UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA ESCUELA DE POSGRADO MAESTRÍA EN PRODUCCIÓN ANIMAL “DETERMINACIÓN DE LA RESERVA OVÁRICA EN ALPACAS MEDIANTE LA CONCENTRACIÓN DE LA HORMONA ANTI- MÜLLERIANA (AMH) EN EL PLASMA SANGUÍNEO” Presentado por: RENSSON HOMERO CÉLIZ YGNACIO TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAGÍSTER SCIENTIAE EN PRODUCCIÓN ANIMAL Lima – Perú
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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINArepositorio.concytec.gob.pe/bitstream/CONCYTEC/662/1/TESIS HOME… · 2.2 FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA ALPACA HEMBRA El conocimiento de la
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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA
MOLINA
ESCUELA DE POSGRADO MAESTRÍA EN
PRODUCCIÓN ANIMAL
“DETERMINACIÓN DE LA RESERVA OVÁRICA EN ALPACAS
MEDIANTE LA CONCENTRACIÓN DE LA HORMONA ANTI-
MÜLLERIANA (AMH) EN EL PLASMA SANGUÍNEO”
Presentado por:
RENSSON HOMERO CÉLIZ YGNACIO
TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAGÍSTER SCIENTIAE EN
PRODUCCIÓN ANIMAL
Lima – Perú
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ÍNDICE GENERAL
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………...1
II. REVISIÓN DE LITERATURA…………………………………………………...3
2.1 LAS ALPACAS Y SU IMPORTANCIA PARA EL PERÚ……………………….3
2.2 FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA ALPACA HEMBRA…………………..3
2.2.1 Anatomía del ovario de alpaca………………………………………………........4
2.2.2 Foliculogénesis en alpaca…………………………………………………….......4
2.2.3 Ovulación en alpacas……………………………………………………………..5
2.3 RESERVA OVÁRICA……………………………………………………………..7
2.3.1 Reserva de folículos primordiales………………………………………………..7
a. Diferenciación de las células germinales primordiales………………….............8
b. Establecimiento de los folículos primordiales ……………………………..........8
2.3.2 Reserva de folículos pre-antrales……………………………………………….11
a. Reclutamiento folicular………………………………………………………...11
b. Activación de los folículos primordiales……………………………………….13
2.3.2 Reserva de folículos Antrales…………………………………………………...15
a. Crecimiento de folículos independientes de gonadotropinas…………………...15
b. Formación de folículos dependientes de gonadotropinas………………………16
2.4 EVALUACIÓN DE LA RESERVA OVÁRICA…………………………………17
2.4.1 Conteo de folículos antrales……………………………………………………..17
disminuye progresivamente debido a la atresia de folículos, así como el
reclutamiento, maduración y ovulación (Pelosi et al., 2015).
a. Diferenciación de las células germinales primordiales
Las células somáticas y las células precursoras de los ovogonias (células
germinales primordiales-CGPs) se desarrollan a partir de microambientes
diferentes. Durante la gastrulación en el desarrollo embrionario humano,
Ginsburg et al., 1990 observaron que la pequeña población de CGPs se
desarrolla en un compartimento extra-embrionario, ubicado en la base de la
alantoides del endodermo de la pared dorsal del saco vitelino. Estudios en
ratones muestran que las etapas críticas para el desarrollo de las CGPS son
la especialización, migración y proliferación de las CGPs (Pelosi et al., 2015).
La especialización depende de la señalización de proteínas morfogenéticas
del hueso (BMP), tales como BMP4, BMP2 y BMP8, las cuales actúan desde
el ectodermo extraembrionario (Pelosi et al., 2011). Posteriormente, la
expresión Blimp1 permite que el grupo de CGPs se mantengan especializadas
inhibiendo la diferenciación a células mesodérmicas (Ohinata et al., 2005).
Luego de la especialización de las CGPs, comienzan a migrar hacia su destino
final, la gónada (Kurilo, 1981). Es durante esta migración que las CGPs
comienzan a proliferar, y continúan su multiplación durante la colonización
de la gónada (Baker, 1963). Genes Nanos son importantes para la
especificación y la migración de las CGPs. La ablación de Nanos3 provocó
defectos en la migración y la proliferación de CGPs de ratón, lo que conduce
a la esterilidad (Tsuda et al., 2003).
b. Establecimiento de los folículos primordiales
En las especies de mamíferos que han sido examinados, antes del nacimiento
se producen procesos como mitosis de la ovogonia e inicio de la profase
meiótica, pero el momento de la detención meiótica, formación del folículo,
y el inicio del crecimiento del folícular (es decir, la activación del folículo)
varía de especie a especie (Figura 1). En el ovario humano, los primeros
folículos primordiales se detectan en la mitad de la gestación y en los roedores
2-4 días post-parto (Sforza y Forabosco 1998). En bovinos, el pool de
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folículos primordiales es establecido durante el segundo trimestre de
gestación.
La migración de CGP ocurre desde el epitelio del saco vitelino hasta colonizar
la cresta gonadal, proceso altamente controlado y dirigido por la secreción de
citoquinas pleiotrópicas y factores de crecimiento (Kunwar et al., 2006). A la
llegada a la cresta gonadal las células germinales migran hacia el interior para
formar cordones primitivos tanto medulares y sexuales, en los que pierden su
movilidad y se convierten en estructuras interconectas y rodeadas de células
somáticas: ovogonia (Sathananthan et al., 2000). La ovogonias se encuentran
agrupadas juntas en nidos ovogoniales las cuales están conectados por
puentes intercelulares, a todo este conjunto se le denomina quistes de la línea
germinal (Pepling 2006). Proteínas GDFs (Factor de diferenciación de
crecimiento) y BMPs, tales como GDF9 y BMP15 están implicados en la
ruptura de las interacciones intercelulares entre ovogonias (Yan et al., 2001).
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Figura 1. Comparación de ovogénesis y foliculogénesis durante la vida de diferentes
mamíferos. Barra azul: inicio de la meiosis y formación de la reserva de folículos
primordiales, barra verde: foliculogénesis antes de la pubertad y barra naranja:
foliculogénesis y la aparición de la ovulación. (Tomado de Monniaux et al., 2013)
Después de una serie de mitosis, las ovogonias entran en las primeras etapas
de meiosis I. Borum, 1961, mostró en ovarios de ratón que los ovocitos
proceden de forma sincronizada a través del leptoteno, cigoteno, y etapas del
paquiteno de la profase I durante el último tercio de la gestación (Figura 2).
En mutantes femeninos, para determinados genes involucrados en la división
y reparación celular como Spo11 (Baudat et al., 2000), Dmc1 (Pittman et al.,
1998) y Atm (Barlow et al., 1998), las células germinales primordiales no
progresan más allá de la etapa de paquiteno de la profase I y posteriormente
mueren. En otro estudio, Paredes et al., 2005 observó que la inhibición de
SCP1 (una proteína del compleja sinaptonemal) causó la llegada prematura a
la fase de diplotene de la meiosis y la aceleración de la formación del pool de
folículos primordiales, lo que sugiere una relación entre la fase del ciclo
celular y el desarrollo del folículo primordial.
