UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA ' Facultad de Ciencias Escuela Profesional de Química Tesis para optar el Título Profesional de: Licenciado en Química Titulada: "Análisis de hidrocarburos totales de petróleo (Cto-C4o) y de hidrocarburos aromáticos policíclicos (fenantreno, pireno y benzo(a) antraceno) para muestras de aguas y suelos mediante cromatografia de gases" Presentado por: Marcelo Bazán, John Franklin Asesor: Doctor Gino Picasso Escobar LIMA-PERÚ 2013 1
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA - …cybertesis.uni.edu.pe/bitstream/uni/3746/1/marcelo_bj.pdf · GLOSARIO USADO EN ESTE TRABAJO Cromatógrafo de Gases. Hidrocarburos Totales de
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
' Facultad de Ciencias
Escuela Profesional de Química
Tesis para optar el Título Profesional de:
Licenciado en Química
Titulada:
"Análisis de hidrocarburos totales de petróleo (Cto-C4o) y de hidrocarburos aromáticos policíclicos (fenantreno, pireno y benzo(a) antraceno) para muestras
de aguas y suelos mediante cromatografia de gases"
Presentado por:
Marcelo Bazán, John Franklin
Asesor:
Doctor Gino Picasso Escobar
LIMA-PERÚ
2013
1
ALUMNO
Nuevo sello
TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................ 2
VII. ANEXOS ................................................................................................................ 121
5
RESUMEN
En el presente trabajo, se han implementado métodos cromatográficos para el análisis de
los hidrocarburos totales de petróleo C 1 O-C40 (TPH) y de hidrocarburos aromáticos
policíclicos (PAH's: fenantreno, pireno y benzo(a)antraceno) para muestras de agua y
suelo, provenientes de empresas mineras y petroleras mediante cromatografía de gases,
para el caso de TPH, la identificación se realizo con el cromatógrafo de gases GC-V arian
450C y para los P AH' s, el cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas
GC-MS Shimadzu QP20; encontrando en cada caso la configuración más apropiada que
incluye el diseño del esquema experimental: cantidad, extracción, limpieza, concentración,
acondicionamiento de la columna, y finalmente el acondicionamiento del detector FID y el
espectrómetro de masas, para obtener en el menor tiempo posible los picos con mayor
resolución y reproducibilidad.
Para el tratamiento de las muestras de agua y suelo se aplica el método de extracción
líquido-líquido y extracción solido-liquido, respectivamente, con diclorometano como
solvente de extracción, luego se purifica la muestra y se hace la lectura en el cromatógrafo
de gases GC-Varian 450C, para el caso de TPH.
Para el caso de PAH's (fenantreno, pireno, benzo(a) antraceno), la lectura se hace en el
cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas GC-Shimadzu QP2010.
6
AGRADECIMIENTOS
• Agradecer primeramente a Dios por la vida, por las fuerzas que me da día tras día,
por cuidarme, por su gran amor y la sabiduría que da cada día.
• A mis padres Teófilo y Judith por su gran amor y porque siempre están cerca de mi
apoyándome, dándome fuerzas y ánimos en todo momento.
• A mis hermanas Lisbeth y Mónica quienes son el complemento perfecto, a quienes
admiro y son ejemplos de vida y a toda mi familia que estuvo apoyándome
constantemente.
• A mi director de tesis, Dr. Gino Picasso Escobar; por su paciencia, quien con su
apoyo y disponibilidad me ayudo a realizar esta tesis.
• A mis amigos Carlos del Águila, José Ingaruca, Enrique Quevedo y Cesar Zavala,
por brindarme sus conocimientos y experiencia en el área de cromatografia.
7
GC
TPH
PAH's
GC-MS
FID
ECD
MINAM
OEFA
EPA
ECAs
STD
TCD
MS
GSC
GSL
GLOSARIO USADO EN ESTE TRABAJO
Cromatógrafo de Gases.
Hidrocarburos Totales de Petróleo.
Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos.
Cromatógrafo de gases acoplado a un
espectrómetro de masas.
Detector de Ionización de Llama.
Detector de Captura de Electrones.
Ministerio del ambiente.
Organismo de Evaluación y Fiscalización
Ambiental.
Enviro mental Protection Agency.
Estándares de Calidad Ambiental.
Estándar.
Detector de Conductividad Térmica.
Espectrómetro de Masas.
Cromatografía gas - sólido.
Cromatografía gas -liquido.
8
l. INTRODUCCION
9
1.1.-IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE LOS HIDROCARBUROS TOTALES DE PETRÓLEO. El término hidrocarburos totales de petróleo (abreviado TPH, en inglés) se usa para
describir una gran familia de varios cientos de compuestos químicos que tiene como origen
el petróleo crudo. Debido a que hay muchos productos químicos diferentes en el petróleo
crudo y en otros productos derivados del petróleo, no es práctico medir cada uno en forma
separada. Sin embargo, es útil medir la cantidad total de TPH en una muestra con el objeto
de conocer los niveles de contaminación [ l).
Los hidrocarburos totales de petróleo (TPH) son una mezcla de muchos compuestos
diferentes. La naturaleza y el hombre están expuestos a los TPH de diferentes fuentes,
incluyendo gasolineras, aceite derramado sobre el pavimento, y sustancias químicas usadas
en el hogar y en el trabajo. Algunos compuestos de los TPH pueden afectar al sistema
nervioso, produciendo dolores de cabeza y mareo, dentro de los cuales se encuentran los
hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH's), estos compuestos están ampliamente
distribuidos en el medio, como resultado de numerosas actividades humanas, aunque
también tienen un origen natural. Estos contaminantes también han adquirido una notable
importancia debido a su persistencia en el medio, ya que muchos de ellos son potentes
tóxicos, mutágenos y teratógenos para los organismos acuáticos e incluso para el hombre,
lo que los llevó a ser considerados contaminantes prioritarios por la Agencia Americana de
la Protección del Medio Ambiente (EPA) y la Unión Europea (Directiva 2000/60/EC) [2].
Dentro de los hidrocarburos aromáticos policíclicos considerados como contaminantes
prioritarios para el medio ambiente son el fenantreno, fluoranteno, benzo(a) antraceno, y
otros [3]-
Se ha encontrado TPH en por lo menos 23 de los 1,467 sitios de la Lista de Prioridades
Nacionales identificados por la Agencia de Protección Ambiental (EPA)[4].
La actividad petrolera, el manejo diario de hidrocarburos, en algunos casos conlleva a la
contaminación del agua cuando tanques de reserva, oleoductos y diversas instalaciones
sufren pérdidas por fallas ó descuidos humanos. Estos líquidos por el relieve de la
topografia migran hacia cursos de agua, suelo, subsuelo, y hacia aguas subterráneas. La
contaminación de aguas y suelos por hidrocarburos, tiene un efecto sobre sus propiedades.
10
La determinación cuantitativa de los compuestos de origen del petróleo es muy importante
en aguas naturales y residuales, por la disminución en el contenido de oxígeno [ 1].
El medio ambiente es un sistema frágil, la presencia de los hidrocarburos en él, puede
causar la alteración fisica y química de los hábitats naturales de las especies, si los vertidos
son en agua, la alteración de la cadena alimenticia por la contaminación de especies,
moluscos, que aunque sobrevivan y se acoplen a las nuevas condiciones de su hábitat, estos
pueden ser un gran peligro para los seres humanos si los consumen. La pérdida de la flora y
fauna es un gran problema no solo por la pérdida de especies sino por la alteración que
sufre el sistema. Es importante mencionar que los lugares donde se puede dar la
contaminación por hidrocarburos son zonas de gran fragilidad ambiental.
Las diferentes actividades humanas que han usado combustibles fósiles han producido
contaminación por residuos de hidrocarburos en el medio ambiente, en especial en su
almacenamiento, distribución y uso, por lo que existe la necesidad de regular las
actividades que empleen este tipo de combustible. En nuestro país las normas que regulan
su nivel de contaminación son La Ley Orgánica de Hidrocarburos- Ley No. 28611 , en
concordancia con el DECRETO SUPREMO N° 002-2008- del MINISTERIO DEL
AMBIENTE (MINAM)- que establecen los estándares de calidad ambiental (ECA) para
TPH' s en suelos y aguay el método de análisis recomendado es por cromatografia de gases
[5,6].
I.l.IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE LOS MÉTODOS CROMATROGRÁFICOS
La cromatografia es un método fisicoquímico de separación para la caracterización de
mezclas complejas. Es el conjunto de técnicas basadas en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separarlos distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes [7].
El empleo de Cromatografia de Gases (GC) en conjunto con otras técnicas, especialmente
la espectrometría de masas, ha aumentado espectacularmente sus posibilidades, siendo
factible la separación, cuantificación y subsiguiente caracterización de una gran variedad de
productos en distintas mezclas, desde gases permanentes y mezclas de isótopos, hasta
11
aceites esenciales en perfumes, ácidos grasos en grasas animales y agentes contaminantes
en aguas y suelos.
Además de las aplicaciones típicamente analíticas, la GC puede utilizarse a escala
preparativa para la obtención de compuestos de elevada pureza, así como también es
posible la obtención de datos fisicoquímicos relativos a propiedades superficiales, cinética
y termodinámica de procesos de adsorción y separación, desarrollo de catalizadores, entre
otros.
La característica que distingue a la cromatografia de la mayoría de los métodos
fisicoquímicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente
inmiscibles. Una fase es estacionaria y la otra móvil. Una muestra que se introduce en la
fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria
distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos)
entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma
apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase
móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de
interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el
que es retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases aprovecha las
diferencias entre las propiedades fisicas y/o químicas de los componentes de la muestra.
Después de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separándose, pasan
por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de
compuesto [8].
Actualmente en el Laboratorio de Investigación de Fisicoquímica de la Facultad de
Ciencias de la Universidad Nacional de Ingeniería se cuenta con un cromatógrafo de
Gases(V ARIAN GC 450) con detector TCD, FID, ECD, que se puede utilizar para el
análisis de diversos contaminantes orgánicos derivados del petróleo como: Diesel y
gasolina. Estos análisis pueden ser un apoyo en la generación de mapas de contaminación,
estudios de línea base en proyectos de impacto ambiental, monitoreos de sitios
contaminados y abandonados, donde se realiza la respectiva declaración de pasivo
ambiental requerido por el Ministerio del Ambiente.
12
L3 OBJETIVOS Generales
);;> Implementar método de análisis de hidrocarburos totales de petróleo (C10-C40),
basados según el método EPA 80 15C, que permite cuantificar los hidrocarburos en
muestras de aguas y suelo mediante cromatografia de gases.
Específicos
~ Detectar la presencia de TPH (C10-C40) en muestras reales (aguas y suelos)
provenientes de Empresas Mineras y Petroleras, y establecer casos de
contaminación, mediante la comparación de los resultados obtenidos con los
estándares de calidad ambiental (ECAs) en la legislación del País.
~ Detectar la presencia de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH's): fenantreno,
pireno y benzo(a) antraceno en las muestras reales provenientes de Empresas
Mineras y Petroleras.
L4 RELEVANCIA DEL TEMA
El temario de esta Tesis consiste en implementar métodos de análisis para la determinación
de hidrocarburos totales de petróleo (C10-C40) en muestras reales tanto para aguas y para
suelos mediante el cromatógrafo de gases GC-Varian 450C del Laboratorio de
Investigación de Fisicoquímica de la Facultad de Ciencias y el cromatógrafo de gases
Agilent 7890N perteneciente al Laboratorio Enviromental Laboratories SAC, empresa que
se dedica al rubro ambiental. Este proyecto propone metodologías de análisis mediante
cromatografia de gases y el estudio de la configuración más apropiada que incluye el diseño
del esquema experimental: cantidad, limpieza y concentración de la muestra, la conexión
del inyector con la columna (capilar) del cromatógrafo y el acondicionamiento del detector
de Ionización de llama (FID) para obtener en el menor tiempo posible la separación de los
componentes de los hidrocarburos totales de petróleo procedentes de Centros Mineros,
Petroleros y sectores Industriales, con la mayor resolución y reproducibilidad. Y la
determinación de algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH's) mediante el uso
Cromatógrafo de Gases acoplado al Espectrómetro de Masas Shimadzu QP-2010
perteneciente al Laboratorio Enviromental Laboratories SAC.
