UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA …148.206.53.84/tesiuami/UAMI10478.pdf · de las proteínas permanece constante a lo largo de todo el ciclo de vida. ... interespecíficos pueden

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

Ciencias Biológicas y de la Salud

DISCRIMINACION DE ESPECIES DE PECES BLANCOS(ATHERINOPSIDAE: CHIROSTOMA) DEL LAGO DE

PATZCUARO, POR MEDIO DE CARACTERES MORFOLOGICOS,ALOENZIMATICOS Y RFLPs DEL GEN MITOCONDRIAL 16S

Licenciatura en Hidrobiología

MONICA YANELLI PEREZ RAMIREZ

Asesor:

Irene de los Angeles Barriga Sosa

México, 2003

DATOS PERSONALES

NOMBRE: Mónica Yanelli Pérez Ramírez

MATRICULA: 98332188

LICENCIATURA: Hidrobiología

DIVISION: Ciencias Biológicas y de la Salud

UNIDAD: Iztapalapa

TRIMESTRE LECTIVO: 03 Otoño

TITULO DEL PROYECTO:

Aplicación de marcadores genéticos para discriminar especies de “pescado blanco” en el

Lago de Pátzcuaro.

TITULO DEL TRABAJO DE SERVICIO SOCIAL:

Discriminación de especies de peces blancos (Atherinopsidae: Chirostoma) del Lago de

Pátzcuaro, por medio de caracteres morfológicos, aloenzimáticos y RFLP’s del gen

mitocondrial 16S.

NOMBRE DEL ASESOR: Dra. Irene de los Angeles Barriga Sosa

LUGAR DE REALIZACION: Laboratorio de Genética y Biología Molecular de la Planta

Experimetal de Producción Acuícola, UAMI.

CLAVE DE REGISTRO: H. 015. 02

Discriminación de especies de peces blancos (Atherinopsidae:Chirostoma)del Lago de Pátzcuaro, por medio de caracteres morfológicos,

aloenzimáticos y de RFLP s del gen mitocondrial 16S.

JUSTIFICACION

El pez blanco (Chirostoma estor, Chirostoma promelas, Chirostoma lucius, Chirostoma

sphyraena y su posible ancestro Chirostoma humboldtianum) constituye un recurso de gran

importancia cultural, alimentaria y económica para diversos grupos étnicos de la Mesa

Central de México. Estos peces se distribuyen en los lagos de Pátzcuaro y Chapala

principalmente, considerándose como una de las pesquerías más antiguas y de mayor

tradición en nuestro país.

Actualmente, en el lago de Pátzcuaro, las especies C. estor y C. humboldtianum se

encuentran bajo sobreexplotación y problemas de deterioro ambiental producto de la

actividad humana, lo cual aunado a la introducción de especies (C. lucius principalmente)

ha provocado la hibridación natural por un lado y por el otro, la disminución de las

poblaciones de especies locales.

Pero quizá el mayor problema está representado en la discriminación de especies,

necesaria para formular o emprender cualquier trabajo de manejo o conservación por

ejemplo, cultivos con fines de repoblamiento. La discriminación de especies por métodos

taxonómicos tradicionales resulta problemática debido a la gran similitud de caracteres

morfométricos y merísticos entre especies o bien a la combinación de caracteres de

diferentes especies en un solo organismo (híbrido). Por lo anterior, en los últimos años, en

la Planta Experimental de Producción Acuícola se han venido utilizando técnicas

moleculares (aloenzimas, restricción enzimática de genes mitocondriales amplificados vía

PCR y secuenciación) que permiten establecer métodos más confiables para la

discriminación de especies.

El presente trabajo es parte de un Convenio establecido con el INP (SAGARPA) y

pretende utilizar patrones de restricción enzimática (haplotipos) y aloenzimas para la

discriminación de especies de peces blancos (C. estor y C. lucius) del Lago de Pátzcuaro,

además de contribuir a la formación de la base de datos morfométricos y merísticos del

género y determinar si existen diferencias en las muestras analizadas.

INTRODUCCION

El género Chirostoma es uno de los elementos ictiofaunísticos representativos del Altiplano

Mexicano, de acuerdo con Barbour (1973 a) está formado por 18 especies y 6 subespecies

cuyo origen difilético se remonta al Terciario, con un antecesor parecido a Menidia el cuál

penetró a territorio mexicano por el portal del Balsas y debido a la intensa actividad

volcánica y geológica, así como a los cambios en el patrón de drenaje, quedó aislado

iniciando su divergencia con una amplia distribución, la cual, actualmente es característica

de la cuenca Lerma-Santiago con las especies del grupo Jordani. Quizá a finales del

Mioceno, una forma semejante a Melaniris invadió los sistemas dulceacuícolas,

restringiendo su distribución para evitar la competencia dando origen al grupo Arge.

Los datos morfológicos y genéticos (Barbour y Chernoff, 1984; Echelle y Echelle,

1984) apoyan la hipótesis de un ensamble monofilético en el grupo Jordani compuesto por

siete especies y un ancestro común posiblemente del tipo humboldtianum. Dentro de este

grupo, los peces blancos (Chirostoma estor, C. promelas, C. lucius, C. sphyraena y C.

humboldtianum) constituyen un recurso de gran importancia alimentaria, cultural y

económica para diversas etnias de la Mesa Central del país, considerándose como una de

las pesquerías más antiguas y de mayor tradición. (Soria-Barreto et al., 1998; Maya et al.,

2000).

En el Lago de Pátzcuaro, se presenta la segunda mayor abundancia de especies del

género (después de Chapala), aunque en épocas anteriores se introdujeron especies de otros

embalses, principalmente C. lucius (Alaye Rahy, 1993 b), lo cual aunado al deterioro

ambiental producto de la actividad humana y la sobreexplotación de C. estor y C.

humboldtianum ha provocado la hibridación natural, la disminución de las poblaciones de

especies locales y la posible subdivisión de poblaciones de C. grandocule (Barriga-Sosa et

al. 2002).

ANTECEDENTES

En 1984, Echelle y Echelle analizan la distribución y situación taxonómica de 15 de las 18

especies del género Chirostoma, así como dos especies de Poblana y dos especies de

Menidia, concluyendo por medio de la caracterización de la variabilidad aloenzimática que

Poblana y Chirostoma comparten con Menidia un ancestro no compartido con otros

aterinópsidos y que el proceso de especiación de estos géneros ocurrió de manera rápida

una vez que el ancestro Menidia invadió la Mesa Central de México, esta hipótesis también

es apoyada por Barbour (1973 b).

