UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Departamento de Bioqumica y
Biologa Molecular I
QUITOSANTO, UN BIOPOLMERO CON APLICACIONES EN SISTEMAS DE
LIBERACIN
CONTROLADA DE FRMACOS.
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Ruth Expsito Harris
Bajo la direccin de los doctores
ngeles Mara Heras Caballero Niuris Acosta Contreras
Madrid, 2010
ISBN: 978-84-693-5983-9 Ruth Expsito Harris, 2010
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I
QUITOSANO, UN BIOPOLMERO CON APLICACIONES
EN SISTEMAS DE LIBERACIN CONTROLADA DE
FRMACOS
MEMORIA DE TESIS DOCTORAL
PRESENTADA POR:
Da. Ruth Expsito Harris
DIRECTORES DE TESIS:
ngeles Mara Heras Caballero
Niuris Acosta Contreras
Madrid, 2009
1
Agradecimientos
Durante estos aos he recibido el apoyo de muchas personas a las
que quiero mostrar mi
ms sincero agradecimiento.
Agradezco a mis directoras de Tesis, las Dras. ngeles Heras y
Niuris Acosta el apoyo
y el nimo que me han brindado durante este tiempo y, sobre todo,
el haberme dado la
oportunidad de trabajar con ellas. A ngeles tengo que
agradecerle el nimo que me ha
dado da tras da para que todo el trabajo realizado durante estos
aos tuviese su fruto en
esta memoria de tesis. A Niuris, agradecerle el esfuerzo por
ayudarme aun trabajando en
otro centro.
Expreso mi agradecimiento al Instituto de Estudios
Biofuncionales y al Departamento
de Fsico-Qumica II de la Facultad de Farmacia, en las personas
que ocupan su
direccin, el Dr. Jos Gonzlez y el Dr. Pedro Antonio Galera,
respectivamente. Gracias
tambin a la Dra. Begoa Elorza, investigadora principal de los
proyectos MAT 2004-
03982 y MAT2007-63757 del Ministerio de Ciencia e Innovacin,
durante los aos que
la Dra. ngeles Heras estuvo en comisin de servicios en el
Ministerio de Sanidad y
Consumo.
El agradecimiento ms grande de todos va dirigido a mi familia,
sobre todo a Sergio, a
David y a mi madre, porque esta Tesis es una realidad gracias a
ellos, a su apoyo
incondicional, desde el principio. Mencin especial para Sergio,
por su ayuda y su
paciencia y por estar ah en los momentos buenos y malos. Gracias
tambin a los que
estn lejos y a los que ya no estn, sobre todo a Paquita, porque
s que le hubiese
gustado estar aqu y ver mi Tesis terminada.
He tenido la suerte de conocer a gente maravillosa en el
Instituto de Estudios
Biofuncionales. Gracias a mis nias, Marian, Carol, Ana y Alba,
que han estado
conmigo desde el principio de esta andadura y con quienes he
compartido tantos
momentos. A las que llegaron despus, Inma, Susana y Elena, por
sus consejos, su
ayuda en estos ltimos meses y su amistad. Y por supuesto, a Bea,
Inma y Gemma, por
ayudarme en mis inicios. No me olvido de Ins, probablemente a
quien le debo que el
tema de mi tesis sea el que es y quien me ayud y apoy durante
los primeros aos. Al
resto de compaeros del Instituto y del CAI de RMN, gracias por
los consejos, las risas
y todos los buenos momentos.
2
He disfrutado de una estancia en la Universidad de Nottingham.
Quiero mostrar mi
agradecimiento a las Prof. Lisbeth Illum y Snow Stolnik el
haberme dado la
oportunidad de realizar parte del trabajo experimental de la
Tesis en su grupo de
investigacin. Gracias a mis compaeros all, a Driton y Emilia,
por dedicar su tiempo a
ensearme y ayudarme en el laboratorio.
Gracias a la Red Alfa II 0259 de la Unin Europea disfrut del
curso Biopolymers in
materials and life sciences en la Universidad de Potsdam
(Alemania), una de las
mejores experiencias que he vivido.
En la Universidad Complutense tambin debo mostrar mi
agradecimiento a Eugenio y
Alfonso, del CAI de Microscopa y a Fernando, del CAI de Rayos
X.
Quiero agradecer a la empresa Vegal Farmacutica S.L., con la que
el Instituto de
Estudios Biofuncionales mantuvo un contrato artculo 83, el
financiar esta tesis durante
el primer ao.
Esta tesis se ha realizado con la financiacin de dos contratos
asociados a los proyectos
MAT 2004-03982 y MAT 2007-63757 del Ministerio de Ciencia e
Innovacin.
Muchas gracias a todos, de corazn.
3
FRUTO DE ESTA TESIS HAN SIDO:
Publicaciones:
I. Paos, R. Harris, N. Acosta, B. Miralles, A. Heras Study of
the amount of
chitosan bound to alginate in polyelectrolyte complexes.
Advances in Quitin
Science, Vol IX (2006). Eds. A. Domard, E. Guibal, K. M. Vrum.
Pags 637-
644.
R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Preparation and
characterization of
chitosan microspheres for controlled release of tramadol.
Journal of
Controlled Release (2008), 132 (3), e76-e77.
Inmaculada Aranaz, Marian Mengbar, Ruth Harris, Ins Paos,
Beatriz
Miralles, Niuris Acosta, Gemma Galed, ngeles Heras.
Functional
characterization of chitin and chitosan. Current Chemical
Biology (2009), 3,
203-230.
B. Miralles, M. Mengbar, R. Harris and A. Heras. Suitability of
a colorimetric
method for the selective determination of chitosan in dietary
supplements.
Food Chemistry. Aceptado Julio de 2009. Ref:
FOODCHEM-D-09-01275R1.
Inmaculada Aranaz, Ruth Harris and Angeles Heras. Chitosan
Amphiphilic
Derivatives. Chemistry and Applications. Current Organic
Chemistry.
Aceptado 2009.
R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar, A.
Heras.
Chitosan nanoparticles and microspheres for the encapsulation of
natural
antioxidants and their application in cosmetics. Carbohydrate
Polymers (En
revisin: CARBPOL-D-09-00950).
R. Harris, N. Acosta, A. Heras. Novel chitosan hydrochloride -
genipin
microspheres for controlled release of tramadol hydrochloride.
Journal of
Microencapsulation (Enviado: TMNC-2009-0197).
E. Lecumberri, R. Harris, A. Heras. Chitosan microspheres
crosslinked with
genipin for controlled release of drugs. En elaboracin para
enviar a la revista
Marine Drugs.
R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. New chitosan films for
controlled
release of ciprofloxacin hydrochloride. En elaboracin para
enviar a la revista
Drug Delivery.
4
D. Vllasaliu, R. Harris, L. Casettari, A. Heras, L. Illum, S.
Stolnik. Tight
junction modulation of chitosan solution and chitosan
nanoparticles. En
elaboracin para enviar a la revista Journal of Controlled
Release.
Contribuciones a congresos internacionales:
I. Paos, R. Harris, I. Aranaz, G. Galed, N. Acosta, A. Heras.
Chitosan films
for the controlled release of ciprofloxacin HCl. IV Congreso
Internacional de
Biomateriales, BIOMAT, La Habana, Cuba, 2006. (Pster).
I. Paos, R. Harris, B. Miralles, N. Acosta, A. Heras. Study of
amount of
chitosan bound to alginate in polyelectrolyte complexes.
10th
International
Conference on Chitin and Chitosan. 7th
International Conference of the
European Chitin Society. Montpellier, Francia, 2006.
(Pster).
I. Paos, R. Harris, B. Miralles, N. Acosta, A. Heras. Chitosan
films for
controlled release of ciprofloxacin. IV Simposio Iberoamericano
de quitina,
SIAQ. Natal, Brasil, 2007. (Pster).
I. Paos, R. Harris, N. Acosta, A. Heras. Sustained release
chitosan
microspheres prepared by a w/o/w emulsion-spray drying method.
34rd
Controlled Release Society Meeting. Long Beach, California,
EE.UU., 2007.
(Pster).
R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Preparation and
characterization of
chitosan microspheres for controlled release of tramadol.
10th
European
Symposium of Controlled Drug Delivery. Noordwijk aan Zee
(Holanda), 2008.
(Pster).
R. Harris, I. Paos, N. Acosta, A. Heras. Chitosan-genipin
microspheres
prepared by spray-drying: characterization. World Meeting in
Pharmaceutics,
Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Barcelona, 2008.
(Pster).
R. Harris, N. Acosta, E. Lecumberri, A. Heras. Novel chitosan
hydrochloride-
genipin microspheres for controlled release of tramadol
hydrochloride.
Controlled Release Society. Copenhague (Dinamarca), 2009.
(Pster).
E. Lecumberri, R. Harris, A. Heras. Chitosan microspheres
crosslinked with
genipin for controlled release of drugs. European Quitin
Society. Venecia
(Italia), 2009. (Pster).
R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M. Mengbar,
S.Iglesias, A.
Heras. Chitosan nanoparticles and microspheres for the
encapsulation of
natural antioxidants and their application in cosmetics.11th
Internacional
Conference on Chitin and Chitosan. Taipei (Taiwan), 2009.
(Pster).
5
A. Heras, R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M.
Mengbar.
Chitosan and co-passengers. Functional applications. 11th
Internacional
Conference on Chitin and Chitosan. Taipei (Taiwan), 2009.
Keynote lecture.
A. Heras, R. Harris, E. Lecumberri, I. Mateos-Aparicio, M.
Mengbar.
Quitosano, biopolmero creador de sinergias. V Iberoamerican
chitin
symposium. Chile, 2010. Plenary conference.
Congresos nacionales:
R. Harris Pelculas de quitosano para la liberacin controlada de
frmacos.
II Jornadas Complutenses y I Congreso Nacional de Investigacin
para alumnos
de pregrado en Ciencias de la Salud. Facultad de Farmacia,
Madrid, Espaa,
2007. Comunicacin oral.
Estancias en centros extranjeros
Estancia de cuatro meses en la Universidad de Nottingham (Reino
Unido). Drug
delivery and tissue engineering department. Febrero-Mayo
2008.
