i UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS CARRERA DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AMBIENTALES RESISTENCIA DE Aedes aegypti (DIPTERA, CULICIDAE) A MALATIÓN, TEMEFOS Y DELTAMETRINA INSECTICIDAS UTILIZADOS EN SALUD PÚBLICA PARA EL CONTROL VECTORIAL EN LAS PROVINCIAS DE SANTO DOMINGO DE LOS TSÁCHILAS-LA CONCORDIA Y ESMERALDAS-QUININDÉ Informe Final de Investigación presentado como requisito para optar por el Título de Licenciado en Ciencias Biológicas y Ambientales Autor: PAUL ANDRES QUINATOA TUTILLO Tutor: DRA. SILVIA JESSICA GUARDERAS MUÑOZ Quito, julio 2018
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS … · 2018. 7. 30. · del dengue, registrando el primer brote epidémico de dengue clásico (DEN1) en 1988 en la ciudad de Guayaquil.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CARRERA DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AMBIENTALES
RESISTENCIA DE Aedes aegypti (DIPTERA, CULICIDAE) A MALATIÓN,
TEMEFOS Y DELTAMETRINA INSECTICIDAS UTILIZADOS EN SALUD
PÚBLICA PARA EL CONTROL VECTORIAL EN LAS PROVINCIAS DE
SANTO DOMINGO DE LOS TSÁCHILAS-LA CONCORDIA Y
ESMERALDAS-QUININDÉ
Informe Final de Investigación presentado como requisito para optar por el
Título de Licenciado en Ciencias Biológicas y Ambientales
Autor: PAUL ANDRES QUINATOA TUTILLO
Tutor: DRA. SILVIA JESSICA GUARDERAS MUÑOZ
Quito, julio 2018
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DERECHOS DE AUTOR
Yo, Paul Andrés Quinatoa Tutillo en calidad de autor y titular de los
derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación Resistencia de
Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) a malatión, temefos y deltametrina
insecticidas utilizados en salud pública para el control vectorial en las
provincias de Santo Domingo de los Tsáchilas-La Concordia y
Esmeraldas-Quinindé, modalidad Proyecto de Grado, de conformidad con
el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor
de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible
y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la
obra, establecidos en la normativa citada. Así mismo, autorizo a la
Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y
publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de
Educación Superior. El autor declara que la obra objeto de la presente
autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho
de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier
reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la
El organofosforado temefos fue probado en poblaciones de Ae. aegypti en
la localidad de La Concordia, obteniendo como resultados del bioensayo
una mortalidad de 33.75%, en respuesta a la dosis diagnostica (0,025
ppm) (ver Tabla 8)
Tabla N 8. Análisis de evaluación de temefos para localidad de La
Concordia.
La Concordia
0,625 ppm 0,125 ppm 0,025 ppm 0,005 ppm
Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
Replica 1 20 0 18 2 6 14 0 20
Replica 2 20 0 20 0 7 13 0 20
Replica 3 20 0 19 1 6 14 0 20
17
Replica 4 20 0 19 1 8 12 0 20
Total 80 0 76 4 27 53 0 80
% de
mortalidad
100 95 33,75 0
La exposición del organofosforado temefos en la localidad de Quinindé,
muestra una mortalidad del 23,75% en respuesta a la dosis diagnóstica
(0,025 ppm), lo que indica que la población es resistente al insecticida
aplicado (ver Tabla N. 9).
Tabla N 9. Análisis de evaluación de temefos para localidad de Quinindé.
Quinindé
0,625 ppm 0,125 ppm 0,025 ppm 0,005 ppm
Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
Replica 1 20 0 19 1 4 16 0 20
Replica 2 20 0 18 2 5 15 0 20
Replica 3 20 0 18 2 4 16 0 20
Replica 4 20 0 19 1 6 14 0 20
Total 80 0 74 6 19 61 0 80
% de
mortalidad
100 92,5 23,75 0
Los valores de pendiente fueron de (2,62±0.14) y (3,71±0.39) lo que
indican una respuesta heterogenia entre poblaciones. La exposición a
varias concentraciones para el insecticida temefos, permitió obtener la
dosis letal (DL50) y posteriormente su factor de resistencia (RR50), al ser
comparado con la DL50 de la cepa susceptible de referencia Rockefeller.