Alaye-Rahy (1996 a) realiza estudios del polimorfismo de la hemoglobina para

identificar especies de Chirostoma en el Lago de Pátzcuaro, considerando que la expresión

de las proteínas permanece constante a lo largo de todo el ciclo de vida. Por medio de

electroforesis en gel de poliacrilamida, se identifica a C. estor, C. humboldtianum, C. lucius

y C. grandocule, al encontrarse diferencias cuantitativas (intensidades en las bandas)

dependientes de la concentración de oligomonómeros en la molécula de hemoglobina. En

un trabajo posterior (1996 b), se reporta la existencia de híbridos entre la especie

introducida C. lucius y la nativa C. estor además de otros híbridos cuyas formas parentales

son difíciles de determinar. Estos resultados derivan en una hibridación del 19.6% un valor

muy alto reportado en ambientes naturales. Por otra parte, se desconoce si los híbridos

interespecíficos pueden conducir a una gametogénesis normal y descendencia viable. El

factor que posiblemente influye en la formación de híbridos, es la alteración ecológica que

sufre el Lago de Pátzcuaro (ChacónTorres et al., 1991; Chacón Torres, 1993).

Empleando la técnica de los marcadores RAPD (Random Amplified Pylomorphic

DNA Markers, por sus siglas en inglés), Coyote (2000) analiza las relaciones taxonómicas

entre Poblana y Chirostoma, puntualizando que a nivel intergenérico el 0.87% de los

marcadores RAPD son exclusivos para ambos géneros y, debido al traslape es necesaria

una revisión taxonómica para determinar su estado real.

Barriga-Sosa (2001) analiza morfológica y molecularmente a diferentes poblaciones

de 13 especies del género Chirostoma, proponiendo nuevos intervalos para variables

merísticas útiles para la identificación, determinando la variabilidad genética por medio de

aloenzimas y además, secuenciando el gen mitocondrial 16S de las especies de peces

blancos.

Por medio de análisis de la variación morfológica y génetica de las especies del

grupo humboldtianum, Barriga-Sosa et al. (2002), determinan que los valores de

variabilidad genética de algunas especies presentan cambios con relación a datos previos,

por lo que concluyen que dicha variación puede ser resultado del constante proceso

evolutivo. Chirostoma grandocule es objeto de un análisis morfológico y aloenzimático

(Barriga-Sosa et al. en revisión) intra-lacustrino (Lago de Pátzcuaro) en tres diferentes

años. Se observaron diferencias genéticas entre sitios y años, relacionadas con factores

biológicos, ecológicos y ambientales propios de cada localidad. Los datos obtenidos

permiten sugerir a los autores que esta especie se encuentra en un proceso de diferenciación

poblacional.

OBJETIVOS

General

Discriminar especies de peces blancos provenientes del Lago de Pátzcuaro, Michoacán a

nivel molecular, por medio de aloenzimas y restricción enzimática del gen mitocondrial

16S.

Específicos

* Identificar morfológicamente a la (s) especie (s).

* Determinar el grado de variabilidad morfométrica y merística de la muestra a analizar.

* Determinar el grado de variabilidad aloenzimática y el grado de variabilidad genética por

medio de análisis de restricción enzimática del gen mitocondrial 16s.

METODOLOGIA

Colecta de muestras – Se colectaron 50 organismos (provenientes de huevos no

identificados) del Lago de Pátzcuaro, los cuales fueron mantenidos en el Instituto de

Investigaciones de Recursos Naturales (INIRENA) de la Universidad Michoacana de San

Nicolás de Hidalgo. Se transportaron en hielo seco al laboratorio de Genética y Biología

Molecular de la PEXPA, en la Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa. Dichos

organismos componen dos muestras diferentes, la primera con un intervalo de talla de los

79 a los 102 mm (n= 15) y considerados como progenitores. La segunda muestra,

considerada como F1 con tallas de 40.5 a 54.9 mm (n= 35) (Fig. 1).

Figura 1. Representantes de ambas muestras (P= progenitores)

Análisis Morfométrico (M) y Merístico (m) e identificación de la especie – Se

emplean 27 variables (Fig. 2) para la identificación morfológica de acuerdo a Barbour

(1973 b) y Barriga-Sosa (2001).

F1

P

Las 19 variables morfométricas utilizadas son: 1) longitud total (LT); 2) longitud

patrón (LS); 3) longitud de la cabeza (LC); 4) diámetro orbital (Dor); 5) longitud del hocico

(LH); 6) longitud mandíbula inferior (LMi); 7) longitud postorbital de la cabeza (LPoC); 8)

longitud del pedúnculo caudal (LpC); 9) base de la aleta anal (BaA); 10) distancia del

hocico a la primera dorsal (DH1D); 11) distancia del hocico a l segunda dorsal (DH2D);

12) distancia del hocico a la aleta pélvica (DHP); 13) base de la aleta pélvica (BaP); 14)

altura máxima (Amax); 15) altura mínima (Amin); 16) altura aleta anal (AaA); 17) altura

aleta pectoral (AaP); 18) altura primera dorsal (A1D) y 19) altura segunda dorsal (A2D)

(Barriga-Sosa et al., 2002). Los organismos se miden del lado izquierdo con ayuda de un

vernier y un ictiometro.

Figura 2. Variables morfométricas y merísticas registradas en las muestras de

Chirostoma (Tomada de Barriga-Sosa, 2001).

Las ocho variables merísticas (m) son: 1) el número de escamas de la línea lateral

(ELL); 2) escamas predorsales (EpD); 3) escamas interdorsales (EiD); 4) radios de la aleta

pectoral (RaP); 5) espinas de la primera dorsal (E1D); 6) espinas de la segunda dorsal

(E2D); 7) radios de la aleta anal (RaA) y 8) número de branquiespinas (B). Las escamas se

tiñen con verde de malaquita y su cuantificación se realiza bajo el microscopio.

Análisis Univariado -- De los caracteres analizados se obtuvieron: máxima, mínima,

media y coeficiente de variación (DS/media*100), mediante el uso del programa EXCEL

versión 7.0. Se realizó una comparación de los resultados del presente estudio con los

citados por Barbour (1973 b), Alaye-Rahy (1996 a) y Barriga-Sosa (2001).

