados durante quatro semanas podem ser empregados.

Os cães com uveíte devem ser tratados com fármacos anti-toxoplasmose em combinação com corticosteroides tópicos, orais ou parenterais para evitar dano secundário ao olho induzido pela inflamação (ETTINGER; 2008; COUTO et. al. 2010). A corioretinite pode responder ao cloridrato de clindamicina isoladamente.

A toxoplasmose ocular, nervosa (SNC) e neuromuscular responde mais lentamente. Se a febre ou a hiperestesia muscular não estiverem resolvendo após três dias de tratamento outras causas devem ser consideradas (ETTINGER, 2008; COUTO et al. 2010).

A recorrência dos sinais clinico pode ser mais comum se a duração do tratamento for inferior a quatro semanas. Atualmente, não há qualquer fármaco capaz de remover totalmente o microrganismo do corpo e, dessa forma, as recorrências são comuns (ETTINGER, 2008; COUTO et al. 2010).

O prognostico é ruim para cães com toxoplasmose disseminada devido a replicação do microrganismo, particularmente se houver imunodeficiência. Os cães com doença neuromuscular também apresentam prognostico ruim (ETTINGER, 2008; COUTO et al. 2010).

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Realizar estudo epidemiológico sobre a prevalência da toxoplasmose em cães provenientes de uma população hospitalar do município de Cuiabá do Estado de Mato Grosso. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Estudar através da técnica de reação de imunofluorescência indireta (RIFI), a soroprevalência da toxoplasmose em cães e gatos provenientes do atendimento de rotina do Hospital Escola Veterinário (HOVET) da Universidade de Cuiabá. • Aplicar questionário epidemiológico para o estudo e avaliação dos fatores de risco para a infecção da toxoplasmose no município de Cuiabá - MT; • Estudar os principais fatores de risco e informações epidemiológicas que possibilitem um significativo avanço no controle do T. gondii em áreas urbanas e rurais do município de Cuiabá –MT; • Contribuir, no âmbito da saúde publica, com medidas de controle e redução da contaminação ambiental e alimentar por oocistos de toxoplasma gondi a partir do estudo das taxas de infecção e identificação dos locais/regiões onde a prevalência por T. gondii foi significativa.

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4. ARTIGO 1

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Estudo epidemiológico, avaliação de fatores de risco da infecção pelo Toxoplasma gondii e achados clinico-patológicos da infecção aguda em cães admitidos em um Hospital Escola Veterinário1 Angelita D. Strital2. Michelle Igarashi3*, Lívia S. Muraro4, Daniel M. Aguiar5, Thábata A. Pacheco5, João L. Garcia6, Silvio H. Freitas7, Alexandre M. Amude8. ABSTRACT.- Strital A.D., Igarashi M., Muraro L.S., Aguiar D.M., Pacheco T.A., Garcia J.L., Freitas S.H. & Amude A.M. 2015. [Epidemiological study, evaluation of risk factors for Toxoplasma gondii infection and clinical-pathological findings of acute infection from dogs admitted in a Veterinary Teaching Hospital]. Estudo epidemiológico, avaliação de fatores de risco da infecção pelo Toxoplasma gondii e achados clinico-patológicos da infecção aguda em cães admitidos em um Hospital Escola Veterinário. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(00):000-000. Departamento de Ciências Básicas em Saúde, Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa 2367, Cuiabá, MT 78060-900, Brasil . E-mail: [email protected] This work aimed to study the prevalence and the risk factors for Toxoplasma gondii infection in dogs from a hospital population. In addition, it was assessed the occurrence rates and the clinicopathological repercussions of the acute infection by T. gondii in these animals. Studied population consisted of 386 dogs of both genders and different breeds and ages, and antibodies were detected in 7% (26/386) of the animals. Only variables, eating offal, rural origin and contact with cattle had significant values at p <0.05. Furthermore, dogs from rural areas showed higher risk (OD = 7.00) of infection than those of urban origin. In 6.5% (25/386) contact titles were detected (between 16 and 256); these titles did not necessarily mean acute infection, and might be only due to prior exposure. It is very important the recognition of prior infection by T. gondii in those hospital patients; depending on the cause of admission, for instance, immunosuppressive disorders, although not being toxoplasmosis the causative, the patient should receive prophylactic anti-parasite treatment or be monitored for additional treatment in case of further acute recurrences of the disease by recrudescence of encysted bradyzoites. Only one animal (3.44% - 1/386) with multisystemic disease (febrile with dermatological, neurologic and hematologic alterations) was admitted with high titer (4096), which might be suggestive of acute infection. Although this animal had been presented with neurological signs (seizures and paraplegia), caution should be required in order to not extrapolate a false interpretation that neurological disease is the main picture of toxoplasmosis or that the acute infection is the major responsible for neurological cases, since numerous other cases included in this study had nervous disease and had no title of acute infection, even title of prior contact. Acute toxoplasmosis was not significant in this hospital ambience; nevertheless, differential diagnosis for T. gondii infection may be made in ill patients, especially those from rural areas, and definitive diagnosis should be accomplished for the correct therapeutic or prophylactic approach. INDEX TERMS: Dogs, toxoplasmosis, epidemiology, risk factors.

