UNIVERSIDAD DE COLIMA MAESTRÍA EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA RELACIONES INTERESPECÍFICAS DEL GÉNERO Pachyphytum (CRASSULACEAE), EMPLEANDO MARCADORES GENÉTICOS AFLP TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGÍA PRESENTA IGNACIO GARCÍA RUIZ ASESORES: M.C. SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZ DRA. JUNE SIMPSON Tecomán, Col. Marzo de 2003
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UNIVERSIDAD DE COLIMAdigeset.ucol.mx/tesis_posgrado/Pdf/Ignacio Garcia Ruiz.pdf · Pachyphytum (Crassulaceae), ... 2.3 Análisis fenéticos y taxonomía numérica 17 2.4 Filogenia
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
MAESTRÍA EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
RELACIONES INTERESPECÍFICAS DEL GÉNERO Pachyphytum(CRASSULACEAE), EMPLEANDO MARCADORES GENÉTICOS AFLP
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
IGNACIO GARCÍA RUIZ
ASESORES:
M.C. SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZ
DRA. JUNE SIMPSON
Tecomán, Col. Marzo de 2003
UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No, 175/2003.
C. IGNACIO GARCIA RUIZEGRESADO DE LA MESTRÍA EN CIENCIASAREA: BIOTECNOLOGÍAPRESENTE
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área; deBiotecnología de esta Facultad a mi cargo de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de queefectuó las correcciones y acato las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo,se le autoriza la impresión de la tesis “RELACIONES INTERESPECÍFICAS DEL GÉNEROPachyphytum (Crassulaceae), EMPLEANDO MARCADORES GENÉTICOS AFLP”,misma que ha sido dirigida por los C.C., M.C. Salvador Guzmán González, Profesor –Investigador de la Universidad de Colima y la Dra. June Simpson W., Profesora delDepartamento de Ingeniería Genética, CINVESTAV, Unidad Irapuato.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Maestro en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a formay contenido por los C.C. Dra. Martha I. Vergara Santana, Dr. Alfonso Pescador Rubio, M.C.Salvador Guzmán González. Profesores –Investigadores de la Universidad de Colima.
Sin otro particular de momento me despido de usted muy cordialmente.
C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNOC.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTEC.C.P. ARCHIVORVMD nlpv** Of. No. 175/2003. “2003, 45º ANIVERSARIO DE LA FACULTAD DE DERECHO”
Al Instituto Politécnico Nacional por haberme brindado la beca de la COTEPABE yCOFAA para realizar los estudios de Maestría durante dos años y seis meses.
A la Universidad de Colima, por permitirme ingresar al posgrado de la Facultad deCiencias Biológica y Agropecuarias.
Al Dr. Silvio Maldonado Bautista, Director del CIIDIR-IPN Michoacán, por suconfianza y apoyo incondicional.
Al Dr. Oscar Comas, por su confianza en apoyarme con la Beca SUPERA-ANUIES
Al Director de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Ing. Rodolfo V.Morentín Delgado, por sus finas atenciones.
Al Coordinador del posgrado Dr. Sergio Aguilar, por su paciencia y finas atenciones.
A todos los profesores del Programar Drs. Jaime Molina Ochoa, Roberto Lezama,Javier Farias, Oscar Rebolledo, Alfonso Pescador, Rocío Flores, y a los M.C.Trinidad Ramírez y Arnoldo Michel quienes aportaron comentarios valiosos durantemi formación profesional.
A la Dra. June Simpson, del CINVESTAV Irapuato, por el apoyo en la realización dela fase final del trabajo de laboratorio (técnica AFLP).
Al M. C. Salvador Guzmán González, por su amistad brindada, paciencia, dirección yorientación, del trabajo desarrollado durante mi formación.
Al comité revisor de la Facultad, Dra. Martha Vergara y Dr. Alfonso Pescador, por supaciencia y por sus atinadas sugerencias en el orden y redacción del documento final.
A todos los compañeros del laboratorio de Genética (L-6), del Cinvestav Irapuato,por su amistad y auxilio en el trabajo experimental, en especial al Dr. RaúlRodríguez, Sanjuana Hernández, así como a Katia, Mónica, Alfredo, Alex, Lulú, Tetéy Fernando Hernández.
A mis compañeros del Laboratorio de Biotecnología Campus Tecomán, por su apoyoen el desarrollo preliminar del trabajo experimental, en especial a Miguel A. Flores yGilberto Manzo. Asimismo a Mario Orozco, Ramiro Ruiz, Argelia Juárez, EmeterioPayró, José Luis Rosas, por su amistad y confianza.
A todos los compañeros del posgrado que convivieron conmigo y que me brindaronsu amistad, en especial a Francisco J. Santana, Rocío Nadal, Miguel A. Manzanilla,Manuel Robles, Ramón Govea.
Al Dr. Alejandro Bravo y Biól. Jaime Nava, del CIIDIR-IPN Michoacán, asimismo alDr. Aarón Rodríguez de la Universidad de Guadalajara, por la lectura crítica ysugerencias en alguna de las versiones de este trabajo.
Al Dr. Jerzy Rzedowski, del Instituto de Ecología A.C., Región Bajío, por su apoyo yconfianza brindada. Del mismo centro, un agradecimiento especial para el M.C.Emmanuel Pérez-Calix, por su apoyo con material y salidas de campo, literatura,sugerencias e ideas, pero sobretodo por su amistad. Al M.C. Eleazar Carranza, porcompartir material colectado en campo; al Dr. Sergio Zamudio por su amistad y porfacilitarme la revisión del herbario IEB.
Al Dr. Octavio Martínez de la Vega, del Cinvestav Irapuato, por su asesoría en lautilización del programa estadístico S-Plus 2000.
Por su disposición y excelente compañía en colectas y exploración de campo: J.Antonio Machuca, Servando García, Jesús García, Yolanda Hernández, MelissaGarcía, Karen Angelina García, Germán Hernández, Miguel Cházaro, Raúl Acevedoy Mario Mendoza.
Al Dr. Jorge Meyrán por facilitarme parte del material original de Pachyphytumcoeruleum.
A Charly Glass (q.e.p.d.), por haberme compartido su amistad, material y literatura.
A todos mis amigos y compañeros del CIIDIR-IPN Michoacán, por su amistad yapoyo brindado desinteresadamente, en especial a Elizabeth del Río, GuadalupeArceo, y Fabián Villalpando.
A TODOS MUCHAS GRACIAS
DEDICATORIA
Con todo respeto a mis padres Angelina Ruiz (q.e.p.d.), y Andrés García, por suconstante apoyo, cariño, y amor fraterno que nunca me han faltado.
A mi esposa Yolanda y a mis hijas Melissa y Karen Angelina, por su paciencia,amor, calidez y dulce compañía que me han brindado.
A todos mis hermanos y hermanas, por su cariño, comprensión y apoyo.
A todos mis sobrinos y sobrinas, deseando que el presente sea considerado unpequeño ejemplo de superación que nos permita mejorar en todos los niveles de vida.
A todos los integrantes de mi familia política, por su atención, apoyo y amistadbrindada.
A todos mis profesores del posgrado por sus experiencias compartidas.
A todos mis parientes y amigos.
En remembranza a una idea de un Profesor del, posgrado:
"Existen dos principales problemas en el mundo: la pobreza y la ignorancia; a
nosotros nos corresponde tratar de resolverla ignorancia."
ÍNDICE
PáginaÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS vii
RESUMEN xABSTRACT xiI INTRODUCCIÓN 1
II REVISIÓN DE LITERATURA 5
2.1 Diversidad genética 5
2.1.1 Variación genética 5
2.1.2 Poliploidia en las plantas 6
2.1.3 Evolución 7
2.1.4 Especiación 8
2.1.5 Especiación y método sistemático 11
2.1.6 Conservación de la herencia 12
2.1.7 Fenotipo y genotipo 13
2.1.8 Mutación 14
2.1.9 Aislamiento reproductivo 14
2.2 Sistemática 16
2.3 Análisis fenéticos y taxonomía numérica 17
2.4 Filogenia y sistemática molecular 19
2.4.1 Enzimas de restricción 23
2.4.2 Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos 25 Amplificados (AFLP)
2.5 Supuestos biológicos y estadísticos sobre los marcadores 31
2.5.1 Homología de los fragmentos 31
2.5.2 Neutralidades de los alelos 32
2.6 Unidades operacionales taxonómicas (OTUs) 33
2.6.1 Medidas de similaridad genética 34
2.6.2 Métodos estadísticos para el análisis de la diversidad 36 genética
2.7 Representaciones gráficas de análisis numéricos 38
2.7.1 Métodos de obtención de dendrogramas 40
2.7.2 Intervalos de confianza y pruebas de hipótesis 41 sobre dendrogramas
2.8 Análisis estadístico de datos moleculares 43
2.9 Generalidades de la familia Crassulaceae 44
2.9.1 Distribución de las Crassulaceae 45
2.9.2 Estudios filogenéticos en las Crassulaceae 48
2.10 Ubicación taxonómica del género Pachyphytum 51
2.10.1 Descripción botánica 52
2.10.2 Secciones del género Pachyphytum 55
III MATERIALES Y MÉTODOS 63
3.1 Material Biológico 63
3.2 Extracción de ADN 66
3.3 Purificación del ADN 66
3.4 Cuantificación del ADN 67
3.5 Integridad del ADN 68
3.6 Análisis AFLP del ADN 69
3.7 Restricción del ADN 69
3.8 Ligación de los adaptadores 69
3.9 Primera amplificación 70
3.10 Marcaje y selección de los iniciadores 70
3.11 Segunda amplificación 71
3.12 Separación de productos de amplificación 72
3.13 Análisis de datos 73
3.13.1 Construcción de la tabla de contingencias 73
3.13.2 Análisis del agrupamiento 73
IV RESULTADOS 75
4.1 Reacciones de la técnica AFLP 76
4.2 Polimorfismos de Pachyphytum con AFLP 76
4.3 Relaciones genéticas interespecíficas 80
V DISCUSIÓN 87
5.1 Uso de la técnica AFLP 87
5.2 Polimorfismo del ADN 90
5.3 Evidencia filogenética 92
5.4 Implicaciones taxonómicas 94
5.5 Las clasificaciones y la sistemática actual 101
5.6 Importancia y status del género Pachyphytum 103
VI CONCLUSIONES 108
VII LITERATURA CITADA 109
ÍNDICE DE CUADROS
Descripción . Página
Cuadro 1. Localidades reportadas de las especies de Pachyphytum 57
Cuadro 2. Lista de taxa y origen del material usado 65
Cuadro 3. Resultados obtenidos con el análisis de marcadores tipo 77
AFLP
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Número Descripción Página
Figura 1. Pachyphytum machucae García, Glass et Cházaro. Tomado de Acta 54
Botánica Mexicana.
Figura 2. Distribución conocida de las especies del género Pachyphytum. 64
Figura 3. Electroforésis en .gel de agarosa del ADN aislado de las 22 especies 75 estudiadas, por medio de la técnica del CTAB carril 1-17 especies de Pachyphytum; 18-22 especies testigo. La marca de peso molecular a los costados derecho e izquierdo.
Figura 4. Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones 78de bandeo de especies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo(18-22), obtenido a partir de la técnica AFLP, con la combinaciónde iniciadores E-ACA/M-AGG. Las flechas del costado izquierdoseñalan algunas de las bandas monomórficas más evidentes.
Figura 5. Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones de 79 bandeo de especies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo (18- 22), obtenido a partir de la técnica AFLP, con la combinación de iniciadores E-ACG/M-AGG. Las flechas señalan algunas de las bandas monomórficas. La escala de la izquierda son las pares de bases (Pb) del marcador de peso molecular usado (escalera 123 Pb). La escala de la derecha indica la numeración de las bandas legibles encontradas.