Análisis Multivariado --- Las variables merísticas y morfométricas se analizan por

separado. Los datos morfométricos son transformados (Cuadras, 1991) de acuerdo a dos

criterios: a) proporciones de las variables con relación a una de ellas (en este caso, longitud

estándar), con la finalidad de eliminar las diferencias de talla y b) transformación

logarítmica de cada una de las medidas para linealizar la información (Ibañez y Lleonart,

1996). De los análisis multivariantes exploratorios que se pueden realizar, se escogieron: i)

Análisis de Componentes Principales (PCA) y ii) Análisis Discriminante (DA), por medio

del programa STARGRAPHICS Plus para Windows versión 2.1.

Extracción del tADN. -- Empleando el Dneasy Tissue Kit (Quiagen R) con las

siguientes modificaciones, se toman 25 mg de tejido branquial del pez, macerándose en un

microtubo de 1.5 mL, adicionando 180 µL de amortiguador de lisis (ATL) y 20 µL de

Proteinasa K para degradar proteínas e incubando a 55 °C de 40 a 60 minutos. Después de

la incubación, se añaden 200 µL de amortiguador AL, el cual remueve los restos de tejido

contenidos en la muestra, se mezcla nuevamente e incuba por 10 minutos a 70°C. Al

terminar éste periodo, se agregan 200 µL de etanol (100%) para hacer que el ADN

precipite, obteniéndose una mezcla homogénea, la cual se deposita en una minicolumna

DNeasy R y se centrifuga a 8000 rpm por 2 minutos. El sobrenadante de cada una de las

muestras es decantado. Se adicionan 500 µL de amortiguador AW1 para centrifugar a 8000

rpm por 2 minutos y nuevamente se decanta el sobrenandante. El uso de ambos

amortiguadores permite eliminar impurezas del ADN. Posteriormente, se adicionan 500 µL

de amortiguador AW2 centrifugando a 12 000 rpm por 3 minutos, con la finalidad de

eliminar residuos de etanol. Por último, todas las minicolumnas se colocan en un microtubo

limpio de 1.5 mL y se añaden directamente 150 µL de amortiguador AE para hidratar el

ADN, se incuba por 15 minutos a temperatura ambiente para después centrifugar a 8000

rpm por 2 minutos, obteniéndose la elución A, nuevamente la microcolumna se coloca en

un microtubo limpio y previamente etiquetado de 1.5 mL, se adicionan 100 µL de

amortiguador AE para incubar 10 minutos a temperatura ambiente, las muestras se

centrifugan durante 2 minutos a 8000 rpm para obtener la elución B. Se mantienen a 4 °C

una vez terminado el procedimiento (Barriga-Sosa, 2001).

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos -- El tADN de las

diferentes muestras se cuantifica por medio de electroforesis en gel de agarosa al 0.7%,

utilizando como amortiguador TAE (Tris-acetato 10mM y EDTA mM)(1x). Se emplea el

marcador molecular 100bp λDNAR (50UG) como referencia para determinar el peso

molecular de la muestra por interpolación. Los geles se someten a 60 voltios (v) por 45

minutos, para después teñirlos con Bromuro de Etidio (EtBr, 10mg/L).

Las bandas se observan al exponer los geles a la luz ultravioleta (320 nm), siendo la

intensidad de la banda proporcional a la cantidad y calidad del ADN total (Alaye Rahy,

1996 a). Los geles son fotografiados.

Amplificación del gen mitocondrial 16S ADN (Polymerase Chain Reaction) --

Empleando el Taq PCR Core Kit (Quiagen R), se prepara una mezcla conteniendo: 2.5 µL

de amortiguador 10xQIAGEN, 0.5 µL (25mM) de MgCl2 (cofactor), 0.5 µL (200 µM)

mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 0.5 µL (0.5 µM)

cebador 16Sar (5’-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3’) y 0.5 µL (0.5 µM) cebador

16Sbr (5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’), 0.125 µL de la enzima Taq DNA

polimerasa (0.65 unidades) y un volumen variable de agua destilada. Los cebadores

empleados son los universales (gen 16S) (Kocher et al., 1989). Todo se mezcla en un

microtubo eppendorf (0.6 mL) para PCR, adicionando posteriormente la muestra de DNA

(∼1 µg /reacción). El volumen final de la mezcla de reacción es de 25 µL por tubo (Palumbi

et al., 1991).

Las amplificaciones se realizan en el termociclador BiometraR con el siguiente

programa: un ciclo de inicio que comprende la desnaturalización por 1 minuto 30 segundos

a 96 °C (separación doble cadena DNA), un minuto a 36 °C de fase de anillamiento

(reconocimiento del cebador) y la elongación por 1 minuto 30 segundos a 72 °C; 30 ciclos

con las mismas condiciones de temperatura pero por 30, 45 y 30 segundos respectivamente.

El ciclo final es de 10 minutos a 72 °C como fase de extensión (Barriga-Sosa, 2001). Al

terminar, las muestras se almacenan a 4 °C.

Cuantificación de productos amplificados -- Los productos amplificados se

observan mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 0.7%, utilizando como

amortiguador TAE (1x) y el marcador de peso molecular de referencia 100 bp λDNAR

(50UG). Los geles son sometidos a 60 v por una hora para después teñirse con Bromuro de

etidio (10mg/L) en ausencia de luz.

Las bandas o productos de amplificación se observan al exponer los geles a la luz

ultravioleta (320 nm). Posteriormente, son fotografiados. El peso molecular de cada uno de

los productos se determina por interpolación a partir de la curva teórica construida con los

pesos moleculares de los diferentes segmentos desplegados por el marcador 100 bp

λDNAR.

Purificación del DNA -- Utilizando el QIA quick (QuiagenR) para purificar

fragmentos de 100 bp a 10 Kb, se calcula el volumen de reacción obtenido vía PCR, para

adicionar a cada muestra 5 volúmenes del amortiguador PB por 1 volumen de reacción

PCR y se mezcla. Cada una de las muestras se coloca en una columna QIA quick para

centrifugarse por 1 minuto a 13 000 rpm, lo cual permite extraer las impurezas del DNA

(restos de nucleótidos, MgCl2) que puedan inhibir la actividad enzimática. El sobrenadante

obtenido es descartado. En seguida, se adicionan 600 µL de amortiguador PE a las

columnas para centrifugar por 1 minuto a 13 000 rpm , el sobrenadante se decanta. Las

columnas se colocan en un microtubo limpio de 1.5 mL, para adicionar 30 µL de

amortiguador EB incubando a temperatura ambiente por 10 minutos, las muestras se

centrifugan por un minuto a 13 000 rpm y terminando pueden almacenarse a 4°C (Barriga-

Sosa, 2001).