Actividades de transferencia de tecnologa:
Integrante del equipo promotor de la empresa de base tecnolgica
(EBT) InFiQuS.
Fecha: 2009
Informes a empresas:
1. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano:
aplicaciones a la
claritromicina y a la venlafaxina. Vegal Farmacutica S.L. Marzo
2007.
2. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano:
aplicaciones a la
claritromicina y a la venlafaxina. Vegal Farmacutica S.L. Junio
2007.
3. Matrices de liberacin controlada a base de quitosano y
genipina. Laboratorios ROVI
S.A. Junio 2008.
7
Abreviaturas
ANOVA: anlisis de la varianza de una va
CS: quitosano
DRX: difraccin de rayos X
EE: eficiencia de encapsulacin
FFLM: formas farmacuticas de liberacin modificada
FT-IR: espectroscopa de infrarrojos por transformada de
Fourier
FD: dextrano marcado con isotiocianato de fluorescena (del ingls
FITC-Dextran)
GD: grado de desacetilacin
Gnp: genipina
HBSS: solucin salina equilibrada de Hank (del ingls Hanks
balanced salt solution)
HCS: hidrocloruro de quitosano
LD 50: dosis letal para el 50% de un conjunto de animales de
prueba (del ingls lethal
dosis)
LDH test de citotoxicidad en el que se determina la liberacin de
lactato
deshidrogenasa de las clulas
MTS ensayo de citotoxicidad en el que se utiliza una sal del
tetrazolio (3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-
tetrazolio)
PBS tampn fosfato salino (del ingles phosphate buffered
saline)
RA: rendimiento de atomizacin
SD: desviacin estndar (del ingls standard deviation)
SEM: microscopa electrnica de barrido (del ingls scanning
electron microscopy)
SGF: fluido gstrico simulado (del ingls simulated gastric
fluid)
SIF: fluido intestinal simulado (del ingls simulated intestinal
fluid)
TPP: tripolifosfato sdico
UV: ultravioleta
UV-Vis: ultravioleta-visible
ndice
9
ndice
I. INTRODUCCIN
....................................................................................................
15
1 Sistemas de liberacin modificada
.............................................................................
17
2 Polmeros utilizados en sistemas de liberacin de
frmacos...................................... 18
3 Quitosano: Caractersticas, propiedades y aplicaciones
............................................. 19
4 Microesferas y nanopartculas de quitosano
..............................................................
22
5 Pelculas de quitosano
................................................................................................
25
5.1 Hinchamiento de las pelculas de quitosano
....................................................... 26
6 El quitosano como promotor de la absorcin de frmacos
........................................ 28
7 Cultivos celulares como modelo epitelial
..................................................................
32
8 Agentes entrecruzantes
...............................................................................................
34
9 Frmacos empleados
..................................................................................................
38
10 Modelos matemticos
.................................................................................................
42
II. MATERIALES Y MTODOS
............................................................................
49
1 Materiales
...................................................................................................................
51
2 Obtencin de microesferas de hidrocloruro de quitosano
.......................................... 52
3 Obtencin de pelculas de quitosano
..........................................................................
53
4 Obtencin de nanopartculas de hidrocloruro de quitosano
....................................... 54
5 Caracterizacin
...........................................................................................................
54
5.1 Estudios de morfologa
.......................................................................................
54
5.2 Determinacin de la caraga elctrica superficial de
microesferas y
nanopartculas
................................................................................................................
55
5.3 Estudios de interaccin frmaco-polmero
......................................................... 56
5.3.1 Difraccin de rayos X
.....................................................................................
56
5.3.2 Espectroscopia de
infrarrojo............................................................................
56
5.4 Reaccin de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y
la genipina ...... 57
ndice
10
5.5 Determinacin del grado de entrecruzamiento con genipina
.............................. 57
5.6 Estudios de hinchamiento de las pelculas de quitosano
.................................... 58
5.7 Determinacin de la cantidad de quitosano unido a las
nanopartculas.............. 58
6 Estudios de liberacin in vitro
....................................................................................
59
6.1 Microesferas de claritromicina
...........................................................................
59
6.2 Microesferas de hidrocloruro de tramadol
.......................................................... 60
6.3 Pelculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino
................................ 61
7 Cultivos celulares
.......................................................................................................
61
7.1 Clulas Calu-3
.....................................................................................................
61
7.2 Ensayo de toxicidad MTS
...................................................................................
62
7.3 Ensayo de liberacin de LDH
.............................................................................
63
7.4 Determinacin de la resistencia
transepitelial.....................................................
63
7.5 Ensayos de permeabilidad celular
.......................................................................
64
III. RESULTADOS Y DISCUSIN
..........................................................................
69
1 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina
obtenidas por
atomizacin
........................................................................................................................
71
1.1 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina
entrecruzadas
con tripolifosfato sdico
................................................................................................
71
1.1.1 Obtencin de las
microesferas.........................................................................
71
1.1.2 Estudios de
morfologa....................................................................................
74
1.1.3 Determinacin de la carga superficial de las microesferas
............................. 75
1.1.4 Interaccin frmaco-polmero
.........................................................................
77
1.1.5 Estudios de liberacin in vitro
.........................................................................
78
1.2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina
entrecruzadas
con genipina
...................................................................................................................
90
1.2.1 Obtencin de las
microesferas.........................................................................
90
1.2.2 Estudios de
morfologa....................................................................................
90
1.2.3 Determinacin de la carga superficial de las microesferas
............................. 91
1.2.4 Interaccin frmaco-polmero
.........................................................................
91
1.2.5 Estudios de liberacin in vitro
.........................................................................
92
1.3 Conclusiones parciales del captulo
....................................................................
95
2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con hidrocloruro de
tramadol obtenidas
por atomizacin
.................................................................................................................
97
2.1 Reaccin de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y
la genipina ...... 97
2.2 Determinacin del grado de entrecruzamiento
................................................. 101
2.3 Obtencin de las microesferas
..........................................................................
103
2.4 Estudios de morfologa
.....................................................................................
104
2.5 Determinacin de la carga superficial de las microesferas
............................... 105
ndice
11
2.6 Interaccin frmaco-polmero
...........................................................................
106
2.7 Estudios de liberacin in vitro
..........................................................................
108
2.8 Conclusiones parciales del captulo
..................................................................
117
3 Pelculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino
..................................... 119
3.1 Obtencin de las pelculas
................................................................................
119
3.2 Estudios de morfologa
.....................................................................................
120
3.3 Grado de hinchamiento de las pelculas
........................................................... 121
3.4 Estudios de interaccin frmaco-polmero
....................................................... 124
3.4.1 Difraccin de rayos X
...................................................................................
124
3.4.2 Espectroscopa de
infrarrojo..........................................................................
128
3.5 Ensayos de liberacin in vitro
...........................................................................
131
3.6 Conclusiones parciales del captulo
..................................................................
136
4 Estudio del efecto del quitosano sobre las uniones estrechas
de clulas Calu-3 ...... 139
4.1 Obtencin y caracterizacin de nanopartculas de hidrocloruro
de quitosano . 140
4.2 Estudios de citotoxicidad
..................................................................................
142
4.2.1 Ensayo de MTS
.............................................................................................
142
4.2.2 Ensayo LDH
..................................................................................................
144
4.3 Estudio de la resistencia transepitelial
..............................................................
146
4.4 Ensayos de permeabilidad celular
.....................................................................
150
4.5 Conclusiones parciales del captulo
..................................................................
151
IV. CONCLUSIONES
....................................................................................................
153
V. BIBLIOGRAFA
........................................................................................................
157
Objetivos
13
OBJETIVOS
Siguiendo la lnea de investigacin del grupo Investigaciones en
el Sistema Quitina-
Quitosano y dentro del rea de sistemas de liberacin controlada
de frmacos basados
en quitosano, en esta Tesis se ha dado un paso ms en el
conocimiento del quitosano y
las potenciales aplicaciones de este biopolmero en el campo de
la tecnologa
farmacutica.
As, el objetivo general de esta Tesis ha sido, por una parte
obtener microesferas,
pelculas y nanopartculas de quitosano para la encapsulacin de
frmacos y, por otra
parte, estudiar la citotoxicidad del quitosano y su capacidad
como promotor de
absorcin de macromolculas en monocapas de clulas Calu-3.
Este objetivo general podra desglosarse en los siguientes
objetivos especficos:
Obtencin, caracterizacin y estudio de la liberacin in vitro de
microesferas de
hidrocloruro de quitosano como sistemas de liberacin controlada
de
claritromicina e hidrocloruro de tramadol para administracin
oral.
Obtencin, caracterizacin y estudio de la liberacin in vitro de
pelculas de
quitosano como sistemas de liberacin controlada de hidrocloruro
de
ciprofloxacino para uso tpico.
Estudio del efecto del quitosano, en solucin o en nanopartculas
sobre una lnea
celular de epitelio respiratorio: citotoxicidad, apertura de
uniones estrechas y
permeabilidad celular de macromolculas.
Introduccin
15
I. INTRODUCCIN
Introduccin
17
1 Sistemas de liberacin modificada
En las ltimas dcadas, el desarrollo de nuevas formas
farmacuticas de liberacin
modificada (FFLM), tambin llamadas de liberacin controlada, ha
suscitado gran
inters en la industria farmacutica. Se trata de dispositivos que
aportan mejores pautas
posolgicas, mejor perfil farmacocintico e incluso reduccin de
efectos adversos. De
acuerdo con la Real Farmacopea Espaola [1], las FFLM son aqullas
en las que la
velocidad y el lugar de liberacin de la sustancia o sustancias
activas es diferente del de
la forma farmacutica de liberacin convencional, administrada por
la misma va. En
ellas se introducen modificaciones en la formulacin o en el
proceso de produccin con
el fin de alterar la velocidad, el tiempo o el lugar de
liberacin del frmaco [2]. De esta
forma se pueden alcanzar los niveles teraputicos del frmaco en
el lugar de accin y
mantenerlos a lo largo del tiempo. Como consecuencia, las FFLM
presentan numerosas
ventajas con respecto a las formas farmacuticas convencionales
[3]:
Disminucin de la frecuencia de administracin del medicamento,
mejorando de
esta forma el cumplimiento del tratamiento por parte del
paciente.