13
11. MARCO TEÓRICO
14
K1HIDROCARBUROSDEPETROLEO
11.1.1 Definición
El término hidrocarburos de petróleo, se usa para describir a un grupo extenso de varios
cientos de sustancias químicas derivadas originalmente del petróleo crudo. En este sentido,
los hidrocarburos de petróleo son realmente una mezcla de productos químicos compuestos
de hidrógeno y carbono [6].
La mayoría de los productos que contienen hidrocarburos de petróleo son inflamables,
algunos son líquidos incoloros o de color claro, altamente volátiles~ mientras que otros son
líquidos espesos de color oscuro o semisólidos de baja volatilidad.
Debido a la demanda de muchos productos derivados del petróleo, como combustibles por
ejemplo gasolina, kerosene, diesel, lubricantes, asfaltos, la posibilidad de contaminación
ambiental por estos productos es relativamente alta.
11.1.2 Clasificación:
Los hidrocarburos pueden ser agrupados en las siguientes clases: saturados, insaturados y
aromáticos [1 0].
11.1.2.A. Hidrocarburos Saturados Los hidrocarburos saturados constituyen la principal clase de compuestos existentes
en el petróleo y en la mayoría de sus derivados. En su estructura se tienen solo
enlaces simples.
(i) Alifáticos: pueden ser lineales y ramificados. Los nombres comunes para
estos tipos de compuestos son alcanos e isoalcanos. En la industria del
petróleo se conoce a estos compuestos como parafinas.
Las parafinas son uno de los principales constituyentes del crudo y se
encuentran en los diferentes productos refinados del petróleo: gasolina,
queroseno, diesel, aceites combustibles, etc.
Ejemplo:
15
CH3 - CH - CH2 - CH2 - CH - CH2 - CH3 1 1
CH3 CH2-CHs 5-etil-2-metilheptano
(ii) Cicloparafinas: Estos compuestos son hidrocarburos cíclicos saturados de
fórmula general C2H2n, que contiene uno o más anillos a los que pueden
estar unidas cadenas saturadas. Son también conocidos como cicloalcanos.
En la industria del petróleo se denomina comúnmente naftenos.
Ejemplo:
CH2
1 \
H2C- CHz Ciclopropano
ll.l.2.B. Hidrocarburos insaturados
H2C- CH2 1 1
H2C- CHz Ciclobutano
En esta clase de compuestos se tiene al menos a dos átomos de carbono de la
molécula unidos por un enlace doble o triple. Estos eompuestos normalmente no se
encuentran en el petróleo crudo y son constituyentes de los derivados del petróleo,
ya que son resultado principalmente del proceso de cracking en la refinación.
Los alquenos o compuestos con dobles enlaces tienen la fórmula general CnH2n y los
alquinos que contienen triples enlaces, su fórmula general es CnH2n-2.
-~ ------~~ ._J Figura 111.3.2 Toma de muestras de agua y suelo.
ID.3.2 Proceso de extracCión
Para 1a extracctOn ae marocarouros totales ae petroleo en matnz acuosa utlltzar la
extracción líquido-líquido y para la extracción de hidrocarburos totales de petróleo en
suelo utilizar la extracción solido-liquido.
ID.3.2.1 Método de extracción liquido-liquido [31]
Para el proceso de extracción para las muestras de agua, se utilizo el método 3510C (ver
figuralll. 3. 3 ).
)> Adicionar 1 mL de la muestra de agua en la pera de decantación.
)> Luego adicionar 30mL de diclorometano para realizar la extracción.
)> Tapar y agitar vigorosamente la pera de decantación por 2 minutos, con
desfogues periódicos para liberar la presión de vapores.
)> Luego dejar decantar por 1 Ominutos, hasta observar una clara separación de las
fases.
59
~ Recoger la fase inferior (que corresponde a la parte orgánica) en un matraz de
250mL.
~ Repetir el proceso de extracción dos veces más, usando porciones frescas del
solvente. Combinar los tres extractos solventes.
~ Luego filtrar el extracto obtenido, a través de un embudo analítico con papel filtro y
sulfato de sodio anhidro, para retener la· posible c-antidad de agúa e impurezas que
pudieran ir junto a la parte orgánica.
~ Efectuar la concentración del extracto utilizando la técnica Kuderna-Danish (K
D).Conecte el concentrador de IOmL al frasco evaporador de 500mL.
~ Trasvasar el extracto secado al concentrador de K-D.
~ Agregue uno o dos perlas de ebullición limpias a la Kuderna y conecte la columna
Snyder de tres bolas.
~ Colocar el aparato de K-Den un baño maría a 65°C, hasta reducir el volumen del
extracto a 5 mL, luego dejar enfriar.
~ Luego realizar el intercambio de solvente para el proceso de limpieza clean-up,. para
cual añadir SmL de hexano a la K-D (el cual contiene 5mt del extracto
concentrado) y colocarlo al baño maría a 70°C hasta reducir el volumen a SmL.
~ Trasvasar el extracto concentrado a un vial de 7 mL.
60
Colocar IL de muestra en la pera
de decantación
Realizar tres extracciones con60mLde
diclorometano
Coleccionar y combinar los
extractos
Secar la muestra con Sulfato de Sodio Anhidro
Concentrar el extracto a 5mL
Intercambiar el solvente del extracto con hexano, añadir 5 mL de Hexano (previo al
proceso de clean up
~l Concentrar a J
SmL
Realizar el análisis cuantitativo y
cualitativo en el cromatógrafo de
l ¿Existe la
presencia de interferencia
Si
Proceder a la Limpieza (clean up)
No Método
Figura 111.3.3 Diagrama del proceso de extracción, para el análisis de muestras de agua
según el metodo 351 OC, extfdccióii liquido-liquido [31].
61
ill.3.2.2 Método de extracción solido-liquido [32]
Para el proceso de extracción para las muestras de suelo, se utilizo el método 3 540C
''Soxhlet Éxtractión" (ver figuraÍÍI.3.4).
~ Pesar lOg de la muestra de suelo, previamente homogenizado.
~ Añadir lOg de sulfato de sodio anhidro v mezclar, para retener la posible cantidad
de agua y obtener una muestra seca.
~ Colocar la muestra en un cartucho de extracción e introducirla en un aparato soxhlet
para la extracción.
¡;. Tomar aproximadamente 180 mL del solvente de extracción ( diclorometano) en un
frasco conteniendo 1 o 2 perlas de ebullición. Sujetar el frasco con el extractor y
extraer la muestra por H>tloras a 4-ó ctclos por nora, aproxtmactamente a óY'C.
~ Dejar enfriar el extracto después de completada la extracción.
,. Luego nttrar e1 extracto ootemao, atraves ae un emouao anannco con papel mtro y
sulfato de sodio anhidro, para retener la posible cantidad de agua e impurezas que
puctteran tr JUnto a la parte organtca.
~ Efectuar la concentración del extracto utilizando la técnica Kudema-Danish (K
D).Conecte el concentrador de lOmL al frasco evaporador de SOOmL.
~ Trasvasar el extracto secado al concentrador de K-D.
~ Agregue uno o dos perlas de ebullición limpias a la Kudema y conecte la columna
Snyder de tres bolas.
~ Colocar el aparato de K-Den un baño maría a 65°C, hasta reducir el volumen del
extracto a 5 mL, luego dejar enfriar.
~ Luego realizar el intercambio de solvente para el proceso de limpieza clean-up, para
cual añadir SmL de hexano a la K-D (el cual contiene SmL del extracto
concentrado) y colocarlo al baño maría a 70°C hasta reducir el volumen a SmL.
~ Trasvasar el extracto concentrado a un vial de 7 mL.
62
~~ --;~tgd~
Í muestra en un vaso i l de 250mL J .._ _______ --- - _____ ___/
~----J ______ -
Adicionar 1 Og de sulfato de sodio
Anhidro y mezclar
Preparar un cartucho de extracción con la
muestra homogenizada y colocarlo en el soxhlet
Extraer con 180mL de diclorometano
por 16horas
Concentrar el extracto a 5mL
Intercambiar el solvente del extracto con hexano, añadir 5 mL de Hexano
(previo al proceso de clean
Realizar el análisis cuantitativo y
cualitativo en el cromatógrafo de
¿Existe la presencia de interferencia
t Si ~,----~--:1
[ Proceder a. la l f · Limpieza l IV
No 1- - l'détodo :-::¡ Determinativ ,
¡ o
l'lgura 111. :J. 4 1J1agrama ae1 proceso ae extraccum, para el análiSIS ae muestras ae suelo
según el método 3510 e, extracción liquido-liquido [32).
63
111.3.3 Proceso de Limpieza Clean-Up
Debido a la gran afinidad que los compuestos orgánicos tienen hacia los solventes es de
esperar que una amplia gama de compuestos sean coextraidos con los analitos (compuestos
de interés) cuando se usen solventes para la extracción, en todas las matrices,
especialmente aguas muy contaminadas y suelos (o sólidos), originando interferencias en
los cromatogramas, entorpeciendo en la interpretación del mismo, la cuantificación de los
ailalitos y deteriorando el rendimiento del sistema cromatográfico. Por ello en determinados
casos se hace necesario limpiar los extractos, de modo que se eliminen la mayor parte de
las interferencias.
ID.3.3.ADescripción general del Proceso.
La límpíeza consisten en hacer pasar un volumen determinado (alícuota) el extracto de la
muestra, el cual debe ser cambiado de- solvente· a uno compatible y especifico de· la técnica
de limpieza, a través de un material que puede retener ( o dejar pasar ) solo un grupo de
compuestos, bajo ciertas condiciones de flujo y tipo de solvente, así como la afinidad del
los compuestos por el material.
Para el proceso de Limpieza de hidrocarburos totales de petróleo tanto en una matriz acuosa
y una matriz de suelo, el extracto de la muestra tiene que estar en hexano y además se
usaron dos tipos de procedimientos con el propósito de obtener una mejor eliminación de
interferencia presente en la matriz, los dos tipos de procedimientos son:
•:• Procedimiento 1: Basado en el artículo "Extractable Petroleum Hydrocarbons
Fractions (EPH). Washington State Department ofEcology [34].
•:• Procedimiento 2: Basado en el artículo de Barry Muijs, Journal ofChromatography
A, 1216 (2009) y el Método ISO 9377-2, Determinación del índice de
Hidrocarburos [33, 35].
A continuación describiremos en qué consiste cada procedimiento:
64
A) Procedimiento 1[34]:
) Cambiar la polaridad del solvente del extracto ( diclorometano ), que se obtiene del
proceso de extracción, con hexano (no polar).
) Pesar 1 Og de sílica gel activada en un vaso de SOmL.
) Añadir diclorometano al vaso de SOmL hasta obtener una papilla.
) Trasvasar la papilla a una columna de vidrio de 1 Omm de ID con llave teflón.
) Añadir 40mL de pentano a la columna y agregar 2cm de sulfato de sodio, luego
abrir la llave hasta que haya una capa delgada de de pentano sobre el sulfato de
sodio.
) Transferir 1 ó 2 mL del extracto en hexano, con una pipeta graduada de SmL, a la
columna y enjuagar con 1mL la pipeta y trasvasar a la columna.
) Colocar una Kuderna Danish, debajo de la columna, para colectar el eluato.
) Abrir la llave y permitir que eluya el solvente hasta que haya una capa delgada de
solvente sobre el sulfato.
) Añadir 25mL de pentano a la columna, abrir la llave y dejar eluir el solvente hasta
que haya una capa delgada de solvente sobre el sulfato. Esta fracción es rica en
hidrocarburos alifáticos.
» Luego, añadrr ;umL de una mezcla de dtctorometano y pentano 4U:óU (volumen
/vo_lumen) a la colurnna, abrir la llave y dejar eluir todo el solvente. Esta fracción es
rica en aromáticos.
) Si se quiere diferenciar entre. alifáticos y aromáticos colectar la elución del solvente_
en kudernas diferentes.
) Finalmente concentrar las muestras en un baño maría a 65°C hasta obtener 1 ó 2mL
y si fuera necesario soplar con nitrógeno hasta el volumen requerido.