Cuantificación de productos purificados – Los productos purificados son sometidos

a electroforesis en gel de agarosa, bajo las condiciones antes mencionadas, se tiñen con

Bromuro de etidio (10mg/L) y se exponen a una longitud de onda de 320 nm. La

concentración (ng) de los productos purificados se determina con base en el marcador

molecular de referencia 100 pb λDNAR de manera cualitativa.

Restricción enzimática – Se utilizó el programa NEB cutter R

(http://rebase.neb.com/rebase/) que permite simular el número y tamaño de fragmentos

esperados con una enzima de restricción determinada para secuencias del gen mitocondrial

r16S (Barriga-Sosa, 2001) de las tres especies de peces blancos reportadas en Pátzcuaro

(Chirostoma lucius, C. estor y C. humboldtianum) y determinar las enzimas que permitan

discriminar a las especies. Las enzimas son que presentan patrones de bandeo diferentes

son: Taq I Thermus aquaticus (5’-T’CGA-3’), HpyCH4 IV Heliobacter pylori CH4 (5’-

A’CGT-3’), Eag I Enterobacter agglomerans (5’-C’GGCCG-3’) y Bbv I Bacillus brevis

(5’-GCAGC(N)8’-3’) (Barriga-Sosa et al. , en prep.) (Tabla 1).

Las digestiones se llevan a cabo en un microtubo de 0.6 mL en el cual se coloca 1

µg del purificado 16S ADN (≈ 610 pb), 2 a 5 unidades de enzima, 2.5 µL de amortiguador

(Tris, cofactor y pH dependiendo de la enzima) y se afora a 25 µL con agua destilada,

dejándose incubar a 37°C por 17 horas. La reacción es detenida a temperatura de 4°C

(Dowling et al., 1990).

Tabla 1. Fragmentos y tamaños esperados de acuerdo al NEBcutterR para la secuencia del

gen 16S

Enzima C. humboldtianum C. estor C. lucius

Taq I 463 483 461

83 83 84

21 21

HpyCH4 IV 556 NSR 553

13 13

Eag I 531 NSR NSR

38

Bbv I 524 524 483

43 42 83

NSR = No se encontró Sitio de Restricción.

Cuantificación de fragmentos de restricción – Por medio de electroforesis en gel de

agarosa al 2%, se colocan de 10 µL de la restricción y 1.5 µL del amortiguador de carga

para restricción, se emplea un marcador molecular de referencia 20pb λDNAR (2.5 µL).

Las diferencias en el patrón de bandeo (numero y/o tamaño de fragmentos) entre individuos

se asumen como diferencias genéticas, las cuales permiten discriminar a la (s) especie(s)

(Gusmao y Solé-Cava, 2002).

Análisis de resultados -- Se construye una base de datos haplotípica (no. de

organismo/haplotipo) con sus respectivas frecuencias para cada una de las cuatro enzimas

de restricción empleadas.

En caso de encontrar variabilidad en las muestras, se emplea el programa REAP

(McElroy et al., 1992) para analizar los haplotipos encontrados, estimando cuantos eventos

mutacionales pudieron haber ocurrido. La premisa es que a mayor número de haplotipos,

mayor diversidad nucleotidica (producto de transiciones y trasversiones), por lo tanto

mayor variabilidad entre las muestras. Se realiza un análisis de distancias genéticas (Nei y

Kumar, 2000).

Aloenzimas - Se toma 0.1-0.2 g de tejido (músculo y ojo) se macera y homogeniza

con los amortiguadores Tris-EDTA y/o NADP (0.5 mL) para centrifugar a 12 000 rpm por

2 minutos, se almacenan posteriormente a -20° C. Los extractos de tejido se colocan en

acetatos de nitrocelulosa y se someten a electroforesis por un período de 20 minutos a 130-

280 volts. Los amortiguadores de electroforesis son Tris-glicina (pH= 8.5) y ácido cítrico

morfolina (pH=7.0). La selección de los dos sistemas enzimáticos se basa en Barriga-Sosa

et al. (2002) y Barriga-Sosa (2003), y son: glucosa-6-fosfato isomerasa (Gpi, EC5.3.1.9) y

L-lactato deshidrogenasa (Ldh, EC1.1.1.27), los cuales permiten discriminar a las especies

mencionadas. Las tinciones histoquímicas se realizan de acuerdo a Hebert y Beaton

(1989), modificadas por Barriga-Sosa et al. (en prensa).

Análisis de resultados aloenzimáticos – Primeramente, se discriminan las especies

de peces blancos (C. humboldtianum, C. estor, C. lucius) de acuerdo con los alelos

presentados. En caso de encontrarse variabilidad, se estima la proporción de loci

polimorficos (empleando los criterios P.95 y P.99), la heterocigosidad (He) para cada

muestra (GENEPOP 3.1, Raymond y Rousset, 1995) y se determina el equilibrio de Hardy-

Weinberg (H-W), también se aplica la prueba P de Fisher para determinar las diferencias

significativas entre las frecuencias alélicas entre especies o muestras (TFPGA 1.3, Miller,

1998).

ACTIVIDADES REALIZADAS

Con base en los objetivos del proyecto, se llevo a cabo:

a) La medición, registro e identificación de los 50 organismos, creando bases de datos para

cada una de las muestras.

b) La extracción (tADN), amplificación y purificación (16S) de los 50 organismos con la

metodología descrita.

c) La presentación de resultados obtenidos hasta ese momento en forma de seminario,

impartido en la PEXPA el 26 de Febrero de 2003.

d) El uso del programa NEBcutter para la nueva selección de enzimas de restricción así

como un total de 174 restricciones enzimáticas, discriminando a la especie.

e) La discriminación de especies empleando aloenzimas (Gpi y Ldh).

f) La compilación y análisis de los resultados moleculares, efectuando la discriminación de

especies y la elaboración del Informe Final de Servicio Social.