1 Recebido em ........................ Aceito para publicação em ............. 2 Discente, Programa de Pós-graduação (stricto senso - mestrado) em Biociência Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Cuiabá (UNIC), Cuiabá, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Cuiabá (UNIC), Avenida Beira Rio 3300, Cuiabá, MT 78.065-420, Brasil. 3 Departamento de Ciências Básicas em Sáude, Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa 2367, Cuiabá, MT 78060-900, Brasil * Autor para correspondência: [email protected] 4 Laboratório de Parasitologia Veterinária e 8 Setor de Clínica Médica de Pequenos Animais (responsável pelo Serviço de Neurologia Animal – Neurologia Clínica e Neurocirurgia), Faculdade de Medicina Veterinária, UNIC, Cuiabá, , MT 78.065-420, Brasil. 5 Departamento de Ciências Básicas e Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa 2367, Cuiabá, MT 78060-900, Brasil .

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6 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Faculdade de Medicina Veterinária, Rodovia Celso Garcia Cid - Pr 445 Km 380, s/n - Campus Universitário, Londrina - PR, 86057-970, Brasil . 7 Unidade Didática Clínico Hospitalar (UDCH) – ZMV, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA) - Universidade de São Paulo (USP), Av. Duque de Caxias Norte, 225, Jd. Elite - Pirassununga – SP CEP 13635-900 RESUMO.- Esse trabalho teve como objetivo estudar a prevalência e respectivos fatores de risco para infecção do Toxoplasma gondii em cães provenientes de uma população hospitalar. Além disso, avaliaram-se as taxas de ocorrência e as repercussões clínico-patológicas da infecção aguda pelo T. gondii nesses animais. Anticorpos foram detectados em 7% (26/386) da população estudada, composta de 386 cães de ambos os sexos e diferentes raças e idades. Somente as variáveis, ingestão de vísceras, origem rural e contato com bovinos apresentaram valores significativos com p<0.05. Adicionalmente os cães de origem rural apresentaram maiores risco (OD=7.00) de infecção do que aqueles de origem urbana. Em 6.5% (25/386) foram detectados títulos de contato (entre 16 e 256); esses títulos não significaram necessariamente infecção aguda e podem ser indicativos de exposição prévia. É de fundamental importância o reconhecimento da infecção prévia por T. gondii nesses pacientes hospitalares. Dependendo da causa da admissão, como por exemplo, doenças imunossupressoras, mesmo não sendo a toxoplasmose a responsável, o paciente deveria receber o tratamento anti-protozoário profilaticamente ou ser monitorado para posterior tratamento em caso de reagudização da enfermidade por recrudescência dos bradizoítos encistados. Apenas um animal (3.44% - 1/386) com sinais multissistêmicos (febre, sinais dermatológicos e neurológicos, e alterações hematológicas) foi admitido com titulação elevada (4096), o qual poderia ser sugestivo de infecção aguda. Embora esse animal tenha sido apresentado com sinais neurológicos (convulsão e paraplegia), cautela é necessária para não extrapolar uma falsa interpretação que a manifestação neurológica é a principal apresentação da infecção aguda ou que a toxoplasmose é a grande responsável por quadros neurológico, uma vez que inúmeros outros casos incluídos nesse estudo tinham manifestações neurológicas e não tinham títulos de infecção aguda, nem mesmo títulos de exposição prévia. A toxoplasmose aguda não foi uma afecção clínica expressiva nessa ambiência hospitalar, no entanto diagnóstico diferencial deveria ser sempre realizado nos pacientes enfermos, principalmente os da área rural, e diagnostico definitivo deveria ser alcançado para a correta conduta terapêutica. TERMOS DE INDEXAÇÃO: Cães, toxoplasmose, epidemiologia, fatores de risco. INTRODUÇÃO As infecções por protozoários são importantes alvos de estudos por conduzirem enfermidades com repercussões clínico-patológicas tanto nos animais quanto nos seres humanos (Dubey & Beattie 1998). Nesse contexto a toxoplasmose se destaca por sua grande importância no cenário nacional tanto na saúde animal, quanto na saúde pública (Fioravanti 2012). Nos países em desenvolvimento, como o Brasil, a ocorrência da enfermidade é grande e isso pode ser justificada por uma série de fatores que contribuem para o processo de desenvolvimento e transmissão do parasita no meio ambiente como: grande contaminação ambiental, condições climáticas favoráveis a manutenção de hospedeiros intermediários de vida livre, saneamento básico precário e ainda, falta de leis efetivas que regem as responsabilidades e deveres dos proprietários e do Estado para com os animais de companhia (Dubey 2006). No Brasil a toxoplasmose ainda é um grande problema nacional e considerada como uma importante enfermidade negligenciada (Souza 2010, Fereira et al. 2001, Fioravanti 2012). Embora existam muitos trabalhos epidemiológicos e estudos de fatores de risco da toxoplasmose em animais no Brasil, a realização desse tipo de investigação e monitoramento no país é importante, pois o território brasileiro é grande, com regiões bem distintas quanto a condições climáticas, culturais e socioeconômicas. Logo, os estudos epidemiológicos e de fatores de risco para doenças infecto-parasitárias de uma determinada região não podem ser extrapolados para todo o território