El valor obtenido para la DL50 en la localidad de la Concordia fue de
0,0555 ppm con un rango entre 0,0462-0,065, mientras que para la
localidad de Quinindé fue de 0,0675ppm con un rango de 0,058-0,077. El
factor de resistencia (RR) calculado fue de 5,24 y 6,37 (ver Tabla N. 10)
los cuales indican la presencia de resistencia moderada al insecticida.
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Tabla N 10. Análisis del factor de resistencia en las localidades de la
Concordia-Santo Domingo de los Tsáchilas y Quinindé-Esmeraldas.
Factor de Resistencia (FR) DL50 La
Concordia
Factor de Resistencia (FR) DL50 Quinindé
DL50
Campo
DL50
Rockefeller
FR b+DE DL50
Campo
DL50
Rockefeller
FR b+D
E
Ppm 0,055 0,0106 5,24 2,62
+/-
0,14
ppm 0,067 0,0106 6,37 3,71
+/-
0,39
IC(+/-) 0,0462-
0,065
0,00829,0,0
131
IC(+/-) 0,058-
0,077
0,00829,0,0
131
Identificación de mutaciones F1534C Y V1016I del gen del canal de
sodio
Se pudo determinar los genotipos homocigotos y heterocigotos mediante
las curvas melting de disociación (Tm) para los loci 1535 y 1016. Se
consideró para el análisis una variación de 0,2 °C en cada una de las
curvas. Las curvas (Tm) en la posición 1534 fueron diferenciadas
mediante un pico sencillo de 82ºC correspondiente al homocigoto silvestre
(Phe) (ver Figura 3a), dos picos de 80ºC y 82ºC correspondiente al
heterocigoto (Phe/Cys) y un solo pico de 80ºC correspondiente al
homocigoto mutante (Cys) (ver Figura 3b). En el análisis de la posición
1016 solamente se encontró la amplificación del alelo mutante (Ile) con
temperaturas entre 76ºC correspondiente al homocigoto mutante (Ile).
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a)
b)
c)
Fig 3. Curvas de amplificación para las SNPs en las posiciones F1534C y V1016G kdr del canal de voltaje de sodio en Ae. aegypti. Análisis de las curvas de amplificación en PCR en tiempo real que diferencia los alelos Phe/Cys de la posicion 1534 (a), Cys/Cys 1534 (b) y Ile/Ile de la posicion1016 (c). La Tm de los alelos se muestra en cada curva.
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Frecuencia alélica
Se analizaron un total de 70 mosquitos, 30 individuos para la localidad de
La Concordia considerados todos como susceptibles y 40 individuos para
la localidad de Quinindé considerando 30 individuos susceptibles y 10
individuos resistentes, de los cuales se obtuvieron las frecuencias
genotípicas para cada localidad. La frecuencia alélica en la población de
Quinindé para el alelo mutante Cys 1535 fue de 0.56 y en la localidad de
La Concordia fue de 0.45 (ver Tabla N 11).
Tabla N 11. Identificación de la frecuencia alélica para las localidades de
Quinindé y La Concordia
Localidad N° de
individuos
1534 Frecuencia Cys 1534
1016 Frecuencia Ile1016
F/F F/C C/C V/V V/I I/I
La Concordia
30 8 17 5 0,45 0 0 30 1.0
Quinindé 40 3 29 8 0,56 0 0 40 1.0
La presencia de heterocigotos fue representativa para las dos localidades,
presentando frecuencias de 0.567 para La Concordia y 0.725 en
Quinindé. Los homocigotos mutantes se expresaron tanto en La
Concordia como en Quinindé en frecuencias de 0.166 y 0.20
respectivamente, además de homocigotos silvestres con porcentajes de
0.266 y 0.075 en las poblaciones de cada localidad (Fig. N 4).