Reduccin de los efectos secundarios relacionados con dosis
elevadas.
Disminucin de la fluctuacin de niveles plasmticos.
Efecto teraputico ms uniforme.
Sin embargo, tambin existen algunos inconvenientes, entre los
que hay que destacar
[3]:
Coste elevado.
Correlaciones in vitro/in vivo difciles de predecir.
Posible sobredosificacin por liberacin inmediata e incontrolada
de la dosis.
Dificultad en el ajuste de la dosificacin.
Dependencia del tiempo de trnsito intestinal en las formas de
administracin
oral.
Riesgo de acumulacin del frmaco y necesidad de ajuste de pautas
posolgicas.
Introduccin
18
En la Tabla I.1 se resumen los principales tipos de liberacin
modificada [4, 5]:
Tabla I.1. Caractersticas y ejemplos de los diferentes tipos de
liberacin modificada.
Tipo de liberacin Caractersticas
principales Ejemplos
Prolongada o controlada
Diseadas para garantizar
una liberacin ms lenta del
frmaco.
Comprimidos o parches
lipdicos, hidroflicos o de
polmeros insolubles.
Retardada
Retrasan la liberacin del
principio activo.
No prolongan el efecto
teraputico.
Sistemas de cubierta
entrica o formas
farmacuticas
gastrorresistentes.
Pulstil
Modificadas para garantizar
una liberacin secuencial
del frmaco.
Normalmente presentan dos
fases: una inmediata y otra
al cabo de un tiempo.
Sistemas que pretenden
hacer coincidir la liberacin
del frmaco con ciclos
circadianos hormonales.
De control espacial
Liberan el principio activo
cuando la forma
farmacutica alcanza su
lugar de accin.
Sistemas bioadhesivos.
Los sistemas de liberacin modificada tambin se pueden clasificar
en funcin del
mecanismo por el cual se libera el principio activo. La
liberacin puede ocurrir por
difusin, disolucin, presin osmtica, fuerza mecnica,
hinchamiento, erosin o
activacin [2].
2 Polmeros utilizados en sistemas de liberacin de frmacos
Actualmente, en la elaboracin de sistemas de liberacin
controlada, se utilizan un gran
nmero de polmeros. Existen dos grandes grupos de polmeros:
Polmeros naturales, como el colgeno, la albmina o el
quitosano.
Polmeros sintticos, entre los que se distinguen:
o Polmeros biodegradables, como los cidos polilctico y
poligliclico.
o Polmeros no biodegradables, como los cidos poliacrlicos.
Introduccin
19
Tanto los materiales empleados en el desarrollo de los sistemas
de liberacin as como
sus productos de degradacin han de ser biocompatibles.
La liberacin del frmaco desde una matriz polimrica puede deberse
a tres tipos de
mecanismos: liberacin desde la superficie de las partculas,
difusin a travs de la
matriz hinchada y liberacin debido a la erosin del polmero. En
la mayora de los
casos, la liberacin se debe a ms de uno de estos mecanismos
[6].
En el caso de la liberacin desde la superficie, el frmaco
atrapado en la capa superficial
de las partculas se disuelve instantneamente al entrar en
contacto con el medio. Esto
provoca el llamado efecto estallido, del ingls burst effect, que
puede evitarse
utilizando agentes entrecruzantes o lavando las partculas con
solventes apropiados, lo
cual puede conducir a una baja eficiencia de encapsulacin.
La liberacin por difusin implica tres etapas. En la primera, el
agua penetra en el
sistema, lo que hace que la matriz se hinche; en la segunda, el
polmero cristalino se
convierte en una matriz hidratada; y en la tercera, se produce
una difusin del frmaco a
travs de dicha matriz hidratada. La velocidad global del proceso
vendr determinada
por la velocidad de cada etapa. Ajustando experimentalmente las
variables adecuadas se
puede conseguir la velocidad de liberacin del frmaco idnea. Este
tipo de liberacin
es tpico en hidrogeles.
En el caso de polmeros biodegradables, el principio activo puede
liberarse por erosin
de la matriz en la que est encapsulado.
3 Quitosano: Caractersticas, propiedades y aplicaciones
El quitosano es un polmero natural que se obtiene a partir de la
quitina, uno de los
biopolmeros ms abundantes en la naturaleza. La quitina forma
parte de la estructura de
soporte de numerosos organismos vivos, tales como artrpodos
(crustceos e insectos),
moluscos y hongos. Se trata adems de un subproducto importante
de varias industrias
como la pesquera y la cervecera. La quitina y el quitosano son
biopolmeros que en los
ltimos aos han encontrado gran cantidad de aplicaciones,
especialmente en la
industria alimentaria y en la biotecnolgica [7].
La quitina est formada por unidades de
2-acetamido-2-deoxy--D-glucosa unidas por
enlaces -(14). La obtencin de quitosano a partir de quitina se
realiza por
desacetilacin de la misma, dejando libre el grupo amino del
carbono 2, si bien este
Introduccin
20
proceso nunca llega al 100% [8]. Es por ello que el quitosano es
un copolmero de 2-
acetamido-2-deoxy--D-glucosa y 2-amino-2-deoxy--D-glucosa
(Figura I.1).
Figura I.1. Estructura de la quitina (a) y del quitosano
(b).
La fuente y el mtodo de obtencin determinan la composicin de las
cadenas de
quitosano y su tamao. Por este motivo, el grado de desacetilacin
y el peso molecular
promedio son dos parmetros de obligado conocimiento para la
caracterizacin de este
polmero.
Las principales propiedades fsico-qumicas del quitosano que
determinan sus
propiedades funcionales son su grado de desacetilacin y su peso
molecular promedio,
aunque la cristalinidad, el contenido de agua, cenizas y
protenas tambin son
caractersticas fsico-qumicas a considerar para la aplicacin de
un quitosano
especfico.
El porcentaje de grupos amino que quedan libres en la molcula de
quitosano es lo que
se denomina grado de desacetilacin y est estrechamente vinculado
con su solubilidad.
Como consecuencia de la hidrlisis del grupo N-acetilo, aumenta
la capacidad
hidroflica del quitosano y pasa a ser soluble en soluciones
cidas diludas (actico,
(b)
(a)
Introduccin
21
frmico, clorhdrico, entre otros) ya que el pKa del gupo amino
del quitosano es de 6,5
[9]. La protonacin de los grupos amino del quitosano en medio
cido le confiere un
carcter altamente reactivo.
El quitosano es un polmero formado por unidades repetidas de
D-glucosamina, por lo
que la longitud de la cadena y, por tanto, su peso molecular, es
una caracterstica
importante de la molcula.
Algunas de las propiedades funcionales del quitosano son:
biodegradabilidad,
biocompatibilidad, mucoadhesin, capacidad filmognica,
hemosttico, promotor de
absorcin, actividad antimicrobiana, anticolesterolmica y
antioxidante [10]. Estas
propiedades funcionales han promovido su utilizacin en varios
campos distintos como
son agricultura, industria y medicina. En agricultura, el
quitosano se ha descrito como
antivirus en plantas y como aditivo en fertilizantes. As mismo
se ha investigado como
agente quelante de metales en agricultura e industria y como
agente filmognico en
cosmtica [11]. Tambin ha sido utilizado en la industria
papelera, en la textil y en el
tratamiento de aguas residuales [12]. En la industria
alimentaria se puede utilizar como
ingrediente funcional y como fibra alimentaria. Adems, tiene la
capacidad de unirse a
grasas, por lo que se utiliza como agente hipocolesterolmico en
productos dietticos
[10]. Ha sido altamente utilizado en el campo de la biomedicina
debido a su actividad
inmunoestimuladora, propiedades anticoagulates, accin
antibacteriana y antifngica
[13] y por su accin como promotor de la cicatrizacin de heridas
[14].
Debido a su carcter catinico y a sus propiedades gelificantes y
filmognicas, el
quitosano ha sido estudiado en la industria farmacutica por su
potencial en el
desarrollo de sistemas de liberacin de frmacos [15, 16]. En este
sentido, hay que
destacar que el hidrocloruro de quitosano fue aprobado por las
autoridades e incluido en
la cuarta edicin de la Farmacopea Europea (2002) [17].
Constituye un vehculo para la encapsulacin del frmaco,
protegindolo y liberndolo
de forma controlada, adems de promover su absorcin a travs del
epitelio. As mismo,
el quitosano presenta propiedades necesarias para su uso en
dicha industria, como son
su biodegradabilidad, biocompatibilidad y no toxicidad. La
toxicidad del quitosano por
va oral es baja; se ha descrito una LD50 (dosis letal para el
50% de un conjunto de
animales de prueba) de 16g/Kg en ratas [18]. El grado de
desacetilacin y el peso
molecular promedio del quitosano son dos caractersticas
fsico-qumicas
Introduccin
22
fundamentales, ya que afectan a las propiedades de las
formulaciones farmacuticas
basadas en este polmero [10].
En los ltimos aos, el estudio del quitosano se ha centrado sobre
todo en mejorar la
liberacin y la absorcin de las llamadas biomolculas teraputicas,
como son los
frmacos proteicos [19]. Existen resultados contradictorios sobre
la mayor eficiencia del
quitosano en solucin, en polvo o en forma de nanopartculas en la
liberacin in vivo.
En general, se ha visto que la eficiencia de la absorcin de
macromolculas en mucosas
utilizando nanopartculas de quitosano como vehculo de
encapsulacin es inferior a la
obtenida con formulaciones de quitosano en solucin o en polvo
[20].
4 Microesferas y nanopartculas de quitosano
El uso de sistemas micro y nanoparticulados para la encapsulacin
de frmacos permite
el transporte de stos al lugar de accin teraputica, el
incremento de su vida media y su
liberacin controlada en el tiempo. Adems, al ser partculas
pequeas, presentan una
relacin superficie-volumen alta [21].
La liberacin de un principio activo a partir de sistemas
particulados a base de quitosano
depende de la densidad de la matriz polimrica. As, mediante la
variacin de la
concentracin y del peso molecular del polmero e incorporando
copolmeros y agentes
entrecruzantes se pueden obtener sistemas de encapsulacin con
los perfiles de
liberacin adecuados en cada caso.