65
Cambiar el solvente del
extracto a Hexano.
Preparar una papilla de 1 Ogr de sílica gel activada en diclorometano, vaciar a una columna de 1 Omm con llave de
Acondicionar la columna con 40mL de Pentano a 2mL/min, no dejar secar. Agregar una capa de 2cm de sulfato de sodio. Abrir la llave hasta que haya una capa delgada de pentano sobre el sulfato.
Eluir la columna con 25mL de Pentano, abrir la llave hasta dejar
..-----..:~ una capa delgada de pentano sobre !lo
el sulfato. Esta fracción de elución
es rica en hidrocarburos Alifáticos.
Continuar la elución de la columna con SOmL de una mezcla Diclorometano +Pentano 40:60 (vol/vol). Esta fracción es rica en aromáticos. (B).
7 ¿Se requiere discriminar entre alifáticos y aromáticos?
J Colectar A y B en
------.:[ Kuder~as Transferir 1 o 2mL del extracto de la muestra a la columna, si se ha cambiado de solvente en un recipiente, enjuagar las paredes de recipiente con máximo 2mL de hexano y transferir esto también a la columna.
SI l rr====-===ñ
Colocar una Kudema preparada para · colectar el eluato. Abrir la llave y permitir que eluya el líquido hasta que haya una capa delgada de solvente sobre el sulfato.
NO l Colectar A y B en la una sola Kudema, concentrar hasta lmLo2mL,
11 Concentrar ambos
11 extractos a 1 mLo
.. 2mL cada u no y
11 analizarlos el GC-
11 FIDóGC-M S -------- --
Figura l/l3.5 Diagrama del procedimiento 1, para el proceso de limpieza según
• CTPH: Concentración (cantidad) de Hidrocarburos Totales de Petróleo (C10-C40)
presentes en la muestra de agua ó suelo, (mg/L) ó (mg/Kg).
• Cextracto: Concentración (cantidad) de TPH presentes en el extracto (mg/L).
• Vextracto: Volumen del extracto es 5 mL.
• V inicial: Volumen inicial para las muestras de aguas (mL), ó
Winiciat: Peso inicial de la muestras de suelos (g).
Para las muestras analizadas en este trabajo:
V inicial= 1 OOOmL
Winiciat= 10g
\ 88
IV.1.3 Análisis de las muestras de agua y suelo
Para la determinación de los hidrocarburos totales de petróleo (C10-C40) para muestras de
agua y suelo, provenientes de industrias petroleras y mineras, se considero los siguientes
pasos para el análisis (ver figura ID.3.1 y tabla IV.l):
•!• Toma de muestra: el muestreo de aguas y suelo se realizaron en diferentes
puntos (ver tabla ID.3.1).
•!• Tratamiento de la muestra (proceso de extracción y proceso de limpieza).
•!• Análisis cuantitativo de la muestra extraída (lectura cromatográfica).
IV.1.3.1 Tratamiento de la muestra
A. Proceso de extracción
Según la tabla IV.l; para las muestras de aguas, se uso el proceso de extracción liquido -
liquido (ver figura 111.3.2) y para las muestras de suelo se uso el proceso de extracción
solido-liquido (ver figura 111.3.3).
Los extractos obtenidos a partir del proceso de extracción se muestran a continuación (ver
figura IV.4):
89
o
Figura W. 4 Extractos obtenidos para las muestras de agua, A) material para la extracción
en aguas, B) extractos obtenidos [31}.
" \) ~rfjgWI!.lii5DIDctiB\· '":' ' J u
~ \ " \, ¡ . . .....
i ¡1 . l)
.·M~
"" ~~-~ ,,
\'?'-l.
Figura W.5 Extractos obtenidos para las muestras de suelo, A )material para la extracción
en suelo, B) extractos obtenidos [32].
90
;~ ,. '1 .. . ... ~
Dado que los hidrocarburos son compuestos mayormente no polares o son muy pocos
solubles en el agua(tales como hidrocarburos alifáticos y aromáticos), se uso como solvente
el diclorometano (poco polar), el cual actúa sobre el soluto, solvatándolo y venciendo las
fuerzas intermoleculares (fuerzas de London) que lo mantienen unido, pero sin dar lugar a
la reacción; es decir, las moléculas del soluto son rodeadas por las moléculas del solvente
[43].
Desafortunadamente, en el proceso de extracción con el solvente ( diclorometano ), aparte de
arrastrar los hidrocarburos de petróleo presentes en la muestras (agua y suelo), también son
arrastrados compuestos orgánicos diferentes a los hidrocarburos, los cuales producen
interferencia en la lectura cromatográfica y como resultado una sobreestimación en las
concentraciones de TPH presentes en las muestras. Por lo cual, es importe el proceso de
limpieza (clean up) para la determinación de las concentraciones de TPH (CIO-C40) en las
muestras ambientales [33].
B) Proceso de limpieza (clean-up)
En esta sección se describirá el procedimiento adecuado de limpieza ( clean-up) para las
muestras de agua y suelo muestreadas (ver tabla III.3.1).
Los extractos obtenidos presentan interferencia orgánica (ácidos grasos, lípidos y otros),
lo cual sin pasar por el proceso del clean up, estos son detectados por el GC-FID y dan
claras señales de interferencia. (Ver figura IV.6 y IV.7).
pA 70
60
50
40
30 .
20.
10
10.
~------~~------~---------r--------~--------T-------~ O 5 10 15 20 25 mi Figura IV. 6 Cromatograma de TPH de la muestra M3A (tabla Ill3. 1)-cromatógrajo
Agilent 7890N
91
70 SQ
so 40 3(1
20
10 IQ ~~~~-r--~~-,~~~~~----~-r--------r-~----~
Figura IV. 7 Cromatograma de TPH de la muestra M7 (tabla 1113. 1)-cromatógrafo Agilent 7890N.
De los cromatogramas mostrados {M3A-muestra de agua y M7-muestra de suelo),si los
comparamos con el cromatograma de un estándar de TPH (ver figura IV.2), ambas
muestras presentan hidrocarburos de petróleo, pero como se observa (figura IV.6 y IV.7),
estas presentan interferencia y no muestran una clara identificación visual de los
hidrocarburos totales de petróleo y si los cuantificamos así como están, darán un resultado
erróneo de TPH (C10-C40), por lo cual se desarrollaron 02 tipos de procedimiento para la
limpieza ( clean-up ).
Los dos tipos de procedimientos para los clean-up de las muestras son: Procedimiento 1 y
procedimiento 2 (ver tabla IV. S).
Tabla IV. S Métodos para el prÓceso de limpieza (clean-up) {33, 34, 35}.
Figura IV. 9 Comparación de los cromatogramas obtenidos en el GC-Agilent 7890 para los dos vrocedimientos de limvieza lv 2 en la muestra de af!Ua: M3-A.
95
A. pA.
70
60
so 40 30
20
10
o o
B. 70 60
so 40 30
20 10
o i)
pA
,c. 50
40
30 :zo~
10
o n
D. .. ....
... .. ...
..,.
"'
O·
c-.-- szo.:LSrngfL
S tn
CmF 280mg/l
S 10
CmF 201,05mg/l
M7 (D1recto)
tS .~20 ....... .
M7 (procedimiento 1)
15 20
M7 (Prooedimiento 2)
mirf
tnterferenc:ia Q orgánica
lfllr
Superponiento 'M7 {directo, ~prooedimiento 1 y ,procedimiento 2)
! !
Figura IV.10Comparaci6n de los cromatogramas obtenidos en el GC-Agilent 7890 para los dos procedimientos de limpieza 1y 2 en la muestra de suelo: M7.
96
De las Figuras se tiene:
Tabla W. 7 Resultados de TPH para las muestras M3-A (agua) y M7 (suelo) obtenidos a
partir del cromatógrajo GC-Agilent 7890N.
Concentración de TPH (C10-C40)
(m giL)
Muestra Con Limpieza Sin Limpieza
(Directo) Procedimiento 1 Procedimiento 2
M3-A 822.08mg/L 145.78mg/L 75.8mg/L
M7 820.15mg/L 280mg/L 201.05mg/L
Como se observa en la tabla IV.7 y en las figuras IV9, IVIO; la cuantificación de las
muestras sin pasar por el proceso de limpieza, dan un resultado elevado de TPH, por el
cual, el proceso de limpieza es muy importante para la determinación de los hidrocarburos
de petróleo C 1 O-C40.
De las pruebas realizadas, con los dos tipos de procedimientos de limpiezas, se puede
observar que el procedimiento 2, con respecto al procedimiento 1, produce una mayor
eficiencia en la limpieza de las interferencias orgánicas presentes en la muestra (ver figura
IV. 9, IV.l 0), por el cual la elección del material de limpieza ( adsorbente) es crucial.
Además, de la tabla IV. 7 al comparar los resultados obtenidos con ambos procedimientos,
para ambas muestras, se -observa -que oon el pr-oc-edimeint-o 1 t-odavía hay presencia de cierta
interferencia orgánica (lípidos) (ver gráfica IV.9B y IV.lOB), y el cual da todavía una
elevada concentración de TPH presentes en la muestra; por lo cual es importante elegir el
pr-oc-edimient-o adecuado para el proceso de limpieza {-clean-up).
Mediante el uso del procedimiento 1[39], se observa todavía la presencia de interferencia
orgánica (lípidos, ácidos grasos)(ver figura IV.9B, IV.IOB), esto es debido a que la sílica
gel retiene compuestos polares (lípidos polares), mientras que los compuestos no polares
(hidrocarburos, lípidos no polares), eluyen con el pentano (disolvente no polar) y además,
97
debido a que se usa diclorometano: pentano (ver tabla IV.5) como solvente de elución, el
diclorometano, que es poco polar, tiende a arrastrar compuestos poco polares, que han
quedado retenido en la sílica gel, como son los lípidos polares [45,46].
Además la eficiencia de la limpieza con sílica gel no se puede mejorar mediante la
desactivación del adsorbente. [ 45]
Para el procedimiento 2 [33, 35], en comparación al procedimiento 1[34], el uso de la
multkapas en la "Columna {ver figura IV8.C), mejora la eliminación de la interferencia
orgánica presente en la muestra (ver figura IV.9.C, IVIOC), esto se debe a los diferentes
tipos de adsorbentes usados en el proceso de limpieza, donde cada uno tiene un papel
importante en la -eliminación de los lípidos {interferencia orgánica).
El uso del fluorisil al 5%, se debe a que el fluorisil en su forma pura es demasiada activa y
es necesaria su desactivación para reducir las interacciones especificas con los compuestos
aromáticos presentes en la muestra, por el cual se trabajo con el fluorisil al 5% deactivada;
al colocar primero al fluorisil al 5% en el llenado de la columna, de arriba hacia abajo (ver
figura IV.8C) ,los compuestos lípidos polares son retenidos por interacción polar con el
fluorisil, pero también se da el caso que los lípidos pueden ·quedar retenidos por
interacciones acidolbase de Lewis debido a sus grupos carbonilo electrofilico presentes en
la moléculas [47]; pero al pasar el extracto por este adsorbente todavía se tiene la presencia
de ciertas interferencias orgánicas (ácidos grasos, lípidos).
Luego en la parte básica de la columna (sílica impregnada con NaOH 33%)(ver figura
IV.SC), el resultado de la adición de lM de hidróxido de sodio es para la desactivación de
la sílica y por lo tanto obtener una disminución en la retención de compuestos no polares
[48], el aumento de la sílica básica en la columna no mejora la limpieza [33]; además, la
parte básica reduce el porcentaje de acido, que podrían estar presentes en el extracto, lo
cual evitaría ventajosamente la obstrucción de la columna por residuos de combustión que
se generaría cuando esta pasa por la parte acida de la columna, lo cual mostraría varios
picos pequeños en el cromatograma [47,48]
En la parte acida de la columna (sílica impregnada con H2S04 7%}, se da la eliminación
de lípidos restantes, -el "Cual se basa en la oxidación de los lípidos [49,50], en lugar que la
98
retención~ esto se explica visualmente, cuando los lípidos eluyen através de la parte acida
de la columna, se observa una película negra (ver figura IV.8.D) el cual es residuo
quemado. Además al usar más cantidad de acido (ejemplo al 44% de H2S04), los PAH's
Por lo tanto, el procedimiento 2, es adecuado para la eliminación de las interferencias
orgánicas (lípidos, ácidos grasos) presentes en la muestras de agua y suelo, y también es
aceptable para la recuperación de los TPH (CIO-C40). Aunque la recuperación de TPH para
·el procedimiento 1 ·es también aceptabl-e, ·pero la ·eliminación de las interf-erencias orgánicas
(lípidos) es deficiente, pero se podría usar cuando las concentraciones de las interferencias
sean bajas.