En ratones, poco después del nacimiento, los ovocitos se detienen en la etapa
de diploteno de la Profase I, los nidos de los ovocitos se rompen y se forman
los folículos primordiales. Las células somáticas invaden la corteza de la
medula y rodean los nidos ovogoniales y son circundadas en una capas de
células aplanadas, denominadas células de la pregranulosa, que se cree que
derivan del mesonéfrico, o de las células del epitelio superficial (McNatty et
al., 2000). Esas células en la gónada interior parecen ser los primeros ovocitos
en reactivar la meiosis, mientras que los ubicados en la periferia son los
últimos en hacerlo (van Wezel y Rodgers 1996) y esto puede tener
consecuencias en la activación del folículo primordial.
Es posible que el tamaño del pool de folículos primordiales esté influenciado
por el entorno que se desarrolla el feto antes y durante el tiempo de gestación
(Mossa et al., 2013). En el ganado vacuno, los esteroides ováricos fetales
(estradiol y progesterona) son reguladores negativos tanto para la formación
del folículo primordial como para la activación e inicio del crecimiento
folicular (Fortune et al., 2013). Por tanto, factores externos que alteren la
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producción o acción de esteroides pueden afectar también el tamaño de la
reserva ovárica (Veiga-Lopez et al. 2012).
Figura 2. Línea de tiempo del desarrollo de células germinales en el ratón. Células
germinales (amarillo) y células somáticas (rojo) se muestran para resumir eventos que se
producen durante el desarrollo temprano de las células germinales de ratón. (dibujo tomado
de Pepling, 2006).
2.3.2 RESERVA DE FOLÍCULOS PRE-ANTRALES
Una vez formados la población de folículos primordiales, estos puede permanecer
inactivos durante meses (ratones) o durante muchas décadas (humanos), o incluso no
se utilizan en absoluto durante la vida reproductiva. Pelosi et al., 2015 plantea dos
mecanismos por los cuales se puede mantener el pool de folículos, por ende la reserva
ovárica: (a) el mantenimiento de la quiescencia y la supervivencia de las células
primordiales, y (b) la supresión de la activación de las células primordiales (Reddy
et al., 2010). El proceso de activación va a permitir que los folículos primordiales
entren a una etapa de continuo crecimiento.
a. Reclutamiento folicular
El término reclutamiento se ha utilizado con frecuencia por diferentes
investigadores para describir dos importantes pero distintos puntos de
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inflexión durante el desarrollo folicular. El primero corresponde al
reclutamiento folicular continuo, en el cual los folículos primordiales son
reclutados de una manera continua para su posterior desarrollo hasta que
tienen una pequeña cavidad antral, mientras que el segundo corresponde al
reclutamiento cíclico en el cual los incrementos en la FSH circulante durante
cada ciclo reproductivo permite reclutar una cohorte de folículos antrales para
alcanzar la fase preovulatoria Figura 3. (McGee y Hsueh, 2000).
Figura 3. Representación esquemática del desarrollo de la foliculogénesis en el ovario de
un ser humano (Tomado de Broer et al., 2014). Dotación y mantenimiento, reclutamiento
inicial, maduración, atresia o reclutamiento cíclico, ovulación, y agotamiento. Se muestra
la acción de hormonas que actúan inhibiendo (AMH e Inhibina B) e induciendo (FSH) el
desarrollo de los folículos.
En el reclutamiento continuo, ocurre la transición de folículos primordiales a
folículos primarios, proceso denominado activación folicular, lo cual resulta
en cambios morfológicos y fisiológicos, tanto del ovocito como de las células
somáticas que lo rodean. El volumen de los ovocitos aumenta en gran medida,
y las células de la pre-granulosa aplanadas que rodean los ovocitos se
diferencian y proliferan en las células de la granulosa cúbicas. Después, los
folículos activados crecen lentamente (crecimiento folicular basal), su tasa de
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crecimiento está estrechamente relacionado con la proliferación de las células
de la granulosa. La mayoría de los folículos activados sufren atresia (Polosi
eta l., 2015). El reclutamiento continuo está bajo el control de factores de
crecimiento de origen paracrino, y es un proceso gonadotrofina
independiente, aunque la hormona estimulante del folículo (FSH) puede
ejercer un efecto mitogénico (indirecto) sobre las células de la granulosa,
mediante la potenciación de la expresión de factores de crecimiento o
receptores de factor de crecimiento (McGee y Huseh 2000).
En el reclutamiento cíclico, el crecimiento folicular es rápido y se produce
por el aumento significativo de la cavidad antral (crecimiento folicular
terminal). Durante este reclutamiento sólo un número limitado de folículos
llegan a sobrevivir, los restantes sufren un proceso de atresia. Los ovocitos en
estos folículos completan su crecimiento, adquieren la zona pelúcida, y están
competentes para reanudar la meiosis (Tsafriri et al., 1997). En las alpacas,
como en todas las especies mono-ovulatorias, sólo uno de estos folículos, el
"folículo dominante", generalmente se selecciona para la ovulación de un
ovocito plenamente competente de cada ciclo, mientras que los otros folículos
antrales seleccionados son los “folículos subordinadas” y sufren atresia. El
reclutamiento cíclico es estrictamente dependiente de la gonadotropinas. FSH
juega un papel determinante en la diferenciación de las células de la granulosa
y la supervivencia. Estas acciones están mediadas o moduladas de manera
importante por factores paracrinos, en particular esteroides y factores de
crecimiento (Broer et al., 2014)
b. Activación de los folículos primordiales
La activación de los folículos primordiales implica un cambio
conformacional en las células de la granulosa, es decir, pasan de ser células
aplanadas o escamosas a cúbicas. Algunos folículos completan la división
meiótica y se desarrollan los folículos secundarios alrededor del final de la
primera semana postnatal. Por el contrario, en las especies de interés más
práctico, como los rumiantes domésticos y los seres humanos, la detención
meiótica, la formación del folículo, y el inicio del crecimiento del folículo, se
produce antes del nacimiento y es mucho menos sincrónica que en los
roedores (Pepling, 2006).
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La capacidad de los folículos para ser activados está vinculado con la división
celular del ovocito (profase I de la meiosis). Los efectos inhibidores del
estradiol sobre la activación de folículo se correlacionan con la inhibición de
la progresión de la profase I. Ovarios bovinos fetales en fase meiótica
producen hormonas esteroides y la producción varía considerablemente
durante la gestación y en un patrón consistente con la hipótesis de que inhiben
la formación del folículo y la capacidad de los folículos recién formadas para
ser activados in vivo (Fortune et al. 2013). La activación de los folículos
primordiales es un proceso altamente regulado y dinámico con comunicación
bidireccional entre el ovocito y el compartimento somático (Zhang et al.,
2014).
La hormona Anti-Mülleriana (miembro de la superfamilia de los TGF)
producido en las células de la granulosa de folículos en estados tempranos
(Durlinger et al., 2002). Esta hormona tiene un papel importante durante la
foliculogénesis: durante el reclutamiento continuo inhibe la transición de los
folículos primordial a folículos primarios, mientras que en la fase de
reclutamiento cíclico es un antagonista a la capacidad de respuesta de la FSH
(Pelosi et al., 2015).