Figura 6. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética 81 “Manhattan” /average. La especie P. glutinicaule , queda fuera del grupo principal, junto con los grupos testigo.
Figura 7. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética 81 "Manhattan" / compact. La especie testigo B. glabrifolia, separa en dos a las especies en estudio, lo cual no es factible.
Figura 8. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética 81 "Manhattan" / connected. De nuevo, la especie P. glutinicaule se comporta junto con los grupos testigo.
Figura 9. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética de 82 Jaccard ó "Binary" / average. Este gráfico, agrupa de manera clara las especies testigo, no así con el grupo en estudio.
Figura 10. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / 82 connected. Similar al anterior en el grupo en estudio no se encuentran claros los agrupamientos formados.
Figura 11. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / 82 compact. Gráfico con mayor representatividad, la separación entre el grupo en estudio y el testigo son más claras.
Figura 12. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / 83 compact. Similar al anterior, se agrupan más claramente las especies en estudio, mejora la interpretación de sus relaciones.
Figura 13. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / 83 connected. Gráfico que no representa claridad entre las relaciones del grupo en estudio.
Figura 14. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / 83 average. Similar al anterior, son poco claras las relaciones entre las especies del género Pachyphytum.
Figura 15. Dendrograma obtenido por medio de "Nei" y compact con un bootstrap 85 de 3000 repeticiones. Las flechas del lado derecho señalan los puntos de intersección con la línea punteada a un nivel de disimilaridad de 0.46, mismas que originan los agrupamientos (A y B) logrados, los números en los nodos significan los valores de confianza en cada agrupación. Del lado izquierdo se señalan con asterisco las “especies problema” de ubicar dentro de alguna sección del género Pachyphytum. Los grupos testigo se ubican en los extremos superior e inferior.
Figura 16. Relaciones geográficas y afinidades genéticas de las especies del 99 género Pachyphytum. Primer grupo especies 1-6, segundo grupo especies 7-17.
ix
RESUMEN
El género Pachyphytum son plantas de ornato con poblaciones naturales reducidas,
tiene cinco especies cuya ubicación taxonómica es incierta a nivel de sección. Se
considera que la clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a
nivel sección, se modificará si se agrupan con relación a su polimorfismo genético.
Para probar esto, se planteó el objetivo de determinar las relaciones genéticas
interespecíficas de plantas del género Pachyphytum mediante el análisis de su
polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP). El ADN de las 17
especies de Pachyphytum fue extraído y analizado a través de marcadores AFLP,
utilizando cinco combinaciones de iniciadores. La longitud de las bandas obtenidas
varió de 175 a 525 pb y el número total de bandas legibles fue de 406, de las cuales
el 92.4 % fueron polimórficas. Las bandas polimórficas fueron analizadas por
diferentes métodos de agrupamiento, donde el que brindó mejor información fue
“Nei” /compact. Un remuestreo (bootstrap) de 3000 repeticiones apoyó al
dendrograma obtenido, el cual confirmó la asociación de dos grupos principales,
presentándose cuatro de las especies problema en uno de estos. Se concluye que
las tres agrupaciones formadas con base en características fenotípicas de la
taxonómica clásica, en las secciones del género Pachyphytum, no se correlacionan
con las dos agrupaciones conformadas por medio de la similaridad genética.
1991ª, 1991b, 1992); Meyrán (1963); UN y Moran (1973); Kimnach y Moran (1993),
mismos que han descrito algunas especies y publicado aspectos relacionados a
Pachyphytum. Los más reciente descubrimientos, aportan la descripción de tres
especies: dos del estado de Michoacán (García et al., 1999, 2002), y otra en el
estado de Querétaro (Pérez-Calix et Glass, 1999), asimismo, existe una más del
estado de Jalisco, cuyo reporte técnico se encuentra “en prensa”.
51
2.10.1 Descripción botánica
Pachyphytum Link, Klotzsch y Otto (Link, Klotzsch y Otto, 1841). Plantas
herbáceas o sufruticosas, carnosas, perennes, glabras, frágiles, solitarias, o bien en
colonias densas; tallo simple o ramificado; hojas fácilmente caedizas, alternas,
dispuestas en espiral o agrupadas en rosetas alargadas o compactas en los ápices
de los tallos, semicilíndricas, rollizas o aplanadas, carnosas, ápice generalmente
mucronado, verdes, rojizas o violáceas, comúnmente glaucas; pedúnculo verde,
anaranjado o rojizo, provisto de brácteas alternas, sésiles, la base prolongada más
debajo de su inserción con el tallo; inflorescencias en forma de cincinos laterales y
axilares, ocasionalmente las flores solitarias; las flores subtendidas por brácteas
grandes o pequeñas; cáliz de 5 sépalos unidos en la base, iguales o desiguales en
longitud y ancho, adpresos, en algunas especies más largos que los pétalos; corola
algo campanulada a urceolada, de color blanco, verde, anaranjado, rojo o
combinando estos colores, pétalos 5, unidos cerca de la base, erectos y extendidos
en el ápice, cada pétalo con un par de escamas en su interior (similar a un pliegue
del mismo segmento); estambres 10, 5 libres, alternando con los pétalos, los otros 5
epipétalos alternos a los sépalos, adnados a los lóbulos de la corola; nectarios 5;
gineceo de 5 pistilos libres; fruto de folículos divergentes en la madurez; semillas
pequeñas numerosas (Link et al., 1841).
El género Pachyphytum posee 12 especies (Eggli et al., 1995). Actualmente
con las descripciones de P. caesium, P. machucae, P. Garciae y P. Rzedowskii suman 16
las especies descritas, si se incluye en este listado P. contrerassi, cuyo reporte
técnico actualmente está “en prensa”, sumarian 17. La totalidad son de distribución
restringida al centro de México, de la región meridional de Tamaulipas a Guanajuato
e Hidalgo, Jalisco y Michoacán. Se desarrollan en laderas rocosas entre los 600 y
2500 m s.n.m. (Uhl y Moran 1973).
Las plantas del género Pachyphytum, por la belleza de sus flores, de sus
estructuras vegetativas, así como por su aparente facilidad de reproducción, son
recomendadas por varios autores para su cultivo, incluyendo los híbridos obtenidos
52
al cruzar este con otros géneros relacionados. Al respecto (Uhl y Moran 1973),
mencionan que el número de cromosomas estándar de Pachyphytum es de 31-33 ó
sus múltiplos, ya que algunas especies presentan poliploidías.
El género Pachyphytum es considerado cercano a Echeveria (Eggli et al.,
1995), del cual se diferencia principalmente por presentar un par de apéndices en
forma de escamas en la superficie interna de cada segmento de la corola uno a cada
lado del filamento epipétalo (fig. 1).
53
Figura 1. Pachyphytum machucae I. García, Glass et Cházaro. A. Habito. B. Hoja envista ventral, a-b sección transversal de la hoja. C. Bráctea a-d sección transversal de labráctea. D. Flor en vista lateral. E. Vista interior de los pétalos. F. Carpelos y nectarios. G.Vista dorsal del cincino joven. (Dibujo basado en material tipo I. García Ruiz 4497, CIMI, IEB,ENCB, MEXU y realizado por Rogelio Cárdenas), (tomado de: Acta Botánica 47: 1 1).
54
2.10.2 Secciones del género Pachyphytum
Berger (1930), dividió al género Pachyphytum en dos grupos, llamados
sección Diotostemon (Salm-Dyck) Walter, y sección Pachyphytum, las cuales han
sido aceptadas desde entonces. Walther (1931), añade la sección Echeveriopsis , a la
cual Moran (1961a), reintegra al género Echeveria. La sección Pachyphytum es
tipificada por la especie P. bracteosum Klotzsch. La sección Diotostemon es
tipificada por P. hookeri (Salm-Dyck) Berger. Moran (1968a), propone la sección
Ixiocaulon, tipificada por la especie P. glutinicaule.
De tal forma que las secciones propuestas con sus respectivas especies
quedan de la siguiente manera:
Sección Pachyphytum
Caracterizada por tener grandes brácteas del cincino joven imbricadas,
pétalos más cortos que el cáliz y pedicelos florales cortos, con una gran mancha roja
en el interior de los pétalos, las hojas basales varían de elípticas a obovadas y de
menos de 2 a más de 5 veces más anchas que gruesas. Las especies son las
siguientes:
P. bracteosum Klotzsch
P. caesium Kimnach y Moran
P. kimnachi Moran
P. longifolium Rose
P. ovíferum C.A. Purpus
P. viride E. Walther
P. werdermannüv. Poellnitz
55
Sección Diotostemon
En esta sección, las brácteas del cincino floral joven son reducidas, no están
imbricadas, los sépalos son menores que los pétalos, los sépalos están adpresos a
los pétalos, los pedicelos son largos. Esta constituida por las especies:
P. coeruleum Meyrán
P. compactum Rose
P. hookeri (Salm-Dyck) Berger
Sección Ixiocaulon
En este subgénero las brácteas del cincino joven son imbricadas, los sépalos
son más cortos que la corola, el tallo es inicialmente víscido, las hojas son ovobada-
espatuladas, dos veces más ancho que grueso. Conformada por las especies:
P. glutinicaule Moran
P. fiftkaui Moran
La distribución geográfica conocida de la totalidad de las especies,
corresponde a las colectas registradas de material botánico para cada especie
(cuadro 1).
56
Cuadro 1. Localidades donde se han reportado especies del género Pachyphytum
P. bracteosumHidalgo: Barranca de Meztitlan; entre Jihuico y poco antes deMeztitlan; barrancas entre Atzcatzintlan y Meztitlan 1200 m H. E.Moore 2115 (BH); canon de venados, Lindsay ex Moran 6413(SD); cerca de San Juan, 1300 m, Moran y Uhl 13415 (BH,ICF,SD); La Paila, 1300m, Moran y Kimnach7793 (BH, SD); Tajode Caballero 1850 m arriba de San Juan Mezquititlan, Moran10071 (BH, SD); San Juan al SE de Meztitlan, enero 9 del 2000, I.Garcia y S. Garcia 5684 (CIMI, IEB).
P. brevifolium Guanajuato: Tipo: Cerca de Guanajuato, enero, 1898, A. Dugés153 (GH, US); cascada cerca de Picones, municipio deGuanajuato, 2150m.s.n.m., E. Pérez y E. Carranza 2875 (IEB);alrededores de Picones, cerca del río, municipio de Guanajuato,2150m.s.n.m, E. Perez y C. Glass 3793 (IEB); Canada delCapulín, cerca de la Sauceda, municipio de Guanajuato,2000m.s.n.m., E. Perez y C. Glass 3796 (IEB).
P. caesium Tipo: Aguascalientes: Cerca de 2 km al N del pueblo Presa dela Serna, cerca de los 2000m, suroeste de Aguascalientes. Abril1990, W. Minnich 12101 (HNT, holotipo; MEXU, isotipo); Arroyoagua zarca, 7.3 millas camino al noroeste de Milpillas de arriba,cerca de los 2000 m. Julio 24, 1989, W. Baker 7073 (CAS, HNT,MEXU, SD, US paratipos).