IV.l.4 Cuantificación de las muestras trabajadas
Para la cuantificación de la muestras se uso el cromatógrafo GC-Varian 450C y para la
verificación de los resultados se uso el cromatógrafo GC-Agilent 7890N.
Tabla IV.8 Criterios para la determinación de TPH (CJO-C40) en el cromatógrajo GC- Varian 450C.
Método de lectura configuración Tipo de muestras Tipo de limpieza
Método 1 primera Agua y suelo Procedimiento 2
Tabla Iv.9 Criterios para la verificación de resultados en la determinación de TPH (CJOC40) con el cromatógrafo GC Agilent 7890N.
Método de lectura configuración Tipo de muestras Tipo de limpieza
Método2 primera Agua y suelo Procedimiento 2
Para la cuantificación de las muestras de agua y suelo, se determinara pnmero la
concentración de TPH, presentes en el extracto, para lo cual se usara la Ec.l6: :·················-············-······-··-·····-·············-· ..... ,,,_, ................................................................................................................................................ , 1 Área (11V*min) =52.244*concentración del extracto (mg/L) + 12500 1
This reference material (RM) ls packaged In a flame-sealed ampule and must be stored at 20-30"C. A mínimum sampling size of 50 uL should be used. Smaller volumes may negatively affect estimated uncertalnty.
To use thls RM. allow it to reach room temperatura. Mlx it gently by lnverslon. lnspect for precipitate. lf present. sonicate for a few minutes to redissolve. Open the ampule and withdraw an .aliquot appropriate for your application. To minimiza uncertainty contribution from lhis dilution step, use Class A pipets and a mínimum sample size of 50 uL.
Traceabllitv lnformation
Analyte Sourco Materials: The highest purity analyte source materials are used in the manufacture of thls RM. The actual purity is referenced above. Analyte source material purity and associated uncertainty has been analytically verified.
<8 IW'CII!NCt! ... nr"'-'L~
ISO Gulde 34:2009 Certlfteate AR·1571
ISO 9001:2008 UL Registered Flrm • Certlflcate #10002343 OM08
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1?.4
~
ISOIIEC 17025:2005 Certiflcate AT-1600
ANEXO 4: Detalles de columnas, fases estacionarias y detectores más comunes en GC
l. Columnas Cromatográficas y fases estacionarias
La columna constituye la parte esencial del sistema cromatográfico y de la que depende el
éxito o el fracaso de los análisis. En ella está contenida la fase estacionaria, que determina
la selectividad y la eficacia de las separaciones.
Existen dos tipos de columnas, columnas empacadas o de relleno y las columnas tubulares
abiertas o capilares; anteriormente, la mayor parte de las cromatografias de gases se
realizaban con columnas empacadas, mientras que actualmente se utilizan más
extensamente las columnas capilares, estas suelen ser de acero inoxidable o vidrio para las
columnas empacadas, y sílice para las capilares, si bien se han utilizado también otros
metales como aluminio o cobre, e incluso teflón (20].
1.1 Columnas Empacadas
Las columnas empacadas suelen ser tubos de vidrio o de acero inoxidable con una longitud
comprendida entre 1 y 6 metros, con un diámetro interno que oscila entre 2 y 6mm, y que
se llenan con un soporte sólido de grano fino (60-100 mallas, 0.25-0.15 mm) recubierto de
una capa delgada (0.05-1~m) de un líquido no volátil que actúa de fase estacionaria. Una
buena columna empacada puede contener entre 1000 y 2000 platos teóricos por metro,
mientras que las columnas capilares pueden llegar hasta los 10000 platos por metro (19].
El soporte sólido deberá presentar las siguientes características:
~ Presentar una superficie relativamente grande, para que la película de la fase
estacionaria pueda distribuirse de manera uniforme y ofrecer un máximo contacto
con la fase móvil y así facilitar el proceso de intercambio entre ambas fases.
» Debe ser relativamente duro, para que las partículas no se rompan durante el
proceso de impregnación con la fase estacionaria y el llenado de la columna.
» Ser térmicamente estable y poroso, para no producir una caída de presión excesiva.
» Ser químicamente inerte y no debe provocar fenómenos de adsorción que puedan
influir en la separación cromatográfica.
125
Aunque se han estudiado muchos materiales, ninguno cumple rigurosamente todas las
condiciones enumeradas previamente. De todos ellos, el más frecuentemente utilizado se
prepara partir de tierra de diatomeas (Chromosorb, Gas Chrom, etc.).Dentro de los cuales
tenemos:
• ChromosorbP. Soporte de color rosa, constituido por granos muy duros, de área
superficial elevada (4.0 m2/g) y que puede soportar gran cantidad de fase
estacionaria (35% w/w). Presenta una marcada interacción con los solutos,
particularmente a temperatura elevada.
• Chromosorb W. Soporte silíceo de color blanco, obtenido por tratamiento a 1600
°Ccon un fundente alcalino. Presenta menor área superficial (1.0 m2/g) que el
ChromosorbP y puede impregnarse, como máximo, con un 15 % de fase líquida.
o ChromosorbG. Es el más duro de todos y doblemente denso que el ChromosorbW,
presentando relativamente poca interacción con compuestos polares. Debido a su
pequeña superficie, tiene poca capacidad de retención de fase líquida.
Un problema importante que presentan los soportes sólidos diatomáceos es la marcada
actividad superficial que presentan. Esta se debe, sobre todo, a la presencia de los grupos
silanol (Si-OH) que se forman sobre la superficie de los silicatos, debido a la humedad, los
cuales constituyen puntos activos que provocan adsorción de compuestos polares; por lo
cual se somete a diversos tratamientos químicos (lavados ácidos o básicos, silanización de
grupos silanol libres, ligado de pequeñas cantidades de fases estacionarias, etc.), con el fin
de eliminar, en la mayor medida posible, los puntos activos de la superficie del soporte que
pudiesen interaccionar con los compuestos a separar.
Estas columnas ofrecen menos eficacia y menos resolución que los capilares.
Figura Vll.l Columnas empacadas para cromatografza de gases. [ 19] 126
L2 Columnas Capilares
Las columnas capilares fueron descritas inicialmente por Golay en 1957, y es ampliamente
usado, debido a la gran eficacia de separación, el cual permite la separación de mezclas
muy complejas. Una columna capilar es un tubo que está hecho de sílice fundida y
recubierta de poliimida, donde la superficie interna está recubierta por la fase estacionaria.
Las columnas capilares tienen longitudes entre 1 O y 100 metros, cuyo diámetro interno esta
comprendido entre 0.1 y 0.6mm. Los dos tipos más importantes de columnas capilares son
las de pared recubierta (WCOT) y con soporte recubierto (SCOT), existiendo una
tercera modalidad denominada de capa porosa (PLOT) (ver figura VII.2) [8].
a) Columna abierta de pared recubierta (WCOT): Son tubos capilares (que son las de uso
más frecuente) cuya pared interna está recubierta por una fina capa de fase estacionaria
b) Columna abierta con soporte recubierto (SCOT): En estas columnas, la superficie interna
del capilar está revestida de una fina capa (de unos 30 !Jlll) de un material soporte, tal como
tierra de diatomeas, el a su vez este soporte está recubierta de una fase líquida estacionaria.
e) Las columnas capilares de capa porosa (PLOT): consisten en columnas de sílice en las
que la fase estacionaria está constituida por partículas de un sólido activo sobre su
superficie interna. Estas columnas se desarrollaron inicialmente para el análisis de
compuestos de bajo peso molecular, tales como gases atmosféricos e hidrocarburos C1 a
C6.
Generalmente, la eficacia de una columna SCOT es menor que la de una columna WCOT,
pero es sensiblemente mayor que la de una columna empacada. Las principales diferencias
entre las columnas WCOT y las columnas empaquetadas son:
•!• Las columnas capilares proporcionan mayor resolución que las columnas
empacadas. Ello se debe a que la longitud de la columna es mayor, con lo que se
aumenta el número de platos teóricos, pudiéndose llegar a los 500000, frente a
10000 de las columnas empaquetadas [52].
127
•!• El tiempo necesario para realizar un análisis (tiempos de retención) con columnas
WCOT es menor que con columnas empacadas, como consecuencia del menor
contenido de fase estacionaria, con lo que los solutos se retienen menos tiempo.
•!• La cantidad de muestra utilizada con columnas capilares suele ser del orden de los
nano-gramos, frente a los microgramos que se usan frecuentemente en las columnas
empacadas [21].
•!• Aunque en las columnas capilares se utiliza una cantidad de muestra
considerablemente menor que en las columnas empaquetadas, el límite de detección
es del mismo orden de magnitud, debido a que con aquellas tiene lugar un menor
ensanchamiento de las bandas, originándose picos estrechos bien definidos.
de la columna
a '-----------~ ---- ---
fase estacionaria líquida
b
Figura Vll.2 Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa (PLOT). b) con pared
recubierta (WCOT). e) con soporte recubierto (SCOT) [20}.
L3 Fase Estacionaria
La fase estacionaria para cromatografia gas-líquido deberá reumr las siguientes
características:
• Baja volatilidad a la temperatura de la columna. Se sugiere que su punto de
ebullición sea, al menos, 100 °C mayor que la máxima temperatura de trabajo.
• Estabilidad térmica a la temperatura de la columna.
• Inercia química, no deberá reaccionar químicamente con los componentes de la
muestra.
128
Las fases estacionarias polares contienen grupos como -CN. -CO y -OH, como por ejemplo
las fases poliésteres. Las fases no polares son del tipo hidrocarbonado y dialquilsiloxanos.
Generalmente la polaridad de la fase estacionaria debe ser parecida a la de los componentes
de la muestra. Cuando la igualdad es buena, el orden de elución viene determinado por el
punto de ebullición de los compuestos a eluir.
El espesor de las fases estacionarias varía entre 0.1 a 5 ~m. Las películas gruesas se utilizan
con analitos muy volátiles debido a que retienen más a los solutos. Por el contrario las
películas delgadas se utilizan para separar especies de baja volatilidad.
El número de fases líquidas empleadas en las separaciones por cromatografia de gases es
muy elevado, si bien, puede afirmarse que el 90 % de los análisis pueden llevarse a cabo
utilizando un reducido número de ellas. En la tabla VII. l. Se muestran algunas de más
utilizadas, situadas en orden creciente de polaridad.
Tabla VII 2: Algunas fases estacionarias comunes en cromatografza gas-líquido;
flll! .estaciourla
l,olidlmetílsiloxano
Poli(fenilmelidifcnil' sifoxano (10% fenil)
T1oli(fenilmeti1) siloxano (SO% fcnil)
Poli(trifluoropropifd.imctil) siloxano
P(llietilcn gtiool
Poli(d,idanoalifdimetil) siloxano
Nomhrt
~· cómén
ov~t. sE-30
ov~t7
OV-210
Carbowax .20M
OV-275
3SO
350
250
2110
250
240
,.·!
Fase no polar de uso gcne.ral; hidrocarburos: .aromáticos plurinuciC'.arcsi drogas; esteroidcs; PCBs
Esteres metílicos de ácido~ gtasos; alcaloides; drog¡1s; compuestos halogcnados
Ácidos grasos ¡poHinsaturados; ácidos de la colofonia; ácidos libres; alcoholes
La columna cromatográfica como se puede observar en la figura Vll.3, consiste en separar
la muestra en componentes individuales. Un componente se divide entre la fase gas carrier
(helio) y la fase estacionaria de la columna, dependiendo de la relativa atracción por las 2
fases.