50 brasileiro. Muitos aspectos epidemiológicos de enfermidades já bem estudadas e caracterizadas no centro-sul e sudeste ainda não são conhecidos em diferentes partes do território nacional. Além das considerações acima, o estudo da epidemiologia e monitoramento da infecção pelo Toxoplasma gondii em animais tem grande importância na saúde pública, pois estes podem representar sentinelas da infecção para o ser humano. O íntimo contato dos cães com os seres humanos, assim como a ocupação conjunta dos ambientes, fazem desses um bom sentinela para avaliar a contaminação ambiental e alimentar por uma série de agentes variando de toxinas e microorganismos (Assunção et al. 2005, Stucchi 2014). O diagnóstico da infecção do T. gondii nos cães indica um ambiente doméstico contaminado pelo parasito e isso representa um risco de infecção para a população humana, uma vez que tanto o homem quanto os cães estão expostos a um veículo de contaminação comum representado pelo ambiente e hábitos alimentares (Germano et al. 1985, Jackson et al. 1987, Varandas et al. 2001, Ullmann et al. 2008). A toxoplasmose nos cães possui manifestações clínicas amplas que vão de quadros gastrentéricos, respiratórios, hemolinfáticos, oculares, musculares e/ou neurológicos (Dubey et al. 2006). Dessa forma, somente a detecção do agente ou do anticorpo anti-T. gondii em cães enfermos podem ajudar o clínico no diagnóstico definitivo da toxoplasmose (Jeremy et al. 2005). Segundo Varandas et al. (2001) e Ullmann et al. (2008), a detecção de anticorpos anti-T. gondii em cães, além de ser uma boa forma de diagnóstico definitivo da infecção, avalia a dispersão do protozoário no ambiente, demonstrando o papel do cão como animal sentinela para toxoplasmose e ressalta a importância do monitoramento nas ações de saúde pública para o controle desta zoonose (Varandas et al. 2001, Ullmann et al. 2008). Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo estudar a prevalência de anticorpos anti-T. gondii e respectivos fatores de risco para infecção pelo T. gondii em cães, assim como avaliar as repercussões clínico-patológicas da infecção aguda em cães enfermos admitidos pela rotina do Hospital Escola Veterinário (HOVET) da Universidade de Cuiabá. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo foi realizado prospectivamente entre o período de janeiro à dezembro 2013. A população de cães alvo do estudo foram animais admitidos no Setor de Clinica Médica de Animais de Companhia (CMPA) do Hospital Escola Veterinário (HOVET) da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Cuiabá (UNIC). O trabalho foi previamente avaliado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Cuiabá com o registro n° 029 CEP/UNIC – protocolo n° 2010-020. Foi incluído no estudo somente animais provenientes da rotina hospitalar que realizaram o procedimento de venopunção para avaliação hematológica e/ou análise de bioquímica clínica. O número da amostragem dos animais foi definido a partir da média de cães atendidos no Setor de CMPA semanalmente no HOVET da UNIC (aproximadamente 25 atendimentos novos semanais). O programa Epi-Info 6.04 foi usado para o cálculo amostral com prevalência esperada de 50%, precisão mínima de 10% e intervalo de confiança (IC) de 95% (Thrusfield 1995). Foram coletadas amostras de sangue por venopunção cefálica ou jugular, após anti-sepsia prévia do local, com seringa (10 ml) e agulha hipodérmica (25 x 0,70mm) descartáveis. O sangue obtido foi aliquotado em duplicata, uma com anticoagulante e outra sem, e então encaminhado ao laboratório de Análises Clínicas; da alíquota desprovida de anticoagulante, após retração do coágulo, foi obtido o soro, sendo esse acondicionado em microtubo de polietileno de 1,5 mL e armazenado a -20°C até o momento do processamento das amostras no Laboratório de Imunofluorescência da UNIC. Após a coleta de sangue pela rotina hospitalar os proprietários foram convidados a participar da pesquisa e aqueles que aceitaram, responderam um questionário epidemiológico com informações sobre o animal e o ambiente; questionário esse que serviu de base para obtenção de dados e variáveis para análise dos fatores de risco. Foram analisadas variáveis como: origem dos cães (urbanos, rurais ou periurbanos), raça, idade, sexo, tipo de alimentação (comercial, caseira, carne crua), contato com felinos ou outros hospedeiros intermediários (roedores), hábitos de caça e observação de sinais neurológicos. A pesquisa de anticorpos anti-T. gondii foi realizada por meio da técnica de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) a partir da cepa RH de T. gondii e segundo técnica descrita por Camargo (1977). Sucintamente, as amostras de soro foram utilizadas seguindo uma diluição inicial de 1:16 em solução salina tamponada (PBS) com a adição de 1% de soroalbumina bovina. As mesmas foram adicionadas à lâmina previamente sensibilizada com taquizoítos de T. gondii e incubadas em câmara úmida a 37°C durante 30 minutos. Em todas as lâminas foram adicionados como controle soros caninos positivos (reativos) e negativos (não reativos). Depois de incubadas,