Aunadas a estas actividades, se encuentran una constante revisión bibliográfica, el

desarrollo de una bitácora de laboratorio y la asistencia a conferencias y seminarios

relacionados con el tema.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

Objetivo General

Discriminación de especies de peces blancos provenientes del Lago de Pátzcuaro,

Michoacán a nivel molecular, por medio de aloenzimas y restricción enzimática del gen

mitocondrial 16S.

Objetivos Específicos

* Identificación morfológica de la especie.

* Determinación del grado de variabilidad morfométrica y merística de las muestras

analizadas.

* Discriminación de la especie por medio de patrones de restricción enzimática.

* Discriminación de la especie por medio de loci aloenzimáticos.

Metas

* Manejo de las técnicas moleculares.

* Desarrollo escalonado del proyecto y cumplimiento de los objetivos.

* Superación y remediación de pequeños inconvenientes presentados en el transcurso del

mismo.

* Desarrollo de habilidades

RESULTADOS Y DISCUSION

Análisis Morfométrico (M) y Merístico (m) e Identificación de la (s) especie (s).

De acuerdo a las claves de Barbour (1973 a), los organismos de ambas muestras

fueron identificados como Chirostoma humboldtianum. Para discriminar a la especie, se

emplea la variable morfométrica distancia del hocico a la aleta pélvica expresada en

porcentaje de longitud estándar y las merísticas: número de escamas de la línea lateral,

número de escamas predorsales, número de radios anales y número de branquiespinas.

Por lo que respecta al número de escamas interdorsales, éste no se ajusta al

reportado en las claves de Barbour (1973 a). Barriga-Sosa (2001), al analizar diferentes

poblaciones de C. humboldtianum y 12 especies más, amplia el intervalo para dicha

variable, siendo compatible con los datos obtenidos en el presente trabajo. Así mismo, se

comparan los intervalos de las variables morfológicas útiles para la discriminación de C.

humboldtianum, propuestos por tres autores (Tabla 2).

En la tabla 3 se presentan los promedios y las medidas de dispersión (análisis

univariado) de las 19 variables morfométricas y las ocho merísticas para ambas muestras.

Cabe mencionar que las claves utilizadas (Barbour, 1973 a) son aplicables a organismos

mayores de 200 mm de LS, por lo que su utilidad para nuestras muestras es limitada,

debido a ello, los resultados de este trabajo pueden considerarse como una base de datos de

referencia para futuros estudios.

Tabla 2. Intervalos y medias para 4 variables merísticas y 2 morfométricas (%LS) para C.

humboldtianum.

VariableBarbour, 1973 a

(n ’=515)

Alaye-Rahy,

1996 a (n =2)

Barriga-Sosa,

2001 (n =89)

Este trabajo

2003 (n1=15 y

n2*=35)

Esc. línea lateral 47-73 (60) 63-72 (68.3) 42-78 (63.2) 58-72 (66)57-71(64)*

Esc. predorsales 24-50 (ND) 38-58 (48.6) 25-75 (47.13) 28-38 (33)23-39 (31)*

E. interdorsales 4-12 (ND) 12-14 (12.6) 7-17 (10.9) 12-20 (17)11-17 (14)*

Branquiespinas 19-28 (23) 23-26 (24.6) 19-32 (24.3) 17-23 (20) 17-22 (19)*

Dist. H. pélvica 40.9-51.2 (44.0) 44.4-47.0 (45.7) 38.7-49 (43.7) 43.8-48.3 (46.04)35.6-45(41.08)*

Dist. H. 2ª dorsal ND 66.3-67.7 (67.2) ND 65.6-71.2 (67.16)60.8-71.4 (66.0)*

n = no. muestra; n ’= no. muestra promedio; n1 = 1ra. Muestra; n2*= 2da. Muestra; ND= no

disponible.

Tabla 3. Intervalos, medias (en paréntesis) y coeficiente de variación (en cursiva) de

caracteres morfométricos (%LS) y merísticos.

C.MORFOMETRICO 1a Muestra n1= 15 2a Muestra n2= 35

Long. Cefálica (LC)26.38-32.47 (28.09)

6.63

22.38-26.98 (24.64)

5.43

Diam. ojo (Dor)7.0-8.66 (7.67)

6.69

4.90-10.36 (7.89)

6.83

Long. hocico (LH)4.16-7.16 (5.54)

13.42

6.39-8.93 (7.56)

8.05

Long. mandibular (Lmi)9.15-12.05 (10.43)

7.73

5.82-10.4 (8.49)

12.30

Long. postorbital (LPoc)11.0-13.13 (12.04)

9.20

8.60-14.07 (10.4)

10.71

Long. P. caudal (LpC)15.87-21.19 (18.58)

8.67

14.66-30.86 (20.78)

10.47

Base aleta anal (BaA)19.61-23.24 (21.96)

4.25

17.60-25.52 (22.31)

8.75

Dist.hocico 1 dorsal (DH1D)52.05-57.93 (54.34)

3.10

46.23-56.27 (50.53)

4.38

Dist.hocico 2 dorsal (DH2D)63.6-71.19 (67.17)

2.56

60.87-71.47 (66.09)

3.48

Dist. hocico pélvica (DHP)43.76-48.31 (46.17)

2.81

35.57-44.67 (41.03)

5.50

Base aleta pélvica (BaP)3.61-5.37 (4.34)

12.62

1.09-5.03 (3.23)

14.58

Altura máxima (Amax)16.49-21.15 (18.39)

5.91

14.81-18.78 (16.47)

7.43

Altura mínima (Amin) 5.84-8.59 (7.2) 5.77-9.8 (7.53)

8.79 10.63

Altura aleta anal (AaA)12.47-18.67 (15.07)

11.55

13.04-19.04 (15.88)

8.74

Altura aleta pectoral (AaP)9.10-17.76 (15.96)

12.86

12.99-19.57 (17.33)

9.05

Altura 1 dorsal (A1D)7.53-10.30 (9.04)

11.34

6.93-10.83 (8.96)

11.69

Altura 2 dorsal (A2D)5.49-15.87 (12.96)

20.02

10.86-18.73 (15.74)

11.34

C. MERISTICO 1a Muestra n= 15 2a Muestra n= 35

Esc. línea lateral (ELL)58-72 (66)

6.23

57-71 (64)

5.74

Esc. predorsales (EPD)28-38 (33)

9.89

23-39 (31)

12.32

Esc. interdorsales (EID)12-20 (17)

12.00

11-17 (14)

13.93

No. radios pectorales (RP)10-14 (12)

9.52

11-14 (13)

8.29

No. radios 1 dorsal (R1D)3-7 (4)

16.80

5-7 (6)

12.99

No. radios 2 dorsal (R2D)10-13 (11)

8.64

10-14 (13)

12.68

No. radios anales (RaA)15-20 (18)

6.76

20-23 (21)

8.20

Branquiespinas (B)17-23 (20)

10.34

17-22 (19)

7.69

Por otra parte, empleando el análisis multivariante, se encontró que no hay

diferencias significativas en las variables morfológicas capaces de separar a ambas

muestras (n = 15 y n =35); la única separación está dada por la talla (LS).