Figura 4. Citoquinas y factores de crecimiento en la señalización durante la transición entre
folículo primordial- folículo primario. Las flechas verdes son promotores del desarrollo y
las flechas rojas son inhibidores de la activación del folículo. Abreviaturas: AMH, Hormona
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Anti-Mülleriana; BMP, proteína morfogenética ósea; FGF, factor de crecimiento de
fibroblastos; GDF, factor de diferenciación de crecimiento; GDNF, factor neurotrófico
derivado de la glia; KGF, factor de crecimiento de queratinocitos; KL, ligando KIT; LIF,
factor inhibidor de leucemia; SDF, el factor derivado de células del estroma. Figura tomado
de McLaughlin y Mclver, 2009
2.3.3 RESERVA DE FOLÍCULOS ANTRALES
El desarrollo de los folículos primarios hasta folículos con pequeña cavidad antral
involucra crecimiento en volumen del ovocito así como el aumento en el número de
células de la granulosa y células tecales (Monniaux et al., 2014). Estos procesos están
regulados, inicialmente, por factores de crecimiento y proteínas de señalización las
cuales participan en la interacción ovocito-células somáticas de los alrededores lo
que conlleva a un buen desarrollo del folículo (Eppig, 2001). En todos mamíferos,
la cavidad antral se forma cuando el folículo en crecimiento alcanza un diámetro
entre 200 y 300 µm, este crecimiento se da por la acumulación del fluido derivado
de la sangre que fluye a través de los capilares de la teca y productos de secreción de
las células foliculares (hialuronanos y proteoglicanos) generando así una gradiente
osmótica que participa en el crecimiento del antro (Rodgers e Irving-Rodgers, 2010).
Los folículos dependientes de gonadotropinas adquieren un diámetro folicular
determinado, específico de cada especie: 200 µm en roedores, 1 mm en el cerdo, 2
mm en el ganado ovino, de 3 a 5 mm en los seres humanos y vacas, y alrededor de
10 mm en el caballo (Monniaux et al., 1997). Por debajo de este diámetro, los
pequeños folículos antrales constituyen un grupo de folículos de gonadotropina-
sensibles, que es la reserva para la ovulación y biotecnologías de ovario.
Una vez que el folículo adquiere receptores funcionales de FSH, estos pueden
responder a las gonodotropinas para luego seguir procesos de maduración y
prepararse para la ovulación. Sólo una pequeña cantidad de folículos ováricos
sobreviven al proceso de maduración, la mayor parte se pierde por el camino en un
proceso de muerte celular programada denominado atresia (Johnson, 2003).
a. Crecimiento de folículos independientes de gonadotropinas
Desde la foliculogénesis temprana hasta la etapa de folículos pre-antrales
parece estar dirigido por señales dentro del ovario y es independiente de la
estimulación con gonadotropinas. También hay comunicación dentro del
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ovario entre oocitos, granulosa y células de la teca (Parker y Schimmer,
2006). Los miembros de la superfamilia Factor de crecimiento transformante
beta (TGF-B) intervienen activamente en el crecimiento del folículo. Entre
ellos, GDF9 y BMP15 tienen funciones similares, implicadas en la progresión
de la maduración del folículo (Yan et al., 2001). La ablación de GDF9 en
ratones provoca un bloqueo en el crecimiento del folículo en la estadio
primario ocasionando una posterior infertilidad (Yan et al., 2001). Además,
GDF9 induce activamente la proliferación de células de la granulosa;
formación de las capas de la teca y la biosíntesis de andrógenos por parte de
estas (Solovyeva et al, 2000). Por el contrario, la ablación de BMP15 en el
ratón no da como resultado la infertilidad, sin embargo, los ratones son
subfértiles, tienen un tamaño reducido de la camada, y muestran un deterioro
de la ovulación y la fertilización, lo que sugiere un papel predominante de
BMP15 en el período peri-ovulatoria (Yan et al., 2001).
b. Formación de folículos dependientes de gonadotropinas
La regulación del crecimiento folicular, después del crecimiento del folículo
antral, es un proceso dependiente de gonadotropinas que ocurre después de la
pubertad y que corresponde a la iniciación de las ondas foliculares, selección
de folículos dominantes y maduración de los folículos pre-ovulatorios
(Monniaux et al., 1997). Las gonadotropinas secretadas por la glándula
pituitaria desarrollan un complejo sistema de alimentación/ retroalimentación
con los ovarios, conocido como el eje hipotálamo-hipófisis-gónadas, lo que
permite a los folículos crezcan más allá de las etapas de pre-antrales
tempranas (Rajkovic et al., 2006). La maduración de los folículos ováricos a
un estado preovulatorio abarca no sólo un aumento explosivo de la
proliferación de células de la granulosa contenidas en el folículo, sino también
la diferenciación celular. Como consecuencia, el folículo desarrolla un antro
lleno de líquido (Rodgers e Irving-Rodgers, 2010).
Entre los marcadores para la formación del antro, tenemos: expresión de la
subunidad α de la hormona inhibina, que tiene una expresión de
retroalimentación negativa hacia la glándula pituitaria anterior reprimiendo
de esta manera la producción de FSH (Woodruff et al., 1987); aumento de la
producción de estrógenos que resulta en gran medida debido a la expresión
17
de la proteína P-450 aromatasa (aromatasa), enzima que convierte la
testosterona a estrógenos; aumento de la expresión de deshidrogenasa 3β-
hidroxiesteroide involucrada en la conversión de colesterol en pregnenolona,
y aumento de la expresión de receptores de membrana para la hormona
leutinizante (LH) necesario para la ovulación (Park et al., 2004).
2.4 EVALUACIÓN DE LA RESERVA OVÁRICA
La evaluación de la reserva ovárica puede ser realizada por dos métodos diferentes: ecografía
ovárica que proporciona estimaciones precisas de número de folículos antrales, y la medición
de los marcadores endocrinos que dan una estimación indirecta del tamaño de la reserva.
2.4.1 CONTEO DE FOLÍCULOS ANTRALES (AFC)
El conteo de folículos antrales es un método directo para cuantificar la cantidad de
folículos con cavidad antral. Ireland et al. (2008) mostraron que el AFC está
positivamente relacionado con el número de folículos y ovocitos sanos en los ovarios
de vacas. La población de pequeños folículos antrales se mantiene en un equilibrio
dinámico, con salidas numéricamente compensadas por las entradas, y el tamaño de
equilibrio de esta reserva dinámica es específica de cada individuo (Burns et al.,
2005; Rico et al., 2012).
AFC ha sido utilizado para predecir la respuesta ovárica de un individuo a
tratamientos a base de gonadotropinas, por tanto, es una herramienta muy utilizada
en la biotecnología de producción de embriones de granja (Broer et al., 2014).
2.4.2 MARCADORES ENDOCRINOS
Se han utilizado diversos marcadores basados en la expresión de determinadas
proteínas y su correlación con la reserva ovárica de folículos en crecimiento. La
inhibina B y la AMH son ejemplos de medidas directas, ya que se producen durante
el desarrollo folicular, independientemente de la estimulación folicular. Medidas
indirectas incluyen FSH, LH y estradiol las cuales se basan en la producción de otras
hormonas a través de un proceso de realimentación (Monniaux et al., 2014).
a. Concentraciones de hormona folículo estimulante (FSH)
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FSH, también conocida como folitropina, es una hormona glicoproteíca que
consta de dos subunidades distintas: una subunidad α presente también en
hormonas glicoproteicas relacionadas como la LH. FSH se produce en células
gonadotrópicas de la pituitaria anterior, y su síntesis y secreción está regulada por
señales neurales y gonadales (Padmanabhan et al., 2002)
FSH es esencial para la foliculogénesis, especialmente para el crecimiento de los
folículos antrales durante las ondas foliculares en el ganado. La glándula pituitaria
produce la FSH que estimula el crecimiento del folículo. Niveles de FSH son
mínimos al comienzo del ciclo estral y luego aumentan. Esto hace que crezca un
folículo y que madure el ovocito que contiene. A medida que esto ocurre, el
folículo libera estradiol. A su vez, estos niveles mayores de estradiol inducen a la
glándula pituitaria que produzca menos FSH (Kumar et al, 1999).