~ La atracción puede ser por solubilidad, volatilidad, polaridad, interacciones química
específicas o cualquier otra propiedad que diferencie un componente de otro.
~ El componente se mueve a través de la columna a una velocidad menor que la de la
fase móvil. La fuerza de su atracción con la fase estacionaria determinará cuanto
menos [24].
~ Si diferentes componentes tienen diferentes atracciones serán separados en el
tiempo.
o e o Carrier oas ftow o c
0 e .....
-La fase estacionaria utilizada retiene (disuelve) los puntos azules
-Los puntos azules se distribuyen entre la fase estacionaria y el gas • portador
-El gas portador empuja ambas moléculas hacia el final de la columna
-La muestra se separa en 2 picos
Figura VII3 Comportamiento del soluto en /ajase estacionaria [23).
En las figuras Vll.4, veremos el comportamiento de la resolución de la columna
(separación) con respecto al diámetro interno y longitud de la columna
130
R=0.87 R=1.01 R=0.84 R=1.16 R=1.68
VOiamdro interno = ol!fSOI.IIOON
'ÚtoNGITUO : Dr RBOUJCION
f--"-" ""-- __,._ ""'- .- ~
0.53 mm 0.32 mm 15m 30m 60m ''·'
, .. ,..,.. .. , ....... , .. ' ~·
Figura VII. 4 Comportamiento de la Resolución con respecto al diámetro interno y longitud
de la columna [8}.
L4 Sistema de Detección
Una vez que los componentes de la muestra han sido separados por la columna, se hace
preciso el disponer a la salida de ésta de un sistema de detección, capaz de señalar la
elución de un componente de la muestra y ofrecer, al mismo tiempo, una señal proporcional
a la cantidad de substancia que pasa a través de él [26].
L4.1 Características de un detector
)o. Sensibilidad adecuada. Puede considerarse que la sensibilidad es una medida de la
magnitud de la señal originada por el detector para una cantidad o concentración de
analito determinada.
}i;> Buena estabilidad y reproducibilidad. La línea base de un cromatograma está
sometida a fluctuaciones fortuitas, conocidas como "ruido de fondo" (figura VII.5),
el cual se puede originar en los distintos componentes del instrumento, como los
amplificadores, registradores, etc., así como en fluctuaciones del gas portador.
Muchos de estos ruidos pueden eliminarse utilizando componentes de alta calidad y
operando adecuadamente con el cromatógrafo, si bien, siempre existirá un ruido
inherente al detector, el cual, junto con la sensibilidad, establece el límite de
detección de un determinado soluto. En cromatografia, el límite de detección suele
considerarse como la mínima cantidad de muestra para la cual el detector
131
proporciona una señal, S, de, al menos, el doble del nivel de ruido (ver figura
VII. S).
S ntax
S S rnin
s------
1 --"i t -t;¡ R.:2 :'
j ------ -·- - _il
Figura VII. 5 Parámetros de la relación señal/ruido de dos bandas cromatográficas [ 19].
)o> Tiempo de respuesta. El detector debe responder con rapidez a los cambios de
concentración del analito, si bien en el tiempo total de respuesta del cromatógrafo
influyen también la inercia de otros componentes, como el registrador [52].
)o> Versatilidad. El detector deberá responder a una gran variedad de analitos y, a ser
posible, proporcionar una respuesta semejante para todos ellos.
Los detectores más utilizados en cromatografia de gases, y de los que se indicarán
seguidamente sus principales características, son el de conductividad térmica (TDC), el de
ionización de llama (FID) y el de captura electrónica (ECD).
Para la determinación de los Hidrocarburos Aromáticos policíclicos se uso como detector el
espectrómetro de masas.
A) Detector de Conductividad Térmica (TCD)
Se basa en los cambios de conductividad térmica de la corriente de gas ocasionados por la
presencia del analito. Consiste en un filamento metálico o un "termistor* que al calentarlo,
en condiciones de estado estacionario, adquiere una temperatura por la conductividad
térmica del gas que se encuentra en sus proximidades. Cuando cambia la composición del
132
gas, cambia la temperatura del elemento (filamento o termistor) y esto se refleja mediante
un cambio en su resistencia eléctrica [8].
El detector de conductividad térmica es universal y no es destructivo; por lo general se
utiliza para el análisis de gases permanentes, hidrocarburos ligeros y otros tipos de
compuestos que ofrecen una respuesta pobre en otros tipos de detectores. La conductividad
térmica del H2y He es mucho mayor que la de moléculas orgánicas. Por lo tanto la
presencia de moléculas orgánicas causa un aumento de T en el filamento, modificando su
resistencia.
El TCD es un detector no destructivo
El filamento caliente se enfria mediante el flujo del gas portador.
t FLUJO
Cuando el gas portador está contaminado con la muestra,el filamento se calienta y produce una señal.
Figura VII6 Detector de Conductividad térmica (TCD).
B) Detector de Ionización de Llama (FID)
El FID consiste de una flama hidrógeno/aire y una placa colectora. Las muestras que salen
de la columna pasan a través de la flama, la cual rompe las moléculas orgánicas y produce
iones. Los iones son colectados en un electrodo parcial y produce una señal eléctrica. Es
extremadamente sensible en un amplio rango dinámico. La única desventaja es que
destruye la muestra.
La Corriente es proporcional al número de iones que se producen que es proporcional al
número de átomos de C reducidos en la llama y es selectivo para sustancias que contienen
133
uniones C-H en su estructura química. El detector de ionización de llama es uno de los más
utilizados actualmente. Responde a casi todos los compuestos orgánicos, mientras que es
insensible a gases no combustibles como C02, S02, óxidos de nitrógeno. Su sensibilidad
es más elevada que la del TCD (~10-12 glmL) (19].
Los detectores de ionización de llama ofrecen una elevada sensibilidad, gran estabilidad y
un rango dinámico lineal excepcionalmente elevado; todo ello, junto con una gran sencillez
de utilización ha hecho que este tipo de detectores, como ya se ha mencionado, sean con
mucho los de mayor utilización.
e~ HO CHO+ 2
HO CHd 2
CHO+
co2
~ HO 2
CHO+
co2
CHO+
HO 2
l
1 El detector FID es un detector sensible ~ a la masa y destruye ésta. t Los cationes generados en la llama ! producen la sef\al del detector. 1 Los analitos que tienen el mayor número de carbonos de bajo estado ·j de oxidación producen la mayor selial. J
j
Column
-Jet
Figura VII. 7 Detector de ionización de llama (FID) [20].
C) Detector de Captura de Electrones (ECD)
El detector de captura electrónica ocupa probablemente el segundo lugar entre los
detectores de más alta utilización, debiéndose este hecho a su excepcional sensibilidad (el
detector de captura electrónica es probablemente el dispositivo analítico más sensible que
se conoce) [19].
En el detector de captura electrónica se mide una pérdida de señal cuando el analito se
eluye de la columna cromatográfica. En la figura VII. S. Se representa un esquema del ECD,
que opera de la forma siguiente: el gas portador, N2, se hace pasar a través de una cámara
que contiene un emisor de partículas ~ (Ni-63 o tritio adsorbido sobre una lámina de
134
platino) de alta energía, las cuales, al interactuar con dicho gas portador producen grandes
cantidades de electrones térmicos que se dirigen hacia un electrodo colector (por aplicación
de un voltaje entre 1 y 100 V), originándose una corriente uniforme o corriente-base.
N2 + !3- <-> N2+ + e-
Cuando moléculas del analito con alta afinidad electrónica entran al detector, capturan
algunos electrones según el proceso,
AB + e--> AB- y A + s-
Con lo que se produce una disminución de la corriente. Esta señal se procesa
electrónicamente para formar el cromatograma.
El detector de captura electrónica, responde de forma muy selectiva frente a compuestos
que presenten grupos con elevada afinidad electrónica, en particular halógenos y grupos
nitro, ofreciendo frente a este tipo de compuestos una respuesta 106-107 veces superior a la
que muestra frente a los hidrocarburos.
. ...... .., •• . . .. ,. ¡
Figura Vll8 Esquema del Detector de captura de electrones (ECD)
135
D) Espectrómetro de Masas (MS)
La espectrometria de masas es una técnica analítica muy potente utilizada para:
./ Identificar compuestos desconocidos .
./ Cuantificar compuestos conocidos .
./ Elucidar la estructura química de las moléculas.
La espectrometria de masas (EM) es una técnica de análisis basada sobre la separación de
acuerdo a sus razones masa/carga de las especies cargadas formadas a partir de la
ionización de una muestra. Se trata de una técnica extremadamente sensible, de gran
versatilidad y cuyos campos de aplicación experimentan un crecimiento vertiginoso en
nuestros días. La EM suministra información muy valiosa sobre los compuestos químicos:
la masa molecular, la fórmula global y, a partir del patrón de fragmentaciones, la estructura
molecular, así como la composición isotópica en sustancias naturales o marcadas.
Los fundamentos de la espectrometria de masas pueden ejemplifican mediante la técnica de
ionización electrónica. Electrones acelerados a través de un campo eléctrico adquieren
energía cinética considerable y pueden interactuar con moléculas (M) para originar especies
cargadas:
M+ e:--_.... M·++ 2e-
En este caso M·+ es un catión-radical molecular. Normalmente M·+ se forma en un estado
excitado y puede sufrir fragmentación, que puede ser de diferentes formas:
R: {radieaij
P.;+.+ N (molécula}
Los iones E+ y p·+ a su vez pueden fragmentarse y así sucesivamente. La forma de
fragmentación dependerá en cada caso de la estructura molecular. La mayoría de los iones
producidos tiene una carga correspondiente a la pérdida de un solo electrón (e = l. 6 1 0"19
C), aunque también se pueden obtener iones multicargados. La carga total de los iones se
representa usualmente por q ( q=ze ), donde e . es la carga del electrón y z el número de
cargas sobre el ión. Todos los iones producidos son separados en un espectrómetro de
masas de acuerdo con su razón masa/carga. Los iones así separados son detectados como
136
corrientes iónicas cuyas intensidades son proporcionales a sus abundancias respectivas.
Procesando esta información se obtiene un espectro de masas (EM), tal como se muestra en
'------------·- --- ~-----·· -~~- ----~·-~ ~ - ______ _, Figura VIL 1 O Esquema de un espectrómetro de masas con analizador cuadrupolo.
Como se puede apreciar, la relación de los aspectos necesarios para obtener un espectro de
masas de hecho incluye los componentes básicos de un espectrómetro de masas.
Todos los espectrómetros de masas tienen que funcionar en condiciones de alto vacío. Esto
es necesario para lograr que los iones puedan llegar al detector sin interactuar con otras
moléculas gaseosas .Esas interacciones unidas a las que pueden ocurrir con las paredes del
instrumento provocan que los iones pierdan su carga. Por otro lado, las interacciones ión
molécula pueden producir reacciones no deseadas e incrementar la complejidad de los
espectros. Reducir el número de interacciones es tan importante que resulta necesario
utilizar sistemas de bombas de vacío muy eficientes, que incluyen bombas mecánicas en
unión de bombas turbomoleculares, de difusión o criogénicas.
A. Sistema de introducción de muestra: En el espectrómetro de masas dependerá de las
propiedades fisico-químicas de los compuestos a detectar. El acoplamiento de la
cromatografia gaseosa (GC) como sistema de introducción de muestra, incrementa la
capacidad de identificación de la técnica, proporcionando una herramienta de identificación
y confirmación única.
138
B. Fuente de Ionización: Es el lugar del espectrómetro de masas en el que se introduce la
muestra y en el que se produce la ionización. Cuando el sistema de introducción de muestra
es un acoplamiento GC, la muestra se encuentra en estado vaporizado y la única función de
la fuente de ionización es ionizar las moléculas neutras (conferirles carga) por aplicación de
una determinada energía. En este tipo de acoplamientos la ionización se produce en estado
de vacío.
B.l. Ionización Electrónica: La fuente de ionización electrónica (Electron lonization: El)
fue la técnica inicialmente más utilizada en espectrometría de masas y su descripción
permite comprender los aspectos esenciales de este método.