Las localidades analizadas presentaron valores de normalidad <0,05, por
lo que al realizar el análisis diferencial entre las frecuencias alélicas entre
localidades no se encontró diferencias estadísticamente significativas en
la frecuencia silvestre F1534C (p=0,09) y en la frecuencia mutante
F1534C (p=0,147) entre las poblaciones analizadas.
21
Figura 4. Frecuencia genética de la mutación F1534C para las localidades
de La Concordia y Quininde.
En la posición V1016I se determinó la presencia de homocigotos
mutantes (Ile1016) en ambas localidades, sin la evidencia de homocigotos
silvestres Val/Val y heterocigotos Val/Ile (ver Figura 5)
V/V V/I I/I
0
5 0
1 0 0
1 5 0
M u ta c io n 1 0 1 6
G e n o tip o s
% d
e i
nd
ivid
uo
s
L a C o n c o rd ia
Q u in in d e
Figura 5. Frecuencia genética de la mutación V1016I para las localidades
de La Concordia y Quininde.
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Se realizó el análisis de equilibrio de Hardy-Weinberg para cada una de
las localidades, utilizando el X2 para encontrar equilibrio génico en las
poblaciones con valores de significancia. La localidad de La Concordia no
se encontraba en equilibrio génico según la propuesta por Hardy-
Weinberg al no encontrar valores significativos (p=0,956). Además en la
población de Quinindé se determinó que la población se encontraba en
equilibrio (p=0.04). El cálculo de Hardy-Weinberg para la mutación V1016I
no pudo ser calculado debido a la dominancia del alelo mutante Ile1016.
DISCUSIÓN
En el análisis con el piretroide deltametrina, en la localidad de Quinindé
provincia de Esmeraldas, presentó resistencia al insecticida (7,5%
mortalidad), mientras que en la localidad de La Concordia provincia de
Santo Domingo de los Tsáchilas se determinó el riesgo de resistencia
(94% mortalidad). En los estudios realizados por Álvarez et al. (2006),
Santacoloma et al. (2010) y Conde et al. (2015) en los países de
Colombia, Perú y Venezuela respectivamente, han registrado la
resistencia a deltametrina similares al presente estudio, con porcentajes
de mortalidad entre 87%, 70% y 89%. La resistencia a los insecticidas
piretroides se ha dispersado ampliamente en poblaciones de Ae aegypti,
probablemente como resultado de la amplia dependencia del insecticida
en los programas de control vectorial durante varias décadas. La pérdida
de la susceptibilidad a deltametrina se encontraría relacionada por la
resistencia cruzada al DDT debido a que son compuestos químicos que
comparten un mismo sitio de acción (Brengues et al. 2003); además la
presión ejercida por el insecticida durante varias décadas en el pasado ha
contribuido al desarrollo de resistencia (Fonseca et al. 2009). Otros
mecanismos también se han vinculado a la resistencia a piretroides como
el incremento de actividades enzimáticas esterasas no específicas, el
citocromo P-450 monooxigenasa, glutatión S-transferasas (GST) y
oxidasas de función mixta (Rodriguez et al., 2014). El desarrollo de
23
mutaciones en el gen del canal de voltaje de sodio (S989P, I1011M/V,
V1016G/I, F1269C, F1534C) también estarían vinculados con la
resistencia a piretroides (Maestre et.al, 2010; Li et al., 2015).
En los últimos veinte años en países de Latinoamérica se ha venido
empleado insecticidas organofosforados para el control de poblaciones de
Ae. aegypti. El insecticida malation es utilizado ampliamente en el
Ecuador como adulticida en rociamientos intra y peridomiciliares; al igual
que el uso del temefos como insecticida de control larvario (Roldan et al.,
2013). En el análisis de susceptibilidad al insecticida malatión se encontró
porcentajes de mortalidad entre los 88% (n=100) en la localidad de
Quinindé y 94% (n=125) para localidad de La Concordia. Estos valores
sugieren la posibilidad de resistencia dentro de las localidades de estudio,
los cual debería ser corroborado, mediante la realización de un gradiente
dosificado del insecticida. En América Latina este organofosforado se
encuentra ampliamente utilizado en programas para el control vectorial y
se ha reportado la susceptibilidad en poblaciones de Colombia, Cuba,
Venezuela, Costa Rica y Jamaica (Cadavid et al., 2011; Coto et al., 2000).