Al evaluar la población de folículos dominantes durante la onda folicular en
vacunos, se observa que el número está correlacionado positivamente con las
concentraciones séricas de la FSH (López et al., 2005). Sin embargo, Ireland et
al., 2007 mostraron que las concentraciones séricas de FSH se asocian
inversamente con el número de folículos totales durante la onda en novillas.
Asimismo, numerosos estudios reportan que el aumento de la concentración sérica
de FSH está asociados con el agotamiento de la reserva ovárica, disminución de
la capacidad de respuesta a la estimulación de gonadotropinas, reducción en el
éxito de la FIV o disminución de la fertilidad durante el envejecimiento ovárico
en las mujeres (Scheffer et al, 2003) y en bovinos (Malhi et al,. 2005).
La desventaja de utilizar FSH como un indicador de la reserva ovárica, es su alta
variabilidad durante la onda folicular. Kwee et al., 2004 mostraron que en mujeres
las mediciones de FSH son muy variables intra e inter-ciclo estral. En mujeres con
un ciclo regular, la concentración de FSH puede servir como predictor de la
reserva ovárica, sólo si tiene niveles muy altos de esta hormona, por tanto como
una prueba de asesoramiento solo será útil para un porcentaje bajo de mujeres
(Broekmans et al., 2006)
b. Concentraciones de hormona Inhibina
La inhibina es una glicoproteína heterodimérica secretada por los folículos en
crecimiento. Tienen una acción paracrina y la forma activa tiene un peso
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molecular de 30 kDa. La secreción de la FSH por la pituitaria es regulada por
la acción de las inhibinas mediante la via inhibina-activina-folistaina (Knight
2012).
Dos formas de inhibina han sido identificadas (Robertson et al., 2012). La
inhibina A, secretada principalmente por los folículos dominantes y el cuerpo
lúteo. Las concentración no se mantienen constantes durante el ciclo estral,
van variando a lo largo de la onda folicular y está relacionado al crecimiento
del folículo dominante (fase folicular) y al patrón de la progesterona (fase
luteal) (Robertson et al., 2012). Se ha demostrado una relación recíproca entre
la inhibina A y el FSH en el suero (Welt et al., 1997) a través de la transición
luteal-folicular.
La inhibina B por el contrario, es el producto de los folículos en desarrollo
temprano. Sus niveles están elevados tempranamente en la fase folicular del
ciclo estral, disminuyen a través de la fase folicular tardia, ovulatoria y luteal
del ciclo. Sin embargo, en contraste con la inhibina A, se observó una relación
inversa entre la inhibina B y la FSH, en particular en la fase folicular
(Robertson et al., 2009 y Welt, 2002).
Inhibina B es utilizado para evaluar la reserva ovárica, en mujeres con valores
muy bajos se correlaciona con pobres respuestas a la superovulación y una
pérdida de éxitos de fecundación (Frattarelli et al., 2000). También se observa
que una disminución de la inhibina B probablemente precede al aumento de
la concentración de FSH (Lee et al., 2008). En los niveles de umbral muy
bajos, la exactitud en la predicción de una respuesta pobre y no embarazo es
sólo moderado (Lie et al., 2012) y por lo tanto su uso rutinario no se puede
recomendar.
c. Concentración de hormona Anti Mülleriana (AMH)
La hormona Anti-Mülleriana, también llamada sustancia inhibidora de
Müller (MIS), es una glicoproteína homodimérica unida por puentes
disulfuro, formándose de esta manera en una estructura dimérica con un
peso molecular de 140 kDa (Cate et al., 1986). AMH se somete a un
procesamiento proteolítico en un sitio de escisión monobásico para generar
20
un dímero de 110 kDa N-terminal y un dímero de 25 kDa C-terminal
(Pepinsky et al., 1988).
AMH es un miembro de la familia factor de crecimiento transformante β
(TGF β) (Visser et al., 2001). La homología de AMH con otros miembros
de esta familia está restringido al fragmento C-terminal, el dominio
bioactivo de la molécula (MacLaughlin et al., 1992). Como otros
miembros de esta familia, el dominio C-terminal de AMH interactúa con
un complejo receptor quinasa transmembrana de serina/treonina, que
contiene componentes de tipo I y de tipo II. El receptor de tipo II,
AMHRII, se ha identificado claramente y es específico del AMH (di
Clemente et al., 1994). Las mutaciones dentro del dominio C- terminal de
AMH afectan la unión de AMH a su receptor afectando de esta manera la
correcta señalización (Belville, et al 2004).
La hormona Anti Mülleriana se sintetiza en las gónadas de una gran
variedad de especies como el pescado (Western et al. 1999), anfibios
(Kodama et al. 2015), aves (Smith et al. 1999), reptiles (Western et al.,
1999,), marsupiales (Juengel et al. 2002) y mamíferos euterios (Josso et
al. 1993). En todas estas especies, la producción de AMH es de las células
que nutren, protegen y regulan las células germinales: las células de Sertoli
de los testículos y las células de la granulosa del ovario. Esto sugiere que
la AMH tiene papeles antiguos en la filogenia como un regulador de las
células germinales (Morinaga et al. 2007).
Durante la foliculogénesis, AMH se expresa en las células de la granulosa,
inmediatamente después de reclutamiento inicial y continúa aumentando
hasta que alcanzan la etapa de folículos pre-antrales y pequeños antrales.
A partir de entonces, la expresión de AMH disminuye y se convierte en
indetectable durante el reclutamiento cíclico (Visser et al., 2012). La
expresión de AMH está ausente en los folículos atrésicos, y en particular,
se considera un inhibidor de intra-ovario de atresia folicular (Visser et al.,
2007).
AMH actúa para inhibir la transición de folículos primordiales a folículos
primarios, manteniendo de esta manera la reserva de folículos primordiales
21
(Visser y Themmen, 2005). El uso de sistemas de cultivos in vitro, en el
desarrollo folicular de ratón, ha informado que la AMH inhibe el
crecimiento del folículo estimulada por FSH, mediante la disminución de
la sensibilidad de los folículos ováricos a la FSH (Figura 5) (Durlinger et
al., 2002 y Visser y Themmen, 2014).
Figura 5. AMH es secretada por folículos pre-antrales (líneas discontinuas) y
antrales (líneas continuas). Se ha postulado que inhibe el reclutamiento de
folículos primordiales (a: reclutamiento inicial) y el crecimiento de folículos FSH-
dependientes (b: reclutamiento cíclico). (Figura tomada de Broekmans et al.,
2008, modificaciones de Visser et al., 2005).