Extracción de tADN y cuantificación.

Las extracciones de tADN realizadas con el DNeasy Tissue KitR presentaron buenos

resultados y una ventaja sobre el método tradicional fenol-cloroformo empleado por

diversos autores (Bartlett y Davidson, 1991; Grijalva Chon et al., 1994; Ruiz-Rejón et al.,

2000; Solé-Cava y Gusmao, 2002), ya que permite obtener un tADN libre de trazas o

impurezas orgánicas las cuales pueden impedir el proceso de amplificación vía PCR. De

este modo, se obtuvo tADN branquial de alto peso molecular y buena calidad en 13 de los

15 organismos de la primera muestra (n =15) (Fig. 3), los dos individuoss que no

funcionaron con branquia se repitieron empleando tejido muscular y el mismo protocolo,

con buenos resultados en ambas diluciones (A y B). Las extracciones de tADN de la

segunda muestra (n= 35) también presentan alto peso molecular y buena calidad, aunque se

observa actividad de RNAsa (Fig. 4) debida posiblemente a un mal manejo de los

organismos durante su congelación.

Figuras 3 y 4. Extracción de tADN de tejido branquial.

Amplificación del gen mitocondrial 16S vía PCR y cuantificación de productos.

La amplificación del gen mitocondrial 16S se llevó a cabo con una temperatura de

anillamiento de 36°C en 49 muestras, la restante funcionó a 50.5°C. Los principales

cambios practicados a la técnica de PCR fueron los volúmenes de tADN empleados para

cada reacción, en ocasiones se utilizaron 1, 2 ó 3 µL de acuerdo a la concentración de

tADN de cada muestra.

El tamaño del fragmento amplificado coincide con el esperado para la especie C.

humboldtianum (Barriga-Sosa, 2001), siendo de aproximadamente 620 pares de pb (Fig. 5)

en todos los organismos por lo que de entrada, se puede suponer que las dos muestras

pertenecen a la misma población y/o especie (Mora-Souza, 1998; Torres-Frías, 1998).

Fig. 5. Gen mt 16S amplificado vía PCR (∼620 pb).

Purificación de productos amplificados y cuantificación.

La purificación de productos amplificados permite la eliminación de impurezas

(restos de dNTP’s principalmente) indispensable para llevar a cabo las restricciones

enzimáticas debido a la sensibilidad de las diferentes enzimas (Dowling et al., 1990). Por

otro lado, es posible cuantificar la concentración y el tamaño del fragmento amplificado y,

de manera cualitativa determinar su calidad. En las figuras 6 y 7 se muestra el gen

mitocondrial 16s ya purifcado para algunos organismos, estos productos muestran bandas

limpias y libres de RNAsa con tamaños de aproximadamente 620 pb y diferentes

concentraciones.

Figuras 6 y 7. Purificación del gen mt 16S.

Algo que es importante mencionar, es que la concentración del fragmento

amplificado (gen mt 16S) varia entre los organismos, se determina en relación con el

marcador molecular de peso conocido (100pb λDNAR) y se expresa en ng/µL

Restricción Enzimática.

Discriminación de especies

De las enzimas utilizadas para la discriminación de las especies, los patrones

generados por Taq I, HpyCH4 IV y Bbv I son los esperados para la especie C.

humboldtianum (Tabla 4, Figura 8), sin embargo, cabe señalar que el patrón esperado para

la enzima Eag I no se observó en ninguno de los organismos analizados. La incertidumbre

en la información que proporciona ésta enzima será resuelta por medio de la utilización de

otro marcador molecular y otras enzimas de restricción que permitirán elucidar sí éste es un

efecto determinado por variabilidad genética dentro de la especie.

Tabla 4. Patrones de restricción del gen mitocondrial 16S.

Taq I HpyCH4 IV Eag I Bbv I

A B A A A

500 620 570 620 560

90 50 60

30

Cabe resaltar que el uso del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de

restricción (RFLP’s) es una técnica potencial para efectuar la discriminación de especies

sometidas a presión pesquera (Bartlett y Davidson, 1991), la cual ofrece resultados hasta

con un 98.5% de confiabilidad empleando dos enzimas de restricción (Gusmao y Solé-

Cava, 2002).

Variabilidad genética determinada por RFLP s

El análisis de RFLP’s de genes mitocondriales amplificados es una herramienta de

utilidad para determinar la variabilidad genética de poblaciones o especies (Grijalva-Chon

et al., 2002). En el presente trabajo, las cuatro enzimas empleadas presentaron un solo

haplotipo (A) a excepción de la Taq I (Tabla 4) que también presenta el haplotipo B (en un

individuo) y puesto que, la variabilidad genética está dada por el número de haplotipos

(Grijalva-Chon et al., 1994); la variabilidad para ambas muestras es nula, por esta razón

los resultados no se analizaron en el programa REAP.

a) b)

c) d)

Figura 8. Patrones de restricción enzimática observados en geles de agarosa 2%: a) Taq I;

b) HpyCH4 IV; c) Bbv I y d) Eag I.

Lo anterior, permite sugerir una homogeneidad genética en la especie C.

humboldtianum del Lago de Pátzcuaro (mantenidos en el INIRENA), aunque es necesario

robustecer el estudio genético poblacional, ya sea aumentando el número de enzimas de

restricción o bien empleando una región mitocondrial altamente variable como la control

(D-loop) (Faber y Stepien, 1997).

Aloenzimas

Discriminación de especies.

Este marcador molecular permitió discriminar a la especie, debido a la resolución

electroforética que se obtuvo al emplear tejido (ojo y músculo) en buenas condiciones

(Bouza et al., 2002).