En poblaciones de Venezuela a pesar del uso intensivo durante cuatro
décadas del insecticida malatión como adulticida, se registró la
susceptibilidad de Ae aegypti con dosis diagnostica (Fernández, 2013).
Según Rodríguez et al (2003), en poblaciones de Ae aegypti el desarrollo
de la resistencia al malation es un proceso evolutivo tardío en el cual
puede estar involucrado con varios factores como las condiciones
ambientales de fumigación, preparación del insecticida o la frecuencia de
aplicación del insecticida respecto a otros compuestos como los
piretroides. En pruebas realizadas en laboratorio la presión continua del
malation demostró que después de varias generaciones desarrolló
resistencia cruzada a la deltametrina (Rodríguez et al., 2003). En otras
especies de mosquitos vectores como Anopheles sp (Fernández et al.,
2007) y Culex sp (Bastidas et al., 2011) han registrado resistencia a un
amplio espectro de organofosforados. Esta resistencia se encontraría
vinculada por la presencia de mecanismos de resistencia diferentes a
24
otros organofosforados, por lo que las enzimas desintoxicadoras carboxil-
esterásas, actúan inhibiendo al insecticida antes de que llegue a su sitio
de acción (Fonseca, 2005).
El uso de dosis diagnostica es un criterio inicial para la determinación de
resistencia y son parámetros que se usan como referencia para ser
comparados con los resultados del ensayo biológico (Brogdon & Chan,
2010). El estudio realizado por Morales et al. (2016) hace énfasis en
realizar bioensayos con dosis diagnóstica y bioensayos con un gradiente
dosificado para la determinación del factor de resistencia, permitiendo una
percepción más clara de resistencia en las poblaciones.
En este estudio se encontró que las poblaciones nativas de Ae. aegypti en
las localidades de Quinindé y La Concordia presentaron resistencia
moderada a temefos con valores de RR50 5,24 y 6,37 respectivamente.
Esta resistencia es similar con la población analizada en la localidad de
Pascuales, provincia del Guayas, la cual presento un factor de resistencia
de 9,2 a la aplicación del temefos (Terán et al., 2012). A nivel regional en
las localidades de Sullana (RR50 6,84) y Tambo grande (RR50 5,60) en el
Perú determinaron igualmente valores de resistencia moderada a temefos
(Vargas et al., 2013), estos valores indican todavía la funcionalidad del
insecticida el cual debería ser monitoreado para su posterior aplicación
con otros insecticidas. La dependencia de este organofosforado durante
los últimos años en el Ecuador, al ser el único larvicida aplicado por el
Ministerio de Salud Pública, estaría provocando una presión selectiva
ocasionando la aparición de poblaciones resistentes como se reporta en
países como Cuba, Venezuela y Brasil los cuales presentan factores de
resistencia de 89,91, 11,1 y 15,5 respectivamente (Bisset et al, 2004;
Braga et al., 2004). La perdida de susceptibilidad al insecticida temefos
debería ser evaluada constantemente ya que la presión ejercida por este
insecticida podría generar resistencia expresada en insecticidas
organofosforados utilizados en el control del mosquito en etapa adulta
(Tikar et al., 2009 ).
25
El desarrollo de la resistencia a temefos también se encontraría vinculado
por las presiones de selección y mecanismos de resistencia como la
síntesis de la enzima carboxil-esterasas (Chen et al., 2005).