Las moléculas pueden interactuar con los electrones para dar iones, los cuales son
micropartículas cargadas eléctricamente. La interacción molécula-electrón suele
denominarse erróneamente impacto electrónico, aunque no es realmente una colisión en el
sentido de la Física Clásica.
La fuente de El, cuyo esquema se muestra en la Figura VII.ll, consiste en un filamento
cargado negativamente y calentado por una corriente que circula en el mismo que actúa
como emisor de electrones.
Potencial de aceleración
rt.-;·~ ~7"'li'"""~:~·'":'~: .. :te==~· o ..:n o
:::
FUamento catódico Haz electrónico l~+ emisor de eletrones ~
--- + eztra«i6a
Lentes --- + --- ealoqae
~ --- acelerati6n
Analizador
Figura VII. JI Fuente de Ionización Electrónica (El)
Los electrones son acelerados hacia un ánodo e interaccionan con las moléculas gaseosas
de la muestra inyectada en la fuente o procedente del sistema de introducción.
139
B.2. Ionización química: La ionización química (Chemical Ionization: CI) es una técnica
blanda que produce iones con pequeña energía en exceso. La fuente de CI es muy similar a
la de El, en muchos instrumentos el cambio de fuente es expedito. En la fuente CI el flujo
de electrones crea un plasma de gas reactivo ionizado (por ejemplo: metano, isobutano,
amoníaco, agua) que se encuentra a mucha mayor concentración que la muestra (presión
parcial 60 Pa, relación gas reactivo/muestra 1000:1 ). La ionización se origina entonces por
la interacción entre las moléculas de la muestra y el gas, y no por la interacción directa de
aquellas con el flujo electrónico.
La ionización química (CI) es mucho más suave que la ionización por impacto electrónico
(El), por lo que se produce menos fragmentación. El gas reactivo más común es el metano,
que produce iones prácticamente con cualquier molécula de muestra, otros gases reactivos
(isobutano, amoniaco) son más selectivos y producen incluso menos fragmentación.
La ionización química (CI), es el método más frecuentemente utilizado para determinar
pesos moleculares de compuestos.
C. Analizadores
Luego de que los iones se han producido en la fuente de ionización, deben ser separados y
enfocados hacia el detector de acuerdo con el valor de la razón masa/ carga de cada uno.
Esto se logra mediante los analizadores, que constituyen la óptica iónica de un
espectrómetro de masas. Esta óptica iónica es frecuentemente un sistema de campos
eléctricos y magnéticos mediante el cual un flujo de iones puede ser separado en sus
componentes de acuerdo con sus valores de miz y enfocado hacia el detector. Al sistema de
campos eléctricos y magnéticos se le denomina lentes por analogía con su contraparte
óptica.
Las tres características principales de un analizador son el límite de masas superior o alcance
de masas, la transmisión y la resolución. El límite de masas es el valor más alto de la razón
miz que puede ser medido y se expresa en thomson (Th) o unidades atómicas (u) para unión
portador de una carga elemental, esto es z =l. La transmisión es la razón entre el número de
iones que llega al detector y el número de iones producido en la fuente.
Los tipos de analizadores más utilizados son:
140
C.l Analizador Cuadrupolar: está formado por cuatro barras conductoras de sección
hiperbólica alineadas paralelamente entre sí y equidistantes de un eje central imaginario
situado sobre el eje Z, .donde los segmentos opuestos están conectados y los segmentos
adyacentes están eléctricamente aislados. Se aplica una combinación de corriente continua
(DC) y voltajes . de radiofrecuencia (RF) sobre los pares de segmentos. La magnitud del
voltaje de radiofrecuencia determina la relación masa/carga que es capaz de describir una
trayectoria tal que atraviesa el analizador y alcanza el detector. De modo que variando
dicha magnitud se podrán detectar los fragmentos iónicos cargados positivamente que se
generaron en la fuente de ionización y que son característicos de cada compuesto.
Este tipo de analizador es robusto y muy reproducible. Es muy utilizado en el modo SIM
(Selected Ion Monitoring) en el que solo filtra los iones los iones de unas relaciones miz
concretas. Esto permite obtener espectros de masas muy simples (con muy pocos iones)
pero que son muy sensibles. Además la respuesta lineal a la concentración es muy buena,
por lo que son muy utilizados para llevar a cabo análisis de cuantificación.
D
Source
ck and ac voltages
Figura Vl112 Esquema de un Analizador Cuadropo/ar.
C.2. Analizador de Sector Magnético: Opera según el principio de la dispersión del haz
de iones cuando se le somete a un campo magnético intenso. Son equipos voluminosos y
que requieren un alto vacío (10K7 torr) .. Para iones de una sola carga y considerando un
campo magnético y un voltaje de aceleración constantes, la masa es directamente
proporcional al radio del arco descrito por los iones, de modo que éstos se pueden separar
en función de su masa. Variando el campo magnético aplicado se van seleccionando todos
141
los fragmentos iónicos generados. Además el campo magnético produce un enfoque
direccional del haz de iones. Los campos electrostáticos permiten corregir la dispersión del
haz de iones que conduce a una pérdida de resolución.
La característica principal de este tipo de analizadores es que permiten trabajar a alta
resolución (diferenciar relaciones m/z que solo difieren a partir del cuarto decimal) con
gran sensibilidad.
.Ac:der-oeión ·de los iones
Figura VI113 Esquema de analizador de sector magnético.
142
Anexos Vlli
Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH's)
IV.l Características y clasificación.
Los hidrocarburos aromáticos poli cíclicos . (P AH' s) han estado presentes en el
medioambiente desde los inicios de la vida del hombre, ya que son compuestos naturales.
Sin embargo, el crecimiento industrial ha supuesto un aumento de gran número de
contaminantes en el entorno natural, entre ellos los P AH' s. El estudio científico de los
PAH's y sus efectos comenzó en 1775, al atribuirse el cáncer padecido por los limpiadores
de chimeneas a la exposición al hollín y la ceniza que suponía su actividad. Investigaciones
posteriores sugirieron que los agentes causantes del cáncer eran los P AH' s contenidos en el
hollín. A lo largo de los años 30 se demostró que algunos de los P AH' s presentaban un
fuerte potencial cancerígeno, mientras se iniciaba el estudio de propiedades similares en
otros. [11]
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (P AH' s) constituyen una familia de mas de 100
compuestos orgánicos diferentes formados por dos o más anillos bencénicos y en algunos
casos un anillo pentagonal, con o sin sustituyentes sobre sus átomos de carbono e
hidrogeno [54]. La abundancia de estos compuestos en el medio ambiente, unido a su
carcinogenicidad, los ha situado en las listas de polucionantes orgánicos prioritarios.
Los PAH's pertenecen al grupo de Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs) ya que,
de acuerdo con el protocolo de Contaminantes Orgánicos Persistentes firmado el 24 de
junio de 1998 en Dinamarca, reúnen las cinco características fundamentales: (i) ser tóxicos,
(ii) persistentes, (iii) bioacumulables, (iv) ser transportados a través del aire y depositados a
largas distancias, y (v) causar efectos negativos sobre la salud y el medioambiente tanto
cerca, como lejos de su fuente emisora [28]. Esta diferencia de persistencia de los distintos
compuestos es la que va a decidir sobre la mayor o menor capacidad de bioacumulación de
cada uno de ellos. Como regla general, la persistencia del compuesto aumenta al aumentar
el tamaño de la molécula. Por ejemplo, la relativa baja persistencia del naftaleno y de otros
compuestos de peso molecular bajo indica su escasa capacidad de bioacumulación. Por otro
143
lado, los compuestos de mayor peso molecular (benzo(a) pireno) son altamente persistentes
y por tanto bioacumulables.
Los P AH' s son sustancias lipofilicas, tendencia que se incrementa con el aumento de su
masa molecular (decrece la solubilidad con el agua), e inestables fotoquimicamente, por lo
que se degradan con la luz (proceso de fotooxidación) [25]. Bajo la influencia de la luz del
sol o de una fuente artificial de luz UV, y en presencia de oxigeno, ozono u otros oxidantes,
los P AH' s reaccionan a peróxidos intracíclicos. Debido al carácter lipofilico son
potencialmente bioacumulados y concentrados en sedimentos y suelos tanto más, cuanto
mayor sea su persistencia en cada medio
La fluorescencia de los hidrocarburos aromáticos policíclicos está relacionada con la
presencia de orbitales 1t-enlazantes de alta energía y deorbitales 1t*-antienlazantes de
energía inferior. La transición electrónica entre ambos tipos de orbitales es la que origina el
color y espectros característicos de absorción UV y de fluorescencia.
La solubilidad de estos compuestos es un parámetro que determinará en gran manera la
concentración y el tipo de P AH' s que podemos encontrar en el medio ambiente acuoso.
Aunque la solubilidad de los PAH's en agua es muy baja, por ejemplo 2.6·10-4 mg/L para
el dibenzo(a, h) antraceno, o 5·10-4 mg/L para el benzo(a) pireno, estos compuestos pueden
aumentar su solubilidad en presencia de detergentes, sales alcalinas, ácidos grasos o
disolventes orgánicos. También tiene una influencia considerable en la solubilidad de estas
sustancias, la presencia de grupos alquílicos en sus moléculas, así como la configuración
geométrica de las mismas. Otro factor importante a tener en cuenta es la temperatura,
pudiéndose triplicar la solubilidad de algunos P AH' s al variar la temperatura entre 6 y 26
°C. Por otra parte, los P AH' s son capaces de asociarse con los coloides presentes en el
medio y, de esta forma, pueden ser transportados através del mismo. De esta forma, se
justifica la presencia de PAH's en organismos que habitan en lugares alejados de una
intensa actividad humana o el hecho de que los sedimentos sean más ricos en P AH' s que el
medio que los rodea.
144
La Agencia Federal para la Protección del Medio Ambiente (EPA) de los Estados Unidos
ha seleccionado 16 PAH's como contaminantes cuyo estudio debe considerarse prioritario.
En la Tabla VITI.1 se recogen dichos hidrocarburos, junto con sus estructuras, constantes
fisicoquímicas y potencia cancerígena estimada. Entre ellos, destacan por sus características
cancerígenas el Benzo(a)pireno, Dibenzo(a,h)antraceno, lndeno(1,2,3-cd)pireno,
Benzo(a)antraceno, Benzo(k)fluoranteno, Criseno y Benzo(ghi)perileno.
El papel de los P AH' s, como inductores del conjunto de anormalidades celulares conocidas
como "cáncer", ha atraído el interés y la actividad de los investigadores, habiéndose
estudiado, cómo la estructura de los P AH' s es crítica para las propiedades cancerígenas y
teratogénicas de los mismos. Los P AH' s no son, aparentemente, cancerígenos reales en sí
mismos, pero son metabólicamente convertidos en cancerígenos activos en el interior del
organismo receptor. Dado que muchos compuestos orgánicos cancerígenos son
electrofilicos, una teoría ampliamente apoyada es que estas sustancias reaccionan con un
átomo de nitrógeno del ADN, modificando el mensaje genético transmitido durante la
formación de nuevas células.
Los P AH' s pueden proceder de la combustión incompleta de la materia orgánica, reciente o
fósil, ya sea esta combustión debida a causas naturales o antropogénicas. Como
consecuencia de las elevadas temperaturas se generan radicales libres que reaccionen entre
sí, formando compuestos con estructuras cíclicas condensadas. La contribución de las
fuentes naturales, como los incendios forestales espontáneos y la actividad volcánica
[Harvey, 1997 ], es mínima comparada con las emisiones causadas por el ser humano. Así,
son fuentes principales de P AH' s, el tráfico intenso de vehículos, las calefacciones
domesticas o las plantas industriales que dependen de la combustión de derivados del
petróleo y del carbón. Aunque su repercusión ambiental es casi insignificante, el hombre
también genera cantidades importantes de PAH's en diferentes actividades sociales, entre
los que se encuentran el humo de tabaco, y procesos tecnológicos de los alimentos:
ahumados, a la parrilla y los sometidos a tratamientos térmicos severos. En general, la tasa
de formación de estos compuestos en los alimentos, depende del tipo de combustible y de
las condiciones de combustión (temperatura, accesibilidad de oxigeno, presencia o ausencia
de llama, etc.).