Las microesferas son sistemas homogneos en los que el frmaco est
disperso en una
matriz polimrica, a diferencia de las microcpsulas, en las que
el principio activo se
encuentra rodeado por una capa de polmero.
Las microesferas de quitosano constituyen uno de los sistemas de
liberacin controlada
de frmacos ms estudiados, tanto para su administracin parenteral
como por va oral.
Adems de controlar la liberacin de principios activos, mejoran
la biodisponibilidad de
sustancias degradables como las protenas y promueven la absorcin
de frmacos
hidrosolubles a travs de las membranas epiteliales.
Introduccin
23
Existen varios mtodos para la obtencin de microesferas, como son
[22]:
Gelificacin ionotrpica
Precipitacin
Atomizacin o spray-drying
Coacervacin simple
Coacervacin compleja
Entrecruzamiento qumico
Entrecruzamiento trmico
Emulsin
La atomizacin o spray-drying es un proceso de evaporacin de
solvente que se ha
empleado extensamente en la industria farmacutica para producir
polvos secos,
grnulos y aglomerados a partir de soluciones y suspensiones.
Esta tcnica se puede
utilizar tanto para frmacos resistentes al calor como para
frmacos sensibles, para
frmacos solubles o insolubles en agua y para polmeros
hidroflicos o hidrofbicos
[23]. Se trata de un proceso de una sola etapa que se puede
escalar fcilmente, es de
bajo coste, produce partculas de pequeo tamao y permite
reformular las partculas en
forma de suspensiones, cpsulas o comprimidos [24]. Las
microesferas obtenidas tienen
un tamao de una micra a varias decenas de micras y son adecuadas
para su
administracin por las vas oral, nasal o parenteral [25-28]. Los
parmetros del proceso
de atomizacin, como son el tipo de aguja, la velocidad de la
bomba y el flujo de air
comprimido, permiten modular el tamao de partcula.
Las nanopartculas han suscitado un gran inters en los ltimos aos
como sistemas de
liberacin de frmacos, sobre todo para vas de administracin
alternativas a la oral,
como aquellas que requieren inyeccin o deposicin en superficies
mucosas como la
nasal. Las nanopartculas se definen como aquellas partculas cuyo
tamao es inferior a
1m [29].
Ohya et al. (1994) [30] presentaron los primeros resultados de
nanopartculas de
quitosano para aplicaciones en liberacin de frmacos. Obtuvieron
nanopartculas
cargadas con 5-fluoroacilo por emulsin (w/o) y entrecruzadas con
glutaraldehido. Este
Introduccin
24
agente entrecuzante es txico, por lo que no es adecuado para la
encapsulacin de
frmacos.
Posteriormente, Calvo et al. (1997) [31] describieron la
preparacin de nanopartculas
de quitosano por gelificacin ionotrpica del quitosano y el
tripolifosfato sdico (de
ahora en adelante TPP), nanopartculas biodegradables y
biocompatibles preparadas por
un proceso ms suave, sin altas temperaturas ni solventes
orgnicos.
Las nanopartculas de quitosano y TPP presentan una serie de
interesantes
caractersticas que las hacen ser vehculos prometedores para la
liberacin de
macromolculas, tales como protenas y ADN. Algunas de estas
propiedades son: su
obtencin por un proceso suave, su tamao ajustable dependiendo de
los parmetros de
obtencin y la modulacin de su carga positiva y su capacidad de
asociacin a pptidos,
protenas, oligonucletidos y plsmidos [16, 32].
La gelificacin inica entre el quitosano y el TPP ha sido
utilizada en diversos estudios.
Por ejemplo, Urrusuno et al. (1999) [33] estudiaron el efecto de
nanopartculas de
quitosano y TPP cargadas con insulina sobre la absorcin de
insulina en conejos.
Observaron que las nanopartculas liberaron el frmaco en su forma
activa y que
promovieron su absorcin. Tambin se ha estudiado en ratones el
efecto sobre los
niveles de inmunoglobulina G en suero e inmunoglobulina A en
mucosa de
formulaciones preparadas por este mtodo con el toxoide del
ttanos, propiciando su
aumento tras la administracin nasal [34]. Pan et al. (2002) [35]
estudiaron la capacidad
de nanopartculas de quitosano-TPP para promover la absorcin
intestinal y la
biodisponibilidad farmacolgica de insulina tras su administracin
oral. Las
nanopartculas as formadas mejoraron la absorcin de insulina en
relacin con una
solucin de quitosano.
El tamao de las nanopartculas es uno de los factores que ms
afectan y determinan la
internalizacin de las mismas en mucosas y tejidos epiteliales y
su transporte dentro de
las clulas. La carga superficial de las nanopartculas determina
sus propiedades
mucoadhesivas y se ha descrito en la bibliografa que la
habilidad de las nanopartculas
para escapar a la accin de los endolisosomas y liberar el
principio activo depende as
mismo de dicha carga superficial [32]. Ambas caractersticas
pueden ser controladas
variando ciertas condiciones y variables del proceso de
obtencin, como la
concentracin de quitosano, la proporcin quitosano: TPP y el pH
de la solucin. La
Introduccin
25
proporcin de quitosano:TPP es, adems, la responsable de la
formacin de las
nanopartculas [36].
5 Pelculas de quitosano
El carcter filmognico del quitosano dio lugar a una de las
primeras aplicaciones
investigadas de este polmero natural. Es posible formar pelculas
de quitosano con
buenas propiedades fsicas y mecnicas a partir de sus
disoluciones en cidos diluidos
[37], tales como frmico, actico o propinico [38]. Las
propiedades filmognicas del
quitosano se deben a la formacin de enlaces de hidrgeno
intermoleculares entre los
grupos amino e hidroxilo de sus cadenas. A pH cido estos enlaces
de hidrgeno se
disocian debido a la protonacin de los grupos amino y se produce
un rpido
hinchamiento de la pelcula.
Muzzarelli plante por primera vez en 1974 dos metodologas
generales de trabajo para
obtener pelculas de quitosano; la primera es mediante la
evaporacin del cido
empleado en la solucin de quitosano (mtodo de evaporacin de
solvente), y la
segunda se basa en la preparacin directa de quitosano a partir
de la pelcula quitinosa
de la jibia (molusco cefalpodo). Este ltimo mtodo [39] no result
eficiente, pues las
propiedades mecnicas de las pelculas obtenidas no fueron las
idneas, por lo cual no
es utilizado en la actualidad.
Las posibles aplicaciones de las pelculas de quitosano se
extienden a la medicina, la
industria fotogrfica, la alimentacin y la cosmtica [40, 41]. En
el campo de la
farmacia, las pelculas de quitosano se han empleado para el
recubrimiento de
comprimidos [42] y como sistemas de liberacin controlada de
frmacos
[43].
El uso de pelculas de quitosano para el tratamiento de heridas
cutneas presenta un
gran inters puesto que se puede administrar el frmaco de forma
localizada y sostenida
en el sitio de accin. Se trata de un sistema ventajoso con
respecto al uso de cremas, ya
que stas deben ser aplicadas continuamente y son eliminadas con
facilidad. Se ha
descrito en la bibliografa el uso de pelculas de quitosano para
el vendaje de heridas
cutneas y pelculas con minociclina para el tratamiento de
quemaduras en ratas [44].
Las pelculas de quitosano resultan efectivas porque protegen la
herida, absorben el
exudado, tienen accin antibacteriana [45, 46]y favorecen la
cicatrizacin de heridas al
estimular la proliferacin de fibroblastos [47, 48]. Por otro
lado, tambin se han
realizado estudios de citotoxicidad del quitosano en clulas
cutneas como
Introduccin
26
queratinocitos y fibroblastos, estudios importantes para este
tipo de aplicacin, y se ha
comprobado que no presenta citotoxicidad in vitro [49].
El carcter hemosttico del quitosano ha promovido su utilizacin
en parches y vendajes
hemostticos [50]. Prueba de ellos es la comercializacin de
varios productos de este
tipo a base de quitosano por parte de la empresa HemCon Medical
Technologies INC
(Oregon, EEUU).
5.1 Hinchamiento de las pelculas de quitosano
La hidratacin de los polmeros es uno de los factores que
influyen en la liberacin de
principios activos a travs de matrices polimricas. La
hidrofilicidad en los polmeros
est dada por el grado de hinchamiento, el cual se calcula a
partir de la relacin entre el
volumen de gel hinchado y el volumen de gel seco. Durante el
proceso de hinchamiento
se produce la incorporacin del lquido en el interior de la
matriz, producto de la
diferencia de potencial qumico del disolvente dentro y fuera de
ella, provocando una
dilatacin de la misma. Al proceso de dilatacin se opone una
fuerza elstica-retrctil, la
cual se opone a la penetracin del solvente [51]. El equilibrio
de hinchamiento se
alcanza cuando se igualan la fuerza de hinchamiento y la fuerza
elstica-retrctil.
En los hidrogeles inicos, la presencia de grupos cargados
confiere caractersticas
nicas al hinchamiento. Dichas caractersticas dependen del pH y
la fuerza inica del
medio. Peppas y Khare [52] determinaron como factores clave que
afectan el
hinchamiento:
Grado de ionizacin.
Equilibrio de ionizacin.
Naturaleza de los contraiones.
El modelo ms comn para estudiar la difusin es el propuesto en
las leyes de Fick. En
la primera ley se define que, en estado de equilibrio, el flujo
del penetrante es
proporcional al gradiente de concentracin [51]:
J = - D (dc/dx) (I.1)
donde J representa el nmero de molculas de sustancia por segundo
y por unidad de
superficie perpendicular a la direccin de flujo, D es el
coeficiente de difusin, y dc/dx
es el gradiente de concentracin.