En América Latina las mutaciones en el canal de voltaje de sodio en
poblaciones de Ae aegypti, se han reportado con mayor frecuencia en los
últimos años. Países como Venezuela, Brasil, Colombia y México (Du, et
al., 2016) han registrado cambios puntuales en las posiciones de F1534C,
V1016I y I1011M en poblaciones de Ae aegypti, los cuales se encuentran
relacionados con la resistencia a piretroides. En nuestro estudio se
determinó la presencia de las mutaciones F1534C y V1016I en las
localidades de Quinindé y La Concordia. La presencia de estos genotipos
se debería a una presión continua en el uso del insecticida durante brotes
epidémicos de dengue, además por el uso del DDT en el pasado lo que
genero la formación de una resistencia cruzada aportando a la expansión
del genotipo kdr en varias especies. (Hemingway & Ranson 2000).
Estudios indican que la resistencia kdr disminuye de 10 a 20 veces la
sensibilidad al insecticida, en otras especies se ha reportado que el
fenotipo puede llegar hasta 100 veces más resistencia a los piretroides, el
cual tiene la presencia de tres mutaciones o más y es conocido como
Súper-kdr (Davies et al., 2007).
Investigaciones indican que la mutación F1534C se encuentra relacionada
directamente con la resistencia a piretroides tipo I (permetrina) que a los
piretroides tipo II (deltametrina) otorgando un mayor factor de resistencia
para este tipo de insecticida (Li et al., 2015). Sin embargo se ha reportado
que la ocurrencia de la mutación 1534 estaría relacionada conjuntamente
con la mutación 1016 formando un polimorfismo simultaneo que otorgaría
el aumento de resistencia a piretroides (Du et al., 2013). En este estudio
se registró la presencia de las dos mutaciones, con resultados similares
en poblaciones de Brasil los cuales confirmaron la presencia simultánea
de los dos polimorfismos (Linss et al., 2014)
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El genotipo homocigoto mutante I/I1016 se encontró en una frecuencia del
100% en los individuos analizados para las localidades de Quinindé y La
Concordia, resultados similares se encontraron en poblaciones de
Venezuela y Brasil (Martins et al., 2009). Al parecer el desarrollo de esta
mutación se encuentra relacionado por la aplicación extensiva y frecuente
con insecticidas piretroides como respuesta a casos por dengue, además
de las condiciones biológicas de la especie al tener ciclos cortos de vida y
alta fecundidad (Siller, 2011); esto se demostró en estudios realizados en
laboratorio con poblaciones de Ae. aegypti, los cuales presentaron el alelo
kdr ile1016 después de cinco generaciones causado por la presión
ejercida por la deltametrina (Saavedra et al., 2012). En otro estudio se
encontró que las altas frecuencias tienen la tendencia rápida de fijación
dentro de las poblaciones, no obstante si la mutación alberga un ambiente
libre del insecticida se espera que cese la presión con los piretroides y
disminuya la frecuencia del alelo mutante (Brito et al., 2013).
Para el locus 1534, se observó una frecuencia alélica de 0,45 (n=30) para
La Concordia y 0,56 (n=40) en Quinindé para el alelo mutante C/C1534,
similares resultados se evidencio en localidades de Colombia donde fue
reportado homocigotos mutantes con mayor frecuencia en rangos desde
0,61 y 0,79 indicando que la mutación se encontraría relacionada con la
resistencia a piretroides en conjunto con mecanismos enzimáticos
(Murcia, 2015). En poblaciones de Venezuela se analizó la prevalencia de
los genes de resistencia 1534 en deltametrina durante quince
generaciones llegando a determinar una frecuencia alélica de 1.0, lo que
indicaría la selección más rápida del alelo para el piretroide (Álvarez et al.,
2015). En las dos localidades analizadas se encontró la alta frecuencia de
individuos heterocigotos, si la aplicación ejercida por el insecticida es
constante puede incrementar por mecanismos de evolución en el
aumento de la frecuencia de alelos kdr (Murcia, 2015).