P. coeruleum Queretaro: Entre Cadereyta y Zimapan, Hgo. (Adquirida por elSr. Jorge Meyran) del Sr. Yoshida, sin localidad exacta. TipoMEXU (52609); UC (1175244)
P. compactum Hidalgo: Tipo lxmiquilpan, marzo 1905, C.A. Purpus (No. 05/801J. N. Rose, Cultivada), Holotipo floracion en Washington, marzo1910, (US 574499)Queretaro: Cerro El Mexicano, 2100m, Moran 14758 (ARIZ, BH,CAS, ENCB, HNT, K, MEXU, MICH, NY, SD, TEX, UC, US);ladera norte cerro de la Cruz, 1950 m W de la canada, Moran14794 (BH, CAS, GH, MEXU, MO, SD, US); cerca de acueducto,Queretaro H. Fittkau ex Moran 14720 (CAS, SD, US); San Jose elAlto, 4 km N-NE de la Ciudad de Qro., Moran 14792 (SD); Cerrode La Cruz,. La Canada, municipio de El Marques, R. Moran14794 (MEXU); Cerro el Mexicano, municipio de Colon, R. Moran14758 (ENCB, MEXU); 5-6 km al NW de la Carbonera, municipiode Colon, E. Carranza y S. Zamudio 4025 (IEB); 8 km del pobladoEl Zamorano, camino al Cerro Zamorano, municipio de Colon, E.Perez y E. Carranza 2756 (IEB); km al NE de Presa de Rayas,municipio de Colon, S. Zamudio 7382 (IEB); Cerro de las TresMadres, El Terreno, municipio de Toliman, S. Zamudio 2009(IEB); 3 km al SE de San Juan de la Rosa, municipio deCadereyta, S. Zamudio 2933 (IEB).
57
P. contrerassi Jalisco: Salto Cascada “Cola de Caballo” o Mirador Dr. Ati, aprox.Km 14 carr. Guadalajara-Zacatecas, Cantiles rocosos, laderaNorte, alt. 1240m, en bosque tropical caducifolio, marzo 7 de1999, I. Garcia Ruiz y J.A. Machuca 5569 (CIMI).
P. fittkaui Guanajuato: Tipo: 13 millas al este de San Luis de La Paz,enero 25 de 1968, R. Moran 14770 (SD 67775); 14 km decanada de Moreno, carretera San Luis de La Paz-Xichu,municipio Victoria, 2100m, E. Perez y E. Carranza 2901 (IEB).San Luis Potosi: Balneario de Lourdes, Glass y Foster 969 (SD).
P. garciae Queretaro: Tipo: El Zapote, ± 4 km al NW de Rio Blanco,municipio de Penamiller, alt... 1600m, canada con matorralsubmontano,,E. Perez y S. Zamudio 3574 (IEB); El Zapote, ± 4km al NW de Rio Blanbo, municipio de Penamiller, alt. 1600m, E.Perez y E. Carranza 3798 (IEB)
P. glutinicaule Hidalgo: Tipo: Ladera norte, Rio Tula a 1550 m, (puenteTasquillo) 13 millas al norte de lxmiquilpan, diciembre 1° de 1959,Moran y Kimnach. 7805. Area circundante del geiser deTecozautla; barranca de Toliman, cerca de Zimapan, fondo de labarranca 1200 m y en la mina Lomo de toro a 1400 m; CerroTathi, cerca de Zimapan, Walther (1936).Queretaro: 6 km al N del río Extorax, municipio de Penamiller, J.Meyran 2692, segun Moran (1963); Ibíd., E. Pérez y S. ZamudioS/n. (IEB); Tziquia, frente a la Sabina, municipio de Cadereyta, S.Zamudio 9013 (IEB).
58
P. hookeri San Luis Potosi: Puente Tecolote, Sierra Fria, Ahualulco SanJose de la Purisima, Escalerilla, ranchito de Juarez, acantiladosen montanas de Aguascalientes y oeste de San Luis Potosi entre2000 y 2500 m. Rocosidades de San Luis Potosí, C.A. Purpus7685 (UC); disperso sobre acantilados cerca del norte al este dela carretera, cañón de Rio Cracalbaquero, 10 mi. Al norte deAhualulco, 2000 m. C.H. Uhl 1534 (BH, CAS, SD, US).Localmente comun acantilados cerca del norte Puente Tecolotekm 52 sobre Ia carretera San Luis Potosi a Zacatecas, J. Meyran2301 (BH, CU, MEXU?, SD). Moran y Uhl 13349 (BH, SD, UC);comun sobre rocosidades de Escalerilla 2200 m. Moran yKimnach 7639 (BH, CAS, CU, SD, US); rocosidades 2400 marriba de San Jose de la Purisima, Moran y Kimnach 7645 (CU,SD); sobre rocosidades 2100 m arriba de Ranchito Juarez, 7 mi.SE de Zaragoza, Moran y Kimnach 7660(CU, MEXU, SD, US),R.T. Clausen, 50-37 (BH, CU) comprada en la calle de San LuisPotosi, dicen que es de un canon y montanas en un mirador de laciudad, E. Palmer in 1902, Rose 499 (holotipo de P. uniflorumRose, US 399948; isotipos NY, US)
Guanajuato: Cascada cerca de Picones, municipio deGuanajuato, E. Perez y E. Carranza 2875 (IEB); Guanajuato,municipio de Guanajuato, A. Duges 153 (GH, US), segun Britton yRose (1903).Se ha observado en bosque de encino. Alt. 2150 m.florece en febrero.
Aguascalientes: Rocosidades volcanicas sombreadas arriba de2400, ca. 20 km al este de Rincón de Romos, R. McVaugh 23749(MICH); acantilados igneos cara norte de Sierra Fria, 3.4 mi. Aleste de Tepezala 8400 ft. C.H. Uhl 2109 (BH, SD)
P. kimnachi Tipo: San Luis Potosi: Ladera este del Pico Agujon, Sierra de laEquiteria, 22 julio, 1962 Myron Kimnach 290, fl. Abril (SD 64541).Ladera sur Cerro Agujon, marzo 19 del 2000, I. Garcia y G.Hernandez 5693 (CIMI, IEB).
P. longifolium Hidalgo: Paredes de la barranca y aparentemente epifita sobrearboles de pino, Mpio. Meztitlan. Comun sobre rocas Iadera NEcerca de la laguna Meztitlan J. Henrickson y B. Christman 2066/(BH, SD). 2mi. NW de San Cristobal, 1200 m, R. Moran y C. H.Uhl 13417(BH, MEXU, MICH, SD, UC, US); 3 mi. NW de Meztitlan1200m R. Moran y C. H. Uhl 13416 (BH, HNT, ICF, SD, MICH,NY, UC, US); sobre acantilados y arboles del rio Tolantongo, F.Otero 01 (SD?). Toxhico, al SW de Meztitlán, enero 9 del 2000, I.Garcia y S. Garcia 5682 (CIMI, IEB).
59
P. machucae Tipo: Michoacán: Municipio Pajacuarán, 2 km al este dePajacuarán, Barranca del Agua, cerca de El Cometa, alt.1850 m,enero 7 de 1997, I. Garcia Ruiz 4497 (IEB, CIMI, ENCB, MEXU);El Cometa, alt. 1850 m. bosque tropical caducifolio, J.A. MachucaN., I. Garcia Ruiz y M. Chazaro B. 7862 (IBUG, WIS, XAL).
P. oviferum San Luis Potosí: Barranca Bagre, cerca de minas San Rafael1911 C.A. Purpus
P. rzedowskii Michoacán: Tipo: municipio de Tuxpan, Cerro Piedra Redonda,al W de Las Caleras, unos 12 km al W de Tuxpan, alt. 2140 m.19.X1.1989, R. Torres y P. Ramirez 13705 (holotipo: IEB);aproximadamente 1 km al SW de Tuxpan, Cerro de la Vibora, enbosque tropical caducifolio, enero 27 del 2000, I. Garcia 5686(CIMI); Ibid., marzo 5 del 2000, I. Garcia y J. Garcia 5690 (CIMI).
P. viride Guanajuato: El Álamo, SW de Xichú, municipio de Xichú, E.Pérez y E. Carranza 2899 (IEB). Querétaro: Aproximadamente2.5 km al S de Arroyo Seco, municipio de Arroyo Seco, E.Carranza 2413 (IEB); ladera NE del Cerro La Tembladera, 10.5km al NE de Pena Blanca, municipio Penamiller, S. Zamudio 9038(IEB); Ibid., E. Perez y S. Zamudio 2748 (IEB); Cerro LaTembladera ladera N al Sur de Camargo, municipio dePenamiller, E. Carranza 4712 (IEB); Santa María del Mexicano,ca. 20 km, adelante de Colón municipio de Colon, R. Moran10179 (ENCB); cliffs 7.7mi NE de Cadereyta, S of San Javier,municipio de Cadereyta, C.H. Uhl 1853 (MEXU). Crece sobreriscos casi verticales, en matorral xerófilo. Alt. 1600-2200 m.florecen durante la mayor parte del ano, principalmente denoviembre-mayo.
P.werdermannii
Tamaulipas: Tipo: Valle de Jaumave, al lado de una montañaentre cactus y arbustos bajos, cerca de 600-700 m, 1933. Prof. E.Werdermann
y Moran (1993); García et al (1999, 2002); Pérez-Calix et Glass (1999). Tambien se revisaron
ejemplares del género Pachyphytum en los Herbarios CIMI del CIIDIR-IPN Michoacan y del IEB del
Instituto de Ecología, A.C., en Pátzcuaro, Michoacán.
60
Se reconoce que teóricamente, las clasificaciones son el marco histórico para
interpretar los patrones de similitudes, interacciones ecológicas y su distribución
geográfica entre taxa como lo mencionan Brooks (1981); Cracaft (1983); Eldredge y
Cracaft (1980); Farris (1979), y que la eficaz sistemática será mayor si el carácter
utilizado no es el resultado de la influencia del medio sobre el fenotipo, el uso directo
del material genético debe aportar los caracteres más fundamentales para una
clasificación (Crawford 1990; Clegg y Durbin 1990). Es considerado “marcador”
(biológico) cualquier característica heredable que nos permita estudiar la diversidad
biológica (Avise 1994). Hasta hace unos cuantos años la mayoría de los
“marcadores” que se utilizaban, eran marcadores morfológicos (fenotípicos), en la
actualidad con el advenimiento de las técnicas de estudio de material genético
(ADN), la tendencia actual es el estudio de la diversidad y variabilidad del material
genético (marcadores moleculares), mismo y no de su expresión fenotípica (Avise
1994).
Los marcadores moleculares pueden ser: las secuencias de ADN y el análisis
de su polimorfismo; con respecto a ésta última, una de las técnicas más recientes es
la del polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), la cual es
una combinación de RFLP con PCR (Vos et al., 1997), usada entre otros, para
resolver problemas de variación de especies cercanamente relacionadas, que ha
sido difícil de resolver con datos morfológicos (Heun et al., 1997; Rusell et al; 1997).
Actualmente la clasificación taxonómica presenta el problema de ubicar varios
taxa con características intermedias dentro de alguno de los diferentes niveles
taxonómicos (Bremer et al., 1998), considerando a las “especies problema”, como un
desacierto de los biólogos al no acordar con exactitud sobre la identificación de las
especies, actualmente se estima conveniente tomar en cuenta aspectos filogenéticos
dentro de la clasificación (O’Hara 1993; Hey 2001).
Se toma como modelo de estudio al género Pachyphytum, ya que dentro del
conocimiento actual del grupo, los taxa: P. machucae I. García, Glass et Cházaro; P.
61
brevifolium Rose, P. garciae Pérez-Calix et Glass, (Pérez-Calix y Glass 1999.) y P.
rzedowskii I. García, Pérez-Calix et Meyrán (García et al., 2002) es difícil asignarles
un lugar apropiado en el esquema tradicional clasificatorio dentro de alguna de las
tres secciones del género Pachyphytum (García et al, 1999, 2002; Pérez-Calix et
Glass, 1999). Adicionalmente una especie cuyo reporte actualmente se encuentra en
“prensa” (P. contrerassi), por sus características morfológicas se ubica en una
situación taxonómica similar que P. machucae, P. garciae, P. brevifolium y P
rzedowskii; por lo que se considera necesario determinar las relaciones genéticas
interespecíficas de plantas del género Pachyphytum mediante el análisis de su
polimorfismo genético con marcadores AFLP.