Introduccin
27
Existen otros modelos de cinticas que describen el
comportamiento del hinchamiento
en los polmeros. Un ejemplo de los mismos es el planteado por
Schott [53], donde se
estudia la cintica de hinchamiento en pelculas de gelatina y
celulosa. El autor llega a
una ecuacin emprica que ajusta los valores obtenidos para todo
el proceso de
hinchamiento. Dicha ecuacin es:
t
A BtW
(I.2)
donde W representa el hinchamiento a un tiempo t, A es la
ordenada en el origen y B es
el inverso del hinchamiento mximo. El hinchamiento se calcula
por la ecuacin [54]:
0
0
M MW
M (I.3)
donde M es el peso de la pelcula a un tiempo t y M0 es el peso
de la pelcula antes del
proceso de hinchamiento.
Para tiempos grandes Bt >>A, la pendiente B se define como
el inverso del
hinchamiento mximo1
W, mientras que para tiempos cortos Bt se puede despreciar y
en este caso A es el recproco de la velocidad inicial de
hinchamiento
0
1A
dW
dt
.
A diferencia del comportamiento Fickiano, en que el hinchamiento
est controlado por
la difusin, en el modelo de Schott el hinchamiento esta
controlado por la relajacin de
las cadenas.
Al representar los valores de t
W en funcin de t, Schott demostr que el proceso de
hinchamiento de estos materiales responda a una cintica de
segundo orden respecto al
hinchamiento remanente, representada por la siguiente
ecuacin:
2dW
K W Wdt
(I.4)
donde W es el hinchamiento a tiempo infinito, W el hinchamiento
a tiempo t y K la
constante del sistema. El proceso completo de transporte en una
matriz polimrica
depende principalmente de dos factores, los cuales estn
gobernados por una amplia
variedad de elementos relacionados con la composicin y las
condiciones
Introduccin
28
experimentales. Uno de ellos es la movilidad segmental de las
cadenas polimricas y el
otro est relacionado con la estructura y morfologa del polmero.
En cuanto al primer
factor, el movimiento difusivo depende de la movilidad relativa
de las molculas del
penetrante y de los segmentos de la cadena polimrica, su tamao,
concentracin, la
interaccin de los componentes, la temperatura y otros factores
que afectan la movilidad
segmental del polmero[51]. La estructura de la red polimrica es
un parmetro
determinante cuando se describe el transporte a travs de las
pelculas, ya que la
magnitud del espacio entre las cadenas polimricas va a
determinar cmo se produce
dicho transporte.
6 El quitosano como promotor de la absorcin de frmacos
El uso de promotores de absorcin de frmacos en las formulaciones
farmacuticas est
siendo objeto de estudio actualmente para mejorar la liberacin
de frmacos a travs de
las mucosas. Los promotores empleados suelen ser polmeros
multifuncionales con
propiedades mucoadhesivas, capaces de abrir transitoriamente las
uniones intercelulares
en el epitelio, que no muestren toxicidad y que no se absorban,
siendo el quitosano uno
de los polmeros ms estudiados [55].
Illum et al. (1994) [27] estudiaron el efecto de una solucin de
quitosano de alto peso
molecular sobre el transporte de insulina a travs de la mucosa
nasal en ratas y ovejas.
Sus resultados fueron prometedores y desde entonces se han
realizado muchos estudios
sobre el potencial del quitosano para mejorar la absorcin de
frmacos peptdicos a
travs de las mucosas. Por otro lado tambin se ha estudiado la
administracin nasal de
antgenos en soluciones de quitosano y quitosano en polvo y se ha
visto que promueven
la respuesta inmune del organismo. Illum et al. (2001) [56]
evaluaron en humanos una
vacuna nasal de la gripe basada en una solucin de quitosano. Ms
del 70% de los
voluntarios presentaron niveles protectores tras la
administracin intranasal.
El efecto positivo del quitosano sobre la liberacin de frmacos a
travs de los epitelios
se debe a una combinacin entre sus propiedades mucoadhesivas y
su capacidad para
abrir las uniones estrechas (del ingls tight junctions) entre
clulas epiteliales,
facilitando as el transporte de frmacos, sobre todo frmacos
macromoleculares, a
travs del epitelio.
Introduccin
29
Mucoadhesin
La mucoadhesin aumenta el tiempo de permanencia y el contacto
entre la membrana y
la formulacin, lo cual permite una liberacin del principio
activo de forma sostenida en
el tiempo, reduciendo as la necesidad de varias dosis. Se ha
descrito en la bibliografa
que la administracin de principios activos combinados con el
quitosano prolonga el
tiempo de contacto entre el frmaco y la superficie de absorcin
de las mucosas en
general [57].
Las propiedades mucoadhesivas del quitosano se deben a la
interaccin entre sus grupos
amino protonados y la capa de mucus. ste est compuesto por una
glicoprotena, la
mucina, que tiene cargas negativas debido a la presencia de
residuos de cido silico. La
unin depende de la cantidad de cido silico presente en la mucina
y del grado de
desacetilacin del quitosano o grupos amino libres. He et al.
(1998) [58] estudiaron la
mucoadhesin de microesferas de quitosano en epitelio intestinal
de rata y vieron que
sta aument con el nmero de grupos amino libres debido a los
monmeros de
glucosamina del quitosano. EL pH tambin influye en las
propiedades mucoadhesivas
del quitosano ya que a pH cido el quitosano se encuentra cargado
positivamente (pKa
6,5). Tambin se ha descrito que los quitosanos con cadenas
polimricas ms largas
penetran ms en la capa de mucina, por lo que un alto peso
molecular del quitosano
tambin puede favorecer la mucoadhesin [59, 60]. En definitiva,
un quitosano de peso
molecular alto y grado de desacetilacin alto favorece la
mucoadhesin.
Apertura de uniones estrechas entre clulas epiteliales
Los epitelios actan como barreras que separan al organismo del
medio externo, de
forma que incluso el movimiento de iones a travs del epitelio
est retringido, dando
lugar a diferencias de potencial elctrico. Las molculas pueden
atravesar el epitelio de
varias formas:
Por transporte pasivo o difusin, que se produce a favor de
gradiente de
concentracin o gradiente de carga elctrica y que, por lo tanto,
no supone un
gasto de energa para las clulas. La difusin pasiva puede
producirse a travs de
la membrana celular (transporte transcelular) o entre clulas
adyacentes
(transporte paracelular).
Introduccin
30
Por transporte activo, mecanismo que permite a la clula
transportar sustancias a
travs de su membrana desde regiones menos concentradas a otras
ms
concentradas. Es un proceso que requiere energa.
Las molculas lipoflicas atraviesan fcilmente la membrana celular
por difusin pasiva.
Sin embargo, las molculas hidroflicas no pueden atravesar la
membrana hidrofbica,
por lo que tienen que atravesar el epitelio por la va
paracelular. Esta va est restringida
por la presencia de las uniones estrechas, estructuras
multiproteicas dinmicas y
complejas que constituyen una barrera semipermeable, que
restringe la difusin
dependiendo de la carga y el tamao del soluto. En el epitelio,
las uniones estrechas se
encuentran en la membrana plasmtica en clulas adyacentes (Figura
I.2) y forman una
estructura continua que rodea a las clulas completamente. Las
uniones estrechas del
epitelio forman una barrera funcional y morfolgica entre las
superficies apical y
basolateral de las clulas y regulan la difusin a travs de la va
paracelular[61].
Complejo de protenas de unin estrecha
Zona basal
Zona apical
Membrana celular
Espacio paracelular
Transporte paracelular
Unin estrecha
Transporte paracelular
Membranaapical
Membranabasolateral
Figura I.2. Representacin esquemtica de las uniones estrechas
entre clulas epiteliales y el transporte
paracelular.
La unin estrecha est formada por un grupo de protenas
transmembrana y citoslicas
que no slo interactan entre ellas, sino tambin con la membrana
celular y el
citoesqueleto de actina, de modo que forman un sistema que une a
los componentes de
las uniones estrechas con el citoesqueleto. Existen varios tipos
de protenas distintas
dentro del grupo que forma parte de las uniones
estrechas[61]:
Introduccin
31
La ocludina es una de las protenas integrales de membrana que
forma parte de las
uniones estrechas. Por un lado proporciona la integridad
estructural de la unin y por
otro regula su funcin de barrera. Hay estudios que asocian las
ocludinas a la regulacin
de la difusin de pequeos marcadores hidroflicos, por lo que estn
implicadas en la
regulacin de la dinmica de las uniones.
Las claudinas son las principales responsables del ensamblaje de
las bandas formadas
por las uniones estrechas y de la formacin de rutas selectivas
de difusin paracelular de
iones, ya que diferentes protenas de la familia de las claudinas
permiten el paso de
distintos tipos de iones.
Se conocen tres protenas citoslicas, ZO-1, ZO-2 y ZO-3 (del latn
Znula
occludens, que significa unin estrecha), denominadas protenas
asociadas a uniones
estrechas, que interactan entre ellas y ponen en contacto la
unin estrecha con el
citoesqueleto. Adems se ha descrito que regulan la funcin de la
unin estrecha junto
con la ocludina. El estado de fosforilacin de estas protenas
reguladoras se ha asociado
con diferencias en la permeabilidad en modelos in vitro. Las
mismas rutas de
sealizacin cuyo efecto final es la fosforilacin de dichas
protenas pueden tambin
afectar al citoesqueleto de actina, asociado a la membrana
plasmtica por un grupo de
filamentos de actina situado debajo de la unin estrecha y por un
anillo de filamentos a
nivel de la unin de adhesin que tambin contiene miosina II. La
disrupcin del
citoesqueleto est asociada con la apertura de las uniones
estrechas y, por tanto, al
aumento de la permeabilidad paracelular [62].
Smith et al. (2005) [63] describieron que la habilidad del
quitosano en solucin y en
forma de nanopartculas para modular las uniones estrechas se
puede explicar por las
posibles interacciones del quitosano con receptores especficos
de la superficie celular
que conlleva la activacin de la transduccin de seales
dependiente de la protena
kinasa C (PKC). La activacin de la PKC adems induce la prdida de
asociacin de las
protenas de las uniones estrechas, la ZO-1 y la ocludina, en la
membrana plasmtica y,
por tanto, la prdida de las uniones estrechas. Ranaldi et al.
(2002) [64] tambin
demostraron que el tratamiento con quitosano alteraba la
distribucin de F-actina en
clulas Caco-2.
