1 UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE TERAPÉUTICA MÉDICO-QUIRÚRGICA. ÁREA DE FARMACOLOGÍA TESIS DOCTORAL REEVALUACIÓN DE FACTORES GENÉTICOS QUE CONDICIONAN LA ACETILACIÓN DE FÁRMACOS Y XENOBIÓTICOS. Jhon Didier Ruiz Buitrago Badajoz, 2011
163
Embed
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA FACULTAD DE MEDICINA ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE TERAPÉUTICA MÉDICO-QUIRÚRGICA.
ÁREA DE FARMACOLOGÍA
TESIS DOCTORAL
REEVALUACIÓN DE FACTORES GENÉTICOS QUE CONDICIONAN
LA ACETILACIÓN DE FÁRMACOS Y XENOBIÓTICOS.
Jhon Didier Ruiz Buitrago
Badajoz, 2011
2
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE TERAPÉUTICA MÉDICO-QUIRÚRGICA.
ÁREA DE FARMACOLOGÍA
REEVALUACIÓN DE FACTORES GENÉTICOS QUE CONDICIONAN
LA ACETILACIÓN DE FÁRMACOS Y XENOBIÓTICOS.
Memoria presentada por
Jhon Didier Ruiz Buitrago
Para optar al grado de Doctor
3
D. JOSÉ AUGUSTO GARCÍA-AGÚNDEZ PÉREZ-COCA, Catedrático de Farmacología del
Departamento de Terapéutica Médico-Quirúrgica de la Universidad de Extremadura, Da
CARMEN MARTÍNEZ OLIVA, Profesora Titular de Farmacología del Departamento de
Terapéutica Médico-Quirúrgica de la Universidad de Extremadura y Da MARÍA ELENA
GARCÍA MARTÍN, Profesora Titular de Bioquímica y Biología Molecular del Departamento
de Bioquímica, Biología Molecular y Genética de la Universidad de Extremadura,
CERTIFICAN:
Que D. JHON DIDIER RUIZ BUITRAGO Licenciado en Medicina Veterinaria, ha
realizado bajo su dirección el presente trabajo titulado “REEVALUACIÓN DE FACTORES
GENÉTICOS QUE CONDICIONAN LA ACETILACIÓN DE FÁRMACOS Y
XENOBIÓTICOS”
Como directores hacemos constar que este ha sido realizado con todas las garantías
ténicas y metodológicas, y que las conclusiones obtenidas son plenamente válidas, además
consideramos que reúne las condiciones necesarias para ser presentado como Tesis
Doctoral.
Para que conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Badajoz,
a 22 de noviembre de 2011.
Fdo. Dr. José A.García-Agúndez. Fdo. Dra. María Elena García Martín.
Fdo. Dra. Carmen Martínez Oliva.
4
AGRADECIMIENTOS:
A mis amigas y compañeras permanentes de laboratorio Gara, Mercedes y Julia, quienes
me hicieron sentir como en casa.
A mis compañeros de estudio Blanca, Mariola, Silvia, Juan Gonzalo, Pedro y Segismundo,
con quienes compartí penas, sueños y alegrías.
A mis profesores José A. García Agundez, Elena García, Carmen Martinez, por su
orientación en este duro camino de la academia.
A los profesores Guillermo Gervasiny y Juan Antonio Carrillo, que con su amistad hicieron
que esta empresa fuera más llevadera.
A todos gracias pues en ellos encontré más que valores académicos, valores humanos que
hacen que esta lucha haya sido digna de realizar.
5
DEDICATORIA
A mi esposa Margarita, que me ha apoyado y me ha dado aliento cuando queria
desfallecer.
A mis hijos Felipe y David de quienes tome parte del tiempo que les debí dedicar y que
espero algún día poder compensar.
6
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 15
1.1 METABOLISMO ACETILADOR 16 1.1.1 ENZIMAS INVOLUCRADAS EN EL METABOLISMO ACETILADOR DE
FÁRMACOS 17
1.1.2 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS NAT 17 1.1.3 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LAS ARILAMINA N-ACETILTRANSFERASAS 23 1.1.4 ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO 26 1.2 VARIACIONES INTERINDIVIDUALES EN EL METABOLISMO ACETILADOR 28 1.3 GENES IMPLICADOS EN LA ACETILACIÓN DE FARMACOS Y
XENOBIÓTICOS 29
1.4 POLIMORFISMOS EN LOS GENES NAT 35 1.4.1 NAT1 35 1.4.2 NAT2 41 1.5 POLIMORFISMO ACETILADOR Y RIESGO DE CÁNCER 48 1.5.1 CÁNCER DE CABEZA Y CUELLO 51 1.5.2 CÁNCER DE MAMA 51 1.5.3 CÁNCER DE PULMÓN 52 1.5.4 CÁNCER COLORRECTAL 53 1.5.5 CÁNCER DE VEJIGA 54 1.6 RELACIÓN ENTRE FENOTIPO ACETILADOR Y GENOTIPO ACETILADOR
55
2 OBJETIVOS
60
3 MATERIALES Y MÉTODOS 62 3.1 PARTICIPANTES 63 3.2 MATERIALES 63 3.3 REACTIVOS 63 3.4 EQUIPOS 65 3.5 TÉCNICAS ANALÍTICAS 66 3.5.1 Determinación del fenotipo acetilador. 66 3.5.2 Extracción ADN genómico 67 3.5.3 Reacción en cadena de polimerasa a tiempo real (PCR-TR) para genotipación 68 3.5.4 Determinación de la variación en el número de copias (Copy Number Variation:
CNV) de los genes NAT. 74
3.5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
78
4 RESULTADOS. 81 4.1 ANÁLISIS DEL FENOTIPO ACETILADOR DETERMINADO POR LA
RELACIÓN DE METABOLITOS DE CAFEÍNA Log AFMU/1X EN ORINA 82
4.2 DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO ACETILADOR 85 4.2.1 Genotipo NAT2 85 4.2.2 Genotipo NAT1. 102 4.3 Integración de los genotipos NAT1 y NAT2 sobre el metabolismo acetilador 113 4.4 Genotipo Xantina oxidasa (Xantina deshidrogenasa). 118 4.4.1 Efecto de los diplotipos XO, y su combinación con el diplotipo NAT2, sobre el
metabolismo de cafeína in vivo.
121
5 DISCUSIÓN
124
6 CONCLUSIONES.
131
7 BIBLIOGRAFÍA 133
7
ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxirribonucleico
AFMU 5-acetilamino-6-formilamino-3-metiluracilo
ANL: Anilina
ANS: 4-metoxianilina
APY: Aminopiridina
BOA: 4-butoxianilina
BRA: 4-bromoanilina
5AS: ácido 5-aminosalicíco
CBZ: 4-clorobenozóico hidrazida
CLA: 4-cloroanilina
CNV: Variación en el número de copias de un gen (Copy Number Variation)
CoA: Coenzima A
CT: Ciclo umbral (Cycle Threshold)
4AV: 4-aminoveratrol
4AS: ácido 4-aminosalicílico
CYP: Citocromo P450 (Cytochrome P450)
dNTP: Desoxirribonucleótido trifosfato
2AF: 2-aminofluorano
24DCA: 2,4-dicloroanilina
EDTA: Etilendiaminotetracético
EOA: 4-etoxianilina
HDZ: Hidralazina
HOA: 4-hexiloxianilina
8
HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución (High Pressure Liquid
Chromatography)
IC: Intervalo de confianza
INH: Isoniazida
IOA: 4-iodoanilina
Kb: Kilobases
MGB: Unidor a la ranura menor (Minor Groove Binder)
NAT: N-acetiltransferasa
NFQ: Inhibidor de fluorescencia (No Fluorecent Quencer)
ORF: Marco de lectura abierto (Open Reading Frame)
pABGlu: 4-aminobenzoil-l-glutamato
PABA: Ácido 4-aminobenzóico
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase chain reaction)
PHZ: Fenilhidrazina
POA: 4-fenoxianilina
PRO: Procainamida
RNAm: Ácido ribonucléico mensajero
SD: Desviación estándar o desviación típica
SE: Error estándar o error típico
SMZ: Sulfametazina
SNP: Polimorfismo de único nucleótido (Single Nucleotide Polymorphism)
TE: Tris-EDTA
TR: Tiempo real
34DCA: 3,4-dicloroanilina
UV: Ultravioleta
UTR: Región no traducida (Unstranslated region)
9
17U: 1,7-dimetilúrico ácido
1X: 1,7-dimetilxanthina
v/v: volumen/volumen
WT: Wild type (tipo silvestre)
XDH: Xantina deshidrogenasa
XO: Xantina oxidasa
10
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas NAT1 y NAT2
18
Tabla 2. Secuencia comparativa de nucleótidos en la región codificadora de los genes NAT1 y NAT2.
34
Tabla 3. Alelos NAT1 en humanos (Haplotipos).
36
Tabla 4. Frecuencias de haplotipos NAT1 en diferentes poblaciones humanas.
41
Tabla 5. Alelos NAT2 en humanos (Haplotipos).
42
Tabla 6. Frecuencias de haplotipos NAT2 en diferentes poblaciones humanas.
48
Tabla 7. Frecuencias de SNPs no sinónimos del gen de xantina oxidasa en caucásicos
58
Tabla 8. Sondas Taqman utilizadas en la genotipación de NAT2
70
Tabla 9. Sondas Taqman utilizadas en la genotipación de NAT1
70
Tabla 10. Sondas Taqman para la genotipación de XO
71
Tabla 11. Frecuencia de SNPs del gen NAT2 en la población de estudio
85
Tabla 12. Frecuencias genotípicas de los SNPs en la región codificadora del gen NAT2 en la población de estudio
86
Tabla 13. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs1801280 (114 Ile/Thr) del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X).
87
Tabla 14. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs1799930 (197 Arg/Gln) del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X)
89
Tabla 15. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para el SNP rs1799931 (286 Gly/Glu) del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X)
90
Tabla 16. Frecuencia de haplotipos y su denominación (nomenclatura) para el gen NAT2
92
Tabla 17. Frecuencias de los diplotipos NAT2 y su distribución según el fenotipo acetilado
94
Tabla 18. Estadística descriptiva del log AFMU/1X según los diplotipos NAT2.
96
11
Tabla 19. Comparación T-test entre los diplotipos del gen NAT2 según los valores de log AFMU/1X en orina.
97
Tabla 20. Frecuencias de CNV del gen NAT2 según el genotipo
100
Tabla 21. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X según el número de copias del gen (CNV) en grupos con distintos genotipos NAT2.
101
Tabla 22. Frecuencia de SNP del gen NAT1 en la población de estudio.
102
Tabla 23. Frecuencias genotípicas de los SNPs en la región codificadora del gen NAT1 en la población de estudio.
103
Tabla 24. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs4986782 (187 Arg/Gln) del gen NAT1 según la relación con el Log AFMU/1X
105
Tabla 25. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs4986783 (Ser/Ala) del gen NAT1 según la relación con el Log AFMU/1X.
106
Tabla 26. Frecuencia de haplotipos del gen NAT1 determinados en la población de estudio.