62
III MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Material biológico
Para determinar las relaciones genéticas y sistemáticas del género
Pachyphytum fueron colectadas las 17 especies que conforman este grupo, de las
cuales existen ejemplares de respaldo en un herbario que corroboran su existencia.
Algunos de estos materiales fueron obtenidos de localidades tipo (lugar donde
se desarrollan las especies de plantas descritas originalmente) en diversos estados
de la republica, como Tamaulipas, San Luis Potosí, Querétaro, Guanajuato, Hidalgo,
Aguascalientes, Michoacán y Jalisco (fig. 2).
Con respecto a las especies testigo se consideraron miembros de distintos
grupos relacionados con el género en estudio (Qiu-Yun et al., 1996); y relacionados
con la familia Crassulaceae, (Mort et al., 2001); de tal manera que representen a
grupos específicos de linajes adoptivos asociados a la sección (Starr et al., 1999;
Hansen et al., 1999; Virk et al., 1998; Schmidt y Jensen 2000; van Ham et al., 1994;
van Ham y ‘t Hart 1998).
Las especies testigo de la misma familia botánica que fueron seleccionadas
por encontrarse muy relacionadas fueron: Graptopetalum pachyphyllum, G.
amethystinum, Sedum corynephyllum y Echeveria fulgens, y como grupo externo se
utilizó Bursera glabrifolia de la familia Burseraceae (cuadro 2).
El material usado se colectó directamente de campo y se acondicionó en
invernadero mediante el transplante en macetas rígidas con un sustrato de arena, jal
y tierra negra en igual proporción, manteniéndose a 30°C de temperatura, con una
humedad relativa de 80%, y riego con agua corriente cada 5-7 días. Aunque por
seguridad, también se mantuvo hasta su utilización, tejido fresco de las especies en
ultracongelador (REVCO) a -70°C.
63
Figura 2. Distribución conocida de las especies del género Pachyphytum, en México.
a) P. bracteosum Klotzsch. Estado de Hidalgob) P. brevifolium Rose Estado de Guanajuatoc) P. longifolium Rose Estado de Hidalgod) P. compactum Rose Estado de Querétaroe) P. oviferum C. A. Purpus Estado de San Luis Potosíf) P. hookeri (Salm-Dyck) Berger Estado de San Luis Potosíg) P. viride E. Walter Estado de Querétaroh) P. werdermanniV. Poellnitz Estado de Tamaulipasi) P. coeruteum Meyrán Estado de Quérétaroj) P. glutínicaule Moran Estados de Hidalgo y Querétarok) P. kimnachi Moran Estado de San Luis Potosí1) P. fittkaui Moran Estado de Guanajuatom) P. caesium Kimnach y Moran Estado de Aguascalientesn) P. machucae 1. García, Glass et Cházaro Estado de Michoacáno) P. garciae Pérez-Calix et Glass Estado de Querétarop) P. rzedowskii 1. García, Pérez-Calix et Meyrán Estado de Michoacánq) P. contrerassi Pérez-Calix, 1. García et Cházaro (en prensa) Estado de Jalisco
64
Cuadro 2. Lista de taxa y origen del material usado
En un tubo de PCR se colocaron 5µ l directamente de cada muestra de la
primera amplificación, al cual se adicionaron 5.0µ l de la mezcla 1 [0.5µ l 32P EcoR1+3
(10ng/µ l), 0.6µ l del oligo Mse1+3 (50ng/µ l), 0.4µ l de dNTPs (10mM), 3.5µ l de agua
desionizada estéril], también se adicionaron 10µ l de la mezcla 2 (2.0µ l de
amortiguador de PCR 10X, 0.2µ l de taq polimerasa (Boehringer) y 7.8µ l de agua
desionizada estéril). Posteriormente el tubo se agitó por inversión y se colocó en el
termociclador, y se corrió 1 ciclo a 30 segundos de desnaturalización a 94°C, 30
segundos de empalme a 65°C y 60 segundos de polimerización a 72°C, seguido de
otros 24 ciclos a las mismas condiciones, excepto la temperatura de empalme, que
fue descendiendo 0.7°C durante los primeros 11 ciclos, hasta llegar a 56°C (Vos et
al., 1995, Simpson et al., 1999, Caicedo et al., 1999).
Para la segunda amplificación se seleccionaron cinco combinaciones de
oligonucleótidos para la evaluación final -(AGG/ATC, AGG/ACC, AGG/ACA,
AGG/ACG, y AGG/AAA). Dicha selección se realizó con base al número de bandas
polimórficas producidas.
71
3.12 Separación de productos de amplificación
La solución para preparar los geles de acrilamida al 6% se realizó a partir de
150 ml de una solución base de acrilamida al 40% [ la cual se preparó utilizando 380
gr de acrilamida Gibco, 20 gr de bisacrilamida (Gibco), seguida de una desionización
con 2% de resina AG501-X8 de bio-radpor durante una hora a temperatura ambiente,
después se filtró la solución con membrana de 1.2 mM millipore y se aforó a un litro
con agua desionizada estéril], 100 mi de solución TBE 10X (Tris base 1 M, ácido
bórico 1 M, EDTA 20mM), finalmente se adicionaron 700 ml de solución de urea 8 M
ajustándose a un volumen de un litro con agua desionizada estéril. La separación de
los fragmentos amplificados se realizó en geles de 35X45 cm, para la preparación del
gel se tomó de la solución de acrilamida al 6%, a la cual se le adicionó 360µ l de
persulfato de amonio al 10% y 36 µ l de TEMED. Las cámaras de electroforesis que
se utilizaron fueron las de secuencia de Bio-Rad 3000, el gel se precorrió con
amortiguador TBE 0.5X durante 30 minutos a 2000 volts (Dowiing et al., 1996;
Simpson et al., 1999, Caicedo et al., 1999).
Se tomó una alícuota de 3µ l del ADN amplificado y se colocó en un tubo
Eppendorf, al cual se le adicionaron 3µ l de amortiguador de carga (formamida 955,
azul de bromofenol 0.05%, Xilen-cianol 0.05%, EDTA 10 mM). Después se colocó en
un agitador durante 3 minutos a 95°C para desnaturalizar el ADN; se enfrió
rápidamente, colocando los tubos en hielo. Posteriormente, se tomó una alícuota de
4 µ l de dicha mezcla y se cargaron en el gel, incluyendo el marcador de peso
molecular en escalera de 123 pares de bases (Dowling et al., 1996). El gel se corrió
a 2000 volts durante 3 horas. Después de terminada la electroforésis, se retiró el gel
de la cámara, poniéndose los cristales sobre la mesa y con ayuda de una espátula,
éstos se separan. Posteriormente, sobre el gel se colocó una hoja de papel whatman
de 3 mm cortado a la medida, se levantó el papel con el gel adherido, en seguida el
papel se clocó sobre la mesa y se cubrió con papel celofán, luego se puso a secar
en un secador de geles. Posteriormente el gel se fijó con cinta adhesiva al cassete
de exposición y esta se cubrió con la película BioMax de 35X43 cm de Kodak (Lin y
72
Kuo 1996, Simpson et al., 1999), finalmente el cassete se colocó en un refrigerador
Revco a -80°C durante un promedio de 24 horas. Finalmente, se realizó el revelado
dentro del cuarto obscuro, retirando la película (autorradiograma) del cassete que la
contenía, el revelado es inmediato de similar forma que las películas instantáneas de
Kodak.
3.13 Análisis de datos
3.13.1 Construcción de la tabla de contingencias
Los patrones de las bandas obtenidos con los diferentes iniciadores, se
examinaron visualmente en los autorradiogramas obtenidos de los geles de
acrilamida. Para generar una tabla de contingencia, tales datos fueron registrados
como variables discretas utilizando 1 para indicar la presencia y 0 para la ausencia
de las bandas en cada una de las especies, a partir de esta tabla de contingencia se
obtuvo el estimador de distancias genéticas utilizando el método de Skroch et al.,
(1992). Posteriormente de la interpretación ocular de presencia o ausencia (1 ó 0) de
bandas polimórficas de ADN en las autorradiografías producto del gel de acrilamida,
se elaboran las tablas de contingencia construyéndose con estos datos una matriz
de las medidas de similaridad genética de las unidades taxonómicas operacionales
(OTUs) por medio de un algoritmo.
3.13.2 Análisis del agrupamiento
A partir de los estimadores de las distancias genéticas (tabla de contingencia,
0/1), se elaboró una matriz con la cual se construyó el dendrograma. El análisis por
agrupamiento, se realizó con diferentes medidas de similaridad genética, esto con la
finalidad de comparar los diversos métodos, y detectar el que se ajustara mejor a las
condiciones “reales” de agrupamiento: A) Coeficiente de apareamiento simple
(Sneath y Sokal 1973; Sckroch et al., 1992) “Manhattan”, con base en sitios iguales
(0, 0 ó 1, 1) entre total de sitios. B) Nei y Li, “Nei” (Nei y Li 1979), que dice: “el doble
del número de bandas compartidas sobre el total de bandas” (en ambos individuos).
73
C) Jaccard, “binary” (Sneath y Sokal, 1973). Posteriormente se utilizaron diferentes
métodos de obtención de dendrograma: UPGMA (average ó promedio), Vecino
cercano (connected), y Vecino lejano (compact).
Con respecto al análisis de agrupamiento de las relaciones genéticas entre las
especies del género Pachyphytum, la disimilaridad genética se midió con los
diferentes métodos mencionados, seleccionándose por la claridad del gráfico, el del
coeficiente Nei y Li (“Nei”), el cual no toma en cuenta las lecturas (0,0); esto es,
cuando las bandas están ausentes en los individuos muestreados, y les da mayor
peso a las coincidencias (1,1). La obtención del dendrograma fue por medio del
método del vecino lejano “compact”, el cual mostró una distribución de las
agrupaciones mas clara que con los otros métodos. Se utilizaron los intervalos de
confianza de Felsenstein “bootstrap” (Felsenstein 1985), con 3000 repeticiones.
Todas las operaciones se realizaron utilizando el programa estadístico S-Plus 2000
(Everit 1994; Schumaker 2001).
74
IV RESULTADOS
La técnica empleada para la extracción del ADN (CTAB), permitió obtener
material suficiente y de considerable grado de pureza de las 17 especies en estudio,y las cinco del grupo testigo. Dos de las especies (Pachyphytum compactum, y P.caesium) presentaron dificultad para la extracción de dicho material genético, por locual fue necesario realizar adecuaciones a la técnica (fig. 3).
Figura 3. Electroforésis en gel de agarosa del ADN aislado de las 22 especiesestudiadas, por medio de la técnica del CTAB carril 1-17 especies de Pachyphytum;18-22 especies testigo. La marca de peso molecular 1 Kb plus (Gibco) a los costadosderecho e izquierdo.
75
4.1 Reacciones de la técnica AFLP
En el gel de electroforésis de acrilamida se presentó un patrón de bandeo muy
variable, siendo necesario realizar una revisión de la técnica en las reacciones
llevadas a cabo en la primera y segunda amplificación del ADN. En principio se
sospechó que se debió al uso de la Taq polimerasa de la marca Gibco. Por lo que se
procedió a realizar distintas pruebas, iniciando con la variación del amortiguador T4
(Exchange y Forward), y el uso de Taq polimerasa marca Roche y Gibco, así como
con una marca radioactiva (32P ℘ -ATP) más reciente; además de modificar el
producto de la primera amplificación en una proporción 1:30. Los resultados tuvieron
diferencias que favorecieron el patrón de bandeo con el uso de la Taq polimerasa
marca Roche y el amortiguador T4 forward. Esto pudiera ser efecto de mejores
condiciones con la mezcla dei material.en estudio.