Introduccin
32
7 Cultivos celulares como modelo epitelial
Los estudios con cultivos de clulas epiteliales permiten una
fcil evaluacin de las
propiedades de las uniones entre clulas y constituyen un mtodo
muy utilizado en
experimentos de transporte de principios activos a travs de
monocapas celulares.
Para llevar a cabo este tipo de experimentos, las clulas
epiteliales se suelen sembrar en
soportes permeables (transwells) (Figura I.3), que estn
constitudos por una membrana
y una cmara basal y otra apical. Sobre estos soportes, las
clulas sembradas forman
monocapas.
Compartimento apical
Monocapa de clulas
Filtro microporosoCompartimento basolateral
Figura I.3. Esquema de una monocapa celular en un soporte
permeable.
Se realizan dos tipos de estudios en relacin con las uniones
estrechas: la medida de
corrientes elctricas y el estudio del flujo de compuestos
marcados a travs de las
monocapas. Como se ha comentado en el apartado anterior, las
uniones estrechas
limitan la difusin paracelular de molculas hidroflicas de forma
selectiva, por carga y
tamao. Cuando el movimiento de iones a travs de la monocapa est
restringido debido
al correcto funcionamiento de la unin estrecha, existe un
gradiente de potencial
elctrico a ambos lados de la misma. Por ello, la integridad y la
madurez de las uniones
estrechas se suele determinar midiendo la resistencia elctrica
transepitelial (TEER),
que es inversamente proporcional a la permeabilidad, empleando
para ello un voltmetro
cuyos electrodos pueden aplicarse directamente sobre los
soportes permeables. Este
estudio se realiza en medio de cultivo, por lo que refleja
principalmente la
permeabilidad al sodio.
Las medidas de TEER se suelen realizar para hacer un seguimiento
del crecimiento
celular tras la siembra, ya que su valor aumenta a medida que se
va formando la
monocapa de clulas. As mismo, se realizan medidas de TEER
durante los
Introduccin
33
experimentos de permeabilidad de sustancias problema para
observar cualquier cambio
en la integridad de la monocapa. Los experimentos de
permeabilidad paracelular se
llevan a cabo con compuestos marcados con fluorescencia como
dextranos, o bien con
protenas que se pueden cuantificar con ensayos enzimticos. De
esta forma es posible
cuantificar la cantidad de compuesto que pasa de la parte apical
a la basal en un perodo
de tiempo concreto. Se pueden emplear marcadores de distintos
pesos moleculares para
evaluar la eficiencia de un determinado promotor de
permeabilidad celular.
Existen distintas lneas de clulas epiteliales que se utilizan
como modelos para
experimentos de permeabilidad y de evaluacin de la apertura de
uniones estrechas.
Clulas Calu-3
Los modelos celulares in vitro son muy utilizados con el fin de
estudiar la deposicin y
absorcin de frmacos tras su administracin por la va
respiratoria, aunque existen
otros mtodos como son estudios con modelos de perfusin en pulmn
aislado y anlisis
frmaco-cinticos in vivo.
La lnea celular Calu-3 procede de adenocarcinoma de pulmn humano
y se utiliza
como modelo del epitelio de las vas respiratorias [65]. El lumen
y el tejido submucoso
de los conductos respiratorios constituyen el lugar de accin de
una gran cantidad de
frmacos, pero tambin constituye una barrera frente a la absorcin
de dichos frmacos.
Por tanto, el epitelio respiratorio es una membrana clave a
estudiar, tanto por ser una
barrera para el transporte de frmacos, como por ser un lugar
donde los frmacos
pueden ejercer su toxicidad. El epitelio vara entre un epitelio
pseudo-estratificado en
columnas, con tres tipos principales de clulas (ciliadas,
basales y secretoras)
interconectadas por uniones estrechas en los bronquios
proximales, hasta un epitelio
progresivamente ms cuboidal, no cicliado y localizado en los
bronquiolos distales [65].
Una caracterstica importante del epitelio respiratorio es su
diferenciacin en capas de
clulas interconectadas por uniones estrechas intercelulares, que
limitan el transporte
paracelular de solutos, por lo que afecta a la absorcin y el
metabolismo de frmacos.
Otras caractersticas propias de este epitelio incluyen la
produccin de mucus, la
presencia de cilios apicales y la expresin de transportadores y
sistemas metablicos. Se
ha demostrado en varios estudios que algunas de estas
caractersticas estn presentes en
las clulas Calu-3, lo que sugiere la utilidad de esta lnea
celular como modelo del
epitelio respiratorio [66, 67].
Introduccin
34
Las condiciones de cultivo tienen un efecto importante sobre la
diferenciacin de las
clulas epiteliales respiratorias y deben ser optimizadas para
cada modelo celular
individualmente. Se han descrito tanto cultivos sumergidos como
cultivos con una
interfase aire-lquido para clulas Calu-3 [68, 69]. La formacin
de cilios est
influenciada por el mtodo de incubacin, siendo ms cortos y
gruesos en cultivos
sumergidos[70].
Uno de los primeros trabajos sobre transporte de frmacos en
clulas Calu-3 fue
realizado por Cavet et al. (1997) [71]. Estudiaron el transporte
de ciprofloxacino a
travs de monocapas constituidas por estas clulas y observaron
que el antibitico era
transportado principalmente por va transcelular por difusin
pasiva. Este resultado
concidi con los resultados de estudios frmaco-cinticos en
humanos.
8 Agentes entrecruzantes
Los sistemas de liberacin a base polmeros biodegradables
necesitan ser entrecruzados
para modular sus propiedades y mantener la estabilidad de la
matriz y as cumplir el
objetivo de liberar el frmaco a lo largo del tiempo deseado. El
quitosano, como se ha
comentado, se disuelve en condiciones cidas, lo que limita su
aplicacin como sistema
de liberacin. El entrecruzamiento puede reducir la solubilidad
del quitosano en
solventes acuosos, aumentar su resistencia a la degradacin
qumica o biolgica y
ayudar a controlar la liberacin de principios activos desde la
matriz formada. El
glutaraldehido es un agente entrecruzante muy utilizado, pero su
capacidad de
transformacin en especies reactivas txicas ha promovido la
bsqueda de otros agentes
y procedimientos de entrecruzamiento ms seguros, como son el
tripolifosfato sdico y
la genipina [72].
Tripolifosfato sdico
El tripolifosfato sdico (TPP) es un agente entrecruzante no
txico (reconocido como
GRAS por la FDA) que es capaz de formar geles al unirse con el
quitosano por
interaccin inica.
Desde que Bodmeier et al. (1989) [73] describiesen la preparacin
de complejos
quitosano/TPP, la formacin de complejos entre estas molculas con
cargas opuestas
para obtener formulaciones que controlan la liberacin de frmacos
ha ganado inters
puesto que se trata de un proceso muy simple. Concretamente, la
formulacin de micro
Introduccin
35
y nanopartculas por interaccin inica entre el quitosano y el
tripolifosfato sdico es
muy comn porque implica la mezcla de dos fases acuosas a
temperatura ambiente sin
el uso de solventes orgnicos.
La reaccin que se produce entre el quitosano y el TPP ha sido
descrita en la
bibliografa [74, 75]. El TPP (Na5P3O10) disuelto en agua se
disocia en iones
tripolifosfricos y en OH
y la solucin resultante tiene pH 9. Los pKa del TPP son:
pK1=1, pK2=2, pK3=2,79, pK4=6,47 y pK5=9,24 [76]. Los aniones
procedentes del TPP
(P3O105-
, HP3O104-
y H2P3O103-
) coexisten en solucin acuosa en funcin del pH.
Dependiendo del valor de ste, predominarn unos u otros y de ello
depender el tipo de
interaccin que ocurra entre el TPP y el quitosano. Cuando el TPP
se disuelve en agua,
con pH 9, se disocia en iones P3O105-
y, ste a su vez en HP3O104-
y en iones OH-. Al
aadir la solucin de este agente entrecruzante (pH 9) a una
solucin de quitosano (pH
cido), los iones P3O105-
y HP3O104-
compiten con los OH- por reaccionar con los grupos
NH3+ del quitosano por entrecruzamiento inico, en el caso de los
iones tripolifosfricos
o por desprotonacin, en el caso de los OH- (Figura I.4).
A pH 9 de la disolucin de TPP, por tanto, habr grupos amino
neutralizados por los
grupos hidroxilo y grupos amino entrecruzados inicamente.
Sin embargo, si el pH del TPP es ajustado a un pH cido, slo
existirn iones
tripolifosfricos. El tipo de iones tripolifosfricos y su
proporcin vendrn dados por el
pH de la solucin. En este caso, el complejo quitosano-TPP se
forma exclusivamente
por entrecruzamiento inico entre los grupos NH3+ y los aniones
de TPP.
Introduccin
36
a) neutralizacin de los grupos amino
b) entrecruzamiento inico
Figura I.4. Esquema de la reaccin entre el quitosano en solucin
cida y los iones de TPP: A-
neutralizacn de los grupos amino, B- entrecruzamiento
inico[75].
Genipina
La genipina (Figura I.5) es un compuesto de origen natural que
se obtiene a partir del
genipsido procedente del fruto de Genipa americana y Gardenia
jasminoides. Estos
frutos tienen propiedades antiinflamatorias, diurticas,
colerticas y hemostticas[77].
Una propiedad destacable de la genipina es su capacidad de
reaccionar espontneamente
con aminas primarias, dando lugar a pigmentos azules. Se ha
descrito su reaccin con
materiales que contienen grupos amino, como el quitosano y
algunos pptidos y
protenas, dando lugar a estructuras entrecruzadas qumicamente.
Dicha propiedad
permite su utilizacin como agente entrecruzante en sistemas de
liberacin de frmacos.
Introduccin
37
Se ha comprobado que la genipina presenta una toxicidad
5000-10000 veces ms baja
con respecto al glutaraldehido[78].
O
CH2OH
O OCH3
OH
Figura I.5. Estructura qumica de la genipina.