La señalización de los miembros de la familia TGFβ se realiza mediante un
complejo receptor quinasa tipo serina/treonina (Visser et al., 2001) que
consiste de un receptor tipo II de ligando específico y receptores tipo I más
generales, conocidos como proteínas quinasas similares al receptor de
activina (ALKs) (Kevennaar et al., 2006). El complejo receptor activado
fosforila y activa proteínas Smad. La señalización downstream (aguas abajo)
de AMH es mediada a través Smad1, Smad5 y Smad8. Tras la activación de
estos Smads específicos del receptor, se forma un complejo común con
Smad4, que se transloca al núcleo y regula la transcripción de genes
(Gouedard et al., 2001) (Figura 6). Aunque todos los miembros de la familia
TGFβ comparten este mecanismo molecular, existen dos modos distintos de
señalización, uno representado por la TGFβs y activinas y el otro por las
BMPs, GDFs y AMH (Clarke et al., 2001). Para AMH, ha sido identificado
un receptor tipo II (AMHRII) y se ha demostrado ser específica y necesaria
22
para la señalización de AMH (Baarends et al., 1995). La función canónica
de los receptores tipo II es la activación de los receptores tipo I, que inician
la señalización downstream (aguas abajo) (Moustakas y Heldin 2009).
Figura 6. Vía de señalización de la AMH, propuesta por Visser et al., 2005. AMH activa
Smad1, Smad5 o Smad8 a través de un complejo receptor que contiene AMHRII y ALK2,
ALK3 o ALK6. Tras la activación de las Smads específicos del receptor (R-Smads), se forma
un complejo con el Smad4. Este complejo se transloca al núcleo y regula la transcripción de
genes.
La concentración de la hormona anti-Mülleriana (AMH) es el mejor marcador
endocrino para la población de pequeños folículos antrales tanto en los seres
humanos (La Marca et al., 2010), así como en rumiantes (Rico et al., 2009;
Lahoz et al., 2012; Monniaux et al., 2014). La estrecha relación existente
entre el conteo de folículos antrales y la concentración plasmática de la AMH
(Broer et al., 2011) se explica por el hecho de que la expresión de AMH está
estrictamente restringida a las células de la granulosa de folículos en
crecimiento, es decir en células de la granulosa del folículo preantal más
grande y del folículo antral más pequeño (Pelusso et al., 2014).
2.5 NUTRICIÓN Y RESERVA OVÁRICA.
Las alteraciones en la nutrición durante los períodos críticos de gestación afectan el
crecimiento, fisiología y metabolismo de la descendencia en la vida posnatal (McMillen et
23
al., 2001). Impactos de la restricción de nutrientes durante la primera mitad de gestación en
ovejas influyen en la reducción del crecimiento fetal, mala calidad de la lana y aumento de
la presión sanguínea (Vonnahme et al., 2006) Además los efectos de la nutrición durante el
embarazo sobre el desarrollo vital de la descendencia, han sido relacionados principalmente
a enfermedades como hipertensión, diabetes, obesidad y enfermedades renales (Langley-
Evans, 2006).
Estos trabajos sirvieron de base para que Robinson et al. (2006) detallaron un resumen de
los efectos nutricionales sobre la calidad de ovocitos. En el cual se muestra que una
desnutrición materna durante el desarrollo del pool de folículos primordiales compromete
todo el crecimiento folicular. La desnutrición en este momento reduce el número de folículos
que emergen y por lo tanto el número disponible de folículos a ovular. Mossa et al. (2013)
vinculan la desnutrición materna transitoria con una reserva ovárica disminuida, así como el
potencial de fertilidad subóptimo, independiente de las alteraciones en el peso al nacer o el
crecimiento postnatal (Fortune et al., 2013).
24
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 LUGAR
El estudio se realizó en dos regiones de la Sierra del Perú, Pasco (Pasco, Ninacaca,
Camal Municipal de Ninacaca) a una altitud de 4 141 m.s.n.m. (10°51'42'‘ -76°06'47'‘)
con temperatura promedio de 6.1°C y precipitaciones de 0 a 2.50 mm; Puno (Melgar,
Umachiri, Centro de Investigación y Producción Chuquibambilla) a una altitud de 3974
m.s.n.m. (70°47’50°O – 14°47’37°S) con temperaturas promedios máxima y mínima de
18.5 y -8°C respectivamente, con precipitaciones de 0 a 2.10 mm.
El procesamiento de muestras se llevó a cabo en el laboratorio de Inmunología de la
Universidad Peruana Cayetano Heredia.
3.2 ANIMALES
La recolección de muestra se realizó en dos etapas, la primera consistió en colectar
ovarios y plasma de alpacas del camal municipal de Ninacaca (Pasco) de alpacas
sacrificadas; y la segunda, colectar muestras de plasma de alpacas vivas después de la
sincronización de la onda folicular.
Los ovarios (n=40) se colectaron post-mortem de alpacas con 4 dientes y condición
corporal de 3.5 (escala 1-5). Los ovarios seleccionados debían tener folículos en
crecimiento, y en caso de presentar cuerpo lúteo se descartaron del estudio.
Los animales utilizados durante la sincronización folicular (n=15) fueron mantenidos en
las instalaciones de la CIP Chuquibambilla (Universidad Nacional del Altiplano-Puno).
Fueron seleccionados teniendo en cuenta los siguientes criterios: que no se encuentren
gestando, mayores de tres años, adecuado tamaño y apariencia no patológica del tracto
reproductivo al examen rectal. Los animales se mantuvieron en pastoreo sobre pastura
natural.
25
3.3 MATERIALES
3.3.1 Equipos
- Microscopio óptico
- Cámara para microscopio
- Lectora Elisa
- Micrótomo
- Estufa
- Balanza electrónica
- Centrifuga
- Vortex
- Agitador de microplacas
- Ecógrafo
3.3.2 Reactivos e insumos
- Agua bidestilada
- Suero de burro (Abcam)
- Ovoalbumina de pollo (Sigma)
- Buffer fosfato tamponado PBS (Merck Millipore)
- Etanol absoluto (Merck Millipore)
- Xilol (Merck Millipore)
- Paraformaldehido (Merck Millipore)
26
- Hematoxilina (Merck Millipore)
- Eosina (Merck Millipore)
- Tween 20 (Sigma)
- Triton X-100 (Sigma)
- Entellan (Merck Millipore)
- Citrato de sodio (Sigma)
- Peróxido de hidrógeno 30 % (Sigma)
- Buseralina 0.08mg/ml (Conceptal)
- Anticuerpo policlonal anti-AMH en cabra (Santa Cruz Biotecnology)
- Anticuerpo anti-cabra IgG-Biotinilado en burro (Santa Cruz Biotecnology)
- Estreptovidina marcado con HRP (KPL)
- Kit AMH ELISA rata/ratón (AnshLab)
- 3,3-diaminobencidina DAB (DAKO)
- Poli-L-lisina (Sigma)
- Parafina sintética (Paraplast)
- Castetes de inclusión.
- Micropipetas (2-200 ul)
- Tubos falcon (15 y 50 ml)
- Vaso de precipitado
- Láminas portaobjetos
- Laminillas cubreobjetos
- Cuchillas para micrótomo (Leica)
- Tubos vacutainer con EDTA (BD)
- Microviales de 2 ml (Corning)
- Tubos de 1.5 ml (Axis)
- Aguja de calibre 20´´ x 1 pulgada.
3.4 ESTUDIOS REALIZADOS
3.4.1 ESTUDIO I: VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA LA MEDICIÓN
DE CONCENTRACIÓN DE AMH EN PLASMA DE ALPACAS
Para validar el ensayo de AMH plasmática en alpacas, se evaluó el paralelismo
de diferentes concentraciones de AMH (Ireland et al., 2008) presentes en el
plasma de alpacas hembra (pool n= 5), en el líquido folicular de ovarios en
27
crecimiento de alpacas hembra (pool n= 5), en el plasma de alpacas macho
castrados (pool n= 5) y en el plasma de rata hembra (pool n=5), con la curva
estándar de AMH.