Apreciando lo anterior, el número de bandas observadas en los geles de las
distintas combinaciones (AGG/ATC, AGG/ACC, AGG/ACA, AGG/ACG, y AGG/AAA),
presentaron un número considerable de bandas polimórficas, lo que se traduce en
mayor cantidad de información de cada especie, consecuentemente en mayor
probabilidad de obtener resultados confiables.
4.2 Polimorfismos de Pachyphytum con AFLP
Es importante notar sobre el patrón de bandeo que manifestó la especie
Pachyphytum glutinicaule, fue legible desde los 50, hasta por arriba de los 525 pares
de bases en todas las combinaciones de iniciadores usadas, situación que no se
presentó en ninguna de las demás especies muestreadas. Podría esto deberse a que
los iniciadores usados permitieron mejor expresión en dicha muestra, o que el ADN
de dicha especie resultase de mejor calidad.
76
Se obtuvieron un total de 497 bandas distintas con las cinco combinaciones
usadas. De éstas resultaron legibles 406 bandas, siendo polimórficas 375, el 92.4 %
(cuadro 3).
Cuadro 3. Número de bandas obtenidas con el análisis de marcadores tipo AFLP, con cincocombinaciones de iniciadores de 17 especies de Pachyphytum.
El número de bandas polimórficas por combinación de oligonucleótidos varió de 75 a
91, con un promedio de 81.2, mientras que la longitud de las bandas se manifestaron
entre los 75 y 525 pares de bases (pb) con respecto al peso molecular (Figura 4 y 5).
77
Figura 4. Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones de bandeo deespecies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo(18-22), obtenido a partir de latécnica AFLP, con la combinación de iniciadores E-ACA/M-AGG. Las flechas delcostado izquierdo señálan algunas de las bandas monomórficas más evidentes.
78
Figura 5. Autorradiograma del gel de poliacrilamida presentando patrones de bandeo deespecies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo (18-22), obtenido a partir de la técnicaAFLP, con la combinación de iniciadores E-ACG/M-AGG. Las flechas señalan algunas de lasbandas monomórficas. La escala de la izquierda corresponde a las pares de bases (Pb) delmarcador de peso molecular usado (escalera 123 pb). La escala de la derecha indica lanumeración de las bandas legibles encontradas.
79
4.3 Relaciones genéticas interespecíficas
Una vez que se obtienen las autorradiografías con las diferentes
combinaciones, se interpretan las bandas polimórficas y se elaboró la tabla de
contingencias con los valores de presencia/ausencia (1, 0). Con esta tabla en el
programa Excel de Word, se exportó al programa S-plus 2000, en el cuál por medio
de un algoritmo, se obtuvo una matriz; a partir de la ésta se les asignó cierta función
del coeficiente de similaridad genética por medio de la cual se construyeron los
diferentes dendrogramas de las relaciones interespecíficas.
Se presentan los dendrogramas logrados por agrupamiento con las diferentes
coeficientes de similaridad genética (Nei y Li “Nei”; apareamiento simple “manhattan” y
Jaccard “ Binary”), así como por medio de tres métodos de obtención de los mismos
(UPGMA, método del promedio de grupo ó “average”; distancia mínima, ligamiento
simple o de conexión corrnected, ó tambien llamada del “vecino cercano” y distancia
máxima, ligamento completo, ó denominada compacto, compact ó “vecino lejano”),
(figs. 6-14).
80
Figura 6. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética "Manhattan" / average.La especie P. glutinicaule, queda fuera del grupo principal, junto con los grupos testigo.
Figura 7. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Manhattan” / compact.La especie testigo B. glabrifolia, separa en dos a las especies en estudio, lo cual no es factible.
Figura 8. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Manhattan” / connected.De nuevo, la especie P. glutinicaule se comporta junto con los grupos testigo.
81
Figura 9. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / average.Este grafico, agrupa de manera clara las especies testigo, no así con el grupo en estudio.
Figura 10. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / connected.Similar al anterior, en el grupo en estudio no se encuentran claros los agrupamientos formados.
Figura 11. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / compact. Gráficocon mayor representatividad, la separación entre el grupo en estudio y el testigo son más claras.
82
Figura 12. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / compact. Similar alanterior, se agrupan más claramente las especies en estudio, mejora la interpretación de susrelaciones.
Figura 13. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / connected.Gráfico que no representa claridad entre las relaciones del grupo en estudio.
Figura 14. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / average.Similar al anterior, son poco claras las relaciones entre las especies del género Pachyphytum.
83
De acuerdo con la topología y el desarrollo de los diversos dendrogramas, se
considera que el agrupamiento obtenido con el coeficiente de Nei y Li “Nei” con el
método “compact” (fig. 12), brinda la información más adecuada sobre las dos
principales asociaciones entre las especies del género Pachyphytum, lo que permite
corroborar la hipótesis planteada inicialmente respecto a la modificación de la
clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a nivel sección, si
se agrupan con relación a su polimorfismo genético.
Los resultados obtenidos con el remuestreo bootstrap (3000 repeticiones)
respecto, a las relaciones genéticas en el dendrograma, realizado mediante el
método de agrupamiento con el coeficiente “Nei” y por medio del análisis del vecino
lejano (compact), indican que la topología del árbol obtenida no varió con respecto a
la mostrada originalmente, lo cual confirma que entre las especies del género
Pachyphytum, se forman dos agrupaciones principales; los valores en los nodos
indican sus respectivos niveles de confianza (fig. 15).
El análisis del dendrograma obtenido (fig. 15), muestra que a un nivel de 46%
de disimilaridad (ó 54% de similaridad) aproximadamente, se forman dos principales
agrupaciones: (A), formado con Pachyphytum glutinicaule, agrupado con P.
longifolium, P. bracteosum P. brevifolium, P. oviferum, y P. hookeri. El segundo B),
más numeroso incluye al resto de las especies del género, con P. machucae, P.
garciae, P. viride, P. werdermannü, P. coeruleum, P. caesium , y P. rzedowskii, P.
contrerassi, P. compactum, P. kimnachi, P. fittkaui.
84
Figura 15. Dendrograma obtenido por medio de “Nei” y compact con un bootstrap de 3000repeticiones. Las flechas del lado derecho señalan los puntos de intersección con la líneapunteada a un nivel de disimilaridad de 0.46, mismas que originan los agrupamientos (A y B)logrados, los números en los nodos significan los valores de confianza en cada agrupación.Del lado izquierdo se señalan con asterisco las “especies problema” de ubicar dentro dealguna sección del género Pachyphytum. Los grupos testigo se ubican en los extremossuperior e inferior.
85
En la primera agrupación (A), se ubican seis especies; formando tres
subagrupaciones principales, una sólo incluye a Pachyphytum glutinicaule, que se
une a otro subgrupo a un 60% de similaridad, y un coeficiente del 17% de confianza;
este subgrupo está conformado a su vez por Pachyphytum longifolium unido a un
71 % de similaridad y un 99% de confianza con un par de especies conformadas por P.
bracteosum y P. brevifollum las cuales se agrupan a un 82% de similaridad y con
un intervalo de confianza de 86%; estas últimas tres especies unen a un 65% de
similaridad con otras dos y con un 42% de confianza, estas son P. oviferum y P.
hookeri unidas entre si a 68% de similaridad con un 19% de confianza.
La segunda agrupación (B), incluye al resto de las especies (11); y lo
conforman cuatro principales subgrupos; el primero constituido por Pachyphytum
machucae unido a P. garciae a un 77% de similaridad con un 81 % de confianza, las
que a su vez se agrupan a un 58% de similaridad y un 45°lo de confianza con la
segunda subagrupación: P. viride y P. werdermannii unidas a un 74% de similaridad
y con un 81 % de confianza; estas se unen una agrupación a un 63% de similaridad
con una confianza de un 8%, dicha agrupación se subdivide para formar el tercer
grupo conformado por P. coeruleum unida a un 67% de similaridad y un 46% de
confianza Con P. caesium y P. rzedowskii las cuales están agrupadas a un 68% de
similaridad y una confianza de 98%; éstas se unen al cuarto subgrupo a un 64% de
similaridad y con un 8% de confianza. Las especies de este cuarto subgrupo lo
conforman P. contrerassi unido con P. compactum a un 68% de similaridad y una
confianza de 31 %, así como a P. kimnachi y P. fittkaui las cuales están unidas entre
si a un 82% de similaridad y con un 100% de confianza.
86
V DISCUSIÓN
5.1 Uso de la técnica AFLP
Se considera necesario incorporar nuevos tipos de datos, en particular los
moleculares, donde los caracteres morfológicos no han resuelto los problemas
taxonómicos (González 1997). Como se ha mencionado desde la aparición de la
técnica AFLP en 1995 (Vos et al), reportes de datos publicados en varios artículos
han demostrado su eficiencia para la caracterización de germoplasma, estudios
filogenéticos en diferentes organismos incluyendo plantas, bacterias, hongos; así
como en estudios de caracterización de poblaciones genéticas y para el mapeo de
diferentes especies de interés económico (Lin y Kuo 1996; Majer et al., 1996; Becker
et al., 1995; Cervera et al., 1996a). Además de que ha sido rápidamente adoptada
por grupos que trabajan campos del mapeo molecular y filogenias (Simpson 1997b).
Acorde con lo anotado por Soltis y Soltis (2000a), los árboles filogenéticos
brindan las bases críticas, no solo para estudios sistemáticos, sino también para
investigaciones en evolución molecular y genética comparativa. Las hipótesis sobre
sus relaciones ya sea basada en datos moleculares (incluyendo DNA, datos de
secuencias, cambios estructurales y pérdidas de gen/intron), morfología y otros
caracteres relacionados con el DNA, o una combinación de caracteres, proveen de
una red muy útil de comparación evolutiva.
La gran utilidad de marcadores moleculares surge de seis propiedades inherentes
que las distinguen de los marcadores morfólógicós (Powell et al., 1996).
• El fenotipo de la mayoría de los marcadores morfológicos pueden ser
determinados en todos los niveles de plantas, por lo que pueden ser hallados
en loci moleculares de tejidos y niveles celulares.
• La frecuencia de alelos tiende a ser mayor en loci moleculares comparados
marcadores morfológicos.
87
• Adicionalmente los mutantes morfológicos tienden a asociarse con efectos
fenotípicos no deseables.
• Los alelos en loci morfológicos interactúan de manera dominante- recesivo que
limita la identificación de genotipos heterogocigotos.
• Los loci moleculares exhiben una forma de herencia codominante que permite
la identificación genotípica de individuos en una población segregada.
• Pocos efectos epistáticos o pleiotrópicos se observan con marcadores
moleculares como con marcadores morfológicos, por esto un gran número de
marcadores polimórficos pueden generarse y monitorearse de un cruzamiento.
Por lo que se demuestra que los AFLP brindan una técnica diferente, la cual
muestra gran potencial para el uso e investigación del genoma (Poweil et al., 1996).
Con respecto a la comparación de la información obtenida con los AFLP y otras
técnicas referentes al estudio del análisis de diversidad y filogenia (Sharma et al.,
1996), concluyen que los AFLP detectaron mayor nivel de polimorfismo que con los
RAPDs. Ya que el nivel de variación detectado con los análisis AFLP indican que
esta es una mayor y mejor tecnología en la construcción de mapas de linajes
genéticos. Al respecto Simpson (19972) menciona que los AFLP son marcadores
multilocus, los cuales brindan una amplia información del genoma de diferentes
individuos. Asimismo menciona que la principal ventaja radica en el análisis de
muchos loci de manera simultánea de la totalidad del genoma, registrando
rápidamente un gran número de marcadores (Simpson 1997b).