51 as lâminas foram lavadas com tampão salina fosfato (PBS) (pH 7.2), seguido de um processo de secagem em temperatura ambiente. Posteriormente foi adicionado o conjugado anti-IgG canino marcado com isotiocianato de fluoresceína (Sigma® Diagnostics, St. Luis, Mo) e uma nova incubação foi feita seguida do mesmo procedimento de lavagem e secagem. Após secas totalmente, as lâminas foram montadas com glicerina tamponada e lamínula e a leitura foi realizada em microscópio de epifluorescência (Axio Scope Carl Zeiss Microscopy®) na objetiva de 40x. As reações foram consideradas positivas, quando os taquizoítos apresentavam fluorescência periférica total. Reações com fluorescência parcial ou apical foram interpretadas como negativas. Foram considerados positivos aqueles que reagiram em diluição a partir de 16; as amostras consideradas positivas passaram por sucessivas diluições na razão dois com objetivo de obter o título final. Títulos de 16, 32, 64, 128, 256 e 512 foram considerados títulos de contato (exposição prévia) e títulos iguais ou maiores que 1024 foram considerados títulos de infecção aguda (Zulpo et al. 2012). As análises de associação foram realizadas pelos testes de Qui-quadrado ou Exato de Fisher, quando necessário (p<0.05), para associar os resultados da sorologia com fatores de risco e variáveis analisadas. RESULTADOS Do total de 386 cães analisados, 227 (58.8%) eram fêmeas e 159 (41.1%) machos; 102 (26.4%) sem raça definida e 284 (73.6%) com raça definida. Não houve associação entre as raças dos cães estudados e a presença de anticorpos anti-T. gondii , mas a maioria dos cães soropositivos foram animais de raça definida (Akita, Basset, Boxer, Chiuahua, Cocker, Dashshund, Fila, Labrador, Pinsher, Pitbull e Rottweiller). Dessas raças, as mais representadas foram Pittbull e Rottweillar, com 4 cães positivos em cada uma das raças, porém sem significância estatística. Com relação a idade, 164 (42.5%) foram menores que 36 meses (3 anos), 206 (53.3%) superiores a 36 meses e em 16 (4.1%) não foi possível determinar a idade (quadro 1). Não houve diferença estatística entre cães positivos e faixa etária (X2=24.74 com p=0.58), porém observou-se maior frequência de reações positivas em cães com idade avançada. Também não houve diferença estatística entre os sexos (X2=0.28 e p=0.59). Anticorpos anti-T. gondii foram detectados em 26/386 (7%; 95%IC; 4.5-9.8) da população estudada. Dos cães positivos, 46% (12/26) dos animais foram admitidos com titulação de 16; 3.84% (1/26) com 32; 19.23% (5/26) com 64; 11.53% (3/26) com 128; 15.38% (4/26) com 256; e apenas um animal (3.44%) foi apresentado com titulação de 4096. Dessa forma, dos 26 animais positivos para T. gondii, 25 apresentaram títulos de contato (menor ou igual a 512) e apenas um teve título compatível com infecção aguda (maior ou igual a 1024). Dos animais com títulos de contato, cinco apresentaram febre, prostração e anorexia, e dois apresentaram perda de peso e vômito. Alterações como anemia, trombocitopenia, leucocitose, leucopenia e azotemia foram variações encontradas nos exames laboratoriais desse pacientes. O animal com títulos de infecção aguda foi um macho, SRD, 4 anos de idade, origem urbana, tinha contato com roedores e gato, hábitos de caça, alimentação mista e apresentava como sinais clínicos febre, perda de peso, alterações dermatológicas e quadro neurológico multifocal caracterizado por convulsão e distúrbio espinhal torocolombar (paraplegia). Nos exames laboratoriais sanguíneos e bioquímicos foram encontrados 3.7 milhões de eritrócitos por dl, 8.9 mg de hemoglobina por dl, 28% de volume globular, 60 mil plaquetas, 6.200 leucócitos totais (248 linfócitos, 5890 segmentados e 62 bastonetes), 8.8 g/dl de proteínas totais, 26.1 de ALT e 0.8 de creatinina. Os resultados de frequência e a análise de associação das diferentes variáveis com a sorologia para T. gondii estão apresentados no Quadro 2. Distúrbios neurológicos foram observados em 12/386 animais (5.43%; 95% IC; 3.4-8.3), contudo em somente um animal (3,84%). foi verificado sorologia positiva. As variáveis significativas foram ingestão de vísceras (14.47%; 95%IC; 11.2-18.4; OR=3.5; P<0.005), origem rural (5.7%; 95%IC; 3.6-8.6; OR=7; P<0.005) e contato com bovinos (4.1%; 95%IC; 2.4-6.7; OR=5.2; P<0.05). DISCUSSÃO