108
Tabla 27. Frecuencias de los diplotipos NAT1 y su distribución según el fenotipo acetilador.
109
Tabla 28. Promedios ± SD, min, max e I.C. 95% del log AFMU según los diplotipos NAT1
110
Tabla 29. Comparación T-test entre los diplotipos del gen NAT1 según los valores de log AFMU/1X
111
Tabla 30. Frecuencias de CNV del gen NAT1 según el genotipo
112
Tabla 31. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X según el número de copias del gen (CNV) en grupos con distintos genotipos NAT1.
112
Tabla 32. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X para la relación de diplotipos NAT2 y SNPs del gen NAT1.
114
Tabla 33. Frecuencia de SNP del gen XO en la población de estudio
118
Tabla 34 Frecuencias genotípicas de los SNPs del gen XO en la población de estudio.
119
Tabla 35. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs17323225 (Ile/Val) del gen XO según la relación con el Log AFMU/1X
120
Tabla 36. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs17011368 (Ile/Val) del gen XO según la relación con el Log AFMU/1X
120
Tabla 37. Frecuencia de haplotipos para el gen XO (n=912 alelos) 121
12
Tabla 38. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X para la relación de diplotipos NAT2 y algunos SNPs del gen XO.
122
13
INDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura tridimensional de la proteína NAT1 19
Figura 2. Modelo estructural del sitio activo de la proteína NAT1 humana.
20
Figura 3. Estructura de la proteína NAT1 humana.
21
Figura 4. Estructura tridimensional de la proteína NAT2.
22
Figura 5. Disposición de los residuos Cys68, His107, y Asp122 de NAT2 humana
22
Figura 6. Representación NAT1 y NAT2 humanas
23
Figura 7. Esquema de la reacción de acetilación N-acetiltransferasa por la traída catalítica de NAT1.
25
Figura 8. Reacción N,O-transacetilación o AHAT
26
Figura 9. Comparación de la especificidad de sustrato de las enzimas NAT1 y NAT2
27
Figura 10. Esquema del locus NAT en el cromosoma 8 humano
30
Figura 11. Esquema de la regulación de la expresión en los genes NAT1 y NAT2
31
Figura 12. Transcripción del gen NAT1 humano. Se observan varias variantes de splicing del gen NAT1 que son expresadas desde los diferentes promotores
32
Figura 13. Localización de polimorfismos en el gen NAT1 humano.
36
Figura 14. Localización de polimorfismos en el gen NAT2 humano.
42
Figura 15. Mecanismo propuesto para la asociación entre el cáncer hepático y polimorfismos de enzimas metabolizadoras de fármacos
49
Figura 16. Posibles mecanismos que relacionan las actividades NAT con la carcinogénesis.
50
Figura 17. Mapa del metabolismo de cafeína
56
Figura 18. Representación esquemática del proceso de genotipación por PCR-TR con sondas TaqMan® MGB
69
Figura 19. Amplificación de un blanco (sin ADN).
72
Figura 20. Amplificación de una muestra de ADN genómico. Genotipo silvestre
73
Figura 21. Amplificación de una muestra de ADN genómico.Genotipo mutado
73
14
Figura 22. Amplificación de una muestra de ADN genómico. Genotipo herocigoto
74
Figura 23. Representación esquemática del proceso de determinación del número de copias de un gen por PCR-TR
75
Figura 24. Amplificación de una muestra de ADN genómico por cuadruplicado, para la determinación de CNV.
77
Figura 25. Resultados de un experimento de estudio de CNV
78
Figura 26. Histograma de frecuencias de la relación log AFMU/1X en la población de estudio.
82
Figura 27. Cálculos de densidad de Kernel
83
Figura 28. Distribución de fenotipo acetilador según el sexo
84
Figura 29. Medias e IC del 95% de log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1801280 (114Ile/Thr) del gen NAT2.
87
Figura 30. Medias e IC del 95% de Log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1799930 NAT2 (Modelo codominante).
89
Figura 31. Medias e IC del 95% de Log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1799931 NAT2.
91
Figura 32. Diagrama de dispersión de valores de log AFMU/1X en orina según el diplotipo del gen NAT2.
95
Figura 33. Comparación de los promedios e I.C. 95% del log AFMU/1X entre los diplotipos NAT2 clasificados como rápidos e intermedios.
98
Figura 34. Comparación de los promedios e I.C. 95% del log AFMU/1X entre los diplotipos NAT2 clasificados como lentos.
99
Figura 35. Análisis de desequilibrio de ligamiento SNPs de NAT1.
107
Figura 36. Valores de media e I.C. 95% del log AFMU/1X según las comparaciones de diplotipos NAT2 y su combinación con el SNP rs4986782
116
Figura 37. Valores promedio e I.C. 95% del log AFMU/1X según el diplotipo de NAT2 combinados con los diplotipos NAT1.
117
Figura 38. Valores promedio e I.C. 95% del log AFMU/1X según el diplotipo de NAT2 combinados con los diplotipos XO
123
15
1. INTRODUCCIÓN
16
1.1 METABOLISMO ACETILADOR.
En los últimos años la investigación acerca de las Arilamina N-acetiltransferasas (CoASAc;
NAT, EC 2.3.1.5), ha permitido realizar importantes avances para comprender las bases de
las alteraciones en el metabolismo de fármacos y xenobióticos (Agundez, 2008). El proceso
de acetilación in vivo de estas sustancias fue descrito por primera vez por Jaffe y Cohn en
1887, cuando observaron en la orina de conejos una cantidad inusual de un producto
acetilado después de la administración de furfural (Jaffe and Cohn, 1887). La variabilidad en
el proceso de acetilación en seres humanos se describió inicialmente en el metabolismo de
isoniazida en pacientes tuberculosos (Bonicke and Reif, 1953; Evans et al., 1960a; Evans et
al., 1960b; Hughes et al., 1954). La observación de que la N-acetilación de isoniazida y de
otros fármacos como la sulfametazina se producía con diferentes fenotipos acetiladores
(rápidos, intermedios y lentos), y que la N-acetilación de otras sustancias como el ácido p-
aminosalicílico tenía una distribución aparentemente monomórfica permitió a Jenne, sugerir
la existencia al menos dos N-acetiltransferasas distintas (Jennne, 1965), denominadas
posteriormente NAT1 y NAT2 (Grant et al., 1989).
Más recientemente se demostró que la presencia de polimorfismos comunes en la enzima
N-acetiltransferasa 2 se relacionaban con una disminución de los niveles de proteína en el
hígado (Blum et al., 1991), lo que dio un impulso al desarrollo del conocimiento de las
enzimas N-acetiltransferasas (Agundez, 2008), llevó a la purificación de las NATs
(Bergstrom et al., 1995; Wagner et al., 1996), la clonación (Blum et al., 1989; Ohsako et al.,
1988), y el análisis funcional de los productos de la proteína recombinante (Blum et al.,
1991), permitiendo así un conocimiento más detallado de los mecanismos moleculares de
estas actividades enzimáticas y de cómo las alteraciones en los genes que las codifican
afectan la capacidad metabólica.
17
1.1.1. ENZIMAS IMPLICADAS EN EL METABOLISMO ACETILADOR DE FÁRMACOS.
Las enzimas implicadas en el metabolismo acetilador de fármacos y xenobióticos se
denominan Arilamina N-acetiltransferasas (NAT; EC 2.3.1.5). Se han identificado en
numerosos vertebrados y microorganismos (Upton et al., 2001; Vagena et al., 2008). Puede
encontrarse una base de datos actualizada de NATs no humanas, incluyendo procariotas y
eucariotas, creada por el comité internacional de nomenclatura de arilaminas N-
acetiltransferasas http://www.mbg.duth.gr/non-humannatnomenclature/background.html, donde pueden
consultarse los genes NAT conocidos. Las enzimas NATs han sido reportadas en muchas
especies de mamíferos (Sinclair et al., 2000), y el número de genes NAT, y por ende, de
enzimas, varía entre diferentes especies. Por ejemplo en ratas, se han identificado tres
genes NAT (Walraven et al., 2006), en conejos y hámsters, existen dos genes que codifican
NAT (Blum et al., 1989); lo mismo que en humanos (Upton et al., 2001); mientras que los
gatos domésticos y otros félidos tienen un único gen NAT (Trepanier et al., 1998); y los
perros domésticos y otros cánidos no tienen genes NAT (Trepanier et al., 1997). Información
mucho más detallada de las dos NATs humanas se puede encontrar en el enlace
Las dos enzimas arilamina N-acetiltransferasas humanas, NAT1 y NAT2, tienen un peso
molecular de 33 y 31 KDa, respectivamente (Levy and Weber., 2002) y 290 aminoácidos. La
comparación de las secuencias de las proteínas no mutadas se muestra en la tabla 1.
18
NAT1 1-10 M D I E A Y L E R I NAT2 1-10 F NAT1 11-20 G Y K K S R N K L D NAT2 11-20 M NAT1 21-30 L E T L T D I L Q H NAT2 21-30 E NAT1 31-40 Q I R A V P F E N L NAT2 31-40 NAT1 41-50 N I H C G D A M D L NAT2 41-50 M Q E NAT1 51-60 G L E A I F D Q V V NAT2 51-60 H I NAT1 61-70 R R N R G G W C L Q NAT2 61-70 NAT1 71-80 V N H L L Y W A L T NAT2 71-80 Q NAT1 81-90 T I G F E T T M L G NAT2 81-90 Q
NAT1 91-100 G Y V Y S T P A K K NAT2 91-100 F I P V N NAT1 101-110 Y S T G M I H L L L NAT2 101-110 V NAT1 111-120 Q V T I D G R N Y I NAT2 111-120 NAT1 121-130 V D A G F G R S Y Q NAT2 121-130 S S S NAT1 131-140 M W Q P L E L I S G NAT2 131-140 NAT1 141-150 K D Q P Q V P C V F NAT2 141-150 I NAT1 151-160 R L T E E N G F W Y NAT2 151-160 C R I NAT1 161-170 L D Q I R R E Q Y I NAT2 161-170 NAT1 171-180 P N E E F L H S D L NAT2 171-180 T K N H NAT1 181-190 L E D S K Y R K I Y NAT2 181-190 P K K H Q NAT1 191-200 S F T L K P R T I E NAT2 191-200 L E NAT1 201-210 D F E S M N T Y L Q NAT2 201-210 NAT1 211-220 T S P S S V F T S K NAT2 211-220 T S I T T NAT1 221-230 S F C S L Q T P D G NAT2 221-230 E NAT1 231-240 V H C L V G F T L T NAT2 231-240 Y I NAT1 241-250 H R R F N Y K D N T NAT2 241-250 Y K NAT1 251-260 D L I E F K T L S E NAT2 251-260 V T NAT1 261-270 E E I E K V L K N I NAT2 261-270 V E NAT1 271-280 F N I S L Q R K L V NAT2 271-280 K G N NAT1 281-290 P K H G D R F F T I NAT2 281-290 P G S L
Tabla 1. Comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas NAT1 y NAT2. Adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/34993. En rojo aparecen los aminoácidos en que difiere NAT2 respecto a NAT1.