El uso de marcadores moleculares presenta ventajas y desventajas, de manera
general se puede mencionar que todas las técnicas basadas en el análisis del ADN
son caras comparativamente con las isoenzimas o marcadores morfológicos, sin
embargo la cantidad de información obtenida compensa este factor (Simpson
1997b). El uso de los RAPDs y DAFs no ocupan del uso de radiactividad y son
relativamente más baratos, sin embargo estos sistemas de marcadores han sido
criticados por la ausencia de reproducibilidad. La técnica AFLP incluye el uso de
88
radiactividad, pero actualmente se ha empezado a hacer uso de la etiquetación por
medio de fluorescencia (Simpson 1997b). Por lo que puede considerarse que la
integración de métodos de marcadores moleculares es esencial para el análisis y
caracterización de genoma en distintos grupos de interés.
Comparativamente con el método normal de RFLP, pruebas específicas son
usadas en una reacción de hibridación en orden para detectar secuencias homólogas
a la prueba entre cientos de fragmentos producidos cuando el ADN es objetó de
digestión con una enzima de restricción (Simpson 1997b). Los polimorfismos ocurren
cuando las mutaciones afectan la posición de un sitio en una enzima de restricción
de un individuo al ser comparado con otro. Los fragmentos de restricción resultantes
podrían ser de diferentes tamaños y bandas migrantes diferenciadas durante la
electroforésis podría observarse siguiendo al análisis de hibridación. En el caso de
los AFLP una selección o grupo de fragmentos de restricción del genoma digerido,
mismo que puede ser fácilmente obtenido y analizado (Simpson 1997ª).
La existencia de variación en los patrones de bandeo resultantes del gel de
acrilamida con las diferentes combinaciones usadas en el presente estudio,
permitieron la revisión de cada paso en la primera y segunda amplificación de la
técnica AFLP (Vos et al., 1995; Simpson 19971), considerándose importante la
proporción de ADN de la primera amplificación (1:30), así como una marca
radioactiva más reciente. Con el uso de estas estrategias se obtuvo una mejor
resolución en el patrón de bandeo obtenido. Una alternativa al uso de la marca
radioactiva, es la detección mediante la quimioluminiscencia o la fluorescencia (Lin et
al., 1997; Vaillancourt et al., 1992; Huang y Sun 1999).
Durante la segunda amplificación realizada (de la técnica AFLP) se seleccionaron
cinco combinaciones de oligonucleótidos para la evaluación final (AGG/ATC,
AGG/ACC, AGG/ACA, AGG/ACG, y AGG/AAA), mismas que permitieron la
obtención de un numero adecuado de bandas legibles así como una proporción de
bandas polimórficas para su análisis. Es .probable que con un mayor número de
89
combinaciones, el número de bandas proporcionalmente se incremente, mejorando o
haciendo más confiables los resultados, como ha sido estimado en otros trabajos por
Yee y colaboradores (1999). El hecho de realizar el análisis con un número reducido
de iniciadores podría ser considerado como una limitante; sin embargo es también
probable que los resultados finales obtenidos (matriz y dendrograma) no se vean
alterados. Esto sólo podrá probarse en la práctica con la realización de una mayor
cantidad de combinaciones de iniciadores, además del uso de diferentes métodos de
agrupamiento y por medio de diversos programas estadísticos de cómputo para su
interpretación como el PHYLIP, PAUP o el MaCClade entre otros (Backeljau et al.,
1996).
5.2 Polimorfismo del ADN
Como se observó el análisis AFLP de las distintas especies del género
Pachyphytum nos arrojó un total de 497 bandas, de las cuales resultaron legibles 406
de estas. Para esto se llevaron a cabo cinco combinaciones de iniciadores selectivos
E+3/M+3: EcoRI+ATC, EcoRI+ACC, EcoRI+ACA, EcoRI+ACG y EcoRI+AAA
(Cuadro 3). El promedio de bandas polimórficas fue de 92.4%. Comparativamente
mayor que otros análisis AFLP de estudios similares (Mace et al., 1999a; Lecerteau y
Szmidt 1999; Yee et al., 1999; Teulat et al., 2000), por lo que resulta alto el valor
obtenido, e indica la proporción de loci polimórficos, así, el significado de
heterogeneidad por locus, brinda una manera de medir la diversidad genética dentro
de especies; como es anotado por Sharma y colaboradores (1996).
El dendrograma obtenido por el método del vecino lejano “compact” fue el que
se mostró mejor desarrollado, sin embargo como lo anota Koopman y colaboradores
(2001), al menos parte de las bandas representan marcadores codominantes que
tienen tres estados de carácter 0/0, 1/0, 1/1, lo cual puede incluir homoplasias en el
juego de datos y posiblemente divida a un árbol con topologías erróneas en el
análisis cladístico. Asimismo, dichos autores consideran que los análisis fenéticos y
cladísticos realizados en Lactuca, en casos de topologías idénticas, las homoplasias
90
son menores, lo que no afecta a las conclusiones de las relaciones entre las
especies; inclusive cuando las homoplasias son mayores por diferencias entre los
análisis, las interrelaciones no se afectan a pesar de las objeciones teóricas. Este
tipo de análisis de agrupamiento también fue usado por Xu, et al (2000), con éxito
para caracterizar cultivos de Vigna angularis entre poblaciones y entre individuos.
Se considera que el método ó coeficiente (Nei y Li), sobrestima (no toma en
cuenta los casos 0,1), la disimilaridad entre individuos sobre todo en situaciones de
especies de la misma población o individuos de la misma especie (Everit, 1993);
acorde con el primer punto; sin embargo se piensa que con respecto al segundo, no
fue el caso del presente' trabajo, ya que se emplearon distintas especies de
diferentes poblaciones.
La toponimia, o forma general en que se presentaron las agrupaciones en el
árbol por medio del coeficiente de Nei y Li “Nei” y el de Jaccard “Binary”, a través
del método “compact”, están muy relacionados, coincidiendo con lo anotado al
respecto por Milbourne, et al., (1997), y Koopman, et al., (2001), excepto por los
valores de similaridad que presentan, considerándose que el coeficiente de “Nei” le
da mayor peso a las coincidencias que al coeficiente de “Jaccard” (Everit, 1993).
Las asociaciones de marcadores genéticos por medio del análisis de
agrupamiento se consideran muy útiles ya que incluyen un gran número de
caracteres y porque es una clasificación jerárquica que puede ser usada para decidir
los niveles umbrales de similaridad entre especies (Singh 1999). Asimismo, indican la
formación de agrupaciones muy distintas a las consideradas a partir del
planteamiento clásico basado en análisis morfológico y anatómico.
A pesar de la frecuente utilización de datos moleculares, existen controversias
sobre su uso en sistemática. El principal hace referencia, que si los datos
morfológicos son mejores que los moleculares para inferir filogenias o viceversa, a
pesar de que hay pocos estudios comparativos y los existentes han demostrado que
91
la divergencia morfológica y la molecular son muy independientes (Wilson et al.,
1974, 1977). Hillis (1987) concluye que la combinación de datos moleculares con los
morfológicos maximizará, tanto la utilización como el contenido de la información, y
este tipo de análisis son los que se están realizando (por ejemplo Chase et al., 1995;
Uhi et al, 1995; Kress 1995).
Los sistemáticos evolutivos intentan utilizar toda la información contenida en
las diferentes dimensiones de la filogenia (Takhtajan 1997). Esto debe dejar claro
que la elaboración de clasificaciones (incluso a nivel de especies) consiste en
realizar los análisis cladísticos y desarrollar la clasificación a partir de la serie de
grupos monofiléticos descubiertos en un cladograma (Mishler y De Luna 1997).
De esta manera se considera que sí existe variación entre las agrupaciones de
las especies del género Pachyphytum a partir de marcadores moleculares tipo
AFLP, y las agrupaciones de las secciones conocidas por aspectos morfológicos;
ubicando a la mayoría de la especies problema (P. machucae, P. garciae P.
rzedowskii y P. contrerassi) en el grupo (B), y a P. brevffolium en el grupo (A)
conformado por seis especies.
5.3 Evidencia Filogenética
Como es mencionado por Cantino y Wagstaff (1998), la filosofía general
aplicada en este tipo de estudios son que la clasificación debe reflejar una filogenia
cuando existe evidencia filogenética; cuando no se ha realizado ningún análisis
cladístico, o cuando los resultados de cada análisis son indecisos, uno podía
delimitar los taxa lo mejor que se pueda sobre las bases de una combinación de
probables sinapomorfias y discernir sobre vacíos de información fenética.
De igual forma es considerado que las clasificaciones formales se elaboran
para varios propósitos, lo cuales incluyen: comunicación almacenamiento de datos,
predictividad y su función en teorías. El último criterio mencionado es posiblemente el
92
menos conocido como una propiedad deseable de una clasificación. No obstante, el
papel que las clasificaciones tienen en teorías es el propósito más importante
(Mishier y De Luna 1997).
Los taxa filogenéticos son naturales en el sentido de que son entidades
resultantes de (y participantes en) procesos evolutivos. Indudablemente, es posible
que estos procesos y la selección natural puedan moldear organismos que son
similares a pesar de que no estén filogenéticamente relacionados. Aún en estas
situaciones, las similitudes no se presentan en todos los casos, sino sólo algunos
caracteres particulares influidos por la selección funcional. En relación a todos los
caracteres, es mucho más probable que la mayoría de las similitudes se deban a
ancestría común (homología táxica) que a la selección por un ambiente común
(analogía). Esta posición es robusta ya sea para el análisis de datos morfológicos o
moleculares (Mishler y De Luna 1997).
De manera expresa, hasta la fecha no existe algún trabajo reportado sobre la
filogenia del género Pachyphytum. Sin embargo, análisis cladísticos recientes del
ADN del cloroplasto (cpDNA) en la familia Crassulaceae (Ham 1994; Ham y t’Hart
1998), y del gen matK (Mort et al., 2001), incluyen la representación de Pachyphytum
dentro de la subfamilia Sedoidea y Crassuloideae; la primera con siete clados, dentro
del cual el clado Acre incluye los más variables y confusos taxa, esto en base a datos
cromosómicos, incluidos Pachyphytum, Graptopetalum, Echeveria, Lenophyllum y las
especies mexicanas del género Sedum (Mort et al., 2001).
Por lo que las especies recientemente publicadas y otro reporte en prensa
resultan ser las “problemáticas”, difíciles, o necesarias de reexaminar su situación
jerárquica para ubicar dentro de alguna de las secciones conocidas de Pachyphytum,
éstas especies, mencionadas en un principio son; (P. machucae, P. brevifolium y P.
garciae; García et al., 1999; Pérez-Calix et Glass 1999), así como P. rzedowskii
(García et aG, 2002), y P. contrerassi. Por lo que se incluyó en el análisis el estudio
de las 17 especies hasta ahora conocidas del género. Se considera que las
93
decisiones de rango son necesarias en vista de que los taxónomos se han
restringido legislativamente al uso de la jerarquía Linneana. Este es entonces un
elemento de arbitrariedad inherente en el sistema formal de nomenclatura de Linneo,
ya que por un lado los organismos (unidades fisiológicas) son reales tal como son los
linajes (unidades filogenéticos) y los demes (unidades reproductivas). Por el otro,
nuestros sistemas de clasificación son obviamente una construcción humana, con
categorías arbitrarias propuestas para servir a ciertos propósitos de nuestro interés
(Mishler y De Luna 1997).
De manera similar se considera que la asignación de una categoría
taxonómica “apropiada” es arbitraria porque depende de decisiones sobre el grado
de conocimiento de los caracteres, de la ecología y distribución de los organismos,
de la tradición en el grupo taxonómico, la facilidad de identificación de las especies y
la estabilidad de la clasificación (Mishler y De Luna 1997). De hecho esto es lo que
de manera formal se expresa en la clasificación de los grupos de plantas desde el
punto de vista Linneano. Por lo que los elementos de análisis moleculares del ADN
nos permiten hasta ahora diferentes puntos de vista sobre una clasificación,
facilitando la identificación y la separación entre especies relacionadas o entre
individuos de la misma especie.