52 No Brasil , estudos mostram que a prevalência de anticorpos anti-T. gondii em cães é heterogênea, com resultados variando 8.2% a 88.5% (Romanelli et al. 2007, Santos et al. 2009). Diferenças climáticas e culturais de cada região, tipo de população estudada e critério de inclusão pré-estabelecidos, como sintomatologia dos animais avaliados, são exemplos de variáveis que podem gerar diversidades nos dados de prevalência nos estudos realizados nas diferentes regiões do país. Zulpo et al. (2012) e Lopes et al. (2011) estudando amostras de cães hospitalares obtiveram prevalência de 50.89% (57/112) em Londrina-PR e 18% (100/530) no Piauí, respectivamente. Comparando com esses dados, o resultado de prevalência encontrado no presente estudo (7%) pode ser considerado relativamente baixo. O município de Cuiabá, segundo o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), pode apresentar médias altas de temperaturas (acima de 40°C) e médias baixas de umidade relativa do ar (abaixo de 20%), fatores estes que poderiam contribuir para a não esporulação ou degradação de oocistos (Neves 2011) e assim contribuir com uma menor contaminação ambiental. Os sinais clínicos e alterações laboratoriais encontradas nos 25 animais positivos com títulos de contato devem ser cautelosamente avaliados e não poderiam ser categoricamente assumidos como sendo causados pela infecção do T. gondii; provavelmente as doenças de base responsável pela admissão hospitalar desses pacientes eram outras. No entanto, é de fundamental importância o reconhecimento da infecção prévia por T. gondii nesses pacientes hospitalares. Dependendo da causa da admissão, mesmo não sendo a toxoplasmose a responsável, o paciente deveria receber o tratamento anti-protozoário profilaticamente ou ser monitorado para posterior tratamento em caso de reagudização da enfermidade por recrudescência dos bradizoítos encistados. Nos pacientes humanos previamente expostos e portadores assintomáticos de cistos teciduais de T. gondii, um grande fator de risco para a manifestação clínica e morte por toxoplasmose é a ocorrência de doença imunossupressora, como por exemplo, a AIDS (Lazo et al. 1998, Ferreira & Borges 2002, Barsotti & Moraes 2005). Em cães, várias condições podem conduzir a imunossupressão, como cinomose, leishmaniose, doenças endócrinas, e até mesmo gestação, entre outras (Gemmill 2008, Smith et al. 2007). Além disso, em muitas outras enfermidades os protocolos terapêuticos utilizam drogas imunossupressoras como no lúpus, anemia hemolítica autoimune, pênfigo, tumores, e até alguns casos de encefalites (Smith et al. 2007, Coates & Jeffery 2014, Nafe et al. 2014, Taylor et al. 2014). Vários estudos têm avaliado a prevalência da toxoplasmose em pacientes portadores de enfermidades neurológicas (Plugger et al. 2011, Girardi et al. 2014). No entanto, muito cuidado deve ser tomado na interpretação dos resultados; um resultado sorológico positivo não é o suficiente para incriminar o T. gondii como agente etiológico, uma vez que muitos animais podem possuir apenas títulos de contato prévio e não de doença/infecção aguda. Plugger et al. (2011) realizaram uma pesquisa com 147 cães domiciliado/errantes que apresentavam sinais neurológicos como convulsão, paresia ou paralisia, ataxia, alterações de comportamento, alterações sensoriais somáticas, e encontrou uma prevalência de 21.08% para toxoplasmose, sendo convulsões, ataxia e paralisia os sinais neurológicos registrados nos pacientes positivos. Nesse estudo de Plugger et al. (2011) todos os pacientes exibiram títulos abaixo de 800; logo, a extrapolação desses sinais neurológicos como sendo devidos a toxoplamose deveria ser feito com respaldas, uma vez que apenas títulos superiores a 1024 poderiam estar associados a infecção aguda (Zulpo et al. 2012). A toxoplasmose é tipicamente uma enfermidade multissistêmica (Dubey & Lappin 1998). Os sinais de febre, perda de peso, déficits neurológicos, alterações eritrocitárias (anemia), leucocitárias (linfopenia) e plaquetárias (trombocitopenia moderada) encontradas no paciente com título de infecção aguda do presente trabalho, vêm de encontro com o conceito de acometimento multissistêmico na infecção pelo T. gondii . É importante ressaltar que existe a possibil idade de co-infecções do T. gondii com outros agentes como, por exemplo, a Ehrlichia canis (Girardi et al. 2014) e o vírus da cinomose canina (CDV) (Aguiar et al. 2012); nessas situações mais de um agente poderia estar contribuindo com os sinais clínicos neurológicos/não-neurológicos, assim como com as alterações laboratoriais (Giraldi et al. 2002). No entanto, a possibilidade de co-infecção com E. canis e/ou CDV não foi avaliada no presente estudo.