19
Las proteínas NAT1 y NAT2 tienen una similitud del 81.4% en la secuencia de aminoácidos
(Blum et al., 1990; Rodrigues-Lima et al., 2001). De los 55 aminoácidos en que difieren las
dos proteínas, sólo 28 son no conservativos (Grant, 2008).
El dominio amino terminal (residuos 1-83) de NAT1, está formado por cinco α hélices (1 a 5)
y una lámina β corta entre las α hélices dos y tres. El segundo dominio comprende los
residuos 85 a 192 y consiste en nueve láminas β (2 a11), con dos α hélices cortas (6 y 7).
Estos dos dominios conectan a través de un interdominio de α hélices (hélices de 8 a 10)
con el tercer dominio, el cual tiene cuatro láminas β en sentido antiparalelo (12 a 15) y la
hélice 11. (Wu et al., 2007), como se muestra en la figura 1.
Figura 1. Estructura tridimensional de la proteína NAT1. La estructura secundaria tiene 11
α hélices y 15 láminas β. Tomado de (Wu et al., 2007).
20
Al comparar la secuencia de aminoácidos de las N-acetiltransferasas de muchas especies,
se observa la conservación de cisteínas en las posiciones 44, 68, y 223, y en particular la
secuencia circundante a C68 (C69 en Salmonella) (Watanabe et al., 1992). Todas las
proteínas arilamina N-acetiltransferasa de mamíferos incluyendo la N-acetiltransferasa 1
humana, contienen tres residuos estrictamente conservados (Cys68, His107, y Asp122), que
forman una tríada catalítica que se muestra en la figura 2 (Rodrigues-Lima et al., 2001;
Sinclair et al., 2000; Wu et al., 2007).
Figura 2. Modelo estructural del sitio activo de la proteína NAT1 humana. Se observa la
ubicación espacial de los residuos de la triada catalítica (Cys68, His107, y Asp122), con los
átomos de carbono en gris. Los residuos que interactúan con la acetanilida se muestran con
los átomos de carbono coloreados en verde. Nótese la posición de Phe217 (Wu et al., 2007)
A través de estudios de mutagénesis dirigida se ha establecido que el aminoácido Cys68 es
crítico en el sitio catalítico y participa directamente de la transferencia del grupo acetilo
desde el cofactor acetil-CoA al sustrato aceptor (Dupret and Grant, 1992). Se ha sugerido
21
que el sitio activo de la enzima NAT1 está oculto en un bolsillo de la proteína para excluir el
agua de la proximidad de Cys68, reduciendo la hidrólisis del producto intermedio sulfidril
acetilado (Wang et al., 2004), como se muestra en siguiente figura.
Figura 3. Estructura de la proteína NAT1 humana. Se muestra el bolsillo central donde se
encuentra el aminoácido Cys68. Tomado de Michin RF, y cols. 2007 (Minchin et al., 2007).
Además de la triada catalítica, existe un bucle o asa flexible que formada por los residuos
122 a 131 y que parece ser crítica para determinar la especificidad de sustrato. En particular
el residuo Phe125 que está alineado aproximadamente a 3.4 Å de la triada catalítica, como
se muestra en la figura 2. El gran volumen de la cadena lateral probablemente restringe el
acceso de sustratos grandes al sitio activo de la proteína NAT1 (Rodrigues-Lima et al.,
2001).
La estructura de la proteína NAT2, es similar a la N-acetiltransferasa 1. NAT2 contiene tres
residuos estrictamente conservados (Cys68, His107, y Asp 122) (Rodrigues-Lima et al.,
2001; Sinclair et al., 2000; Wu et al., 2007), como se muestran en las figuras 4 y 5.
22
Figura 4. Estructura tridimensional de la proteína NAT2. La estructura secundaria tiene 11 α
hélices y 15 láminas β. Tomado de (Wu et al., 2007).
Figura 5. Disposición de los residuos Cys68, His107, y Asp122 de NAT2 humana (Wu et al.,
2007).
23
Una diferencia de la proteína NAT2, comparada con la proteína NAT1, es el aminoácido en
la posición 125. Mientras que NAT1 tiene una fenilalanina, NAT2 tiene una serina. Ello le
permite acetilar arilaminas mucho más grandes que las que puede acetilar NAT1, ya que la
cadena lateral de la serina ocupa la mitad del volumen que ocupa la de la fenilalanina
(Rodrigues-Lima et al., 2001), como se puede ver en la figura 6.
Figura 6. Representación de NAT1 y NAT2 humanas, mostradas en ángulos similares. Los
residuos de la posición 125 (Phe125 en NAT1 y Ser125 en NAT2), se muestran en rojo. El
residuo Cys68 se muestra en verde. El bucle comprendido entre los residuos Val93 a Ile106
en NAT1 y Phe93 a Val106 en NAT2 se muestran en azul turquesa. Tomado de (Rodrigues-
Lima and Dupret, 2002).
1.1.3 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LAS ARILAMINA N-ACETILTRANSFERASAS.
Las arilamina N-acetiltransferasas 1 y 2, son enzimas citosólicas de fase II (Liu et al., 2007).
La actividad NAT2 es alta en el hígado (Fretland et al., 2003) y en el intestino (Kashuba et
al., 1998), por lo que esta enzima juega un papel relevante en el metabolismo presistémico
24
de fármacos. Aunque el catabolito del ácido fólico, p-aminobenzoilglutamato es N-acetilado
por NAT1 (Minchin, 1995; Ward et al., 1995), se desconocen sustratos endógenos de las
enzimas NAT1 y NAT2 humanas. La amplia distribución en tejidos de la actividad acetiladora
p-aba en hamsters, ratas, ratones, gatos y humanos, sugieren que NAT1 está implicada en
el metabolismo endógeno además de en el metabolismo de xenobióticos (Butcher et al.,
2000); sin embargo, además del aparente papel en el catabolismo del folato, todavía no se
ha identificado ninguna otra función endógena (Cornish et al., 2003). En el caso de NAT2, se
ha sugerido que es posible que participe en el mantenimiento de la homeostasis del acetil
CoA (Butcher et al., 2000).
Las enzimas arilamina N-acetiltransferasas catalizan las transferencia de un grupo acetilo
desde Ac-CoA a un átomo de nitrógeno o de oxígeno de arilaminas primarias, hidrazinas, y
sus metabolitos N-hidroxilados (Blum et al., 1990; Upton et al., 2001), de acuerdo al
esquema mostrado en la Figura 7.
La reacción de acetilación ocurre en dos pasos: primero el grupo acetilo es transferido
desde AcetilCoenzima A al residuo cisteína (Cys68) de la proteína NAT, formando un
intermediario catalítico acetil-cisteinil-NAT (Andres et al., 1988), y en el segundo paso el
grupo acetil es transferido al nitrógeno amino exocíclico o al oxígeno de sustratos amino
hidroxilados. El primer producto (CoA) es liberado antes de que el segundo reactante
(arilamina) se una; este mecanismo de reacción es clasificado como ping-pong Bi Bi (Wang
et al., 2004).
25
Figura 7. Esquema de la reacción de acetilación N-acetiltransferasa por la traída catalítica
de NAT1. Tomado de (Minchin et al., 2007).
Otra reacción catalizada por NAT es independiente del Acetil-CoA e implica la transferencia
de un grupo acetilo desde el nitrógeno de un ácido arilhidroxámico al oxígeno produciendo
un acetoxiarilamina. Esta reacción es referida como N,O-transacetilación o AHAT por sus
siglas en inglés (arylhydroxamic acid acetyl transfer) y produce una acetil-enzima intermedia.
La transferencia de N a O del grupo acetilo puede ser intramolecular o intermolecular
dependiendo de si el donante y el aceptor es la misma o diferente molécula. (Levy and
Weber., 2002).
26
Figura 8. Reacción N,O-transacetilación o AHAT (Arylhydroxamic acid acetyltransfer
reaction) (Levy and Weber., 2002)
1.1.4 ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO
Aunque las enzimas NAT1 y NAT2 humanas tienen diferencias en su especificidad de
sustrato, también presentan cierto grado de solapamiento (Dupret and Grant, 1992). En la
figura 9 se presenta el porcentaje de actividad específica de las enzimas NAT1 y NAT2
hacia diferentes sustratos.
Como se puede observar en la figura 9, NAT1 tiene mayor especificidad sobre algunos
sustratos como el ácido 4-aminobenzóico (PABA), ácido 4-aminosalicílico (4AS), 4-
metoxianilina (ANS), 2-aminofluorano (2AF) y 4-aminobenzoil-l-glutamato (pABGlu);
mientras que NAT2 tiene mayor especificidad sobre otros sustratos como anilina (ANL), 2,4-
Tabla 2. Secuencia comparativa de nucleótidos en la región codificadora de los genes NAT1
y NAT2. Las secuencias corresponden a los genes no mutados. En rojo aparecen marcados
los nucleótidos en que difiere NAT2 respecto a NAT1.
35
1.4 POLIMORFISMOS EN LOS GENES NAT.
En el primer simposio internacional sobre las arilamina N-acetiltransferasas en 1998, se creó
el comité internacional sobre nomenclatura NAT (Hein et al., 2000b; Ilett et al., 1999), para
actualizar, revisar y publicar una página web que mantenga al día, la nomenclatura NAT.
Esta página se publica desde 1995 (http://louisville.edu/medschool/pharmacology/consensus-
human-arylamine-n-acetyltransferase-gene-nomenclature/)(Hein et al., 2000b; Vatsis et al.,
1995). En el simposio de septiembre de 2010 se amplió el comité internacional y se decidió
reformular las páginas web de NATs. Actualmente estas páginas se encuentran en proceso
de revisión y actualización aunque las antiguas siguen siendo accesibles.
1.4.1 NAT1
Desde el punto de vista funcional, la enzima NAT1 fue inicialmente descrita como
monomórfica, debido a la distribución de frecuencias de su actividad in vivo sobre el ácido p-
aminosalicílico y otros sustratos que se distribuían como una única campana de Gauss en
poblaciones humanas (Weber and Hein, 1985). Sin embargo, estudios posteriores mostraron
que la actividad NAT1 no tiene una distribución completamente monomórfica (Grant et al.,
1991; Ozawa et al., 1990). Actualmente se sabe que el gen NAT1 es altamente polimórfico y
presenta mutaciones tanto en la región codificadora como en las UTR. Se han descrito
numerosas sustituciones de nucleótidos (Figura 13) que aparecen en alelos de NAT1 con
frecuencias entre 0.0003 y 0.005. En la base de datos de NAT (actualizada en 24 mayo de
2011), existen 28 haplotipos diferentes de NAT1, que consisten en diversas combinaciones
de mutaciones: http://www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html.
36
Figura 13. Localización de polimorfismos en el gen NAT1 humano. Los polimorfismos no
sinónimos aparecen en rojo. Tomado de (Ruiz JD, 2009a).
De estos, el haplotipo NAT1*4 que es el que corresponde a la ausencia de mutaciones, es el
más frecuente en todas las poblaciones (Hein et al., 2000a) y al que se le atribuye la
activada enzimática rápida, y como se puede observar en la Tabla 3, a muchos de los
demás haplotipos no se les ha determinado la actividad enzimática y aparece como fenotipo
desconocido.
