UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA Producción de lacasa a partir de hongos ligninolíticos utilizando vinazas y bagazo de origen mezcalero Avances Alumna: I.A. Stefi Castillejos-Márquez Director de tesis: Dr. Vania S. Robles-González Co- Director: Dra. Ireri V. Robles-González Asesores: Dra. Edith Graciela González Mondragón Dr. Raúl Salas Coronado Dr. Rogelio Valadez Blanco Huajuapan de León, Oaxaca. Mayo de 2014
117
Embed
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA...Pleurotus spp. y Trametes versicolor en medio sólido y líquido. –Realizar la formación de pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo)
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA
DE LA MIXTECA
Producción de lacasa a partir de hongos
ligninolíticos utilizando vinazas y bagazo de
origen mezcalero
Avances
Alumna: I.A. Stefi Castillejos-Márquez
Director de tesis: Dr. Vania S. Robles-González
Co- Director: Dra. Ireri V. Robles-González
Asesores:
Dra. Edith Graciela González Mondragón
Dr. Raúl Salas Coronado
Dr. Rogelio Valadez Blanco
Huajuapan de León, Oaxaca. Mayo de 2014
Contenido Introducción
Justificación
Hipótesis
Objetivos
Metodología
Resultados y discusión
Conclusiones
2
Abreviaturas
• AE: Actividad enzimática
• CDS: Caldo dextrosa sabouraud.
• DQO: demanda química de oxígeno
• EM : Extracto de malta
• HL: hongo ligninolítico
• Lac: Lacasa
• Lip: lignino peroxidasa
• MC: medio de cultivo
• MnP: manganeso peroxidasa
• PeAh: Penca de agave Augustifolia haw (Espadín)
• PePz: Penca de agave Potatorum zucc (tóbala)
• PDS: papa dextrosa sabouraud.
• PiPz: Piña de agave Potatorum zucc (tóbala)
3
Introducción
Enzimas
4 Domínguez et al., 2006; Santos et al., 2012
Producción de enzimas
Organismo
• Bacteria
• Hongo
• Planta, etc.
Sistema fermentativo
• Sustrato
• Tipos de cultivo
• Condiciones de cultivo.
Recuperación
• Métodos Físicos
• Métodos químicos
5
6
Costos
elevados
Desechos industriales
Shin y Lee, 2000; Si, 1994; Ren et al., 2007; Steele et al., 2005; Kahraman y Yesilada, 2001; Pant y Adholeya, 2007
Comúnmente contienen
compuestos recalcitrantes como
fenoles, lignina, celulosa, etc;
7
Pueden utilizar como
sustrato a los
desechos debido a
enzimas que
producen
Dellamatrice, et al 2005; Archibald, et al., 1997; Takemori et al., 1992
8
Hongos
ligninolíticos (HL) Lacasa
(Lac)
Lignino
peroxidasa
(LiP)
Manganeso
peroxidasa
(MnP)
Pleurotus spp.
Trametes
versicolor. Homolka, et al., 1997, Mijiashvili, et al., 2006; Mendonça et al., 2010; Gedikli, et al., 2010; Archibald, et al., 1997; Osma, et
al., 2010
Aplicaciones de la lacasa
Lacasa
Textil
Papelera
Ambiental
Alimentaria
9
Proceso de elaboración del mezcal
Materia prima Trozamiento Cocimiento
(Hidrólisis)
Mieles de
cocimiento
Molienda Bagazo
15 a 20 kg /L
de mezcal
Rectificación
Fermentación
Destilación
Vinazas
8 a 15L / L de
alcohol
destilado
10 Robles- González et al., 2011
14 millones de
litros de vinazas
19 millones
de kg de
bagazo
11 Duarte et al., 1997; Sangave et al., 2007; García et al., 1997; Jiménez et al., 2003; Coca et al., 2005; Robles- González et
al., 2011; Romahnolo- Herrera, et al., 2011
Vinazas
DQO 70,000–150,000 mgO2/L DBO
35,000–50,000 mgO2/L
pH ácido 3.5 -4.5
Nitrógeno 900 mgNH3-
N/L
Azúcares reductores 962mg/L
Fenoles 478.4 -541.8 mg de ácido
gálico/L
Color oscuro
Características fisicoquímicas de las
vinazas.