53

Muita ênfase é dada às repercussões neurológicas nos pacientes caninos com toxoplasmose. Os autores acreditam que isso ocorra provavelmente pela transposição para a Medicina Veterinária da importância da neurotoxoplasmose congênita humana. No entanto, no conhecimento dos autores, a ênfase que se tem dado a neurotoxoplasmose nos caninos deveria ser revista. Em um estudo anatomopatológico com cães portadores de doença neurológica que vieram a óbito, apenas dois de 60 animais tinham neurotoxoplasmose (Amude 2008). O conhecimento da prevalência da toxoplasmose, assim como outras enfermidades infecciosas causadoras de distúrbios neurológicos deveria ser sabido nas diferentes regiões. Muitas outras enfermidades com potenciais neurotrópicos podem possuir taxas de prevalência superiores as registradas para toxoplasmose. Como exemplo, pode-se citar a erliquiose que pode chegar a uma prevalência de 70 a 90% (Santos et al. 2013); em um estudo de fatores de risco em uma população hospitalar, a presença de sinais neurológicos foi considerado risco para infecção por Ehrlichia canis (Trapp et al. 2006). A cinomose tem sido reconhecida como a principal causa de óbito em animais (Silva et al. 2007) e a principal responsável por causar distúrbios neurológicos (Greene & Appel 2006, Amude 2008). Portanto a neurotoxoplasmose nos caninos deve ser incluída no diagnóstico diferencial, entre os inúmeros agentes infecciosos que podem causar doença neurológica (Braund 1994, Vite 2005), como por exemplo, a erliquiose (Trapp et al. 2006, Santos et al, 2013), a leishmaniose (Grano et al. 2014) e a cinomose (Amude et al. 2007). Em um estudo realizado em Cuiabá, utilizando uma amostra de cães com viés de seleção, onde se incluiu apenas animais com sinais neurológicos (58 cães), foi observado uma prevalência de 10,3% de anticorpos anti-T.gondii (Girardi et al. 2014). Se compararmos esse resultado com o resultado de prevalência (7%) do presente estudo, que avaliou uma população hospitalar geral, pode-se sugerir que na região de Cuiabá a prevalência de toxoplasmose em animais portadores de enfermidades neurológicas tende a ser similar a prevalência de toxoplasmose em animais de uma população hospitalar geral. Essa tendência também pode ser verificada no presente estudo quando comparamos os dados de prevalência nesses dois tipos de população, uma vez que a prevalência de toxoplasmose na população geral (7% - 26/386) foi similar a encontrada na população com sinais neurológicos (8.33% - 1/12). As associações entre a presença de anticorpos anti-T. gondii e as variáveis analisadas pelo teste do X2 ou Exato de Fisher identificaram como variáveis estatisticamente significativas (p<0.05), a ingestão de vísceras, a origem rural e o contato com bovinos. Adicionalmente, os cães de origem rural apresentaram maiores risco (OD = 7.00) de infecção do que aqueles de origem urbana. Provavelmente esse risco aumentado pode estar ligado ao fato desses animais terem mais chances de ingerirem vísceras pelos hábitos e costumes dos moradores rurais fornecerem aos cães as vísceras dos animais abatidos na propriedade para o consumo humano. Corroborando com essa hipótese, Marques et al. (2009) constataram uma alta prevalência (47.61%) de anticorpos anti-T.gondii em cães provenientes de 20 propriedades rurais no Estado do Mato Grosso do Sul. A significância encontrada no caso de contato com bovinos, não necessariamente ligam a toxoplasmose canina ao bovino, diferente do que acontece na neosporose. A significância matemática encontrada provavelmente pode estar ligada ao fato de que cães que tem contato com bovino provavelmente moram em ambiente rural, e segundo os resultados deste trabalho os riscos aumentados nesse tipo de ambiente. Não houve diferença estatística entre cães positivos e faixa etária (X2=24.74 com p=0.58), porém, observou-se maior frequência de reações positivas em cães com idade avançada, provavelmente devido a um maior tempo para a exposição ao agente. Esses dados estão em concordância com Garcia et al.(1999) que verificaram que a soropositividade dos cães aumentam com a idade. CONCLUSÃO Embora com prevalência menor do que em outras regiões do Brasil , as infecções por T. gondii ocorrem em cães de Cuiabá-MT. A baixa prevalência da infecção nos cães dessa região pode indicar um ambiente doméstico pouco contaminado pelo parasito com um risco menor de infecção para a população comparada com outras regiões brasileiras. A infecção aguda não foi