De acuerdo a los sistemas aloenzimáticos ensayados, todas las muestras mostraron

el patrón de discriminación determinado para la especie C. humboldtinuam (Barriga-Sosa,

2003), el cual consiste en la presencia del alelo f para el locus Gpi-3, así como el alelo d

para el locus Gpi-1 y monomorfismo para los loci Ldh-1 y 2 (Figura 9).

a) b)

Figura 9. Patrones aloenzimáticos a) Gpi; b) Ldh.

Variabilidad genética

Al igual que con los RFLP’s, no se presenta variabilidad en las muestras, ya que

todos los organismos presentaron patrones monomorficos.

Barriga-Sosa et al. (2002), empleando 23 loci, reportan un proporción de

polimorfismo (P.95) para la especie de 17 y una heterocigosidad (He) de 0.087; por lo que

es recomendable aumentar el numero de loci para determinar la variabilidad (Barriga-Sosa

et al., 2003).

CONCLUSIONES

* Por medio del análisis morfológico, se identificaron a los 50 individuos como C.

humboldtianum.

* Los datos morfométricos reportados en el presente trabajo, pueden ayudar a futuros

estudios para llevar a cabo la discriminación de C. humboldtianum en estadio juvenil.

* El análisis de RFLP’s del gen mitocondrial 16S sustenta que la especie es C.

humboldtianum, en su caso, los mismos marcadores pueden discriminar a las especies C.

lucius y C. estor, usando tejido vivo o congelado.

* Los loci diagnóstico empleados, apoyan los resultados morfológicos y RFLP’s.

• Se reporta cero variabilidad genética con ambos marcadores, por lo que se

sugiere aumentar el número de sistemas enzimáticos y el uso de la región

control en el caso de los RFLP’s.

•

* Los marcadores moleculares específicos (RFLP’s y aloenzimas) constituyen un

sistema de diagnóstico que podrá ser útil para el desarrollo de programas de manejo y

conservación de este recurso.

CRITERIOS DE EVALUACION

El alumno será evaluado de acuerdo a su desempeño académico y experimental,

durante el desarrollo del proyecto y con base en el contenido del reporte final.

REFERENCIAS

Alaye R. N., 1993. El pescado blanco (género Chirostoma) del lago de Pátzcuaro,

Michoacán. Composición de especies. Ciencia Pesquera (9): 113-128.

Alaye R. N., 1996 a. Estudios del polimorfismo de la hemoglobina para identificar especies

del género Chirostoma del Lago de Pátzcuaro, Michoacán, México. Ciencia Pesquera

(13):1-9.

Alaye, R. N., 1996 b. Híbridos entre especies del género Chirostoma del Lago de

Pátzcuaro, Michoacán, México. Ciencia Pesquera (13): 10-17.

Barbour, C.D., 1973 a. The systematics and evolution of the genus Chirostoma, Swaison.

Tul. Stud. Zool. Bot. 19: 97-141.

Barbour, C.D., 1973 b. A biogeographycal history of Chirostoma (Pisces: Atherinidae): A

species flock from the Mexican Plateau. Copeia (3): 533-556.

Barbour, C. D. y B. Chernoff, 1984. Comparative morphologyc and morphometrics of the

pescados blancos (Genius Chirostoma) from Lake Chapala, México. Evolution of fish

species flocks. University of Maine at Orono Press, Maine. 111-127.

Barriga Sosa, I.D.L.A., 2001. Variabilidad morfométrica, merística y molecular de especies

del género Chirostoma (Pisces: Atherinopsidae). Tesis Doctorado en Ciencias

Biológicas. UAM Iztapalapa. 199 pp.

Barriga-Sosa, I.D.L.A., A.L. Ibañez-Aguirre y J.L. Arredondo-Figueroa, 2002.

Morphologycal and generic variation of seven species of the engangered Chirostoma

“humboldtianum species group” (Pisces: Atherinidae). Rev. Biol. Trop., 50 (1): 199-

216.

Barriga-Sosa, I.D.L.A., L.E. Eguiarte y J.L. Arredondo-Figueroa. (en revisión Revista

Biotropica). Is Population subdivision ocurring in Chirostoma grandocule from Lake

Pátzcuaro, México?

Barriga-Sosa, I.D.L.A, I. Mora-Souza y J.L. Arredondo Figueroa (en prensa). Manual

técnico para la discriminación de tilapias introducidas a México por medio de la

utilización de marcadores aloenzimáticos. Serie Desarrollos Tecnológicos en

Acuicultura. Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. México.43 pp.

Barriga-Sosa, I.D.L.A., M.D.L. Jiménez-Badillo, A.L. Ibañez y J.L. Figueroa, 2003.

Variability of tilapias (Oreochromis spp.) introduced in Mexico: morphometric,

meristic and genetic characters. J. Appl. Ichthyol. 18: 1-8.

Barriga-Sosa, I.D.L.A., 2003. La importancia de los estudios de génetica molecular en el

género Chirostoma. Contactos, 47: 5-11.

Bartlett, S.E. y W.S. Davidson, 1991. Identification of Thunnus Tuna species by the

Polymerase Chain Reaction and direct sequence analysis of their mitochobdrial

cytochrome b genes. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 48: 309-317.

Bouza, C., P. Presa, J. Castro, L. Sánchez y P. Martínez, 2002. Allozyme and microsatellite

diversity in natural and domestic populations of turbot (Scophthalmus maximus) in

comparison with other Pleuronectiformes. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 59: 1460-1473.

Chacón Torres, A., M. R. Pérez y I.E ,Muzquiz, 1991. Síntesis Limnológica del Lago de

Pátzcuaro, Michoacán, México. Biol. Acuat. I, Sría. de Difusión Cultural Edit. Univ.,

México. 48 pp.

Chacón Torres, A., 1993. Pátzcuaro, un Lago Amenazado. Bosquejo Limnológico.

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, México. 144 pp.

Coyote, B. A., 2000. Análisis de las relaciones taxonómicas entre las especies de Poblana

De Buen (Pisces: Atherinopsidae) mediante marcadores RAPD. Tesis Licenciatura.

IPN, México. 91 pp.

Cuadras, C. M., 1991. Métodos de análisis multivariante. Promociones y Publicaciones

Universitarias, Barcelona.

Dowling, T.E., C. Moritz y J.D. Palmer, 1990. Nucleic Acids II: Restriction Site Analysis.