5.4 Implicaciones taxonómicas
Si se toma en cuenta lo planteado por Stevens (1984, 1986), referente a que
los caracteres morfológicos de manera tradicional han servido como la única base
para la mayoría de los estudios taxonómicos. Esto es lo que inicialmente planteó el
problema de cuatro especies del género Pachyphytum que no coincidían con la
clasificación tradicional a nivel sección o subgénero (P. machucae, P. garciae, P.
brevifolium; y P. rzedoswkii (García, et al., 1999; Pérez-Calix et Glass, 1999; García
et al., 2002). Posteriormente se incluyó en situación similar una especie cuyo reporte
técnico se encuentra en prensa (P. contrerassi). Por lo que se asumió como lo
menciona (González 1997) la búsqueda de nuevos tipos de datos que auxiliaran a
94
resolver este tipo de problemas taxonómicos. De esta forma, los resultados de los
análisis de agrupamiento genético, a partir de marcadores moleculares tipo AFLP
conforman dos agrupaciones muy diferentes a las tres agrupaciones conocidas con
el diseño habitual de clasificación.
Respecto con lo anteriormente señalado, se coincide con lo planteado por
Soltis y Soltis (2000a), en que los resultados de los análisis filogenéticos dirigidos en
todos los niveles taxonómicos de los principales grupos de plantas, han propuesto
los cambios más dramáticos en la clasificación y sus relaciones durante los últimos
100-200 años. La relevancia en examinar estos cambios, con recientes análisis
filogenéticos se ejemplifica bien en las angiospermas, donde se considera más
apropiado no usar esquemas tradicionales de clasificación para inferir altos niveles
de relaciones (Soltis y Soltis 2000a). Sin embargo, Moore (1998), considera que el
método filogenético podría incrementar temporalmente el registro global de nombres,
pero podría hacer más costoso el acceso a la taxonomía así como a la estabilidad y
delimitación de un taxon dado.
Los agrupamientos conformados en el dendrograma final obtenido
(Nei/compact), permiten considerar el hecho de que es necesario un rearreglo
sistemático a nivel dé sección, en virtud de que la clasificación taxonómica clásica,
basada en características morfológicas y anatómicas externas, considera en la
actualidad tres secciones o subgéneros (Pachyphytum, Diotostemon e
Ixiocaulon), dentro de las cuales las especies se encuentran ubicadas (sensu lato)
(Moran 1968a).
Los análisis del ADN por medio de la técnica AFLP permiten separar a la
totalidad de las especies agrupándolas por parecidos genéticos que no coinciden con
las de la clasificación clásica ó linneana, permitiendo plantear la respectiva hipótesis
sobre su relación y posible origen entre éstas.
95
En virtud de lo anterior, se acepta el planteamiento de la hipótesis inicial; ya
que “la clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a nivel de
sección, se modifica si se agrupan en relación a su polimorfismo genético”.
Es válido el hecho de plantear un arreglo sistemático a nivel de sección o de
subgéneros, apoyados en el uso de marcadores moleculares, con la posibilidad de
complementar la sistemática basada en la morfología, como lo han considerado
algunos autores (Chase et aG, 1995; Uhl et al., 1995; Kress 1995). Las hipótesis de
las relaciones ya sea basadas en datos moleculares (incluyendo secuencia de datos
del DNA, cambios estructurales y pérdida de genes/intron), morfológicos y otros
caracteres que no incluyen el DNA o una combinación de caracteres, brindan la
estructura más significativa de comparaciones evolutivas (Soltis y Soltis 2000b).
Se considera que el análisis por agrupamiento con el coeficiente de Nei y Li, y
el método de la distancia máxima (vecino lejano ó compact), resultaron herramientas
apropiadas para el esclarecimiento de especies difíciles de ubicar en alguna sección,
a nivel interespecífico, tal como se observó en este estudio, cuyos niveles de
similitud mostrados en el dendrograma permiten considerar dos principales
agrupaciones del género Pachyphytum por arriba del 50% de similaridad. Los
dendrogramas que no fueron tomados en cuenta, fue en virtud de que no reflejaron
aspectos reales de agrupación, se eligió al que brindó aspectos más claros de
relación entre las especies.
Los niveles de confianza el reemuestreo “bootstrap” (3000 repeticiones) variaron
con porcentajes del 8 al 100%. Los valores menores implican agrupamientos
débiles, en virtud de la falta de consistencia en dicha unión, pudiendo este
agrupamiento ser producto del azar. En contraste valores altos por arriba del 80,
hasta el 100%, representan mayor afinidad entre especies, con la seguridad de que
dicho nodo realmente existe en el verdadero dendrograma. Sin embargo en ninguno
de estos casos afectó la formación de las dos principales agrupaciones.
96
En virtud del nivel de similaridad y de confianza (100%) observada en el
agrupamiento entre las especies Pachyphytum kimnachi y P. fittkaui, indica que
ambos están estrechamente .relacionados, siendo factible de que se trate de un solo
taxon, considerándose que los fragmentos comigrantes sean homólogos. Esto con
base en el mayor valor de confianza de su unión y un alto nivel de similaridad.
Asimismo, se puede considerar el hecho de que existen variaciones morfológicas
entre éstos taxa, con pocas diferencias significativas a nivel de genoma; además, sus
poblaciones naturales se encuentran bajo condiciones ecológicas similares y de
cercanía geográfica. En ningún otro caso se presenta un valor tan alto de nivel de
confianza, inclusive la recién. descrita P. rzedowskü, así como P. contrerassi, las
cuales pudieran ser consideradas afines o variante de algún taxon previo.
Con base en el análisis de agrupamiento “Nei” con el método “compact” y
haciendo referencia a las localidades citada para cada especie, se elabora un
esquema de asociaciones genético-geográfico entre las especies del género
Pachyphytum. Los grupos logrados se entrelazan a manera de “herradura” por su
interior. Dicha distribución coincide con uno de los centros regionales de
endemismos de México (Hidalgo-Querétaro), como lo menciona Thiede (1995) (fig.
16).
En los gráficos obtenidos de las agrupaciones conformadas mediante el
análisis de disimilaridad genética entre las especies, destaca la forma aislada en que
se comporta Pachyphytum glutinicaule, unida por la parte superior al resto de las
especies del primer grupo (grupo A), por lo que podría considerarse el taxon mas
primitivo ó basal de este, ó de ambos grupos, o la especie principal que participó en
el proceso de variación genética de los demás taxa; ya que como lo considera Lewin
(1999), esta (la variación genética), constituye la materia prima de la evolución
confiriendo ventajas adaptativas en los individuos que las poseen.
Esto coincide con las relaciones geográficas conocidas de las especies, ya
que se reporta a P. glutinicaule de la zona limítrofe entre los estados de Querétaro e
97
Hidalgo; el resto de las especies son de los alrededores y entorno de estados
circunvecinos. Por otro lado, aquellas “especies problema” mismas que no fue
posible su ubicación taxonómica por medio de características morfológicas a nivel de
sección (P. machucae, P. garciae, P. brevifolium y P. rzedowskii), así como P.
contrerassi actualmente “en prensa”; todas, excepto P. brevifolium, se encuentran en
el grupo B. Pachyphytum brevifolium forma parte del grupo A, conformado por seis
especies.
98
Figura 16. Relaciones geográficas y afinidades genéticasde las especies
del género Pachyphytum. Primer. grupo especies 1-6, segundo grupo
especies 7-17.
1. Pachyphytum glutinicaule 2. P. longifolium 3. P. bracteosum 4. P. brevifolium 5. P. oviferum 6. P: hookeri 7. P. machucae. 8. P. garciae 9. P: viride 10. P. werdermannii 11. P: coeruleum 12 P caesium 13. P. rzedowskil 14. P contrerassi 15. P compactum 16. P kimnachi 17. P. fittkaui
99
Similarmente, en estas agrupaciones se separa Pachyphytum glutinicaule del resto
de especies del grupo A; coincidiendo en parte con lo planteado por Moran (1968ª),
en la sistemática clásica del grupo, que por sus características morfológicas forma
parte de la sección Ixiocaulon junto a P. fittkaui. Asimismo, la agrupación de P.
oviferum, P. longifolium y P. bracteosum ; coincide parcialmente con el agrupamiento
que tradicionalmente conforma la sección Pachyphytum, sin embargo dicha sección
no incluye a P. brevifolium, ni a P. hookeri, (esta última de la sección Diotostemon);
como lo establece la agrupación a partir de los AFLP.
El grupo B se considera de novedad, ya que dicha agrupación incluye
también especies de las tres secciones clásicas; (Pachyphytum, Diotostemon e
Ixicocaulon). Asimismo contiene especies que se consideraron problemáticas de
ubicar taxonómicamente (P. machucae, P. garciae, P. rzedowskii, P. contrerassi).
Además se considera que las especies P. kimnachi y P. fittkaui, de esta agrupación,
comparten la mayor de las similaridades observadas con el mayor valor de confianza
(100%), del género, lo que supone un posible origen común, o admitir el hecho de
que se trate de un solo taxon, coincidiendo en que sus poblaciones se encuentran
muy estrechas geográficamente.
Actualmente es difícil realizar una comparación de los resultados observados
con la técnica (AFLP), con el método de agrupamiento (Nei), ni con el género
Pachyphytum; ya que a la fecha no. se conocen reportes de trabajos previos al
respecto con este modelo, por lo que se puede considerar útil esta primera prueba
realizada. Sin embargo existen trabajos como el de Koopman et al., (2001), quienes
concluyen que dicha técnica molecular es adecuada para el estudio de las relaciones
entre especies cercanas.
Con el avance en el conocimiento de nuevas técnicas que permitan
acercarnos al genotipo de las especies, es muy probable que existan arreglos en
taxa considerados problemáticos de ubicación taxonómica, se estima este ensayo
una primera aproximación al grupo a nivel entre especies. Por lo que se considera
necesario realizar otras pruebas con marcadores genéticos diferentes, como el ADN
100
del cloroplasto (cpADN), secuenciación, RAPD’s, RFLP, etc., que permitan
comparaciones o complementar los resultados presentados. Así como el manejo de
la información por medio del uso de programas estadísticos ex profeso como el
PAUP, PHYLYP, Parsimony Analysis Software, HICLAS, entre otros (Backeljau et al.,
1996).
5.5 Las clasificaciones y la sistemática actual
Las dos principales actividades de la sistemática vegetal son la clasificación e
identificación (Judd et al., 1999). Ellos mismos añaden que, la primera consiste en la
ubicación de una entidad dentro de un esquema de relaciones lógico y organizado.
Dentro de los organismos este esquema es usualmente jerárquico, que consiste de
grandes grupos incluyentes: el reino vegetal (la totalidad de las plantas verdes), y
grupos menos incluyentes gradualmente en conjuntos de redes como familias,
géneros y especies (Judd et al., 1999). Por lo que fundamentalmente la sistemática
vegetal se basa en caracteres morfológicos como rasgo distintivo entre los
organismos usando las jerarquías linneanas (Stevens 2002). De este modo la
clasificación siempre se ha enfocado en la agrupación y descripción de organismos,
y hasta recientemente se ha interesado con las relaciones filogenéticas (Judd et al.,
1999).
Con el trabajo de Darwin sobre el. origen de las especies en 1859, se ha
estimulado la incorporación de las relaciones generales evolutivas dentro de la
clasificación, un proceso actual que todavía no ha sido totalmente realizado (De
Queiroz y Gauthier 1992). Los sistematas filogenéticos enfocan su atención sobre el
resultado del proceso de descendencia con modificación y separación de linajes, y su
principal propósito es descubrir los productos de este proceso y la crónica de eventos
evolutivos que han resultado con la diversidad presente (De Queiroz y Gauthier
1992).