Tabla 3. Alelos NAT1 en humanos (Haplotipos). Actualizado 24 mayo de 2011. Alelo NAT1 Haplotipo
Nucleótidos cambiados e
identificador (rs)
Alteración de aminoácido(s) Fenotipo1 Referencias
NAT1*4 Referencia Referencia Referencia
(Vatsis and Weber, 1993) (Badawi et al., 1995) (Bell et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*3 1095 A>C (rs15561) Fuera de la región codificadora Desconocida
(Blum et al., 1990). (de Leon et al., 2000) (Zhu et al., 2011)
Fuera de la región codificadora. Fuera de la región codificadora
Desconocida
(Vatsis and Weber, 1993) (Hughes et al., 1998) (Payton and Sim, 1998) (de Leon et al., 2000) (Butcher et al., 1998) (Yang et al., 2000) (Badawi et al., 1995) (Bell et al., 1995) (Hein et al., 2000c) (Vaziri et al., 2001)
Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora V149I T153T (sinónimo) S214A Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora
Desconocida
(Doll et al., 1997) (de Leon et al., 2000) (Zhu and Hein, 2008) (Vaziri et al., 2001)
R187Q Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora
Menor que NAT1*4 “lento”
(Hughes et al., 1998) (Payton and Sim, 1998) (Vaziri et al., 2001)
NAT1*14B 560G>A (rs4986782) R187Q Menor que NAT1*4 “lento”
(Payton and Sim, 1998) (Hubbard et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*15 559C>T (rs5030839) R187Stop Menor que NAT1*4 “lento”
(Hughes et al., 1998) (Hubbard et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
38
NAT1*16 [AAA] inmediatamente después de 1091 1095A>C (rs15561)
Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora
Desconocida (de Leon et al., 2000)
NAT1*17 190C>T (rs56379106) R64W Menor que NAT1*4 “lento”
(Butcher et al., 1998) (Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*18A
∆3 between 1065-1087 (rs4646271) 1088T>A (rs1057126) 1095A>C (rs15561)
Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora
Desconocida (Deitz AC et al., 1997a) (Yang et al., 2000) (Sekine et al., 2001)
NAT1*18B ∆3 between 1065-1090 (rs4646271)
Fuera de la región codificadora
Desconocida (Deitz AC et al., 1997b) (Yang et al., 2000) (Sekine et al., 2001)
NAT1*19A 97C>T (rs56318881) R33Stop
Proteína truncada/ sin actividad enzimática
(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*19B 97C>T (rs56318881) 190C>T (rs56379106)
R33Stop R64W
Proteína truncada/ sin actividad enzimática
Agundez J et al.; datos sin publicar
NAT1*20 402T>C P134P (sinónimo) Equivalente a NAT1*4
(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*21 613A>G (rs72554609) M205V Equivalente a NAT1*4
(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*22 752A>T (rs56172717) D251V Menor que NAT1*4 “lento”
(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008) (Vaziri et al., 2001)
NAT1*23 777T>C(rs4986991) S259S (sinónimo) Equivalente a NAT1*4
(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997). (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002)
39
(Zhu and Hein, 2008)
NAT1*24 781G>A (rs72554610) E261K Equivalente a NAT1*4
(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*25 787A>G (rs72554611) I263V Equivalente a NAT1*4
(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*26A [TAA] inserción entre 1065 - 1090 1095C>A (rs15561)
Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora
Desconocida (Deitz AC et al., 1998b)
NAT1*26B
[TAA] inserción entre 1065 -1090
Fuera de la región codificadora
Desconocida (Deitz AC et al., 1998a)
NAT1*27 21T>G (rs4986992) 777T>C (rs4986991)
L7L (sinónimo) S259S (sinónimo)
Equivalente a NAT1*4
(Smelt et al., 2000) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)
NAT1*28 [TAATAA] delección entre 1065 - 1090
Fuera de la región codificadora Desconocida (Lo-Guidice J-M et al., 1999)
(Lo-Guidice et al., 2000) NAT1*29 1088T>A (rs1057126)
1095A>C (rs15561)
∆
1025
Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora
Desconocida (Lo-Guidice J-M et al., 1999) (Lo-Guidice et al., 2000)
NAT1*30 445G>>>>A (rs4987076) V149I Desconocida Agundez J et al. datos sin publicar
1El fenotipo asignado refleja la más reciente investigación, pero no necesariamente
es consistente en todos los estudios.
Adaptado de: (Hein David W et al., 2000) Consensus Human Arylamine N-Acetyltransferase Gene Nomenclature.
Determinadas variantes alélicas de NAT1 producen proteínas inestables con vidas medias
menores de cuatro horas (Butcher et al., 2004). Varios alelos de NAT1 han sido asociados
con una actividad reducida por estudios de expresión en bacterias (Butcher et al., 2000;
Hughes et al., 1998; Lin et al., 1998). La expresión de las variantes NAT1*21, NAT1*24, y
NAT1*25 produce aloenzimas N-acetyltransferasas con actividades de 2 a 3 veces más
40
altas que NAT1*4 (Lin et al., 1998). Algunos estudios también sugieren que NAT1*10 puede
ser un alelo acetilador más rápido que NAT1*4, debido a que NAT1*10 se ha asociado con
altas actividades N-acetiltransferasa en mucosa de vejiga y colon (Bell et al., 1995).
NAT1*10 no produce sustituciones de nucleótidos en la región codificadora, pero se ha
sugerido que la sustitución (T1088A), en la región 3’ altera la señal de poliadenilación
(TAATAA →TAAAAA), lo que puede aumentar la estabilidad del mRNA (Bell et al., 1995).
Sin embargo, estudios posteriores no han confirmado que NAT1*10 confiera una alta
actividad (Butcher et al., 1998; Hughes et al., 1998). A pesar del gran número de
polimorfismos identificados (Figura 13), la interrelación entre el genotipo y fenotipo NAT1
permanece sin aclarar, probablemente debido a la compleja regulación y transcripción de
este gen, esquematizadas en las Figuras 11 y 12, y al efecto de otros factores no genéticos
en la actividad NAT1 in vivo (Hein et al., 2000a).
El haplotipo más frecuente de NAT1 en poblaciones humanas caucásicas es el NAT1*4 (ver
tabla 4), que aparece con una frecuencia del 70 al 76%; mientras que en poblaciones negras
éste haplotipo está presente en el 45 al 54% de los genes. El segundo haplotipo más
frecuente en poblaciones humanas caucásicas es el NAT1*10 que aparece con una
frecuencia del 17,4 a 21%, mientras que en poblaciones negras este mismo haplotipo
representa del 42 al 50,5% de la población, como se resume en la Tabla 4.
41
Tabla 4. Frecuencias de haplotipos NAT1 en diferentes poblaciones humanas.
NAT1*22 - - - - - - - - - - a (Bruhn et al., 1999; Lo-Guidice et al., 2000; Loktionov et al., 2002) b (Butler et al., 2008; Millikan et al., 1998; Taylor et al., 1998; Zheng et al., 1999) c (Loktionov et al., 2002; Taylor et al., 1998) d (Butler et al., 2008; Millikan et al., 1998) e (Zhangwei et al., 2006; Zhao et al., 1998) f (Katoh et al., 1998; Sekine et al., 2001; Yang et al., 2000) g (Zhao et al., 1998) h (Kukongviriyapan et al., 2003b). i (Hsieh et al., 1999)
1.4.2 NAT2
En cuanto al gen NAT2 humano, existe un gran número de polimorfismos, la mayoría de los
cuales producen cambios de aminoácidos, afectando la actividad de la enzima. En la base
de datos NAT (actualizada el 22 de julio de 2011), existen 66 diferentes haplotipos de NAT2
(ver figura 14 y tabla 5), identificados en poblaciones humanas y descritos en la base de
datos http://www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html,
42
Figura 14. Localización de polimorfismos en el gen NAT2 humano. Los polimorfismos no
sinónimos aparecen en rojo. Tomado de (Ruiz JD, 2009b)
Tabla 5. Alelos NAT2 en humanos (Haplotipos). Actualizado 22 de julio de 2011.
Alelo NAT2 Haplotipo
Nucleótidos cambiados e
identificador (rs)
Alteración de aminoácido(s)
Fenotipo1 Referencias
NAT2*4 Referencia Referencia Rápido
(Deguchi, 1992). (Blum et al., 1991). (Ebisawa and Deguchi, 1991). (Vatsis et al., 1991). (Blum et al., 1990). (Ohsako and Deguchi, 1990). (Grant et al., 1989). (Hickman and Sim, 1991). (Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a).
NAT2*5A 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929)
I114T L161L (sinónimo) Lento
(Blum et al., 1991). (Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1992). (Lin et al., 1993).
(Vatsis et al., 1991). (Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1995) (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Abe et al., 1993)
43
NAT2*5C 341T>C (rs1801280) 803A>G (rs1208)
I114T K268R Lento
(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1992). (Lin et al., 1993). (Ferguson et al., 1994). (Cascorbi et al., 1995).
NAT2*5D 341T>C (rs1801280) I114T Lento
(Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Martinez et al., 1995). (Agundez et al., 1996a). (Agundez et al., 1996b). (Leff et al., 1999).
(Deguchi, 1992). (Blum et al., 1991). (Ebisawa and Deguchi, 1991). (Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Cascorbi et al., 1995).
NAT2*6B 590G>A (rs1799930) R197Q Lento
(Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Agundez et al., 1996a). (Agundez et al., 1996b).
(Blum et al., 1991). (Hickman et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Hein and Doll, 2007).
NAT2*7B 282C>T (rs1041983) 857G>A (rs1799931)
Y94Y (sinónimo) G286E
Lento Dependiente de sustrato?
(Deguchi, 1992). (Hein et al., 1994) (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1995). (Fretland et al., 2001b) (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a). (Hickman et al., 1992). (Hein and Doll, 2007)
(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Cascorbi et al., 1995). (Martinez et al., 1995). (Bolt et al., 2005). (Agundez et al., 1994).
NAT2*13B 282C>T (rs1041983) 578C>T
Y94Y (sinónimo) T193M
(Patin et al., 2006b).
NAT2*14A 191G>A (rs1801279) R64Q Lento
(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Ferguson et al., 1994). (Bell et al., 1993).
Otros 9,7 0-9,0 a (Agundez et al., 1996b; Bell et al., 1993; Cascorbi et al., 1996; Rabstein et al., 2006). . b (Gross et al., 1999; Taylor et al., 1998) c (Patin et al., 2006b) h (Kukongviriyapan et al., 2003a) d (Bell et al., 1993; Taylor et al., 1998) i (Hsieh et al., 1999) e (Straka et al., 2006) j (Rabstein et al., 2006) f (Okumura et al., 1997) g (Yuliwulandari et al., 2008).