54 uma afecção clínica expressiva nessa ambiência hospitalar, no entanto, diagnóstico diferencial deve ser feito nos pacientes enfermos, principalmente os da área rural, e diagnostico definitivo deve ser alcançado para a correta conduta terapêutica. Agradecimentos-. Esse trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Mato Grosso (FAPEMAT). REFERÊNCIAS Aguiar D.M., Amude A.M., Dos Santos L.G.F., Ribeiro M.G., Ueno T.T.E.H., Megid J., Paes A.C., Alfieri A.F., Alfieri A.A. & Gennari S.M. 2012. Canine distemper virus and Toxoplasma gondii co-infection in dogs with neurological signs. Arq. Bras. de Med. Vet. e Zoot. 64(01):232-235. Amude A.M. 2008. Encefalomielite pelo vírus da cinomose canina: aspectos neuroclínicos e neuropatológicos, e uso de técnicas moleculares para o diagnóstico seguro. Tese de Doutorado em Ciência Animal – Centro de Ciências Agrárias – Universidade Estadual de Londrina. 216p. Amude A.M, Alfieri A.A & Alfieri A.F. 2007. Clinicopathological findings in dogs with distemper encephalomyelitis presented without characteristic signs of the disease. Res. Vet. Sci. 82:416-422. Assunção L., Pamplona M., Gentil K. & Miranda, D. 2005. p.47-52. Vigilância Epidemiológica. Manual integrado de vigilância epidemiológica do botulismo. Ministério da Saúde: Secretária de Vigilância em Saúde. Brasília: Ministério da Saúde. Brasília. 88p. Barsotti V. & Moraes A.T. 2005. Neurotoxoplasmose como primeira manifestação da síndrome de imunodeficiência adquirida. Rev. Fac. Ciênc. Méd. Sorocaba, 7(2):20-22. Braund K.G. 1994. Clinical Syndromes in Veterinary Neurology. 2nd ed. Mosby, St Louis. 477p. Bresciani K.D.S., Costa J., Nunes C.M., Serrano A.C.M., Moura A.B., Stobbe N.S., Perri S.H.V. Dias R.A. & Gennari S.M. 2007. Ocorrência de Anticorpos Contra Neospora caninum e Toxoplasma gondii e Estudo de Fatores de Risco em Cães de Araçatuba-SP. ARS Vet. Jaboticabal SP. 23(1)40-46. Coates J.R & Jeffery N.D. 2014. Perspectives on meningoencephalomyelitis of unknown origin. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 44(6):1157-85. Camargo, M.E. 1974. Introdução às técnicas de imunofluorescência. Rev. Bras. de Pat. Clín. 10:143-69. Corrêa W.M. & Corrêa C.N.M. 1992. Toxoplasmose, p.757-766. In: ______. Enfermidades infecciosas dos mamíferos domésticos. Rio de Janeiro: Medsi. 