3.4.2 ESTUDIO II: DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE AMH
DURANTE LA ONDA FOLICULAR
Para observar si existe variaciones variación en la concentración de la hormona
Anti-Müleriana durante la dinámica folicular de la alpaca, se realizó la
sincronizóación de la onda folicular con la utilización deusando una dosis única
de la hormona análoga a GnRH, que induciráinductora de ovulación en animales
que tiene folículos dominantes mayores a 7 mm (Vaughan et al., 2004),). Para
ello se utilizaráon alpacas mayores de 3 años (n=8) de la CIP Chuquibambilla
(Universidad Nacional del Altiplano-Puno) a las que se les fueron colectadas
muestras dey la sangre fue colectada cada 3 días, durante el periodo de12 días
(después de la colocarción de la hormona), o hasta que el nuevo folículo
dominante alcance el diámetro >7 mm.
3.4.3 ESTUDIO III: CORRELACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE AMH Y
EL CONTEO DE FOLÍCULOS ANTRALES
Se utilizó ovarios de alpacas sacrificadas en camal (n=35), de las cuales por
histología se obtuvo el total de folículos antrales. Folículos antrales son aquellos
que tienen 3 o más capas de células de la granulosa y tienen una cavidad antral
(Cahill et al., 2009). El conteo de folículos antrales (CFA) por par de ovarios se
determinó para cada animal. Se dividió en dos grupos: Hembras con un alto (A-
Alto) o bajo (B-bajo) número de folículos antrales.
El número de folículos por grupo (A-Alto o B-Bajo) se define mediante el número
medio de folículos antrales por animal ± 1 Desviación estándar (Silva-Santos et
al., 2014). Los animales con un CFA intermedio, fueron eliminados para obtener
un análisis más detallado.
Alpacas con CFA-Alto (A-Alto) = µ +1
Alpacas con CFA-Bajo (B-Bajo) = µ-1
Donde µ: es la media de folículos antrales contados de toda la población
estudiadada.
28
Las muestras de plasma correspondiente a los animales de cada grupo se
seleccionaran y se observó si el tipo de correlación existente.
3.4.4 ESTUDIO IV: EXPRESIÓN DE LA HORMONA AMH EN LOS
FOLÍCULOS EN CRECIMIENTO
Se evaluó ovarios obtenidos de alpacas sacrificadas en camal (n=15), se utilizó cortes
de ovarios de 6 micras de folículos en diferentes estadios, para determinar si la expresión
de AMH está restringida a las células de la granulosa de folículos en crecimiento u otros
tipos de folículos. De acuerdo a la disposición de las células de la granulosa y contenido
de los folículos (Ireland et al., 2008), se dividirá en los siguientes grupos:
- Grupo a: Folículos primordiales, ovocito compacto rodeado de una sola capa de
células de la granulosa aplanadas.
- Grupo b: Folículos preantrales, ovocito rodeado por más de unacapa de células de
la granulosa cúbicas.
- Grupo c: Folículos antrales, ovocito rodeado por 6 o más capas de células de la
granulosa cúbicas con una teca interna formando la cavidad antral.
3.5 DEFINICIONES OPERACIONALES
3.5.1 COLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
a. Ovarios
Los ovarios fueron colectados inmediatamente después del sacrificio del animal.
Se realizaron las medidas de longitud, altura y profundidad; y el peso de cada
uno. Luego se fijaron en paraformaldehido al 4%, y, 24 horas más tarde se
lavaron con agua corriente para luego colocarse en etanol al 70%.
Los ovarios se reducen a la mitad longitudinalmente y se colocaron en casetes,
los casetes se pasan automáticamente por etanol al 90%, 96%, absoluto y xilol
para la eliminación del fijador, deshidratación y la posterior inclusión en parafina
sintética (Histosec® pastillas Merck) a 56 y 57 ºC. A continuación, se elaboraron
los bloques de tejidos en parafina utilizando una unidad formadora. A partir de
los bloques se obtuvieron secciones de tejido en parafina de 6µm de grosor
29
mediante un microtomo de rotación (Leica). Para la tinción con hematoxilina y
eosina (H-E), y la posterior inmunohistoquímica, las secciones se desparafinaron
en Xilol y siguieron un proceso de hidratación pasando por una serie de alcoholes
de gradación decreciente hasta el agua.
b. Plasma
El plasma se recuperó a partir de la sangre venosa colectada inmediatamente
después del sacrificio del animal y colocandose en tubos vacuteiner con EDTA
de 4 ml. En el caso de animales vivos, la sangre se obtuvo mediante punción de
la vena yugular externa en tubos vacutainer de 4ml con EDTA y una aguja de
calibre 20´´ x 1 pulgada, con una frecuencia de cada 3 días durante 15 días.
Las muestras de sangre se centrifugaron (Centrifuge PLC, Gemmy Industrial) a
3000 rpm x 15 min, separando los glóbulos rojos del plasma sanguíneo. A
continuación, el plasma se extrae del tubo de recogida de sangre y se deposita en
un microvial (Corning® de 2ml), se rotulan y guarda en nitrógeno líquido para
el posterior transporte. Se guardó las muestras de plasma en congeladoras a -
20°C.
3.5.2 SINCRONIZACIÓN DE LA ONDA FOLICULAR.
Se realizaron observaciones ecográficas cada 24 horas a los 20 animales seleccionados
desde dos días antes de la selección para la aplicación hormonal (Día 0). Para ello, se
utilizó ecografía transrectal usando un ecógrafo portátil modelo Medison SV 600 con
transductor lineal de 7.5 MHz de frecuencia, seleccionando 10 alpacas que presenten
folículos con tamaño ≥7 mm de diámetro, y sin la presencia de cuerpo lúteo en ninguno
de los ovarios.
Posteriormente, las alpacas con un folículo dominante recibieron una dosis única de 8µg
de Buserelina (Conceptal®, 1 ml contiene 0.0042 mg de acetato de Buserelina) a las
5:00 am y 24 horas después para inducir la ovulación, la ovulación fue confirmada por
ultrasonografía transrectal. Todas las alpacas seleccionadas fueron evaluadas cada 3 días
empleando ultrasonografía transrectal a fin de seguir la onda folicular, hasta que se
observe un nuevo folículo de 7 mm en cualquiera de los ovarios.
Al inicio del presente trabajo, se separaron 20 alpacas adultas con edad media de 3.72
años y una condición corporal media de 3.43. Se realizó el ultrasonido para observar
30
cuales presentan el folículo dominante. El 75 % de alpacas (15/20) presentaron folículo
dominante (>7 mm), las cuales ingresaron al estudio. Para sincronizar la onda folicular,
los 15 animales seleccionadosrecibieron una dosis única de Buseralina a las 6 a.m. del
día 0 para la sincronización del ciclo. De las 15 alpacas con tratamiento hormonal,
respondieron correctamente al análogo de gonadotropinas 12 (80%), esto se observoó
mediante una nueva ecografía a las 48h post inyección hormonal. Estas 12 alpacas
fueron evaluadas por ultrasonido cada 3 días hasta que presenten nuevamente el folículo
dominante (> 7mm). Al momento del ultrasonido se extrajo 10 ml de sangre en tubos
bacuteirner con EDTA. Al día doce después del tratamiento con el análogo de
buseralina, 8 de las 12 alpacas presentaron nuevamente un folículo dominante.