Sistemas fermentativos
Enzimas
Fermentación en cultivo sumergido
Fermentación en estado
sólido
12 Aguilar et al., 2008; Toca et al., 2009; Moldes et al., 2003; Vintila et al., 2008
- Ambiente similar al
del hábitat natural
del hongo.
-Bajo requerimiento
energético
-Bajo costo
-Baja producción de
aguas de desecho
-Mayor facilidad para
obtener datos de pH,
acidez.
- Mejor extracción
del sustrato
producido
- Mejor transferencia
de nutrientes.
Métodos de extracción y
purificación
Precipitación, centrifugación y re- suspensión
Cromatografía de intercambio
iónico Identificación por cromatografía en
gel
13
Uso de membranas
Champagne y Ramsay, 2005; Paszczynski, et al., 1994; Shraddha, et al., 2011
Justificación del problema
• El estado de Oaxaca produce el 60% de mezcal a nivel
nacional, en el año 2012 se generaron cerca de 14
millones de litros de vinazas y más de 19 millones de
kilos de bagazo, por lo cual estos residuos pueden ser
aprovechados para la producción de lacasa.
14 COMERCAM, (2010-2011)
Originalidad
• La originalidad del trabajo radica en los siguientes puntos.
i) El uso de residuos de la industria mezcalera (vinazas y bagazo) para la producción de lacasa.
ii) Evaluación de actividad enzimática de lacasa en cepas de Pleurotus spp. (Parentales e híbridos) aisladas en la UTM.
iii) Formación y uso de pellets dobles (HL+bagazo).
15
Hipótesis
• La presencia de azúcares residuales de la fermentación
de agave así como de ácidos fenólicos en las vinazas de
origen mezcalero servirán como medio de cultivo para la
producción enzimática de lacasa empleando Trametes
versicolor y Pleurotus spp.
16
Objetivos
• General
– Producir lacasa a partir de Pleurotus spp. y
Trametes versicolor empleando vinazas y
bagazo de origen mezcalero como sustrato.
17
Objetivos • Específicos
– Efectuar la caracterización fisicoquímica del bagazo y las vinazas mezcaleras.
– Realizar el cultivo, propagación y mantenimiento de Pleurotus spp. y Trametes versicolor en medio sólido y líquido.
– Realizar la formación de pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo) para utilizarlos como biocatalizadores.
– Evaluar la actividad enzimática de lacasa utilizando pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo).
– Evaluar la influencia de la concentración de fructosa en vinazas en la producción de la enzima lacasa.
– Realizar la separación, extracción y purificación parcial de la lacasa del medio de cultivo líquido.
18
METODOLOGÍA
19
Plan general de trabajo
20
Caracterizar fisicoquímicamente las
vinazas y el bagazo de origen
mezcalero
Evaluar los medios de cultivo
sólidos y líquidos
Evaluar la actividad enzimática de las cepas de
Pleurotus spp.y de Trametes versicolor.
Mantener y propagar los hongos
ligninolíticos
Fermentación en estado sólido
(bagazo + HL)
Obtener la enzima
Extraer e identificar la enzima lacasa producida
por el hongo ligninolítico que presente la mayor
actividad enzimática
Seleccionar las cepa de Pleurotus spp. con mayor actividad enzimática
Formar el biocatalizador
(bagazo+HL) (cepas con mayor
actividad enzimática)
FASE I: Caracterización fisicoquímica de vinazas
21
Parámetro Método
pH Método estándar 423
Demanda Química de Oxígeno
(mgO2/L)
Método estándar 5220 D
Sólidos suspendidos volátiles, fijos y
totales (mg/mL)
Método estándar 2540
Conductividad (µS/cm) Método estándar 2510 B
Sulfatos (mg SO2- 4/L Método 8051 HACH MR
Fosfatos (mg PO3- 4/L) Método 8048 HACH MR
Nitrógeno total (mg N/L) Método 10071 HACH MR
Fenoles totales (mg ácido gálico/L) Box, 1983
Color (abs 580 nm) Peña et al., 2003
Aromáticos totales (abs 254 nm) Benitez et al., 2003
Cenizas (g/g de bagazo) 0.12a ± 0.007 0.11a ± 0.008
Ca+2 (ppm) 265 239a ± 22 520 202 311a ± 6659
K+1 (ppm) 48 159a ± 3814 16 386b ± 4548
Mg+2 (ppm) 34 075a ± 775 26 969a ± 1816
Na+1 (ppm) 894a ± 98 417b ± 119
Fe+3 (ppm) 1106a ± 208 738a ± 195
Cu+2 (ppm) 482a ± 16 480a ± 1
Zn+2 (ppm) 269a ± 47 546b ± 2
Ni+2 (ppm) No detectable No detectable
Cd+2 (ppm) No detectable No detectable
Fase I. Caracterización fisicoquímica del bagazo
Nota: Superíndice a- a: no hay diferencia significativa, a un nivel de significancia de 0.05; superíndice a-b: existe
diferencia significativa. Desing Expert versión 6.0.10.