145
Tabla VIII ILos 16 PAH's seleccionados por la Agencia Federal para la Protección del
Medio Ambiente (EPA) de los Estados Unidos.
PAH's Solubilidad en agua Potencial cancerigeno (mg/L) IARC US/US EPA
l. Naftaleno 32 -2.Acenaftileno 393 -3 .Acenafteno 3.4 a 25°C 4.Fluoreno 19 5.Fenantreno 1-1.3 a 25°C 3 6. Antraceno 0.05-0.07 a 25°C 3 7 .Fluoranteno 0.26 a25°C 3 8.Pireno 0.11 a25°C 3 9.Benzo(a)antraceno 0.01 a 25°C 2A/B2 10.Criseno ----- 3/B2 ll.Benzo(b )fluoranteno ------ 2B/B2 12.Benzo(k )fluoranteno 0.0038 a 25°C 2B 13 .Benzo( a )piren o 0.0005 a 25°C 2A/B2 14 .Dibenzo( a,h)antraceno 0.00026 a25°C 2A/B2 15 .Benzo(g,h )perileno 3 16.Indeno(1,2,3)pireno ----- 2B/B2
2A: probablemente cancerígeno en humanos. 2B posiblemente cancerígenos en humanos. 3. no calificable como cancerígeno en humanos. --- .No experimentado en humanos.
IARC: Agencia Internacional en la Investigación del Cáncer.
146
IV.2 Contaminación medioambiental por los P AH' s
Los P AH' s son un importante grupo de contaminantes orgánicos muy extendidos en el
medio ambiente, donde pueden alcanzar importantes concentraciones. La mayoría de los
P AH' s presentes en el medio ambiente provienen de fuentes antropogénica, mientras que
son pocos los originados a partir de fuentes naturales.
Estos compuestos se han hallado en el aire de las grandes ciudades en elevadas
concentraciones debido a la intensidad del tráfico o la existencia de fuentes directas de
combustión, pero también se encuentran en las aguas, los sedimentos y los lagos de alta
montana. Gracias a su relativa volatilidad o a su capacidad de adsorción a las partículas
atmosféricas, los P AH' s se transportan continuamente a través del aire, pudiendo ser
depositados en lugares remotos a gran distancia de la fuente emisora, ampliando así la
dimensión de un problema local o regional a una escala planetaria.
La contaminación mundial por P AH' s se ha debido principalmente a la producción
industrial a gran escala en el hemisferio norte desde la Revolución Industrial. Las
concentraciones han aumentado desde este momento hasta los años 1960-1980. A partir de
aquí la disminución de las deposiciones se relaciona con la sustitución del carbón como
fuente de energía de centrales hidroeléctricas por gas natural o por energía nuclear, la
disminución de la industria pesada, y la regulación de la contaminación del aire.
Como consecuencia de la gran variedad de procesos que producen los P AH' s, estos se
encuentran en pequeñas concentraciones en todos los sedimentos y suelos del planeta. El
estudio de los cambios de sus niveles en zonas remotas permite conocer si la influencia
antropogénica ha dado lugar a incrementos -significativos de su nivel de fondo y, por tanto,
da una idea bastante exacta de la exposición general a la que se encuentran todos los
organismos vivos.
147
ANEXO IX
METHOD 3510C
SEPARATORY FUNNELLIOUID-LIOUID EXTRACTION
1.0 SCOPE AND APPLICATION
1.1 This method describes a procedure for isolating organic compounds from
aqueous samples. The method also describes concentration techniques suitable for preparing
the extract for the appropriate determinative methods described in Section 4.3 of Chapter
Four.
1.2 This method is applicable to the isolation and concentration of water-insoluble and
slightly water-soluble organics in preparation for a variety of chromatographic procedures.
1.3 This method is restricted to use by or under the supervision of trained analysts.
Each analyst must demonstrate the ability to generate acceptable results with this method.
2.0 SUMMARYOFMETHOD
2.1 A measured volume of sample, usually 1 liter, at a specified pH (see Tablel), is
serially extracted with methylene chloride using a separatory funnel.
2.2 The extract is dried, concentrated (if necessary), and, as necessary, exchanged into
a solvent compatible with the cleanup or determinative method to be used (see Table 1 for
appropriate exchange solvents ).
3.0 INTERFERENCES
3.1 RefertoMethod 3500.
3.2 The decomposition of sorne analytes has been demonstrated under basic
148
extraction conditions. Organochlorine pesticides may dechlorinate, phthalate esters may
exchange, and pliimots may react to form taimates. These reactions increase with
increasing pH, and are decreased by the shorter reaction times available in Method 3510.
Method 3510 is preferred over Method 3520 for the analysis pf the~e classes ,of
compounds. However, the recovery of phenols may be optimized by using Method 3520,
and performing the initial extraction at the acid pH.
4.0 APP ARA TUS AND MATERIALS
4.1 Separátory funnel - 2-liter, with polytetrafluoroethylene (PTFE) stopcock.
4.2Drying column- 20 mm ID Pyrex® chromatographic column with Pyrex® glass
wool at bottom and a PTFE stopcock.
NOTE: Fritted glass discs are difficult to decontaminate after highly contaminated
extracts have been passed through. Columns without frits may be purchased. U se a small
pad of Pyrex® glass wool to retain the adsorbent. Prewash the glass wool pad with 50 mL
of acetone followed'by .So mL of elution solvent prior to packing the column with adsorbent.
4.3 Kudema-Danish (K-D) ap~aratus.
4.3.1 Concentratortube- 10-mL, graduated (Kontes K-570050-1025 or equivalent). A
.. ground~glass sto.pper is used toprevent evaporation of extracts.
4.3.2 Evaporation flask- 500-mL (Kontes K-570001-500 or equivalent). Attach to
concentrator tube with springs, clamps, or equivalent.
4.3.3 Snyder column- Three-ball macro (Kontes K-503000-0121 or equivalent).
4.3.4 Snyder column- Two-ball micro (Kontes K-569001-0219 or equivalent).
4.3.5 Springs- 1/2 inch (Kontes K-662750 or equivalent).
NOTE: The following glassware is recommended for the purpose of solvent recovery
149
during the concentration procedures requiring the use of Kuderna-Danish evaporative
concentrators. Incorporation of this apparatus may be required by State or local municipality
regulations that govem air emissions of volatile organics. EPA recommends the
incorporation of this type of reclamation system as a method to implement an emissions
reduction program. Solventrecovery is a means to conform with waste minimization
and pollution prevention initiatives.
4.4 Solvent vapor recovery system (Kontes K-545000-1006 or K-547300-0000, Ace
Glass 6614-30, or equivalent).
4.5 Boiling chips- Solvent-extracted, approximately 10/40 mesh (silicon carbide or
equivalent).
4.6 Water bath- Heated, with concentric ring cover, capable oftemperature control(±
5EC). The bath should be used in a hood.
4.7 Vials- 2-mL, glass with PTFE-lined screw-caps or crimp tops.
4.8 pH indicator paper- pH range including the desired extraction pH.
4.9 Erlenmeyer flask - 250-mL.
4.10 Syringe - 5-mL.
4.11 Graduated cylinder- 1-liter.
5.0 REAGENTS
5.1 Reagent grade chemicals shall be used in all tests. Unless otherwise indicated,
it is intended that all reagents shall conform to the specifications of the Committee on
Analytical Reagents of the American Chemical Society, where such specifications are
available. Other grades may be used, provided it is frrst ascertained that the reagent is of
sufficiently high purity to permit its use without lessening the accuracy of the determination.
Reagents should be stored in glass to prevent the leaching of contaminants from plastic
150
containers.
5.2 Organic-free reagent water- All references to water in this method refer to organic
free reagent water, as defined in Chapter One.
5.3 Sodium hydroxide solution (10 N), NaOH. Dissolve 40 g NaOH in organic-free
reagent wat~r and dilute to 100 mL. Other concentrations of hydroxide solutions may be
used to adjust sample pH, provided that the volume added does not appreciably change
(e.g., <1%) the total sample volume.
5.4 Sodium sulfate (granular, anhydrous), Na2S04. Purify by heating to 400EC for 4 hours
in a shallow tray, or by precleaning the sodium sulfate with methylene chloride. If the sodium
sulfate is precleaned with methylene chloride, a method blank must be analyzed,
demonstrating that there is no interference from the sodium sulfate. Other concentrations of
acid solutions may be used to adjust sample pH, provided that the volume added does not
appreciably change ( e,g., <1%) the otal sample volume.
5.5 Sulfuric acid solution (1: 1 v/v), H2S04. Slowly add 50 mL of H2S04 (sp. gr.
1.84) to 50 mL of organic-free reagent water.
5.6 Extraction/exchange solvents- All solvents must be pesticide quality or equivalent.
5 .6.1Methylene chloride, CH2Cl2, boiling point 39EC.
5.6.2 Hexane, C6H14, boiling point 68.7EC.
5.6.3 2-Propanol, CH3CH(OH)CH3, boiling point 82.3EC.
5 .6. 4 Cyclohexane, C6H12, boiling point 80. 7EC.
5.6.5 Acetonitrile, CH3CN, boiling point 81.6EC.
6.0 SAMPLE COLLECTION, PRESERVATION, AND HANDLING
See the introductory material to this chapter, Organic Analytes, Sect. 4.1.
151
7.0 PROCEDURE
7.1 Using a 1-liter graduated cylinder, measure 1 liter (nominal) of sample.
Alternatively, if the entire contents of the sample bottle are to be extracted, mark the level of
sample on the outside of the bottle. If high analyte concentrations are anticipated, a smaller
sample volume may be taken and diluted to 1-L with organic-free reagent water, or samples
may be collected in smaller sample bottles and the whole sample used.
7.2 Pipet 1.0 mL of the surrogate spiking solution into each sample in the graduated
cylinder (or sample bottle) and mix well. (See Method 3500 and the determinative method
to be used for details on the surrogate standard solution and matrix spiking solution).
7.2.1 For the sample in each batch (see Chapter One) selected for use as a matrix
spike sample, add 1.0 mL ofthe matrix spiking standard.
7.2.2 If Method 3640, Gel-Permeation Cleanup, is to be employed, add twice the
volume of the surrogate spiking solution and the matrix spiking standard, since half of
the
extract is not recovered from the GPC apparatus. (Alternatively, use 1.0 mL ofthe spiking
solutions and concentrate the final extract to halfthe normal volume, e.g., 0.5 mL instead of
1.0 mL).
7.3 Check the pH of the sample with wide-range pH paper and adjust the pH, if
necessary, to the pH indicated in Table 1, using 1:1 (v/v) sulfuric acid or 10 N sodium
hydroxide. Lesser strengths of acid or base solution may be employed, provided that they
do not result in a significant change (<1%) in the volume of sample extracted (see Secs. 5.3
and 5.5).
7.4 Quantitatively transfer the sample from the graduated cylinder (or sample bottle)
to the separatory funnel. Use 60 mL of methylene chloride to rinse the cylinder (or bottle)
and transfer this rinse solvent to the separatory funnel. If the sample was transferred directly
from the sample bottle, refill the bottle to the mark made in Sec. 7.1 with water and then
measure the volume of sample that was in the bottle.
152
7.5 Seal and shake the separatory funnel vigorously for 1 - 2 minutes with periodic
venting to release excess pressure. Altematively, pour the exchange solvent into the top of
the Snyder column while the concentrator remains on the water bath in Sec. 7.11.4.
NOTE: Methylene chloride creates excessive pressure very rapidly; therefore, initial
venting should be done immediately after the separatory funnel has been sealed and shaken
once. The separatory funnel should be vented into a hood to avoid exposure of the analyst to
solvent vapors.
7.6 Allow the organic layer to separate from the water phase for a minimum of 1 O
minutes. If the emulsion interface between layers is more than one-third the . size of the
solvent layer, the analyst must employ mechanical techniques to complete the phase
separation. The optimum technique depends upon the sample and may include stirring,
filtration of the emulsion through glass wool, centrifugation, or other physical methods.
Collect the solvent extract in an Erlenmeyer flask. If the emulsion cannot be broken
(recovery of < 80% of themethylene chloride, corrected for the water solubility of
methylene chloride ), transfer the sample, solvent, and emulsion into the extraction chamber of
a continuous extractor and proceed as described in Method 3520, Continuous Liquid-Liquid
Extraction.