1.5 POLIMORFISMO ACETILADOR Y RIESGO DE CÁNCER
Además de los efectos de los SNPs descritos anteriormente en los genes NATs sobre el
metabolismo de fármacos y xenobióticos, en décadas recientes las enzimas NATs han sido
consideradas como factores potencialmente relevantes en el riesgo y desarrollo de cáncer,
49
especialmente en aquellos relacionados con factores ambientales (Agúndez, 2008). Tras la
activación de muchos carcinógenos a través de encimas de fase I (principalmente
citocromos P450) (Autrup, 2000; Daly et al., 1994), existe una segunda fase metabólica que
generalmente lleva a la detoxificación a través de procesos de conjugación de los
compuestos reactivos con moléculas endógenas y que se realiza por las enzimas de fase II
(entre ellas NATs y GSTs), esta fase del metabolismo en general convierte los carcinógenos
activados en compuestos inactivos antes de la eliminación (Autrup, 2000). Un esquema
general de este mecanismo ya fue propuesto con relación al cáncer hepático en 1996, como
se muestra en la Figura 15.
Figura 15. Mecanismo propuesto para la asociación entre el cáncer hepático y
polimorfismos de enzimas metabolizadoras de fármacos. Tomado de (Agúndez, 2008),
modificado de (Agundez et al., 1996a).
50
Numerosos estudios han investigado las interrelaciones entre el fenotipo acetilador (NAT2) y
el riesgo de desarrollar cáncer, aunque más recientemente se están llevando a cabo
estudios en los que se combinan análisis de los genes NAT1 y NAT2, combinaciones de los
polimorfismos de estos genes con otros que codifican enzimas de fase II (como las GSTs) y
combinaciones de genes codificadores de enzimas de fase II con las de fase I. La Figura 16
muestra un esquema de los posibles efectos de la actividad enzimática.
Figura 16. Posibles mecanismos que relacionan las actividades NAT con la carcinogénesis.
Tomado de (Rodrigues-Lima et al., 2008).
Los estudios que integran varios genes son más prometedores que aquellos en los que sólo
se investigaban polimorfismos en el gen NAT2, porque permiten tener una visión mucho
más completa del estado de las vías de activación y desactivación de carcinógenos. Por
51
este motivo solamente mencionaremos de forma sucinta algunos de estos estudios para
ilustrar los mecanismos que se han propuesto para explicar las posibles asociaciones.
1.5.1 CÁNCER DE CABEZA Y CUELLO.
Los compuestos químicos presentes en el tabaco son inactivados por enzimas de fase II, y
se ha propuesto que el riesgo de cáncer de cabeza y cuello puede ser modificado por los
genotipos NAT. Los cánceres de cabeza y cuello están fuertemente asociados con el hábito
de fumar, y unos pocos estudios han explorado el papel de los polimorfismos NAT1 en el
riesgo del desarrollo de cáncer de cabeza y cuello en fumadores; sin embargo los hallazgos
son inconsistentes y, cuando se presentan asociaciones, éstas son débiles y pueden indicar
cualquier opción entre una disminución del riesgo en portadores de la variante NAT1*10
(McKay et al., 2008), un incremento del riesgo (Katoh et al., 1998) o de débil a ninguna
asociación (Fronhoffs et al., 2001; Henning et al., 1999). De manera similar al genotipo
NAT1, en los estudios que exploran la participación de NAT2 en los cánceres de cabeza y
cuello, existen estudios que indican que los acetiladores rápidos tienen mayor riesgo
(Chatzimichalis et al., 2010); o los que concluyen que la acetilación lenta aumenta el riesgo
(Gonzalez et al., 1998) mientras que otros indican que no existe una asociación entre los
genotipos acetiladores NAT1 y NAT2 y el cancer de cabeza y cuello (McKay et al., 2008).
Sin embargo un reciente estudio ha establecido que determinados diplotipos NAT1/NAT2
pueden modificar el riesgo al cáncer de cabeza y cuello (Demokan et al., 2010).
1.5.2 CÁNCER DE MAMA
El alelo NAT1*10 ha sido asociado con el incremento del riesgo de cáncer de mama entre
mujeres fumadoras o que consumen carne muy hecha, que por lo tanto están expuestas a
52
aminas heterocíclicas (Krajinovic et al., 2001; Zheng et al., 1999), aunque estos resultados
requieren replicación. En cuanto a NAT2, después de decenas de estudios que implican
varios miles de pacientes con cáncer de mama (Agundez et al., 1995a; Gertig et al., 1999;
Kocabas et al., 2004; Millikan et al., 1998), así como varios metanálisis (Ochs-Balcom et al.,
2007; Terry and Goodman, 2006); no se ha encontrado una asociación relevante de los
polimorfismos NAT2 y el riesgo de cáncer de mama en la población general (Agúndez,
2008). No obstante, en estudios recientes se sugiere que cuando existe exposición a aminas
heterociclícas como las del tabaco o la carne muy asada, los genotipos NAT pueden
modificar el riesgo al desarrollo de cáncer de mama (Ambrosone et al., 2008; Conlon et al.,
2010; Deitz et al., 2000; Zhang et al., 2010).
1.5.3 CÁNCER DE PULMÓN
Se han realizado numerosos estudios basados sobre la hipótesis inicial que la acetilación
lenta puede incrementar el riesgo a desarrollar cáncer de pulmón (Agúndez, 2008), esta
hipótesis ha sido reforzada por otros estudios que indican que la acetilación lenta,
especialmente si está asociada a defectos genéticos de otras enzimas de fase II, puede
conferir un incremento en la susceptibilidad de formación de aductos (Hou et al., 2001; Hou
et al., 2000; Lee et al., 2010; Zupa et al., 2009) y concuerda con los hallazgos de varias
investigaciones en las que los genotipos NAT2 acetiladores lentos o genotipos lentos NAT1
y NAT2 causan incrementos, de marginales a significativos, en el desarrollo de cáncer de
pulmón (Gemignani et al., 2007; Habalova et al., 2005; Hou et al., 2000; Martinez et al.,
1995); sin embargo algunos estudios sugieren un papel diferencial de la acetilación en
según la enzima que se analiza. Así, un estudio no encontró asociación entre genotipos
NAT2 y el riesgo a cáncer de pulmón, mientras que si observó una asociación significativa
de los haplotipos NAT1 lentos con el riesgo de cáncer de pulmón (Bouchardy et al., 1998);
53
De forma similar, otro estudio indicó que los polimorfismos de NAT2 no se asocian al riesgo
de cáncer de pulmón; pero cuando se analizan los haplotipos NAT1 y NAT2 juntos se
encontró que la combinación de NAT1 rápidos con NAT2 lentos aumentaba el riesgo de
cáncer de pulmón (Wikman et al., 2001), En un metanálisis se encontró una asociación
relevante entre el genotipo NAT1 acetilador rápido y el cáncer (Zienolddiny et al., 2008), en
pacientes no fumadores que sufrieron cáncer pulmonar de células no pequeñas. No
obstante estos datos deben ser interpretados con cautela, pues contradicen la base teórica
del riesgo de la acetilación y el cáncer de pulmón. A pesar de estos resultados, la evidencia
actual sugiere que los polimorfismos NAT2 por sí solos no constituyen un factor de riesgo
relevante en el cáncer de pulmón (Agúndez, 2008). En este contexto NAT1 está emergiendo
como el gen NAT más probablemente relacionado con cáncer de pulmón (McKay et al.,
2008).
1.5.4 CÁNCER COLORRECTAL
En estudios iniciales se propuso que el genotipo acetilador rápido predisponía al cáncer
colorrectal (Borlak and Reamon-Buettner, 2006; Gil and Lechner, 1998; Hein, 2002; Huang
et al., 2007; Huang et al., 2009; Ilett et al., 1987; Minchin et al., 1993; Nothlings et al., 2009;
Osian et al., 2006; Tamer et al., 2006; Yoshida et al., 2007). La hipótesis de trabajo en estos
estudios sugería que la combinación de genotipos NAT1 y/o NAT2 acetiladores rápidos
deberían activar más los carcinógenos (aminas heterocíclicas) dentro del colon,
predisponiendo de ese modo a cáncer colorrectal (Agúndez, 2008). Algunos metaanálisis
posteriores a estos estudios mostraron de forma consistente una débil o ausente asociación
de los genotipos NAT acetiladores rápidos y el riesgo de cáncer colorrectal (Butler et al.,
2008; Chen K et al., 2005; Houlston and Tomlinson, 2001; Ye and Parry, 2002). En cambio
otros estudios han sugerido que el genotipo acetilador lento está asociado a cáncer de colon
54
(Frazier et al., 2001; Zupa et al., 2009). Globalmente estos resultados permiten descartar
una asociación relevante de los genotipos NAT2 por sí solos, con el riesgo de cáncer
colorrectal; sin embargo la interacción entre el consumo de carne (exposición a aminas
heterocíclicas) y los genotipos NAT2, merecen particular atención y deben ser objeto de
estudios adicionales (Agúndez, 2008; da Silva et al.).
1.5.5 CÁNCER DE VEJIGA
A pesar de que este es el tipo de cáncer más frecuentemente estudiado en relación al
estatus acetilador, y a pesar de los prometedores hallazgos iniciales, la asociación general
del estatus acetilador lento con el riesgo de cáncer de vejiga no ha sido completamente
confirmada. Los metaanálisis han obtenido resultados positivos que reflejan una modesta
asociación del genotipo acetilador NAT2 lento con el riesgo de cáncer de vejiga con un odds
ratio entre 1,3 y 1,5 (Dong et al., 2008; Garcia-Closas et al., 2005; Johns and Houlston,
2000; Marcus et al., 2000a; Marcus et al., 2000b; Rothman et al., 2007; Sanderson et al.,
2007; Song et al., 2009; Vineis et al., 2000) y esta asociación es particularmente significativa
en pacientes fumadores (Fontana et al., 2009; Gu et al., 2005; Klimcakova et al., 2011;
Sanderson et al., 2007; Vineis et al., 2001). Sin embargo también existen estudios en los
que se estableció un efecto protector del estatus acetilador lento NAT2 y para el desarrollo
de cáncer de vejiga y para la formación de aductos de ADN en trabajadores expuestos a
benzidinas (Carreon et al., 2006; Rothman et al., 1996). En otros estudios no se estableció
asociación positiva entre acetiladores lentos riesgo de cáncer de vejiga en pacientes con
riesgo ocupacional o en fumadores (Hayes et al., 1993; Kontani et al., 2001; Ma et al., 2004;
Mittal et al., 2004; Zupa et al., 2009). Cuando se estudian conjuntamente los genotipos
NAT1 y NAT2, varios estudios hallaron un efecto conjunto de genotipos NAT1 rápidos y
genotipos NAT2 lentos sumados al hábito de fumar o a la exposición ocupacional como
55
factores que incrementan el riesgo de cáncer de vejiga (Cascorbi et al., 2001; Hsieh et al.,
1999; Jaskula-Sztul et al., 2001; Sanderson et al., 2007; Taylor et al., 1998); mientras que
otros estudios no observaron ninguna asociación significativa de los genotipos NAT1 con el
riesgo de cáncer de vejiga (Covolo et al., 2008; Okkels et al., 1997; Sanderson et al., 2007).