3.5.3 VISUALIZACIÓN DE FOLÍCULOS ANTRALES POR HISTOLOGÍA:
Después de la inclusión de los ovarios en parafina, se cortaron en un micrótomo (Leica)
en un espesor de 4 µm y todas las secciones se montaron en láminas con Poly-l-lisina.
Se tiñeron con la tinción de Hematoxilina-Eosina.
Protocolo de tinción con Hematoxilina-eosina a temperatura ambiente (Lillie et al.,
1974):
- En primer lugar, se colocó las secciones de tejido en el portaláminas en una
estufa a 56°C durante 20 minutos.
- Se desparafinó las secciones mediante 4 cambios de xileno, 2 minutos cada
uno.
- Se hidrató con 2 cambios de etanol 100% durante 3 minutos cada uno, luego
por etanol al 95% y 80% durante 1 minuto cada uno. Luego se enjuagó con
agua destilada.
- La tinción se realizó con Hematoxilina (Merck Milllipore) por 2 minutos.
Inmediatamente después, se lavó con abundante agua de caño por 5 min.
- Las secciones fueron colocadas por 30 segundos en alcohol ácido al 1%, y
después se lavó con agua corriente por 1 min.
- Luego las secciones fueron colocadas por 30 segundos en agua amoniacal 0,2%
y se lavó con agua corriente por 5 min.
- Las secciones fueron colocadas por 2 min. en etanol 90% y luego en eosina
alcohólica al 1% por 30 segundos.
- Las secciones fueron deshidratas con cambios de etanol 80%, 90%, 96% y
Absoluto por 1 minuto cada uno. Se deja secar.
31
- Las secciones se colocan por 3 min en xilol y se montan con una gota de xiilol-
entellan 1:1 por lámina y se cubren con cubreobjetos.
Se observó al microscopio óptico, y clasificó según su morfología. Los folículos se
clasificaron de la acuerdo a estudios publicados anteriormente (Cushman, 1999). El
nucleolo del ovocito se utilizó como marcador para cada folículo para evitar contar dos
veces los folículos. Folículos antrales son aquellos que tienen 3 o más capas de células
de la granulosa y tienen una cavidad antral (Cahill et al., 2009).
Los folículos fueron considerados degenerados o atrésicos si tenían uno o más de los
siguientes aspectos: un núcleo de ovocito condensado, un ovocito encogido, cuerpos
picnóticos en las células de la granulosa y baja densidad celular. Sobre la base de estos
parámetros, se evaluaron morfológicamente sólo folículos sanos (Lucci et al., 2002)
3.5.4 ENSAYO HORMONAL:
Las concentraciones plasmáticas de AMH (ng/ml) se cuantificaron utilizando el kit
comercial de inmunoensayo (AnshLabs rata/ratón AMH ELISA AL-113. Webster, TX),
el cual fue validado en el presente estudio. El ensayo tuvo un rango analítico de 0.23 a
15 ng/ml (catálogo del producto). Las muestras y reactivos del Kit se descongelaron y
atemperaron a 25°C. Los estándares, las muestras (plasma de alpaca) y el control
negativo (plasma de alpacas macho castrados) se realizaron por duplicado. El kit de
inmunoensayo es de tipo sándwich cuantitativo de tres pasos y se realizó según
indicaciones del fabricante.
En primer lugar, se coloca 50 ul de la muestra, estándares y el control negativo en los
pocillos de las placas de microtitulación las cuales están recubiertas del anticuerpo anti-
AMH inmovilizado. Luego se agrega 50 ul de buffer de ensayo a cada pocillo. Las
placas se incubaron con agitación de 600 rpm en un agitador de microplacas por dos
horas a temperatura ambiente (25°C). Después de la primera incubación las placas se
lavaron con la solución de lavado. Se añade 100 ul de solución con anticuerpo anti-
AMH biotinilado. Las placas se incubaron con agitación de 600 rpm por una hora a
temperatura ambiente. Luego de la segunda incubación y posterior lavado, los pocillos
se incuban con 100 ul de solución que contiene estreptovidina conjugada con HRP
(horseradish peroxidase). Las placas se incubaron con agitación de 600 rpm por 30
minutos a temperatura ambiente. A continuación de la tercera incubación y del lavado,
32
los pocillos se incubaron 100 ul de solución TMB (Tetramethylbenzidine) en un buffer
con peróxido de hidrógeno. Las placas se incubaron con agitación de 600 rpm por 10
minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 100 ul de solución de
detención (solución ácida) a cada pocillo y se determinó la absorbancia en un Lector
Elisa a 450 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la concentración
de AMH en las muestras y estándares (AnshLabs, 2014).
3.5.5 INMUNOHISTOQUÍMICA DE AMH.
Se utilizó una de las seccione fijadas del ovario, descritas anteriormente. Se realizó el
siguiente procedimiento:
- En primer lugar, se colocó las secciones de tejido en el portaláminas en una estufa
a 56°C durante 40 minutos.
- Se desparafinó las secciones de tejido en las portaláminas mediante 2 cambios
de xileno, 5 minutos cada uno.
- Se hidrató con 2 cambios de etanol 100% durante 3 minutos cada uno, etanol al
95% y 80% durante 1 minuto cada uno. Luego se enjuagó con agua destilada.
- Precalentar en un vaso de precipitado, 600 ml de buffer citrato de sodio (0.01 M,
ph=6) hasta que la temperatura llegue a 84 °C. Se sumergió los portaobjetos con
las secciones de tejido y se incubó durante 15 minutos.
- Se retiró el vaso de precipitado que contiene los portaobjetos y se dejó enfriar por
1h.
- Las secciones fueron lavadas con solución tamponada de fosfato (PBS ph=7.3)
tres veces por 5 min cada uno.
- Las secciones fueron incubadas con 3% de peróxido de hidrógeno en metanol,
durante 30 min, para bloquear la peroxidasa endógena.
- Después de lavar 3 veces (5 minutos cada uno) con PBS, las secciones se
incubaron con 0.1% de ovoalbúmina de pollo y 5% de suero de burro en PBS-
tritón 0.05% durante 1h para bloquear las uniones no específicas.
- Las secciones fueron lavadas con PBS cuatro veces por 5 min cada uno.
- Después incubar con un anticuerpo primario policlonal cabra anti-AMH (sc-6886,
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) con una dilución de 1:500
en PBS-triton 0.05% y 10% suero de donkey, durante la noche a 4 °C. El control
se incubará sin la presencia de anticuerpo primario.
33
- Las secciones fueron colocadas a temperatura ambiente y se lavaron con PBS
cinco veces por 5 min cada uno.
- Las secciones asignados para la detección de AMH se incuban con anticuerpo
secundario burro anti-cabra IgG-biotinilado (sc-2023, Santa Cruz de
Biotecnologías, Santa Cruz, CA) diluido 1:500 en PBS durante 1 h.
- Las secciones fueron lavadas con solución tamponada de fosfato (PBS) cinco
veces por 5 min cada uno. Luego se incubaron con estreptavidina marcado con
HRP (KPL) diluido 1:500 en PBS durante 1h.
- Finalmente las secciones fueron lavadas con solución tamponada de fosfato (PBS)
cinco veces por 5 min cada uno.
- La detección de AMH se realizó utilizando 0.1% de 3,3-diaminobencidina (DAB)
diluido en Buffer sustrato (Dako) durante 1 min. Luego de ver el marcaje se lavó
con abundante agua destilada.
- Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina, deshidratadas, y se montan
con una gota de xiilol-entellan 1:1 por lámina y se cubren con cubreobjetos.
Las secciones se analizaron y se puntuaron usando un microscopio Zeiss Axioplan 2
(Alemania). El análisis se realizó de acuerdo a lo reportado por Weenen et al., 2002 (en
humanos), Durlinger et al., 2002 (en ratones), Ball et al., 2008 (en equinos), Campbell
et al., 2012 (en ovejas), Uzumcu et al., 2006 (en rata), Polat et al., 2015 (en bovinos).
Estos reportes evalúan la intensidad relativa del marcaje de la AMH con respecto al
control.
Las células de la granulosa de cada folículo se puntuaron negativo (1) si ninguna tinción
estaba presente en comparación con secciones de tejido de control adyacentes. Si la
tinción estuvo presente sólo en algunas células de la granulosa, el folículo se anotó
`débilmente positivo" (2). Los folículos se puntuaron positivo (3) si la tinción específica
AMH estaba presente en casi todas o todas las células de la granulosa. Cuando las
células de la granulosa de un único folículo tiñeron mucho más fuerte que células de la
granulosa en otros folículos en el mismo portaobjetos, se puntúo este folículo
fuertemente positivo (4). Imágenes fueron tomadas con una cámara Pro Coolsnap y el
software ImageProâ Plus (Media Cybernetics, Inc., EE.UU.).
34
3.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Este es un estudio del tipo no experimental, transeccional descriptivo y es una
caracterización primaria, la cual consiste en la toma de datos solo por cada estudio, se
determinaron las medidas de tendencia central (promedio) y las medidas de dispersión
(desviación estándar, coeficiente de variación, valores máximos y mínimos).
Se utilizó un análisis de varianza para determinar las concentraciones de AMH, el número
de folículos en los ovarios, el peso del ovario y la longitud y altura ovárica diferían entre los
animales con diferentes conteo folicular durante la onda foliculare. La prueba de Turkey se
utilizó para determinar si existían diferencias estadísticas.
35
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Estudio I. Validación de la metodología para la medición de la concentración
de AMH en plasma de alpacas
Utilizando una serie de diluciones que partían de una concentración inicial de 21,5 ng/ml se
obtuvo la curva estándar correspondiente al Kit AnshLabs rata/ratón AMH ELISA AL-113.
A partir de estas diluciones, el valor máximo de densidad óptica fue de alrededor de 2,036.
El rango del AMH estándar usado es de 0.022- 2.036 ng/ml (Anexo I). El límite de
detección, definido como la media de las absorbancias del blanco + 2 Desviación estándar,
fue 0.039 ng/ml (Figura 7).
Figura 7. Curva estándar utilizada en la cuantificación de AMH, en el plasma sanguíneo de
alpacas.
Además el kit fue validado tomando como referencia los trabajos de Keveenar et al.(2005),
Ireland et al. (2008) y Nagashima et al. (2016) utilizando el paralelismo entre las
absorbancias de la curva estándar, y las diluciones seriadas de la muestra en estudio.
Como se observa en la figura 8, se encontró paralelismo en las concentraciones de AMH de
las diluciones seriales del plasma y líquido folicular de alpaca con la curva estándar del Kit
AMH ratón. La curva de dilución fue lineal para cada muestra (R2>0.99). Los niveles de
AMH fueron indetectables en el plasma sanguíneo de alpacas macho castrados (Anexo I).
36
Figura 8. Paralelismo en las curvas de las muestras diluidas. Los datos presentados son
resultado de las diluciones seriales de ( ) estándar; ( ) plasma de alpaca; ( ) líquido folicular;
( ) alpacas castradas.
El paralelismo entre las curvas señala que los anticuerpos utilizados en el ensayo de
inmunoabsorbancia ligado a enzimas (ELISA), presentes en el Kit AMH ratón, reconocen
de manera específica las moléculas de AMH del plasma sanguíneo de alpaca (Ireland et al.,
2008).
4.2 Estudio II: Determinación de la concentración de AMH durante la onda folicular
En la actualidad, es limitada la predicción y el control avanzado y preciso de los ciclos
reproductivos en las alpacas por ende el uso de tecnologías de reproducción asistida son
limitados; por tanto, es primordial evaluar el comportamiento de la concentración de la
AMH, durante la onda folicular. Por ello, se trabajó en un ambiente controlado, en el cual se
podía evaluar y seguir la onda folicular de las alpacas, al mismo tiempo que se extraía sangre
para su posterior evaluación.
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10
0.1 1 10 100
Ab
sorb
anci
a
ng/ml AMH
Validación de AMH
37
Al análisis conjunto, no se encontró variación entre las concentraciones de AMH durante la
onda folicular (Anexo II). Es decir, no se encontraron diferencias (P<0,01) en la
concentración de AMH a lo largo de los 12 días estudiados (Tabla 1).
Concentración de la hormona AMH durante la onda folicular en alpacas
Alpaca Variables Días de evaluación (Media ±ES)
0 3 6 9 12
n=8 [AMH] 1.605±1.2a 1.700±1.3 a 1.639±1.3 a 1.600±1.3 a 1.393±1.2 a
Tabla 1. Concentración de la Hormona AMH durante la onda folicular en alpacas. a. Letras iguales dentro de fila indican que las medias de concentración de AMH no son
significativamente diferentes (p<0,01) durante la onda folicular de alpacas.
Contrario a este estudio, en vacunos Rico et al., 2011 observaron cambios significativos en
la concentración sérica de AMH durante el ciclo estral; con un pico en el primer día de estro,
seguido de una disminución rápida a niveles básicos en el día 6, que luego aumentó
gradualmente hacia el subsiguiente estro. Paralelamente, algunos estudios realizados en
humanos, a sugieren una expresión estable a lo largo del ciclo menstrual (La Marca et al.,
2006 y Tsepelidis et al., 2007), mientras que otros muestran que las mujeres con AMH basal
más alta exhiben mayor variabilidad de AMH durante el periodo periovulatorio (Hehenkamp
et al., 2006, Sowers et al., 2010).
La circulación estable de la AMH encontrada en las alpacas, así como la variación observada
en los valores basales entre los individuos, enfatiza la necesidad de cuidado especial en el
uso de la AMH como marcador reproductivo.
4.3 Estudio III: Correlación de la concentración de AMH y el conteo de folículos
antrales
Una vez obtenido los valores de conteo de folículos antrales por cada animal (n=40). Se
seleccionó en dos grupos, los de alto conteo folicular (Alto-AFC) y bajo conteo folicular
(Bajo –AFC). El número de folículos por grupo (A-Alto o B-Bajo) se define mediante el
número medio de folículos antrales por animal (u) ± 1 Desviación estándar (DS) (Silva-
Santos et al., 2014). Para el grupo de Alto-AFC (u+1DS), el valor de cohorte fue 25, es decir,
se seleccionaron las alpacas con 25 o más folículos antrales (Anexo III). Para el grupo de
Bajo-AFC (u-1 DS), el valor de cohorte fue de 10, es decir se seleccionaron alpacas con 10
o menos folículos antrales. El número de de Alpacas con A-Alto (≥ 25 folículos) fue de 11,
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B-Bajo (≤ 10 folículos) fue de 10. Los animales con una CFA intermedio (11-23 folículos)
fueron eliminados para obtener un análisis más detallado. Las muestras de plasma
correspondiente a los animales de cada grupo se seleccionaran y se observó el tipo de