7.7 Repeat the extraction two more times using fresh portions of solvent (Secs. 7.2
through 7.5). Combine the three solvent extracts.
7.8 If further pH adjustment and extraction is required, adjust the pH of the aqueous
phase to the desired pH indicated in Table l. Serially extract three times with 60 mL of
methylene chloride, as outlined in Secs. 7.2 through 7.5. Collect and combine the extracts
and label the combined extract appropriately.
7.9 Ifperforming GC/MS analysis (Method 8270), the acid/neutral and base extracts may
be combined prior to concentration. However, in sorne situations, separate concentration and
analysis ofthe acid/neutral and base extracts may be preferable (e.g. iffor regulatory purposes
the presence or absence of specific acid/neutral or base compounds at low concentrations must
153
be determined, separate extract analyses may be warranted).
7.10 Perform the concentration (ifnecessary) using the Kudema-Danish Technique (Secs.
7 .11.1 through 7 .11. 6).
7.11 K-D technique
7.11.1 Assemble a Kudema-Danish (K-D) concentrator (Sec. 4.3) by attaching a 10-
mL concentrator tube to a 500-mL evaporation flask.
7 .11.2 Attach the solvent vapor recovery glassware ( condenser and collection device)
(Sec. 4.4) to the Snyder column ofthe K-D apparatus following manufacturer's instructions.
7 .11. 3 Dry the extract by passing it through a drying column containing about 1 O cm
of anhydrous sodium sulfate. Collect the dried extract in a K-D concentrator. Rinse
the Erlenmeyer flask, which contained the solvent extract, with 20 - 30 mL of methylene
chloride and add it to the column to complete the quantitative transfer.
7 .11. 4 Add one or two clean boiling chips to the flask and attach a three-ball Snyder
column. Prewet the Snyder column by adding about 1 mL of methylene chloride to the top
of the column. Place the K-D apparatus on a hot water bath (15- 20EC above the boiling
point of the solvent) so that the concentrator tube is partially immersed in the hot water
and the entire lower rounded surface of the flask is bathed with hot vapor. Adjust the
vertical position of the apparatus and the water temperature as required to complete the
concentration in 1 O -20 minutes. At the proper rate of distillation the balls of the column
will actively chatter, but the chambers will not flood. When the apparent volume of liquid
reaches 1 mL, remove the K-D apparatus from the water bath and allow it to drain and cool
for at least 1 O minutes;
7.11.5 Ifa solvent exchange is required (as indicated in Table 1), momentarily remove
the Snyder column, add 50 mL of the exchange solvent, a new boiling chip, and reattach the
Snyder column. Altematively, pour the exchange solvent into the top of the Snyder
154
column while the concentrator remains on the water bath in Sec. 7.11.4. Concentrate the
extract, as described in Sec. 7.11.4, raising the temperature of the water bath, if necessary,
to maintain proper distillation.
7.11.6 Remove the Snyder column and rinse the flask and its lower joints into the
concentrator tube with 1 - 2 mL of methylene chloride or exchange solvent. If sulfur
crystals are a problem, proceed to Method 3660 for cleanup. The extract may be further
concentrated by using the technique outlined in Sec. 7.12 or adjusted to 10.0 mL with the
solvent last used.
7.12 If further concentration is indicated in Table 1, either the micro-Snyder coiumn
technique (7.12.1) or nitrogen blowdown technique (7.12.2) is used to adjust the extract to
the final volume required.
7.12.1 Micro-Snyder column technique
If further concentration is indicated in Table 1, add another clean boiling chip to
the concentrator tube and attach a two-ball micro-Snyder column. Prewet the column by
adding 0.5 mL ofmethylene chloride or exchange solvent to the top ofthe column. Place
the K-D apparatus in a hot water bath so that the concentrator tube is partially immersed in
the hot water. Adjust the vertical position of the apparatus and the water temperature, as
required, to complete the concentration in 5 - 1 O minutes. At the proper rate of distillation
the balls of the column will actively chatter, but the chambers will not flood. When the
apparent volume of liquid reaches 0.5 mL, remove the K-D apparatus from the water bath
and allow it to drain and cool for at least 1 O minutes. Remove the Snyder column, rinse the
flask and its lower joints into the concentrator tube with 0.2 mL of methylene chloride or
the exchange solvent, and adjust the final volume as indicated in Table 1, with solvent.
7,12.2 Nitrogen blowdown technique
7.12.2.1 Place the concentrator tube in a warm bath (35EC) and evaporate the
solvent to the final volume indicated in Table 1, using a gentle stream of clean, dry
155
nitrogen (filtered through a column ofactivated carbon).
CAUTION: New plastic tubing must not be used between the carbon trap and
the sample, since it may introduce contaminants.
7 .12.2.2 The intemal wall of the tube must be rinsed several times with
methylene chloride or appropriate solvent during the operation. During evaporation, the tube
must be positioned to avoid water condensation (i.e., the solvent level should be below the
level of the water bath). Under normal procedures, the extract must not be allowed to
become dry.
CAUTION: When the volume of solvent is reduced below 1 mL, semivolatile analytes
maybe lost.
7.13 The extract may now be analyzed for the target analytes using the
appropriate determinative technique(s) (see Sec. 4.3 ofthis Chapter). lf analysis ofthe
extract will not be performed immediately, stopper the concentrator tube and store
refrigerated. If the extract will be stored longer than 2 days it should be transferred to a vial
with a PTFE-lined screw-cap or crimp top, and labeled appropriately.
8.0 QUALITY CONTROL
8.1 Any reagent blanks, matrix spikes, or replicate samples should be subjected to
exactly the same analytical procedures as those used on actual samples.
8.2 Refer to Chapter One for specific quality control procedures and Method-3500 for
extraction and sample preparation procedures.
9.0 :METHOD PERFORMANCE
Refer to the determinative methods for performance data.
e For method.swherethesuggestedfinal extractvolumeis 10.0 ml, thevolume may be reduced toas low as 1.0 ml to achieve lower detection limits.
t1 Phenols maybeanalyzed, by Method8041, usinga 1.0 ml2-propanol extract by GCIFID. Method 8041 also contains an optiona1 derivatization procedure for phenots which results in a 0.5 ml hexane extract to be analyzed by GCIECD.
e Thespecificity ofGCIMS may make cleanup ofthe extracts unneces.sary. Refer to Method 3600 for guidance on the cleanup procedures available if required.
11 Extraction pH sequence m ay be reversed to better s eparateacid andn eutra1 was1e components. Excessive pH acf,JUStments m ay result in the In u: nf c::nm,. SllnSIIIvt,.c:: /e ~~A,.~¡:¡.¡" 1i ?\
157
ANEXO X
METHOD 3540C
SOXHLET EXTRACTION
1.0 SCOPE AND APPLICATION
1.1 Method 3540 is a procedure for extracting nonvolatile and semivolatile
organic compounds from solids such as soils, sludges, and wastes. The Soxhlet extraction
process ensures intimate contact of the sample matrix with the extraction solvent.
1.2 This method is applicable to the isolation and concentration of water-insoluble and
slightly water soluble organics in preparation for a variety of chromatographic procedures.
1.3 This method is restricted to use by or under the supervision of trained analysts.
Each analyst must demonstrate the ability to generate acceptable results with this method.
2.0 SUMMARY OF METHOD
2.1 The solid sample is mixed with anhydrous sodium sulfate; placed in an extraction
thimble or between two plugs of glass wool, and extracted using an appropriate solvent
in a Soxhlet extractor.
2.2 The extract is then dried, concentrated (if necessary), and, as necessary, exchanged
into a solvent compatible with the cleanup or determinative step being employed.
3 .O INTERFERENCES
Refer to Method 3500.
4.0 APP ARA TUS AND MATERIALS
4.1 Soxhlet extractor- 40 mm ID, with 500-mL round bottom flask.
4.2 Drying column- 20 mm ID Pyrex® chromatographic column with Pyrex® glass
158
wool atbottom.
NOTE: Fritted glass discs are difficult to decontaminate after highly contaminated
extracts have been passed through. Columns without frits may be purchased. U se a small
pad of Pyrex® glass wool to retain the adsorbent. Prewash the glass wool pad with 50 mL
of acetone followed by 50 mL of elution solvent prior to packing the column with adsorbent.
4.3 Kudema-Danish (K-D) apparatus
4.3.1 Concentrator tube- 10-mL, graduated (Kontes K-570050-1025 or equivalent).
A ground-glass stopper is used to prevent evaporation of extracts.
4.3.2 Evaporation flask- 500-mL (Kontes K-570001-500 or equivalent). Attach to
concentrator tube with springs, clamps, or equivalent.
4.3.3 Snyder column- Three-ball macro (Kontes K-503000-0121 or equivalent).
4.3.4 Snyder column- Two-ball micro (Kontes K-569001-0219 or equivalent).
4.3.5 Springs- 112 inch (Kontes K-662750 or equivalent).
NOTE: The following glassware is recommended for the purpose of solvent recovery
during the concentration procedures requiring the use of Kudema-Danish
evaporative concentrators. Incorporation of this apparatus may be required
by State or local municipality regulations that govem air emissions of volatile
organics. EPA recommends the incorporation of this type of reclamation
system as a method to implement an emissions reduction program. Solvent
recovery is a means to conform with waste minimization and pollution prevention
initiatives.
4.4 Solvent vapor recovery system (Kontes K-545000-1006 or K-547300-0000, Ace
Glass 6614-30, or equivalent).
4.5 Boiling chips- Solvent-extracted, approximately 10/40 mesh (silicon carbide or
159
equivalent ).
4.6 Water bath- Heated, with concentric ring cover, capable oftemperature control(±
5EC). The bath should be used in a hood.
4.7 Vials- Glass, 2-mL capacity, with polytetrafluoroethylene (PTFE)-lined screw or
crimptop.
4.8 Glass or paperthimble or glass wool- Contaminant-free.
4.9 Heating mantle- Rheostat controlled.
4.10 Disposable glass pasteur pipet and bulb.
4.11 Apparatus for determining percent dry weight.
4.11.1 Drying oven- capable ofmaintaining 105EC.
4.11.2 Desiccator.
4.11.3 Crucibles - Porcelain or disposable aluminum.
4.12 Apparatus for grinding
4.13 Analytical balance- capable ofweighing to 0.0001 g.
5.0 REAGENTS
5.1 Reagent grade inorganic chemicals shall be used in all tests. Unless otherwise
indicated, it is intended that all reagents shall conform to the specifications of the
Committee on Analytical Reagents of the American Chemical Society, where such
specifications are available. Other grades may be used, provided it is first ascertained that the
reagent is of sufficiently high purity to permit its use without lessening the accuracy of the
determination.
5.2 Organic-free reagent water. All references to water in this method refer to organic
free reagent water, as defined in Chapter One.
160
5.3 Sodium sulfate (granular, anhydrous), Na2S04. Purify by heating at 400EC for 4
hours in a shallow tray, or by precleaning the sodium sulfate with methylene chloride. If the
sodium sulfate is precleaned with methylene chloride, a method blank must be analyzed,
demonstrating that there is no interference from the sodium sulfate.
5.4 Extraction solvents- All solvents must be pesticide quality or equivalent.
5.4.1 Soil/sediment and aqueous sludge samples shall be extracted using either of
the following solvent systems:
5.4.1.1 Acetone/Hexane(1:1)(v/v), CH3COCH3/C6H14.
NOTE: This solvent system has lower disposal cost and lower toxicity.
For methodswherethesuggestedfinal extractvolumeis 1'0.0 mL, the volume may be reduced to as low as 1.0 mL to aehieve lower detection limits.
Phenclsmay beanatyzedey Method8041~.usinga 1.0..mL2-propand extract by GCIFID. Method 8041 a.tso contains a:n optional derivatiza.tion procedure for phenols which results in a 0.5-ml hexane extract to be a.na:lyzed by GCIECD ..
e Thespecificity ofGCJMS may make C:leanup ·Ofthe extracts unnecessary. Refer to Method 3600 for guidance on the cleanup, procedures available if required.