1.6 RELACIÓN ENTRE FENOTIPO ACETILADOR Y GENOTIPO ACETILADOR.
Como se muestra en la Figura 9, la especificidad de sustrato de las enzimas NAT1 y NAT2
dista de ser absoluta. Ambas enzimas, aunque con diferente grado de participación,
intervienen en la acetilación de fármacos y xenobióticos. No obstante lo anterior, y debido a
que el genotipo NAT1 no muestra una clara asociación con la actividad de la enzima in vivo,
por los motivos comentados en apartados anteriores de esta introducción, cuando se
menciona el término fenotipo acetilador se está haciendo referencia de forma implícita al
fenotipo de la enzima NAT2. No debe olvidarse, sin embargo, que una parte de la actividad
enzimática se debe a NAT1.
Se han utilizado numerosos sustratos para analizar el estatus acetilador in vivo. Entre ellas
la cafeína es, con mucha diferencia, la más utilizada. El metabolismo de cafeína es muy
complejo, como se muestra en la siguiente Figura:
56
Figura 17. Mapa del metabolismo de cafeína. Aparece marcada en rojo la actividad NAT y
en azul la xantina oxidasa.
Para la determinación del fenotipo acetilador uno de los métodos más utilizados es el
recomendado por Grant y colaboradores en 1984, en el cual la determinación por HPLC de
la relación de AFMU/1-MX, en la orina recolectada por 24 horas de personas que
consumieron 300 mg de cafeína, permite diferenciar los distintos fenotipos acetiladores
(Grant et al., 1984, 2004). El ratio entre los metabolitos de cafeína AFMU/1-MX es un
indicador fiable y bien documentado del fenotipo acetilador (Miners and Birkett, 1996). Sin
embargo hay que tener en cuenta que hay otra enzima, la xantina oxidasa, que condiciona
AFMU
1-MU
1-MX
57
la transformación del metabolito 1-MX en 1-MU. Aunque se ha argumentado que los
resultados más fiables se obtienen con el ratio AFMU/1-MX, se ha propuesto el uso del ratio
AFMU / (AFMU + 1MX + 1MU) para obviar el efecto de la actividad xantina oxidasa (Miners
and Birkett, 1996). Utilizando la fenotipación con cafeína en algunos estudios como el de
Cascorbi y colaboradores en 1995, se encontró que el 7,2% de los individuos genotipados
como acetiladores lentos, presentaban actividades de acetilación altas y el 6,1% de los
individuos genotipados como acetiladores rápidos tuvieron actividades de acetilación lentas
(Cascorbi et al., 1995). Estas discrepancias entre el fenotipo y también han sido publicadas
por otros autores con un rango del 2 al 7% de los individuos (Blum et al., 1991; Gross et al.,
1999; Hickman et al., 1992). En otras poblaciones estas discrepancias son incluso más altas
(O'Neil et al., 2002; Straka et al., 2006).
Dado que se ha postulado que parte de las discordancias entre fenotipo y genotipo cuando
se utiliza cafeína como sustrato puedan ser debidas a la xantina oxidasa, se ha planteado
que alteraciones en el gen que codifica esta enzima, puedan producir alteraciones que
modifiquen la relación de los metabolitos de cafeína en orina. A continuación se presenta la
tabla 7 con los SNPs no sinónimos del gen que codifica la xantina oxidasa publicados en la
página www.ncbi.nml.nih.gov
En la tabla 7 se observa que son muy pocos los SNPs presentes en poblaciones caucásicas
y que aparecen con frecuencias muy bajas, siendo rs17323225 y rs17011368, los más
frecuentes. Dado que uno de los objetivos de esta Tesis es comparar los fenotipos y los
genotipos acetiladores de los participantes, se estudiarán como posibles factores que
modifiquen el fenotipo la presencia de estos dos SNPs del gen que codifica la xantina
oxidasa. No obstante lo anterior, algunas discordancias importantes entre el fenotipo
acetilador y genotipo NAT2 se han observado con el uso de otros sustratos como la
sulfametazina, en cuyo metabolismo no interviene la xantina oxidasa, por lo que es probable
58
que, además de la actividad xantino oxidasa, existan otros factores que puedan modificar el
compararon la distribución de genotipos en la población analizada asumiendo un diseño
caso-control. Además mediante SNPstats se realizó un test de asociación entre los
genotipos y la respuesta a una variable asumiendo cuatro modelos genéticos: 1) modelo
codominante, que compara todos los pares de genotipos, 2) el modelo dominante, que
compara los homocigotos del alelo común con los heterocigotos más los homocigotos del
alelo poco frecuente, 3) el modelo recesivo que compara los alelos poco frecuentes con los
heterocigotos más los homocigotos del alelo frecuente y 4) el modelo aditivo.
80
.
En los estudios que se llevaron a cabo se aplicó un modelo de regresión logística ya que la
regresión lineal no era aplicable debido a que la variable respuesta es de tipo dicotómica. La
determinación de diplotipos para cada individuo se realizó a partir de los haplotipos inferidos
mediante el uso del software PHASEv2.1.1 (Stephens et al., 2001), utilizando siete análisis
independientes con 1000 iteraciones cada una (para más detalles ver (Agundez et al.,
2008)).
81
4. RESULTADOS.
82
4.1 ANÁLISIS DEL FENOTIPO ACETILADOR DETERMINADO POR LA RELACIÓN DE
METABOLITOS DE CAFEÍNA Log AFMU/1X EN ORINA.
La distribución de los fenotipos acetiladores in vivo en los 504 participantes, medidos como
el logaritmo de la relación de metabolitos de cafeína, 5-acetilamino-6-formilamino-3-
metiluracilo (AFMU) y 1-metilxanthina (1X) en orina (log AFMU/1X), mostró una distribución
aparentemente bimodal, según se puede observar en el histograma de frecuencias de la
figura 26.
Figura 26. Histograma de frecuencias de la relación log AFMU/1X en la población de
estudio.
Para este tipo de distribuciones se realizaron análisis de distribución de densidades de
Kernel, lo que permitió precisar que los datos presentaban una distribución bimodal (ver
figura 27).
83
Figura 27. Gráficas de diferentes cálculos de densidad de Kernel. En todos los gráficos se
observa que la distribución de frecuencias es bimodal.
Según el análisis de la función de densidad de Kernel, se calculó que el valor de log
AFMU/1X = -0,18, era el punto de corte del modelo de distribución bimodal (Silverman,
1986). De esta manera los individuos con valores <-0,18 log AFMU/1X, fueron clasificados
como acetiladores lentos y aquellos individuos con valores ≥-0,18 log AFMU/1X, fueron
clasificados como acetiladores rápidos. Según este criterio de clasificación 280 individuos
(147 hombres, 133 mujeres) de 504 de este estudio fueron acetiladores lentos (55,6%) y 224
individuos (119 hombres y 105 mujeres), fueron clasificados como acetiladores rápidos
(44,4%).
84
El valor promedio ± SD del log AFMU/1X para los individuos con fenotipo acetilador lento fue
de -0,548 ± 0,16063 (95% I.C. -0,5669 a -0,5291) y para los que presentaron fenotipo
acetilador rápido de 0,1940 ± 0,16274 (95% I.C. 0,1725 a 0,2174) y la comparación entre
ambos grupos fue estadísticamente significativa (p=0.0001).
En este estudio no se observaron diferencias estadísticas significativas en la proporción de
individuos clasificados como acetiladores rápidos o lentos según el sexo (p=0,895), como se
observa en la siguiente figura.
Figura 28. Distribución de fenotipo acetilador medido como log AFMU/1X según sexo.
P=0,771
P=0,671
85
4.2 DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO ACETILADOR
4.2.1 Genotipo NAT2.
Como se ha comentado en el capítulo de introducción, las mutaciones en el gen NAT2, y
particularmente aquellas que causan cambios de aminoácidos, son las que mejor
discriminan entre acetiladores lentos y rápidos. En una primera aproximación a la predicción
de fenotipo basada en el genotipo, se procedió a analizar los cuatro polimorfismos más
predictivos (Agundez et al., 2008). Los resultados de la frecuencia de los polimorfismos
analizados del gen NAT2 en la población de estudio se presentan en la tabla 11.
Tabla 11. Frecuencia de SNPs del gen NAT2 en la población de estudio.
Num rs Nombre trivial Alelo Num Porcentaje
rs1801279 191G>>>>A
G A
1008 0
100 0
rs1801280 341T>>>>C
T C
567 441
56 44
rs1799930 590G>>>>A
G A
733 275
73 27
rs1799931 857G>>>>A
G A
966 42
96 4
El SNP más frecuente en la población de estudio fue rs1801280, seguido del rs1799930. El
SNP rs1799931 tiene una muy baja frecuencia en la población de estudio, mientras el
rs1801279 presentó una distribución monomórfica. Estos resultados son consistentes con
los observados en poblaciones de origen caucásico (Garcia-Martin, 2008). En la tabla 12 se
observa que todos los SNP del gen NAT2 analizados se encuentran en equilibrio de Hardy-
Weinberg en la población de estudio y que no existe una diferencia estadísticamente
significativa con el modelo teórico.
86
Tabla 12. Frecuencias genotípicas de los SNPs en la región codificadora del gen NAT2 en la población de estudio.
SNP (Num rs) Aminoácido Frecuencia observada
% Frecuencia observada
% Frecuencia esperada
Valor de P
191G>>>>A (rs1801279) G/G G/A A/A
64 Arg/Arg 64 Arg/Glu 64 Glu/Glu
504
0 0
100,0 000,0 000,0
100,0 00,0 00,0
(--,--)
341T>>>>C (rs1801280) T/T T/C C/C
114 Ile/Ile 114 Ile/Thr 114 Thr/Thr
162 243 99
32,14 48,22 19,64
31,64 49,22 19,14
0,647
590G>>>>A (rs1799930) G/G G/A A/A
197 Arg/Arg 197 Arg/Gln 197 Gln/Gln
263 207 34
52,18 41,07 6,75
52,88 39,68 7,44
0,430
857G>>>>A (rs1799931) G/G G/A A/A
286 Gly/Gly 286 Gly/Glu 286 Glu/Glu
464 38 2
92,06 7,54 0,40
91,84 7,99 0,17
0,209
4.2.1.1. Relación entre SNPs de NAT2 y los metabolitos de cafeína en orina (log
AFMU/1X).
Para evaluar la relación entre los diferentes SNPs del gen NAT2, se revisó el modelo de
dominancia con respecto a la relación de metabolitos de cafeína en orina (log AFMU/1X). El
SNP rs1801279 no fue analizado ya que fue monomórfico en la población de estudio. En la
siguiente tabla se observa la probabilidad de ajuste al modelo de dominancia del SNP
rs1801280.
87
Tabla 13. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs1801280 (114 Ile/Thr)
del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X).
SNP rs1801280
(341T>>>>C)
Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P AIC BIC
Codominante
T/T 162 -0,05 ± 0,03
<0,0001 455,1 472 T/C 243 -0,24 ± 0,03
C/C 99 -0,44 ± 0,02
Dominante T/T 162 -0,05 ± 0,03
<0,0001 472,8 485,5 T/C C/C 342 -0,3 ± 0,02
Recesivo T/T T/C 405 -0,16 ± 0,02
<0,0001 478,7 491,4 C/C 99 -0,44 ± 0,02
Sobredominancia T/T C/C 261 -0,2 ± 0,03
0,21 517,1 529,8 T/C 243 -0,24 ± 0,03
Aditivo 0, T, C <0,0001 453,1 465,8
SE: Error estándar. AIC: Criterio de Información de Akaike's. BIC: Criterio de información
Bayesiano.