Durante la reaccin de entrecruzamiento entre la genipina y el
quitosano se producen
dos reacciones separadas. La primera reaccin consiste en un
ataque nucleoflico por
parte de los grupos amino del quitosano sobre el carbono 3 de la
genipina, que da lugar
a la formacin de un compuesto heterocclico de la genipina unida
al residuo de
glucosamina en el quitosano. La segunda reaccin, ms lenta,
consiste en una
sustitucin nucleoflica del grupo ester de la genipina, liberando
metanol y formndose
un enlace amida con el quitosano. En la Figura I.6 se muestra un
esquema del
entrecruzamiento del quitosano con genipina. Simultneamente, se
puede producir una
polimerizacin entre molculas de genipina que ya estn unidas a
los grupos amino del
quitosano, lo cual puede dar lugar al entrecruzamiento del
quitosano a travs de
copolmeros de genipina [77].
O
H
O
O
H
H
CH2OH
H
OH
H
H
NH
H
OH
NH2
H
HOH
CH2OH
N
CH2OH
O
OH
O
H
O
O
H
OH
HOH2C
H
H
H
H
H
H
HOH
CH2OH NH2
H
Figura I.6. Esquema del entrecruzamiento del quitosano con la
genipina.
Introduccin
38
La genipina ha sido utilizada en la obtencin de diversos
sistemas de liberacin de
frmacos tales como microcpsulas e hidrogeles. Mi et al.
prepararon complejos
polielectrolitos con la membrana formada por alginato y
quitosano y el interior de la
cpsula compuesto por quitosano entrecruzado con genipina [79],
as como cpsulas de
quitosano entrecruzadas simultneamente por entrecruzamiento
inico con TPP y
qumico con genipina[80]. Barck & Butler (2005) emplearon
distintos polmeros
polianinicos, entre ellos el alginato, para formar complejos
polielectrolitos con
quitosano y entrecruzados con genipina[81]. Por otro lado,
microcpsulas de alginato-
quitosano con el interior compuesto de alginato y la membrana de
quitosano con
genipina fueron preparadas por Chen et al. (2006) para la
encapsulacin de clulas vivas
y otras aplicaciones en liberacin [82]. Hidrogeles de quitosano
entrecruzados con
genipina han sido preparados y caracterizados en diversos
trabajos [83, 84]. Slo se han
descrito en la biliografa algunos estudios sobre la preparacin,
caracterizacin y
liberacin in vitro de frmacos a partir de microesferas de
quitosano entrecruzadas con
genipina. Mi et al. (2001) prepararon microesferas de quitosano
por un mtodo de
dispersin agua en aceite, utilizando genipina como agente
entrecruzante[85]. Yuan et
al. (2007) obtuvieron microesferas de quitosano, albmina bovina
y genipina[86].
9 Frmacos empleados
Claritromicina
La claritromicina es un antibitico perteneciente al grupo de los
macrlidos, que ejerce
su accin antibacteriana por interferir en la sntesis de protenas
de las bacterias
sensibles ligndose a la subunidad ribosomal 50S. Se trata de una
sustancia bsica de
carcter cristalino, de color blanco. Su masa molecular es 747
g/mol. En la Figura I.7 se
presenta la estructura molecular de la claritromicina.
Introduccin
39
Figura I.7. Estructura molecular de Claritromicina.
La claritromicina es bactericida para Helicobacter pylori,
presente en la mucosa gstrica
de la mayora de los pacientes con lcera duodenal o gastritis. La
infeccin por
Helicobacter pylori se considera uno de los principales factores
patognicos
responsables de la lcera gstrica.
La terapia con antibiticos presenta ciertos inconvenientes, como
la necesidad de una
dosis frecuente para mantener la concentracin de frmaco en
plasma al nivel
teraputico, el bajo cumplimiento por parte del paciente,
infecciones causadas por
microorganismos resistentes y efectos secundarios en el tracto
gastrointestinal [87]. La
ineficacia descrita en el tratamiento de la infeccin por H.
pylori puede ser debida a la
baja estabilidad de los antibiticos en el medio cido del
estmago, a la baja absorcin a
travs de la capa de mucus, o a la administracin de una dosis
sub-teraputica[60].
La liberacin especfica de claritromicina en el estmago a travs
de un sistema de
encapsulacin basado en quitosano podra ser un tratamiento
adecuado frente a
H.pylori. El quitosano se hincha en medio cido, es un sistema
adecuado para la
liberacin controlada de frmacos, presenta propiedades anticidas,
disminuye la
irritacin en el estmago causada por la administracin de
frmacos[60] y ejerce
actividad antibacteriana debido a la unin de los grupos
catinicos del quitosano a las
molculas aninicas de la superficie externa de la membrana
bacteriana [88]. Adems,
como se ha explicado anteriormente, es bioadhesivo y acta sobre
las uniones estrechas
entre clulas epiteliales, por lo que aumenta el tiempo de
residencia en el tejido y
promueve la absorcin del frmaco a travs de las mucosas. Por otro
lado, la
Introduccin
40
microencapsulacin de claritromicina en una matriz polimrica la
protegera frente a la
degradacin a pH cido.
La claritromicina es soluble a pH cido y su solubilidad
disminuye al aumentar el pH,
por lo que es ms soluble y se absorbe mejor en el estmago que en
el intestino.
Se han descrito en la bibliografa otros estudios de encapsulacin
de claritromicina.
Majithiya y Murthy (2005) [60]obtuvieron microesferas de
quitosano con claritromicina
por emulsificacin y entrecruzamiento con glutaraldehido. Zgoulli
et al. (1999) [24]
prepararon microesferas cargadas con eritromicina y
claritromicina por atomizacin
para enmascarar su sabor, aumentar la biodisponibilidad de estos
antibiticos y mejorar
su estabilidad.
Hidrocloruro de tramadol
El hidrocloruro de tramadol (Figura I.8) es un opiceo sinttico
del grupo de los
aminociclohexanoles (clorhidrato de () cis-2-
[(dimetillamino)metil]-1-(3-metoxifenil)
ciclohexanol) con accin analgsica a nivel central. El tramadol
es un anlogo sinttico
de la codena, con una menor afinidad que sta hacia los
receptores opiceos. Su vida
media es de 5,5 horas, y la dosis adecuada suele ser de 50-100mg
cada 4-6 horas. La
frmula emprica es C16H25NO2 y su masa molecular 263g/mol.
Figura I.8. Estructura molecular del hidrocloruro de
tramadol.
El tramadol es un analgsico opiceo con un mecanismo dual de
accin. Es una mezcla
racmica de los ismeros trans, observndose importantes
diferencias desde el punto de
vista bioqumico, farmacolgico y metablico entre ambos
enantimeros. El tramadol
tiene un potencial mucho menor que otros opiceos para inducir
depresin respiratoria y
dependencia, pero ambos efectos adversos pueden tener lugar.
Para disminuir la
frecuencia de administracin, sera deseable administrarlo a travs
de una forma
farmacutica de accin retardada.
Introduccin
41
Hidrocloruro de ciprofloxacino
El hidrocloruro de ciprofloxacino (Figura I.9) es un antibitico
del grupo de las
fluoroquinolonas. Se utiliza en casos de pneumona, infecciones
cutneas y es uno de
los antibiticos ms utlizados en oftalmologa [89]. Su peso
molecular es de
331,35g/mol. Es activo frente a un amplio espectro de bacterias
Gram-negativas
aerobias, incluyendo patgenos entricos, Pseudomonas y Serratia
marcescens, aunque
ya han empezado a aparecer cepas resistentes. Igualmente es
activo frente a bacterias
Gram-positivas, aunque tambin se han detectado resistencias en
algunas cepas de
Staphyloccocus aureus y Pneumococos. No es activo frente a
microorganismos
anaerobios. Se utiliza ocasionalmente, en combinacin con otros
antibacterianos, en el
tratamiento de las infecciones por micobacterias.
Los efectos antibacterianos del hidrocloruro de ciprofloxacino
se deben a la inhibicin
de la topoisomerasa IV y la DNA-girasa bacterianas. Estas
topoisomerasas alteran el
DNA introduciendo pliegues superhelicoidales en el DNA de doble
cadena, facilitando
el desenrollado de las cadenas. La DNA-girasa tiene dos
subunidades codificadas por el
gen gyrA, y actuan rompiendo las cadenas del cromosoma
bacteriano y luego
pegndolas una vez que se ha formado la superhlice. Las
quinolonas inhiben estas
subunidades impidiendo la replicacin y la transcripcin del DNA
bacteriano. Las
clulas humanas y de los mamferos contienen una topoisomerasa que
acta de una
forma parecida a la DNA-girasa bacteriana, pero esta enzima no
es afectada por las
concentraciones bactericidas del hidrocloruro de
ciprofloxacino.
Este principio activo puede producir efectos secundarios cuando
se administra por va
oral, como dolor abdominal, nauseas, dolor de cabeza, entre
otros. Una forma
alternativa de administracin, como la va tpica podra minimizar
estos efectos
secundarios [90].
N
NH
N
F
O
OH
O
Figura I.9. Estructura molecular del hidrocloruro de
ciprofloxacino
Introduccin
42
10 Modelos matemticos
Los estudios de disolucin/liberacin in vitro constituyen un
eslabn importante dentro
de la cadena del desarrollo de un nuevo medicamento. Bajo
ciertas condiciones puede
servir para aportar criterios de biodisponibilidad y
bioequivalencia.
Un objetivo fundamental a la hora de desarrollar nuevos sistemas
de liberacin
controlada, es poder predecir los niveles plasmticos que
alcanzar el frmaco una vez
administrado. De esa forma, el desarrollo de los procesos de
obtencin de nuevos
medicamentos puede ser acelerado, de modo que stos pueden
ponerse en el mercado
con mayor brevedad y a menor precio. Por este motivo se han
desarrollado numerosos
modelos matemticos que permiten predecir las cinticas de
disolucin- liberacin de
los principios activos incluidos en los sistemas de liberacin
controlada, y por tanto su
biodisponibilidad in vivo. Estos modelos permiten interpretar
los resultados
cuantitativos de un ensayo de liberacin in vitro a travs de una
ecuacin que relaciona
varios parmetros [91]. Para comparar diferentes perfiles de
liberacin se pueden
emplear mtodos matemticos (mtodos modelo dependiente) y mtodos
estadsticos
(mtodos modelo independiente), que incluyen el anlisis de la
varianza, de una o dos
vas (ANOVA).