En varios casos los fenotipos resistentes no se pueden explicarse
mediante las mutaciones kdr que representan la insensibilidad de los
sitios diana, estas variaciones también se encontrarían relacionadas con
27
capacidades metabólicas detoxificantes de los mosquitos (Hemingway et
al., 2004). Según Scott (2016) la alta frecuencia de kdr en algunos casos
no puede ser explicados por los niveles de resistencia, por lo que
parecería probable que el alelo puede tener un costo de fitness reducido
en relación con KDR respecto a la ausencia del uso de insecticidas.
La homogeneidad de las frecuencias alélicas F/F1534, C/C1534 y I/I1016
entre las localidades analizadas, se debería al modo de dispersión génico
a larga distancia realizado por las redes de comunicación vía terrestre
entre localidades (Goncalves et al., 2012).
Varias mutaciones en el gen del canal de sodio han sido asociadas con
los fenotipos resistentes a piretroides, Brooke, 2008 determino que la
resistencia podría ser multigenetica y que las mutaciones en el gen del
canal de sodio por sí sola no puede explicar completamente el fenotipo
resistente
Los resultados de la población de Quinindé mostraron un equilibrio de
Hardy-Weiberg para el alelo 1534, lo que sugiere la trasferencia continua
SNPs a través de las siguientes generaciones, al ya no ser dependiente la
exposición o no del insecticida estos genotipos se encontrarían
establecidos dentro de la población, un resultado diferente se observó en
la localidad de La Concordia el cual no se encontró en equilibrio de Hardy-
Weiberg. Según Collet et al., 2016 este resultado se debería a una posible
introducción de Ae. aegypti de otras localidades cercanas mediante el
flujo de trasporte terrestre. Además, el modo de aplicación de piretroides y
la presión ejercida por insecticidas de uso doméstico podría ser otro factor
de continuidad de este genotipo dentro de la población.
Los resultados de este estudio muestran la importancia y la necesidad de
realizar la vigilancia a los insecticidas utilizados para el control vectorial. El
conocimiento del cambio temporal en la susceptibilidad de los vectores y
el esclarecimiento de la distribución real de los polimorfismos pueden
ayudar en la gestión resistencia y la elaboración de estrategias para
28
garantizar la eficacia del programa de control. Por lo tanto, el monitoreo
de la presencia y la evolución de estos polimorfismos es indispensable
para el uso adecuado de piretroides y un control de vectores más
eficiente. Este estudio es una contribución para estudios futuros de
resistencia y/o susceptibilidad de Ae aegypti a los insecticidas aplicados
en el país.
CONCLUSIONES
1. Se determinó la presencia de resistencia a deltametrina y malation
con dosis diagnosticas en las poblaciones de La Concordia y
Quinindé debido a la continua exposición y presión generada por el
uso de los insecticidas, en el caso de deltametrina la resistencia
cruzada con el DDT durante varios años ha hecho que este
insecticida pierda su efectividad y desarrolle mecanismo de
resistencia.
2. Se estableció un factor de resistencia moderado en larvas a la
aplicación de temefos en las dos localidades analizadas, debido al
uso continuo del insecticida y al ser el único larvicida aplicado en
el control vectorial de Ae aegypti.
3. Se detectó la presencia de las mutaciones F1534C y V1016I que
confieren la resistencia a piretroides en el canal de voltaje de sodio,
con las frecuencias alélicas moderadas
29
RECOMENDACIONES
Analizar otros mecanismos de resistencia en insecticidas piretroides en
poblaciones de Ae aegypti
Identificar y monitorear las mutaciones que confieren resistencia a
piretroides para relacionar el estado génico de las poblaciones y su
relación con el fenotipo kdr
Realizar un seguimiento de las frecuencias alélicas en las mutaciones
F1534C y V1016I para verificar el aumento o disminución y su relación
con la aplicación del insecticida.
Realizar un gradiente dosificado para la confirmación de resistencia a
insecticidas, además de un monitoreo constante de los insecticidas
utilizados para el control vectorial.
30
LITERATURA CITADA
1. Álvarez L, Briceño A, Oviedo M. 2006. Resistencia al Temephos en
poblaciones de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) del occidente de
Venezuela. Revista Colombiana de Entomología, 32, 172-175.