P. 250-317. In: D.M. Hills & C. Moritz (eds.). Molecular Systematics. Sinaver

Associates Publishers, EUA.

Echelle, A. A. y A. F. Echelle, 1984. Evolutionary genetics of a “species flock”: Atherinid

fishes of the Mesa Central Mexico, p. 93-110. In: A.A. Echelle & I. Konfield (eds.).

Evolution of fish species flocks. University of Maine, Orono.

Faber, J.E. y C.A. Stepien, 1997. The utility of mitochondrial DNA control region

sequences for analyzing phylogenetic relationships among populations, species, and

genera of the Percidae, p. 129-143. In: T.D. Kocher y C.A. Stepien (eds.). Molecular

Systematics of Fishes. Academic Press, San Diego.

Grijalva-Chon, J.M., K. Numachi, O. Sosa-Nishizaki y J. de la Rosa-Vélez, 1994.

Mitochondrial DNA analysis of North Pacific swordfish Xiphias gladius population

structure. Mar. Ecol. Prog. Ser., 115: 15-19.

Grijalva-Chon, J.M., A. Kaichi y K. Numachi, 2002. Homogeneidad genética en tiburón

angelito (Squatina californica) del Golfo de California, evidenciada por análisis

PCR-RFLP de la región control del ADN mitocondrial. Ciencia y Mar, 11: 37-42.

Gusmao, J. Y A.M. Solé-Cava, 2002. Um sistema de diagnóstico molecular para a

identifiςacao de espécies comerciais de camaroes marinhos brasileiros. I Congreso

Iberoamericano Virtual de Acuicultura, 754-764.

Hebert, D. N. P. y M. J. Beaton, 1989. Methologies for allozyme analyses using cellulose

acetate electrophoresis: a practical handbook. Helena Laboratories, Beaumont, EUA.

31 pp.

Ibañez-Aguirre, A.L. y J. Lleonart, 1996. Relative growth and comparative morphometrics

of Mugil cephalus L. and M. curema V. in the Gulf of México. Sci. Mar., 60 (2-3):

361-368.

Kocher, T.D., W.K. Thomas y A. Meyer, 1989. Dynamics of mitochondrial DNA evolution

in animals: Amplification and sequencing with conserved primers. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 86: 6196-6200.

Maya, J. P., G. Figueroa-Lucero y M. Soria-Barreto, 2000. Peces Dulceacuícolas

Mexicanos. XIX Chirostoma humboldtianum (Atheriniphormes: Atherinopsidae).

Zoología Informa (43): 59-74.

McElroy, D., P. Moran, E. Bermingham e I. Kornfield, 1992. REAP. The Restriction

Enzyme Analysis Package. Versión 4.0. Orono, Maine. 38 pp.

Miller, M. P., 1998. Tools for populations genetic analysis. Northern Arizona Univ.

Flagstaff, AZ, USA.

Mora-Souza, P.I., 1998. Estudio merístico, morfométrico y molecular de ocho especies del

género Chirostoma (Pisces: Atherinidae). Informe Final Servicio Social. UAM

Xochimilco. 52 pp.

Nei, M., 1987. Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York.

512 pp.

Nei, M. y S.D. Kumar, 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University

press, New York. 333 pp.

Palumbi S., A. Martin, S. Romano, W.O. McMillan, L. Stice y G. Grabowski, 1991. The

simple fool’s guide to PCR. University of Hawaii, Honolulu. 34 pp.

QiagenR, 2002. QIA quickR Spin Handbook. EUA. 34 pp.

QiagenR, 2002. DneasyR Tissue Handboob. EUA. 43 pp.

QiagenR, 2002. Taq PCR Handbook. EUA. 38 pp.

Ruiz-Rejón, M., R. De la Herrán, C. Ruiz-Rejón y M.A. Garrido-Ramos, 2000. Genetic

characterization of Acipenser sturio L., 1758 in relation to other sturgeon species

using satellite DNA. Bol. Inst. Esp. Oceanogr., 16 (1-4): 231-236.

Soria-Barreto, M., J. Paulo Maya, A. Chacón-Torres y V. Segura-García, 1998. Peces

Dulceacuícolas Mexicanos. XVI Chirostoma estor (Atheriniformes: Atherinidae).

Zoología Informa (38): 33-46.

Torres-Frías, E., 1998. Estudio merístico, morfométrico y molecular de siete especies del

género Chirostoma (Pisces: Atherinidae). Informe Final Servicio Social. UAM

Xochimilco. 48 pp.

Mónica Yanelli Pérez Ramírez, 98332188, Hidrobiología.

DISCRIMINACIÓN DE ESPECIES DE PECES BLANCOS (ATHERINOPSIDAE:

Chirostoma) DEL LAGO DE PÁTZCUARO, POR MEDIO DE CARACTERES

MORFOLÓGICOS, ALOENZIMÁTICOS Y RFLP’S DEL GEN MITOCONDRIAL 16S.

H.015.02, 5 de Junio, 2003.

Dra. Irene de los Angeles Barriga sosa. Titular C, Dpto. Hidrobiología, CBS.

Resumen

Los peces blancos del Lago de Pátzcuaro (Chirostoma estor, C. lucius y C.

humboldtianum) constituyen un recurso de gran importancia cultural y económica. El

deterioro ambiental, la sobreexplotación y la introducción de especies, ha provocado la

disminución de las poblaciones locales y la hibridación natural la cual, aunada a la gran

similitud de caracteres morfológicos entre éstas especies, dificulta la discriminación por

métodos tradicionales. En este trabajo, se discrimina a 50 organismos por medio de 27

caracteres morfológicos: 19 morfométricos y 8 merísticos (análisis univariado y

multivariado); dos loci diagnóstico (Gpi-3 y Ldh-1) y RFLP’s del gen mitocondrial 16S

amplificado vía PCR. Los resultados morfológicos eluden que se trata de la especie C.

humboldtianum, lo cual es soportado por el uso de los marcadores moleculares. Así mismo,

se reporta cero variabilidad en las muestras, por lo que se recomienda aumentar el número

de enzimas de restricción y emplear la región control (D-loop) en el caso de los RFLP’s.

Por lo anterior, se concluye que el empleo de marcadores moleculares permite establecer

métodos confiables para efectuar la discriminación de especies, necesaria para formular o

desarrollar programas de manejo y/o conservación.