Los modelos matemticos facilitan el anlisis cuantitativo de los
resultados obtenidos en
los ensayos de liberacin/disolucin, y describen los resultados
de liberacin en funcin
de alguna de las caractersticas o variables de la formulacin
empleada [91].
Cintica de orden cero
Las formas farmacuticas que presentan esta cintica liberan la
misma cantidad de
frmaco por unidad de tiempo. Es el mecanismo de liberacin ideal
cuando se quiere
conseguir una accin farmacolgica prolongada.
La liberacin del frmaco desde formas farmacuticas que no se
disgregan y que liberan
el principio activo lentamente (asumiendo que el rea no cambia y
que no se alcanzan
condiciones de equilibrio), puede ser representada por la
siguiente ecuacin:
W0-Wt = Kt (I.5)
donde W0 es la cantidad inicial de frmaco en la forma
farmacutica, Wt es la cantidad
de frmaco presente en la misma a tiempo t y K la constante de
proporcionalidad.
Introduccin
43
Si esta ecuacin se divide entre W0 y se simplifica, se
obtiene:
ft = K0 t (I.6)
donde )/(1 0WWf tt y tf representa la fraccin de frmaco liberado
a tiempo t y K0
la constante de liberacin aparente o constante de orden cero. De
esta forma, una grfica
de la fraccin de frmaco liberado en funcin del tiempo ser lineal
si se cumplen las
condiciones anteriores.
Otra forma de expresar este modelo se refleja en la siguiente
ecuacin:
Qt = Q0 + K0t (I.7)
donde Qt es la cantidad de frmaco liberado a tiempo t, Q0 es la
cantidad inicial de
frmaco en solucin, que generalmente es cero y K0 es la constante
de velocidad en la
cintica de orden cero.
Cintica de primer orden
La aplicacin de este modelo al estudio de la liberacin de
frmacos fue propuesto por
primera vez por Gibaldi y Feldman en 1967 [92]. La cintica de
orden uno presenta la
siguiente ecuacin de velocidad:
Qt = Q0 e -K1t
(I.8)
ln Qt= -K1t+ ln Q0 (I.9)
o en logaritmos decimales:
log Qt = -(K1t/2,303) +log Q0 (I.10)
donde Qt es la cantidad de frmaco liberado a tiempo t, Q0 es la
cantidad inicial de
frmaco en la solucin y K1 es la constante de primer orden.
De esta forma, la representacin del logaritmo de la cantidad de
frmaco disuelto frente
al tiempo transcurrido da lugar a una recta en los procesos con
cintica de primer orden.
Las formas farmacuticas que siguen este perfil de disolucin
suelen ser matrices
porosas que contienen principios activos hidrosolubles.
Modelo de Higuchi
Higuchi (1963) desarroll varios modelos tericos para estudiar la
liberacin de
frmacos solubles y poco solubles incorporados en matrices slidas
o semi-slidas[93].
Introduccin
44
Este modelo describe la liberacin del frmaco como un proceso de
difusin a travs de
la matriz de polmero, siempre y cuando se mantengan las
condiciones sumidero (del
ingls sink conditions), es decir, que se garantice la
solubilidad del frmaco en todo
momento durante la liberacin. Esta difusin est basada en la ley
de Fick, que depende
de la raz cuadrada del tiempo. Generalmente se emplea lo que se
conoce como
ecuacin simplificada de Higuchi:
Q = KH t1/2
(I.11)
donde Q es la cantidad de frmaco liberado y KH es la constante
de disolucin de
Higuchi.
Modelo de Hixson- Crowell o de la raz cbica
Hixson and Crowell (1931) [94], partiendo de la base de que el
rea regular de la
partcula es proporcional a la raz cbica de su volumen
propusieron la siguiente
ecuacin para describir este modelo:
W01/3
- Wt1/3
= Kst (I.12)
donde W0 es la cantidad inicial de frmaco en la forma
farmacutica, Wt es la cantidad
de frmaco que queda en la forma farmacutica a tiempo t y Ks es
una constante que
incorpora la relacin superficie-volumen.
Dividiendo la ecuacin anterior entre W01/3
y simplificando:
(1 f t) 1/3
= 1- K t (I.13)
donde )/(1 0WWf tt y representa la fraccin de frmaco disuelto a
tiempo t y K es la
constante de liberacin.
La grfica de la raz cbica de la fraccin de frmaco no liberada en
funcin del tiempo
ser lineal si la forma farmacutica disminuye de tamao
proporcionalmente en el
tiempo. Cuando se utiliza este modelo, se asume que la velocidad
de liberacin est
condicionada por la velocidad de disolucin de las partculas de
frmaco y no por la
difusin que pueda ocurrir a travs de la matriz polimrica.
Modelo de Korsmeyer-Peppas
Korsmeyer et al. (1983) [95] desarrollaron un modelo semiemprico
sencillo que
relaciona la liberacin de frmaco con el tiempo a travs de una
ecuacin exponencial.
Estos autores plantearon que, en ocasiones, el mecanismo de
difusin se desva de la
Introduccin
45
difusin Fickiana, siguiendo un comportamiento anmalo o no
Fickiano. Es un modelo
especialmente til cuando se desconoce el mecanismo de liberacin
o cuando sta
ocurre por ms de un mecanismo.
Mt/M= Ktn (I.14)
Log Mt/M= Log K+ n Log t (I.15)
donde Mt es cantidad de frmaco liberado a tiempo t, M es la
cantidad de frmaco que
se liberara a tiempo infinito (por tanto, Mt/M es la fraccin de
frmaco liberado a
tiempo t), K es la constante del sistema y n es el exponente
difusional. La representacin
del Log Mt/M en funcin del Log t dar lugar a una lnea recta si
el sistema se ajusta a
este modelo.
Segn los valores que tome n se pueden definir distintos
mecanismos de transporte [96].
En la Tabla I.2 se muestran los posibles mecanismos que se
pueden observar en la
liberacin controlada de un principio activo utilizando una
pelcula polimrica como
sistema regulador. Cuando n = 0,5 se trata de una difusin
Fickiana y la constante k
puede expresarse como:
1/ 2
24
iDk (I.16)
donde Di es el coeficiente de difusin del frmaco desde el
polmero y el espesor de la
matriz de polmero.
Valores de n > 0,5 se asocian a un mecanismo de difusin
anmalo (no Fickiano). En
particular, cuando n = 1, se trata de la cintica de orden cero,
que Peppas considera un
caso lmite de transporte no Fickiano, denominndolo Transporte
Caso II. En este
caso, el transporte del soluto se realiza a velocidad constante
debido a que el frente de
hinchamiento del polmero avanza de forma constante. Este tipo de
transporte est
controlado por la relajacin de las cadenas del polmero.
Cuando n < 0,5 < 1, el proceso est dominado por procesos
de difusin y relajacin de
las cadenas polimricas. Valores de n > 1 aparecen usualmente
cuando los tiempos de
liberacin son muy elevados y a este tipo de transporte lo
denominan Transporte
Supercaso II. Por ltimo, valores de n < 0,5 se asocian a la
presencia de poros en la
matriz polimrica y a la consiguiente difusin simultnea a travs
de la matriz hinchada
y a travs de los poros llenos de medio de disolucin.
Introduccin
46
Tabla I.2. Resumen de los mecanismos de transporte de solutos
dependiendo del exponente difusional n.
Exponente de liberacin
(n)
Mecanismo de
transporte del frmaco
0,5 Difusin Fickiana
0,5 n 1 Transporte anmalo
1 Transporte Caso II
n>1 Transporte Supercaso II
En la Tabla I.3 se muestran los valores del exponente difusional
(n) para matrices de
liberacin con diferentes geometras y mecanismos de
liberacin.
Tabla I.3. Valores del exponente difusional en el modelo emprico
de Korsmeyer-Peppas para sistemas de
distinta geometra.
Geometra de
la matriz
Sistema controlado
por difusin (Caso I)
Sistema controlado
por hinchamiento
(Caso II)
Lmina n = 0,5 n = 1
Cilindro n = 0,45 n = 0,89
Esfera n = 0,43 n = 0,85
Cuando el hidrogel est inicialmente hinchado y contiene un
frmaco soluble, las
ecuaciones que se utilizan en la cintica de liberacin son las
mostradas en la Tabla I.4,
las cuales dependen de la geometra del hidrogel [97].
Tabla I.4. Soluciones aproximadas para la liberacin difusional
de frmacos a partir de matrices
polimricas [97].
Geometra Estados iniciales Estados finales
Pelculas
r = espesor
2/1
24
r
Dt
M
M t
2
2
2exp
81
r
Dt
M
M t
Cilindros
r = radio 2
2/1
24
r
Dt
r
Dt
M
M t
2
2
2
405.2exp
405.2
41
r
Dt
M
M t
Esferas
r = radio 2
2/1
236
r
Dt
r
Dt
M
M t
2
2
2exp
61
r
Dt
M
M t
Introduccin
47
Modelo de Baker- Lonsdale
Este modelo fue desarrollado por Baker and Lonsdale (1974) [98]
a partir del modelo de
Higuchi. Describe la liberacin de frmaco desde una matriz
esfrica y viene dado por
la siguiente expresin:
ktM
M
M
Mf ttt
3/2
112
3 (I.17)
donde Mt es la cantidad de frmaco liberada a tiempo t, M es la
cantidad de frmaco
que se liberara a tiempo infinito (por tanto, Mt/M es la fraccin
de frmaco liberado a
tiempo t) y k la constante de liberacin y pendiente de la
recta.
Esta ecuacin se ha empleado para la linealizacin de perfiles de
liberacin de
microcpsulas y microesferas[99].
Materiales y Mtodos
49
II. MATERIALES Y MTODOS
Materiales y Mtodos
51
1 Materiales
En este trabajo se han empleado los siguientes reactivos:
Polmeros
Hidrocloruro de quitosano (HCS) (Protasan UP Cl 113 y 213),
suministrado por
Novamatrix (Noruega), de 150 y 400 kDa de peso molecular
respectivamente y un
grado de desacetilacin del 86% en ambos casos.