844p. Costa V.M., Silva R.C., Brant J.L., Módolo J.R. & Langoni H. 2013. Prevalence and geographical distribution of Toxoplasma gondii in dogs in the urban area of Botucatu, SP, Brazil. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. 50(2):152-155. Dubey J.P. 1977. Toxoplasma, hammondia, besnoitia, sarcocystis and other tissue cyst-forming coccidia of man and animals, p.101-71 In: KREIER, J. P. Parasitic protozoa. Vol.3 New York: Academic Press. Dubey J.P., Beattie C.P. 1998. Toxoplasmosis in dogs (Canis familiaris), p.127-42. In: ______. Toxoplamosis of animals and man. Boca Raton: CRC Press. 232P. Dubey J.P., Chapman J. L., Rosenthal B. M. Mense M. & Schueler R. L. 2006. Clinical Sarcocystis neurona, Sarcocystis canis, Toxoplasma gondii, and Neospora caninum infections in dogs. Vet. Parasit. 137:36–49. Dubey J.P. & Lappin M.R. 1998. Toxoplasmosis and neosporosis, p.493-503. In: GREENE, C. E. Infectious diseases of the dog and cat. 2.ed. Philadelphia: WB Saunders Company. 1376p. Ferreira M.S. & Borges A.S. 2002. Some aspects of protozoan infections in immunocompromised patients - a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 97(4):443-457. Fereira I.M., Vidal J.E., de Mattos C.C., de Mattos L.C., Qu D., Su C. & Prereira-Chioccola VL. 2011. Toxoplasma gondii isolates: multilocus RFLP-PCR genotyping from human patients in Sao Paulo State, Brazil identified distinct genotypes. Exp. Parasit. 29(2):190-195. Grano F.G., Melo G.D., Belinchón-Lorenzo S., Gomez-Nieto L.C. & Machado G.F. 2014. First detection of Leishmania infantum DNA within the brain of naturally infected dogs. Vet. Parasit. 204:376–380. Fioravanti C. 2012. Parasitas Emergentes - Formas brasileiras de Toxoplasmose. Rev. Pesq. FAPESP. 193:42-45. Garcia J.L., Navarro I.T., Ogawa L. & Oliveira, R.C. 1999. Soroepidemiologia da toxoplasmose em cães e gatos de propriedades rurais do município de Jaguapitã, Estado do Paraná, Brasil. Ciên. Rural. 29(1):99-104. Gemmill T.J. 2008. SELF ASSESSMENT - What is your diagnosis? J. Small Anim. Pract. 49:110-112.

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