La siguiente Figura muestra los valores medios e I.C. del 95% de (log AFMU/1X):
Figura 29. Medias e IC del 95% de log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1801280 (114Ile/Thr) del gen NAT2. La línea marca el punto de corte entre acetiladores rápidos (por encima de la línea) y acetiladores lentos (por debajo de la línea).
88
Globalmente se observa que el modelo codominante es el que más se ajusta para la
influencia del SNP rs1801280 (114 Ile/Thr) de NAT2 sobre el fenotipo acetilador. Los
resultados indican que existe un efecto de dosis génica (confirmado por el modelo aditivo en
la Tabla 13), que determina en la población de estudio su capacidad acetiladora.
Este efecto de dosis génica va en contra de la clasificación tradicional de individuos
acetiladores lentos y rápidos, ya que el genotipo del SNP rs1801280 permite una
discriminación más fina entre los acetiladores rápidos heterocigotos y homocigotos. No
obstante, se observa que entre los portadores del genotipo T/C hay individuos con fenotipos
lentos debido al efecto de otras mutaciones en el gen NAT2 como se describe a
continuación. Por ese motivo el análisis aislado de SNPs en el gen NAT2 no aporta
información suficientemente predictiva y debe hacerse un análisis combinado como se
describe más adelante.
En la siguiente tabla se observa la probabilidad de ajuste al modelo de dominancia del SNP
rs1799930.
89
Tabla 14. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs1799930 (197 Arg/Gln)
del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X).
SNP rs1799930
590G>>>>A Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P AIC BIC
Codominante
G/G 263 -0,11 ± 0,02
<0,0001 459,5 476,4 G/A 207 -0,28 ± 0,03
A/A 34 -0,63 ± 0,03
Dominante G/G 263 -0,11 ± 0,02
<0,0001 481,1 493,7 G/A A/A 241 -0,33 ± 0,02
Recesivo G/G G/A 470 -0,19 ± 0,02
<0,0001 479,7 492,3 A/A 34 -0,63 ± 0,03
Sobredominancia G/G A/A 297 -0,17 ± 0,02
0,0027 509,7 522,3 G/A 207 -0,28 ± 0,03
Aditivo 0, G, A <0,0001 461,6 474,3
SE: Error estándar. AIC: Criterio de Información de Akaike's. BIC: Criterio de información
Bayesiano.
La siguiente Figura muestra los valores medios e I.C. del 95% de (log AFMU/1X):
Figura 30. Medias e IC del 95% de Log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1799930 NAT2 (Modelo codominante). La línea marca el punto de corte entre acetiladores rápidos (por encima de la línea) y acetiladores lentos (por debajo de la línea).
90
De nuevo se observa que el modelo codominante es el que más se ajusta para describir la
influencia SNP rs1799930 (197 Arg/Gln) de NAT2 sobre el fenotipo acetilador, indicando
que también existe un efecto de dosis génica en este polimorfismo.
En la tabla 15 se observa la probabilidad de ajuste a modelos de dominancia del SNP
rs1799931 (286 Gly/Glu) del gen NAT2.
Tabla 15. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para el SNP rs1799931 (286 Gly/Glu)
del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X)
SNP rs1799931
857G>>>>A
Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P value AIC BIC
Codominante
G/G 464 -0,2 ± 0,02
0,0003 504,6 521,5 G/A 38 -0,44 ± 0,07
A/A 2 -0,74 ± 0,22
Dominante G/G 464 -0,2 ± 0,02
0,0001 503,6 516,3 G/A A/A 40 -0,45 ± 0,07
Recesivo G/G G/A 502 -0,22 ± 0,02
0,069 515,4 528 A/A 2 -0,74 ± 0,02
Sobredominancia G/G A/A 466 -0,2 ± 0,02
0,0004 506,2 518,9 G/A 38 -0,44 ± 0,07
Aditivo 0, G, A 0,0001 502,6 515,3
SE: Error estándar. AIC: Criterio de Información de Akaike's. BIC: Criterio de información
Bayesiano.
La siguiente Figura muestra los valores medios e I.C. del 95% de (log AFMU/1X):
91
Figura 31. Medias e IC del 95% de Log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1799931 NAT2. La línea marca el punto de corte entre acetiladores rápidos (por encima de la línea) y acetiladores lentos (por debajo de la línea).
El modelo más probable para SNP rs1799931 (286 Gly/Glu) es el dominante. El modelo
codominante, que es el que tienen los otros SNPs, muestra para este SNP una validez
ligeramente inferior al dominante (Tabla 15). Esta aparente discordancia puede ser debida a
la baja frecuencia de la mutación en la población de estudio, que no permite determinar con
precisión el modelo de dominancia en esta población.
92
4.2.1.2. Análisis de haplotipos y diplotipos del gen NAT2.
Del análisis de haplotipos de los SNPs de la región codificadora del gen NAT2 se deduce que
la población presenta 5 variantes alélicas que combinan los cuatro SNPs analizados, en la
tabla 16 se muestra los haplotipos y las frecuencias inferidas, así como la nomenclatura de
los haplotipos de NAT2.
Tabla 16. Frecuencia de haplotipos y su denominación (nomenclatura) para el gen NAT2 (n=1008).
Alelos rs1801279
64 Arg/Gln
rs1801280
114 Ile/Thr
rs1799930
197 Arg/Gln
rs1799931
286 Gly/Glu Frecuencia
NAT2*4 G T G G 0,2564
NAT2*5 C 0,4324
NAT2*6 A 0,2654
NAT2*7 A 0,0374
NAT2*6I ó *6J
A A 0,0084
Total 1.0
Hay que resaltar que el análisis de SNPs realizado en este estudio sobre el gen NAT2 ha
sido simplificado, limitándose a los SNPs no sinónimos. Por ese motivo la asignación de
haplotipos debe considerarse como genérica. Así, los haplotipos clasificados como NAT2*4
podrían incluir también los haplotipos sumamente infrecuentes clasificados como NAT2*10,
En la tabla 21 no se observan diferencias relevantes en los valores de log AFMU/1X, que
puedan ser atribuibles al número de copias del gen NAT2, cuando estos se analizaron
según el genotipo acetilador. Los resultados globales sugieren que las copias extra son
inactivas, ya que entre los acetiladores lentos la presencia de copias extra no incrementa la
capacidad acetiladora, y tampoco lo hace entre los acetiladores intermedios ni los rápidos.
102
4.2.2. Genotipo NAT1.
La frecuencia de los SNPs en la región codificadora del gen NAT1, y que se analizaron en la
población de estudio se muestran en la tabla 22.
Tabla 22. Frecuencia de SNP del gen NAT1 en la población de estudio.
Num rs
Nombre trivial Alelos Num Porcentaje
rs56318881
97C>>>>T
C
T
1000
2
99,8
0,20
rs56379106
190C>>>>T
C
T
992
8
99,92
0,80
rs4987076
445G>>>>A
G
A
972
24
97,59
2,41
rs5030839
559C>>>>T
C
T
994
6
99,4
0,6
rs4986782
560G>>>>A
G
A
952
34
96,65
3,45
rs4986783
640T>>>>G
T
G
943
27
97,22
2,78
A diferencia del gen NAT2, el gen NAT1 está muy bien conservado en el ser humano y las
frecuencias de SNPs observadas fueron bajas.
Los SNPs de mayor frecuencia en esta población de estudio fueron rs4987076 (149 Val/Ile),
rs4986782 (187 Arg/Gln) y rs4986783 (214 Ser/Ala); los demás SNPs, tuvieron frecuencias
103
menores del 1% en la población de estudio. Todos los SNPs analizados se encontraban en
equilibrio de Hardy y Weinberg, como se muestra en la siguiente Tabla.
Tabla 23. Frecuencias genotípicas de los SNPs en la región codificadora del gen NAT1 en la población de estudio.
SNP (Num rs) Aminoácido Frecuencia observada
% Frecuencia observada
% Frecuencia esperada Valor P
97C>>>>T (rs56318881) C/C C/T T/T
33 Arg/Arg 33 Arg/Stop 33 Stop/Stop
499
2 0
99,60 0,40
0
99,60 0,40 0,00
0,964
190C>>>>T (rs56379106) C/C C/T T/T
64 Arg/Arg 64 Arg/Trp 64 Trp/Trp
492
8 0
98,40 1,60
0
98,40 1,60 0,00 0,857
445G>>>>A (rs4987076) G/G G/A A/A
149 Val/Val 149 Val/Ileu 149 Ileu/Ileu
474 24 0
95,18 4,82
0
95,20 4,80 0,00
0,582
559C>>>>T (rs5030839) C/C C/T T/T
187 Arg/Arg 187 Arg/Stop 187 Stop/Stop
494
6 0
98,8 1,2 0
98,80 1,20 0,00
0,892
560G>>>>A (rs4986782) G/A G/A A/A
187 Arg/Arg 187 Arg/Gln 187 Gln/Gln
461 30 2
93,91 5,68 0,41
93,20 6,59 0,21
0,056
640T>>>>G (rs4986783) T/T T/G G/G
214 Ser/Ser 214 Ser/Ala 214 Ala/Ala
459 25 1
94,64 5,15 0,21
94,64 5,86 0,00
0,295
104
4.2.2.1. Relación entre SNPs de NAT1 y los metabolitos de cafeína en orina (log
AFMU/1X).
Para la evaluación de los modelos de dominancia de los SNPs del gen NAT1, con relación a
la actividad metabólica, se omitieron del análisis aquellos SNPs para los que no observamos
homocigotos mutados en la población de estudio (97C>>>>T rs56318881, 190C>>>>T rs56379106,
445G>A rs4987076, 559C>T rs5030839), debido a que no pueden ajustarse a ningún
modelo.
El análisis estadístico demostró que no hay diferencias estadísticamente significativas entre
los valores log AFMU/1X de C/C y de C/T del SNP rs56318881 de NAT1 (p=0,763), entre
los valores de C/C y C/T del SNP rs56379106 (p=0,52), y entre los valores de G/G y G/A
del SNP rs4987076 (p=0,883). En cambio, si que se observaron diferencias
estadísticamente significativas entre los valores de portadores de C/C y C/T del SNP
rs5030839 de NAT1 (p=0,025). Los valores medios ± SE fueron de -0,2162 ± 0,1830 para
C/C y de -0,5050 ± 0,9215 para C/T. Esto sugiere que la variante T se asocia a una menor
capacidad acetiladora, aunque esta asociación no ha podido confirmarse de forma definitiva
debido a la baja frecuencia de la variante T, que no permite la identificación de individuos
homocigotos en la población de estudio. Ello no es extraño ya que, de acuerdo a la
frecuencia alélica, debería aparecer un homocigoto cada aproximadamente 30.000
individuos.
El resto de SNPs de NAT1 pudieron ser analizados en los modelos de dominancia, que se
muestran a continuación. En la siguiente tabla se observa la probabilidad de ajuste al
modelo de dominancia del SNP 560G>A rs4986782.