Medio líquido
• En el medio A y B no se observó crecimiento en las cepas ensayadas.
• En CDS 2% (Medio C) y CDS 2% + extracto de malta (Medio D) se logró el crecimiento.
Medio sólido
• No se observó crecimiento en la piña de agave Potatorum zucc (tobalá).
• En PeAh y PePz si se observó crecimiento y se procedió con al evaluación de actividad enzimática de lacasa
FASE II: Evaluación de medios de cultivo
para el crecimiento de Pleurotus spp.
46
47
Cepa Actividad enzimática
UTM-B (Medio C) 94±7 U/L
UTM-B (Medio D) 248±0.2 U/L
H1R4B6 (Medio C) 6.9±0.1 U/L
H1R4B6 (Medio D) 81±1 U/L
UTM-R (Medio C) 1.6±0-003 U/L
UTM-R (Medio D) 7.4±0.7 U/L
H2R2B4(Medio C) 6.4±0.017 U/L
H2R2B4(Medio D) 18.3±0.7 U/L
H2R3B4 (Medio C) 3.1±1 U/L
H2R3B4 (Medio D) 2.4±0.3 U/L
H3R2B1 (Medio C) 2.9±0.034 U/L
H3R2B1 (Medio D) 81±1 U/L
Tv (Medio C) 538±58 U/L
Actividad enzimática
obtenidas de las
cepas de Pleurotus
spp. y Trametes
versicolor
evaluadas en el
medio C y D; En
cultivo sumergido
Nota: cds: Caldo dextrosa
sabouraod (Medio C).
Cds+em: caldo dextrosa
sabouraud con extracto de
malta (Medio D). TVC: Trametes versicolor.
FASE III: Selección de la cepa (s) de Pleurotus spp que
presenten la mayor actividad enzimática de lacasa y
evaluación de actividad enzimática de Trametes
versicolor (Tv)
Fase IV. Formación de pellets
dobles. Los pellets dobles formados con BPeAh +PsUTM-B. y BPeAh+Tv presentaron un diámetro promedio de 0.5 ± 0.1 cm.
Pellets dobles formados con BPeAh – Pleurotus spp.(a) o Trametes versicolor (b).
(b) (a)
48
Fase V. Actividad 1. Cinética de AE
evaluadas en FCS.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 5 10 15 20
Act
ivid
ad
en
zim
áti
ca
(U/L
)
Tiempo (días)
Cinética de actividad de lacasa empleando pellets de BPeAh-Tv y vinazas
mezcaleras. ○: VM diluidas a 674 mg de fructosa/L; Δ: VM diluidas a 917 mg
de fructosa/L
49
2402 U/L
997.33 U/L
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15 Acti
vid
ad
en
zim
áti
ca (
U/L
)
Tiempo (días)
Cinéticas de actividad enzimática de lacasa empleando pellets de BPeAh - Ps-
UTM-B con vinazas mezcaleras ○: VM diluidas a 674 mg de fructosa/L; Δ: VM
diluidas a 917 mg de fructosa/L.
50
13.9 U/L
1.33 U/L
A concentraciones de 1303 y 1918 mg fructosa/L, no se observó actividad enzimática.
Eggert et al.(1996) reportan que a concentraciones altas de azúcares simples en el medio de cultivo, pueden causar inhibición en la producción de lacasa.
79 1) Gnanamani, A; et.al.1959. 2) Zhiyu, L. 2009. 3) Malhotra, K; et.al. 2004. 4) Li- Quiong, G., et al. 2011. 5)Hess, J.
2002. 6) Elisashvili, V., et.al. 2010. 7) pozdnyakova, N. et.al. 2011. 8) Asgher, M. 2006.