101
La sistemática tradicional o evolutiva organiza a las especies por su grado de
parentesco dentro del árbol filogenético, agrupa a especies que comparten
caracteres derivados de un antecesor común pero que no necesariamente incluye a
todos los descendientes, así resulta que los árboles filogenéticos tradicionales
incluyen una serie de ramas que se suceden en el tiempo y que tienen la misma
categoría taxonómica (Pough et al., 1996).
Acorde con Mishler (2000), se prevén futuras trayectorias en aspectos de
clasificación, particularmente la necesidad sobre las jerarquías libres en taxonomía.
Aquí cabe mencionar las iniciativas al respecto con trabajos como los de Cantino y
de Queiroz (2000), Stevens (2002), Brummitt (2002) y de Berry (2002); entre otros;
los primeros proponen el nuevo Código Filogenético (Phylocode), el cual vendría a
sustituir al tradicional Código Internacional de Nomenclatura Botánica. Hasta ahora
esta propuesta se fundamenta en la necesidad de que las nuevas clasificaciones se
basen en caracteres puramente evolutivos sugiriéndolo como práctico y de mejor
manejo de la información. Se considera que requiere de tiempo para su total
aceptación, por parte de la comunidad científica.
En base a lo anteriormente expuesto se considera que con el conocimiento de
la filogenia de las especies se tendrá una clasificación más precisa que brinde una
ubicación más clara de los organismos dentro del grupo al que corresponde. Si nos
referimos al caso del estudio del género Pachyphytum, como se ha manifestado en
este trabajo, sin duda repercutirá en que las secciones conocidas por la clasificación
clásica basada en caracteres morfológicos serán solo parte de la historia del grupo.
Sin duda, al realizar algun otro análisis similar basado en el estudio del ADN
de las especies de Pachyphytum, se proporcionarán los elementos que permitan
corroborar y /o aseverar la separación o la conformación de tan solo dos grupos,
como se ha demostrado con los presentes hechos, grupo A y grupo B;
desconociendo por la falta de elementos de coincidencias las tres secciones
reconocidas por Moran (1968a). Para esto sin duda tendrán que realizarse mayor
102
número de análisis al respecto a nivel de diversidad genética entre las poblaciones
que componen el grupo, con un mayor número representativo de muestras.
Ya que como lo aborda Crawford (2000), la sistemática macromolecular
durante los pasados 50 años, ha estado representado por diferentes fases desde los
compuestos secundarios hasta las proteínas. La secuenciación de aminoácidos de
proteínas de los 60’s y 70’s presentaron un impacto en la filogenia, la electroforésis
de enzimas brindó datos a nivel de población y niveles taxonómicos bajos, con lo
cual se estimuló la discusión sobre la especiación. El empleo del ADN
intensivamente en la generación de filogenias se incrementó al brindar datos
moleculares en rangos de grupos de especies y géneros (Crawford 2000).
Por lo que la incorporación de datos moleculares ha tenido un efecto
estimulante positivo en la sistemática vegetal durante las pasadas cinco décadas,
además los resultados de los estudios moleculares son de gran valor cuando estos
son parte de investigaciones que en un sentido amplio incluya técnicas tradicionales
como estudios en campo y de cromosomas (Crawford 2000).
5.6 Importancia y status del género Pachyphytum
La familia Crassulaceae comprende un gran número de especies de gran valor
en la horticultura como plantas de ornato, la mayoría de las cuales pueden ser
fácilmente propagadas y producidas comercialmente (Heywood 1978; ’t Hart 1997),
sobre todo en Europa y Norteamérica, ya que se presentan como hierbas o arbustos
sobretodo perennes, de variadas formas de desarrollo, con hojas crasas de diversas
formas y tamaños, dispuesta en roseta, o en espiral con atractivas flores de varios
tamaños y colores, además de tolerar largos períodos de sequía. En nuestro país es
explotada a baja escala como planta de ornato. Cházaro y Huerta (1995), reportan
que especies exóticas de los géneros Crassula, Aeonium, Graptopetalum, Echeveria,
103
Sedum y Kalanchoe, son cultivadas en Jalisco como plantas de ornato, y consideran
a Echeveria colorata como la más cultivada por este carácter.
Sin embargo si se considera lo anotado por Jacobsen (1978), Walther (1972),
Fitz y Anderson, (1997), con respecto a la riqueza florística que esta familia
representa en México (350 taxa), se tendrían enormes posibilidades de explotar este
recurso mediante el cultivo formal en invernaderos, tanto de especies o de los
numerosos híbridos que se pueden obtener a partir de los géneros conocidos como
lo reporta Uhl (1992) y Thiede (1995). El mismo Uhl (1992), considera que es factible
que puedan hibridarse intergenéricamente - en virtud de que los taxa son
relativamente jóvenes y muestran poca divergencia evolutiva; a este respecto, Ham
(1994), reconoce que todas las crasuláceas mexicanas pertenecen a una misma
línea evolutiva.
En particular, respecto al género Pachyphytum, las posibilidades de
considerarla como planta de ornato son bajas, ya que del total de especies
reportadas (14) por y Fitz y Anderson (1997), al parecer la principal especie que es
objeto de cultivo masivo es, P. oviferum, siendo esto justificable en virtud de que
presenta hojas gruesas y carnosas con una inflorescencia atractiva, además por ser
de fácil propagación vegetativa.
Considerando las 17 especies de Pachyphytum que se reportan en este
trabajo, las posibilidades de explotarlas en la horticultura mediante los diferentes
híbridos obtenidos serian mayores; ya que se pueden hibridar con Echeveria,
Villadia, Lenophyllum, Thompsonella y Tacitus como lo reportan (Walther 1934;
1996, 1997, 1999). Por otro lado, Jacobsen (1978), se manifiesta contrario a los
híbridos, ya que el atribuye que esto contribuirá a mayores errores o equivocaciones
haciendo más confusa su identificación.
104
El hábitat en que se desarrollan las crasuláceas principalmente son lugares
rocosos, la alteración o destrucción es debido a la reforestación en lugares
montañosos que localmente pueden reducir su área, esto podría ser de poca
consecuencias; sin embargo es más serio el desarrollo de turismo en masa en
ambientes alpinos afectando poblaciones endémicas estrechas (‘t Hart 1997). Se
considera que la sobrecolecta es otro factor que no se reporta en documentación
escrita, sin embargo es común observar en los mercados, tianguis y viveros
numerosas especies de plantas de las Crassulaceae, que conjuntamente con varios
taxa de las Cactaceae, son extraídas ilegalmente de su hábitat natural y
comercializadas como si fueran producto de explotación en vivero o de invernadero,
algunas de éstas son enviadas al extranjero desde donde se promueve la venta de
plántulas y semillas a través del internet.
Sánchez-Mejorada (1982), anota este problema en el caso de las Cactáceas,
y según él las dos principales causas que amenazan a este grupo de plantas y que
menguan continuamente sus poblaciones son: la destrucción del medio ecológico en
que habitan y la recolección excesiva de ejemplares con fines comerciales. A pesar
de lo anterior no existe alguna restricción para ello, ya que la Norma Oficial
Mexicana, ni en el anexo 11 de suculentas mexicanas amenazadas de la IUCN
(Olfield 1997) reportan alguna especie de Pachyphytum en los apéndices
correspondientes; por lo que se considera proponer en los foros respectivos que
ciertas especies de este género presentan poblaciones muy reducidas y que su
hábitat se esta perdiendo mediante diversas causas como las anteriormente
presentadas, y que en virtud de esto sería conveniente ubicarlas en alguno de los
apéndices de esta Norma.
El género Pachyphytum es endémico de México (Jacobsen 1978), desde
Tamaulipas hasta el oriente de Michoacán y del norte de Hidalgo hasta Jalisco y
Aguascalientes, desarrollándose un mayor número de especies en la región centro
de Querétaro, Guanajuato y San Luis Potosí; sin embargo se considera poco
conocido, en virtud de que se desarrolla de manera natural en rocosidades poco
105
accesibles y hasta recientemente con una mayor exploración botánica se ha
incrementado el número de especies conocidas, creyéndose factible el hallazgo de
algunas otras en los espacios intermedios de la distribución geográfica hasta ahora
conocida.
Hasta ahora no se conocen reportes en sistemática molecular, filogenia,
biodiversidad y conservación genética referente, o exclusiva de Pachyphytum. Van
Ham (1994, 1995), reporta haber incluido P. compactum de el Cerro el Mexicano de
Querétaro en el análisis sobre las relaciones filogenéticas de las Crassulaceae a
partir del ADN del cloroplasto (cpDNA), al respecto comenta que este género
pertenece al clado 7 (Acre), junto con Echeveria y Villadia; así como con especies de
Sedum de diversas partes del planeta. Además concluye que con esta información
generada puede considerarse que es muy poco conocido sobre de la evolución de la
familia Crassulaceae; y que Pachyphytum junto a otros, representa recientes
radiaciones evolutivas de antiguos progenitores parecidos a Sedum. Posteriormente
Ham y Hart (1998); Mort et al (2001), incluyen a Pachyphytum compactum y P.
kimnachi en el análisis sobre las relaciones filogenéticas de las crasuláceas a partir
del cpDNA y del gen del cloroplasto matK respectivamente, con similares resultados
a los reportados por Ham en 1994.
Perspectivas
Acorde a lo reportado por Ham (1994); Ham y Hart (1998), así como Mort y
colaboradores (2001), el clado a que pertenece el género Pachyphtum comprende un
tercio de la diversidad taxonómica dentro de las Crassulaceae, y que acorde con la
hipótesis de Ham y Hart (1998) es necesario mucho más trabajo filogenético para
resolver los límites entre géneros y sus relaciones dentro de este enorme clado. Se
considera .fue dentro de este clado se encuentran los taxa mas variables y confusos
en base a datos cromosómicos e incluyen a los géneros Pachyphytum,
Graptopetalum, Echeveria, Lenophyllum y a las especies mexicanas del género
Sedum (Mort et al., 2001). Así mismo como lo anota Stebbins (1999) debería
conocerse el desarrollo del principal objetivo de una . investigación referente a la
106
evolución vegetal, y que ésta incluya la combinación de aspectos morfológicos,
fisiológicos e histológicos, con una cuidadosa observación de las poblaciones
naturales, así como de las poblaciones artificiales que se establecen en jardines,
invernaderos y viveros; el costo económico que representa se verá justificado en
virtud de que constituye un gasto que será recompensado en el futuro por lo efectos
de daños evitados al ambiente.
Por otro lado Hillis y Holder (2000), consideran que aunque la biología
comparativa tiene inmensos beneficios del desarrollo de la tecnología computarizada,
hay muchas técnicas y algoritmos en la ciencia de la computación que no han sido
ampliamente aplicadas a la filogenética. Esto implica que una vez que se han
realizado los aspectos prácticos de la investigación y logrado las tablas de
contingencias respectivas; será necesario usar al límite los algoritmos y programas
conocidos para obtener el máximo provecho de los resultados de la investigación
realizada.
107
VI CONCLUSIONES
Las dos agrupaciones observadas en las relaciones interespecíficas de las
especies del género Pachyphytum por medio del análisis de ADN con marcadores
genéticos tipo AFLP, no se correlacionan con las agrupaciones conformadas a través
de la sistemática clásica basada en características morfológicas y anatómicas
externas, por lo que la situación de la clasificación taxonómica de las secciones
Pachyphytum, Diotostemon e Ixiocaulon varía.
La técnica AFLP permitió detectar un alto nivel promedio (81.2%) de
polimorfismos en las especies de Pachyphytum analizadas, por lo que se considera
dicha técnica como una importante herramienta para precisar “especies problema” de
ubicación taxonómica en especies relacionadas.
108
VII LITERATURA CITADA
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