105
Tabla 24. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs4986782 (187 Arg/Gln)
del gen NAT1 según la relación con el Log AFMU/1X
SNP rs4986782
560G>A Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P value AIC BIC
Codominante
G/G 461 -0,23 ± 0,02
0,0002 490,5 507,3 G/A 30 0,06 ± 0,07
A/A 2 -0,66 ± 0,08
Dominante G/G 461 -0,23 ± 0,02
0,0008 494,7 507,3 G/A, A/A 32 0,01 ± 0,07
Recesivo G/G, G/A 491 -0,22 ± 0,02
0,12 503,5 516,1 A/A 2 -0,66 ± 0,08
Sobredominancia G/G, A/A 463 -0,24 ± 0,02
0,0001 490,9 503,5 G/A 30 0,06 ± 0,07
Aditivo 0,0072 496,1 508,7
SE: Error estándar. AIC: Criterio de Información de Akaike's. BIC: Criterio de información
Bayesiano.
De acuerdo a los resultados de la tabla anterior se observa un modelo de sobredominancia
del SNP rs4986782 (187 Arg/Gln), según la relación de metabolitos en orina log AFMU/1X.
Estos resultados sugieren que este SNP se asocia a la capacidad de acetilación de la cafeína
en la población de estudio. No obstante, el efecto es difícilmente explicable de acuerdo a los
modelos mostrados en la Tabla, ya que no parece existir una clara asociación entre la
presencia de una determinada variante alélica y la capacidad acetiladora.
En la siguiente tabla se observa la probabilidad de ajuste al modelo de dominancia del SNP
640T>G rs4986783.
106
Tabla 25. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para el SNP rs4986783 (Ser/Ala)
del gen NAT1 según la relación con el Log AFMU/1X.
SNP rs4986783
640T>G Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P value AIC BIC
Codominante
T/T 459 -0,22 ± 0,02
0,75 500 516,7 TG 25 -0,26 ± 0,08
G/G 1 -0,03 ± 0,0
Dominante T/T 459 0,22 ± 0,02
0,62 498,3 510,9 TG, G/G 26 -0,26 ± 0,08
Recesivo T/T, T/G 484 -0,22 ± 0,2
0,64 498,4 510,9 G/G 1 -0,03 ± 0,0
Sobredominancia T/T, G/G 460 -0,21 ± 0,02
0,54 498,2 510,8 T/G 25 -0,26 ± 0,08
Aditivo 0,7 498,4 511
SE: Error estándar. AIC: Criterio de Información de Akaike's. BIC: Criterio de información
Bayesiano
Del resultado del análisis de dominancia del SNP rs4986783 (Ser/Ala) del gen NAT1, se
deduce que este SNP no se asocia con la acetilación de cafeína en esta población de
estudio.
4.2.2.2. Análisis de haplotipos del gen NAT1.
Para el análisis de haplotipo y desequilibrio de ligamiento del gen NAT1 se utilizaron
aquellos individuos en los que pudieron analizarse todos los SNPs, que fueron 473. A
diferencia del gen NAT2, para el que existen numerosas aproximaciones empíricas y
matemáticas para la asignación de haplotipos, dichas aproximaciones no existen para el gen
NAT1, de modo que en este caso hemos utilizado procedimientos estándar que se
describen en el capítulo de métodos.
107
El análisis de desequilibrio de ligamiento demostró asociación de dos pares de SNPs (en
rojo en la Figura 35). Estos eran los SNPs 97C>T (rs56318881), y 190C>T (rs56379106) y
los SNPs 445G>A (rs4987076) y 640T>G (rs4986783).
Figura 35. Análisis de desequilibrio de ligamientos SNPs de NAT1.
NAT1.SNP_97: 97C>T rs56318881, NAT1.SNP_190: 190C>T rs56379106, NAT1.SNP_445: 445G>A rs4987076, NAT1.SNP_559: 559C>T rs5030839, NAT1.SNP_560: 560G>A rs4986782, NAT1.SNP_640: 640T>G rs4986783. En rojo aparecen las asociaciones con más alta probabilidad de estar en desequilibrio de ligamiento.
La asociación rs4987076 (149 Val/Ile) y rs4986783 (214 Ser/Ala) ya había sido observada
por otros autores, sin embargo la asociación de los SNPs rs56318881 (33 Arg/Stop), y
rs56379106 (64 Arg/Arg), no había sido descrita previamente.
108
El análisis de haplotipos determinó que existen 7 variantes alélicas en la población de
estudio. La tabla 26 muestra los haplotipos y las frecuencias inferidas.
Tabla 26. Frecuencia de haplotipos del gen NAT1 determinados en la población de estudio.
Alelos rs563188813
3 Arg/Stop
rs56379106
64 Arg/Trp
rs49870761
149 Val/Ile
rs5030839
187 Arg/Stop
rs4986782
187 Arg/Gln rs4986783
214 Ser/Ala
Frec.
NAT1*4 C C G C G T 92,16
NAT1*11 (A ó B) A G 2,41
NAT1*11C G 0,51
NAT1*14 (A ó B) A 3,16
NAT1*15 T 0,62
NAT1*30 A 0,21
NAT1*17 T 0,73
NAT1*19 T 0,10
NAT1*19B T T 0,10
Total 100,00
En este estudio hemos identificado dos haplotipos que no habían sido descritos previamente
y que por lo tanto aún no tenían denominación (en rojo en la Tabla). Estos haplotipos, que
aparecen con la nomenclatura NAT1*30 y NAT1*19B han sido recientemente admitidos por
el Comité Internacional de Nomenclatura de los genes NATs.
Al igual que ocurre con el gen NAT2, la asignación de haplotipos no es completa, ya que
solo se han estudiado los SNPs que pueden tener repercusión funcional. De modo que los
haplotipos clasificados como NAT1*4 pueden incluir también los haplotipos clasificados
como NAT1*3, NAT1*5, NAT1*10, NAT1*16, NAT1*18, NAT1*20, NAT1*21, NAT1*22,
NAT1*23, NAT1*24, NAT1*25, NAT1*26, NAT1*27, NAT1*28 y NAT1*29.
109
Las frecuencias de diplotipos de NAT1 se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 27. Frecuencias de los diplotipos NAT1 y su distribución según el fenotipo acetilador.
Diplotipo n Acetilador rápido Frec.
Acetilador lento Frec.
*4/*4 402 178 82,80 224 86,82
*4/*11A ó B 22 9 4,19 13 5,03
*4/*11C 3 0 0 3 1,16
*4/*14 27 22 10,24 5 1,94
*4/*15 6 1 0,46 5 1,94
*4/*17 6 1 0,46 5 1,94
*4/*19 1 1 0,46 0 0
*11C/*11C 1 1 0,46 0 0
*14/*14 1 0 0 1 0,39
*14/*19 1 1 0,46 0 0
*30 ó 19B 3 1 0,46 2 0,78
Total 473 215 100 258 100
Como puede observarse, no hay diferencias relevantes salvo en los portadores del diplotipo
*4/*14, entre los que aparece una frecuencia de acetiladores rápidos 5 veces superior a la
de acetiladores lentos. Estos resultados pueden sugerir un efecto directo de la variante *14
en la actividad acetiladora, o bien una asociación (ligamiento) de la variante *14 con
variantes rápidas del gen NAT2.
En las siguientes tablas 28 y 29 se muestran los valores de estadística descriptiva de la
relación de los metabolitos de cafeína en orina (log AFMU/1X) y los valores de p de la
110
comparación entre los diferentes diplotipos NAT1. De nuevo llama la atención el efecto de
diplotipos que contienen la variante *14, que parece tender a fenotipos acetiladores más
rápidos con diferencias estadísticamente significativas (Tabla 29). Sin embargo existe un
individuo homocigoto para la variante *14 que presenta un fenotipo lento, lo que resta
probabilidad a la hipótesis de un efecto directo de la variante *14 en la actividad acetiladora
in vivo.
Tabla 28. Promedios ± SD, min, max e I.C. 95% del log AFMU según los diplotipos NAT1
Como se observa en la tabla anterior, los SNPs de NAT1 rs56379106 (64 Arg/Trp),
rs4987076 (149 Val/Ile), rs5030839 (187 Arg/Stop), y rs4986783 (214 Ser/Ala), no tuvieron
efecto significativo en metabolismo acetilador, cuando estos SNP se estratificaron según el
genotipo acetilador de NAT2. De estos resultados se puede interpretar que los SNPs de
NAT1 en combinación con diplotipos NAT2 (clasificados como rápidos, intermedios y lentos)
analizados, no afectan significativamente el metabolismo acetilador de cafeína en esta
población de estudio.
El SNP rs4986782 (187 Arg/Gln; variante NAT1*14), no presentó efecto estadístico
significativo en la relación log AFMU/1X de metabolitos de cafeína en orina, en combinación
con los genotipos NAT2 acetiladores rápidos (p=0,231) e intermedios (p=0,801); sin
embargo cuando se analizó este mismo SNP en combinación con el genotipo NAT2
acetilador lento, si se observa una diferencia estadística significativa (p=0,03), como se
muestra en la siguiente figura.
116
Figura 36. Valores de media e I.C. 95% del log AFMU/1X según las comparaciones de diplotipos NAT2 y su combinación con el SNP rs4986782. NAT2 (R): NAT2*4/*4, NAT2 (I): NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7. NAT2 (L): NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7.
Aunque en el análisis aislado de la variante NAT1*14 parecía que se relacionaba con un
fenotipo acetilador más rápido, este efecto no se observa en los individuos con genotipos
acetiladores lentos del gen NAT2 en la figura 36, por lo que es poco probable un efecto
directo de la variante NAT1*14 sobre la capacidad acetiladora.
Para evaluar si los diplotipos del gen NAT2 combinados con los diplotipos del gen NAT1,
presentan efecto sobre el metabolismo de cafeína se realizó un análisis estadístico que no
mostró evidencias de que los diplotipos NAT1 intermedio o lento (que tuvieran al menos un
P=0,231
P=0,030
P=0,801
117
alelo mutado), combinados con los diplotipos NAT2, modificaran la capacidad acetiladora,
como se muestra en la figura 37.
Figura 37. Valores promedio e I.C. 95% del log AFMU/1X según el diplotipo de NAT2 rápidos, intermedios y lentos combinados con diplotipo NAT1 . NAT2R: NAT2*4/*4, NAT2 I: NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7. NAT2 L: NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7. NAT1R: NAT1*4/*4 NAT1 I ó L: Al menos un alelo NAT1*11A ó B, NAT1*11C, NAT1*14, NAT1*15, NAT1*17, NAT1*19.
En los anteriores resultados no se observan diferencias estadísticas significativas en la
capacidad acetiladora de acuerdo al efecto de las variantes de NAT1. Globalmente, estos
resultados indican que, en contra de las publicaciones que indicaban que las variaciones
P=0,283
P=0,651 P=0,806
118
genéticas de NAT1 podrían influenciar la capacidad acetiladora in vivo, basándose en la
superposición de sustratos de estas enzimas (ver el capítulo de introducción), en lo que se
refiere al metabolismo de cafeína no hay un efecto relevante de las variaciones en el gen