Lacasa
• Lacasa (benzenodiol:oxygeno
oxidoreductasa, EC 1.10.3.2) son
oxidasas multicobres, que catalizan
reacciones de oxidación, y tiene como
sustrato compuestos aromáticos, y al
mismo tiempo ocurre el oxígeno molecular
a agua(b). Su peso molecular es de 60 -
100KDa. Puntos isoeléctricos de 3 a 7 ,
pH óptimo de 3.6. (a).
80 a) Madhavi, V; et.al 2009. b) Lettera, V; et.al. 2010.
Lignino Peroxidasa
• Ligninasa es el nombre genérico para un
grupo de isozimas que catalizan la
despolimerización oxidativa de lignina .
• Ensayo : Ligninasa cataliza la oxidación
del alcohol veratrílico a veratraldehido en
presencia de peróxido de hidrógeno (a).
• La actividad de Lip, fue determinada a T
de entre 25 y 65 C a su pH óptimo (b).
81 a) Tien, M; Kirk, K. 1988. b) Yang, J; et.al. 2005.
Manganeso peroxidasa
• Oxida al Mn(II) a Mn(III) y muestra
actividad oxidasa, produciendo peróxido
de hidrógeno por oxidación del sustrato al
estado reducido como NAD(P)H,
glutationa (GSH), ditiotreitol (DTE) y ácido
dihidroximaleico. La reacción es
catalizada de la siguiente manera (a):
2 Mn2+ + H2O2 2Mn3++H2O
82 a) Pasczynki et al., 1986
Arabiloxilano
• Polisacaridos que se encuentran en el salvado de trigo,
cebada y centeno. Las unidades de arabinosa que lo
componen producen compuestos viscosos con el agua
que afectan la consistencia de la masa, retención de
burbujas de la fermentación en las películas de gluten y
almidón y la textura final del pan..
83
Columna de cromatografía. • DEAE Sephacel ™ es un intercambiador de
aniones débiles a base de celulosa moldeada.
• El ion intercambio grupo es dietilaminoetilo, conserva su carga y mantiene consistentemente alta capacidad en toda la gama de trabajo, pH 2-9.
• DEAE Sephacel es macroporosa y tiene un límite de exclusión de aproximadamente 1000 000 daltons de las proteínas globulares.
84
Norma
• NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-052-
SEMARNAT-2005, QUE ESTABLECE
LAS CARACTERÍSTICAS, EL
PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN,
CLASIFICACIÓN Y LOS LISTADOS DE
LOS RESIDUOS PELIGROSOS.
85
Ciclo de vida de los hongos
86
87
88
Actividades enzimáticas obtenidas de la cinética en cultivo
sumergido empleando pellets dobles con diferentes soportes.
Origen del polvo de bagazo Actividad enzimática (U/L)
PiAT + Tv –A 1362.4
PiAT + Tv- B 2668.0
PeAT+Tv-A 1476.2
PeAT+Tv-B 5634.8
PeAE+Tv-A 4304.1
PeAE+Tv-A 1432.3
Aserrín + Tv-A 49.0
Aserrín + Tv-B 1308.0
89
Actividad enzimática
• Una unidad de actividad enzimática (símbolo U) es la
cantidad de enzima que en una reacción
enzimática cataliza la conversión de
1 µmol de sustrato por minuto. Se utiliza también en
combinación con otras unidades (U/mg de proteína o
U/mL) para señalar, respectivamente, la actividad
enzimática específica o la concentración de actividad
enzimática.
90
91
Enzima Métodos para
determinar actividad
enzimática
Estructura Referencia
Lacasa
ABTS
Karp et al., 2012;
Dwivedi et al., 2011;
Babiĉ y Pavko,
2012; Iandolo et al.,
2011; Schückel et
al., 2011; Zhi-Xin et
al., 2010.
Siringaldazina
Mikiashvili et al.,
2006; Schückel et
al., 2011; Zhi-Xin et
al., 2010.
2,6 dimetoxifenol
Tlecuitl-Beristain et
al., 2008; Schückel
et al., 2011; Zhi-Xin
et al., 2010.
Guayacol Schückel et al.,
2011; Zhi-Xin et al.,
2010.
2,4-diclorofenol / 4-
aminoantipirina
Schückel et al.,
2011;
92
93
Enzima y hongo Método de extracción Método de purificación Ref.
Lacasa; Pleurotus
ostreatus.
Lacasa, Coniothyrium
variabile.
Homogeneización de los cuerpos
fructíferos del hongo, seguido por
centrifugación a 13000g/30 minutos y
filtración del sobrenadante.
Sulfato de amonio al 80% de
saturación, centrifugación a 10000g/40
minutos, re-suspensión del precipitado.
Se realizó una diálisis y cromatografía
de intercambio iónico (columna aniónica
con sepharosa), se recolectaron las
fracciones de la enzima, y se filtraron
con una membrana PM-10. Se sometió
a una columna de intercambio aniónico
Q.
Lettera
et al.,
2010;
Foroot
anfar et
al.,
2011;
Salony
et al.,
2006
Lacasa, Cyathus bulleri.
Sedimentación por centrifugación,
filtración, ultrafiltración,
Precipitación de proteínas con sulfato
de amonio, centrifugación,
cromatografía en gel.
Autore
et al.,
2009
Lacasa, Polyporus sp.
Homogeneización y centrifugación a
5000g/15min
Concentración del sobrenadante por
ultrafiltración (viva flow 200 system,
200cm2), seguido por el análisis con
cromatografía de intercambio iónico
(anionico, DEAE, sepharosa flujo
rápido). Se comprobó la presencia de
lacasa por el ensayo de actividad. Las
fracciones positivas se sometieron a
ultrafiltración, finalmente se sometió a
una columna sephadexG100.
Lo-
Qion et
al., 2011.
Métodos para la purificación de lacasa.
Enzima Referencia
Hongos se la pudrición
blanca
Lacasa Pointing, 2001; Silverio
et al., 2013;
Lignino peroxidasa Pointing, 2001; Pant y
Adholeya, 2007.
Manganeso peroxidasa Pointing, 2001;
Champagne y Ramsay,
2005.
Glioxal oxidasa Kersten, 1990; Pointing,
2001.
Superoxido dismutasa Pointing, 2001.
Glucosa oxidasa Wong et al., 2008;
Pointing, 2001.
Aril alcohol oxidasa Goswami et al., 2013;
Pointing, 2001,.
Celobiosa: quinona
oxidoreductasa
Pointing, 2001.
Celobiosa
deshidrogenasa
Pointing, 2001.
Versatil peroxidasa Pointing, 2001. 94
Sustratos de la Lacasa
• Laccases are nonspecific with regard to reducing substrates. They catalyze oxidation of various organic substances, including O and p-diphenols, aminophenols, polyphenols, polyamines, methoxy phenols, lignins, aryl diamines, and some inorganic ions with simultaneous direct reduction of dioxygen to water without intermediate production of hydrogen peroxide (Yaropolov et al., 1994; Solomon et al., 1996; Reinhammar, 1984; Gianfreda et al., 1999; Morozova et al., 2007)
95
Marco teórico
96
Producen
Bacterias
Hongos
Más
utilizadas
Debido a :
- Cantidad
- Tipo y Variedad
Domínguez et al., 2006; Santos et al., 2012; Wang et al., 2013; Vhardwaj et al., 2013; Ramesh y Venugopalan, 1987
Aplicaciones de lacasa en la industria textil, papelera y
biorremediación
Enzima Aplicaciones Ref
.
Lacasa
Despolimerización de lignina
1,2 Deslignificación de pastas de madera
Blanqueo de pastas kraft
Degradación de blanqueo de colorantes textiles 3,4
,5
Biodegradación de hidrocarburos xenobióticos
aromáticos policiclicos. 6,7
Ref: 1)Bourbonnais et al, 1997; .2) Lund y Ragauskas, 2001; 3) Mc Kay, 1979; 4) Cripps et al. 1990; 5)Cooper, 1993; 6) Pointing, 2001; 7) Bamforth y Singleton,
2005.
97
Enzima Aplicaciones Ref.
Lacasa
Estabilidad de vinos (reducción de compuestos
polifenólicos) 1,2
Estabilización de cerveza (reducción de compuestos
polifenólicos) 2,3
Clarificante en el procesamiento de jugos de fruta
(reducción de compuestos polifenólicos) 4,5
En panadería, aumentando la fuerza, estabilidad,
maleabilidad de la masa. (ruptura de los enlaces
entrecruzados de ácido ferúlico y arabinoxilano) 6,7