Identifica ción y caracterizaci ón parcial del gen de la enzima profenoloxidasa en Dactylopius coccus Fernando García, Patricia Aguilar, Ana Beatriz Celma, Humberto Lanz, Ignacio del Río y Fidel Hernández Introducción En los insectos, el sistema de la profenoloxidasa es un mecanismo regulador del sistema inmune cuya activación depende de reacciones en cascada en las que participan enzimas tipo serina proteasas, las cuales son activadas por la presencia de compo - nentes micóticos y bacterianos como los lipopoli- sacáridos (LPS) y β1-3 glucanos (Zymosan). La acti- vación del sistema de la fenoloxidasa desencade- na mecanismos de defensa de la int egridad corporal del insecto, incluyendo la síntesis de melanina, polí- mero capaz de recubrir el cuerpo de organismos invasores y de participar en el cierre de heridas, entre otras funciones. La melanización consiste en una serie de reaccio- nes que se inician con la hidroxilación de tirosina para formar L-hidroxifenilalanina (L-DOPA) la cual, a su vez, se oxida y da lugar a diferentes compues- tos llamados dopacromos, y éstos, por su parte, producen indolquinonas que se polimerizan y for- man la melanina como producto final (Söderhall e Iwanaga, 1996). La molécula clave en esta ruta es la proFO, la cual es una enzima bifuncional que posee actividad de oxidoreductasa y de mono- oxigenasa y presenta, además, dos sitios de unión al cobre. La proFO está asociada a tres procesos fisiológicos diferentes pero interrelacionados: a) endurecimiento de la exocutícula, proceso donde se añaden a esta estructura las moléculas quitina y Resumen La profenoloxidasa (proFO) es la enzima clave de la ruta bioquímica de la fenoloxidasa, la cuales responsable de activar varios mecanismos de defensa de los invertebrados, tanto para evitarla entrada de microorganismos invasores, como para realizar la coagulación y cierre de heridas. En este trabajo se obtuvo la secuencia parcial del gen de la proFO del insecto Dactylopius coccus o grana fina del nopal, la cual presentó alto grado de homología con la enzima de dípteros. Por otra parte, se observó que el RNA mensajero (RNAm) de la proFO se expresa en las ninfas de primer y segundo estadio, así como en las hembras oviplenas del insecto. melanina (Ashida y Brey, 1995); b) encapsulación y melanización de microorganismos extraños, reac- ciones que forman estructuras que inmovilizan microorganismos invasores, y c) la producción de quinonas citotóxicas, compuestos capaces de ma- tar agentes infecciosos (Sugumaran y Nellaiappan, 1991). El sistema inmune de la grana fina ( Dactylopius coccus Costa) –insecto parásito del nopal que se cul- tiva para obtener ácido carmínico (colorante rojo de uso comercial) (Llanderal y Nieto, 1999)– ha sido poco estudiado. Las células originadas en el cuer- po graso de esta especie son portadoras de gránu- los de ácido carmínico (Maza, 1999), y cuando en- tran en contacto con azúcares propios de la pared celular bacteriana y de hongos –como el zymosan y la laminarina, entre otros–, se produce degranu- lación y ennegrecimiento del pigmento de los grá- nulos, lo que sugiere una reacción similar a la melanización, la cual podría depender de la ruta de la fenoloxidasa. También se ha observado que cuando a la hemolinfa (HL) de D. coccus se le agre- gan zymosan o péptidoglicanos, se presenta cierto consumo de carmín durante la reacción. Por otra parte, en la HL tratada con feniltiourea (FTU), un inhibidor específico de la proFO, se inhibe el con- sumo de carmín y no ocurre obscurecimiento de la HL, esto sugiere que el carmín podría ser meta- bolizado por la proFO (García, Lanz, Rojas y Hernández, 2002). 12INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA B i o l o g í a
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Una mirada a los distintos tipos de familias. Un estudio de caso en la Universidad Simón Bolívar. María Teresa Torres.
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8/14/2019 Una mirada a los distintos tipos de familias. Un estudio de caso en la Universidad Simón Bolívar. María Teresa Torr…
La finalidad de este trabajo es identificar y secuenciar el gen de la proFO de la grana fina Dactylopius coccus,
así como analizar su expresión en diferentes estadios del ciclo de vida de este insecto.
Metodología
Reactivos. Los reactivos utilizados en este trabajo fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las compa-
ñías Sigma Chem (St. Louis Missouri), Invitrogen y PE Applied Biosystems. Los reactivos para electroforesis
provinieron de Gibco-BRL (Life Technologies).
Insectos. Se utilizaron insectos de la especie D. coccus cultivados en módulos de experimentación tipo cober-
tizo, ubicados en Coyotepec, Oaxaca, en terrenos de la compañía productora de grana Tlapanochestli.
Obtención de DNA genómico y amplificación de un fragmento de proFO. Para extraer el DNA de D. coccus
se utilizaron tres hembras adultas oviplenas. El tejido que se obtuvo fue homogenizado en un tubo demicrocentrífuga con 700 µl de DNAzol (Life Technologies, Rockville, Maryland) Las muestras fueron
centrifugadas a 4,000 x g durante 10 min a 4 °C. Se recuperó el sobrenadante (fase viscosa) y se agregaron
0.5 vol de etanol absoluto para precipitar el DNA. Posteriormente, se centrifugaron a 4,000 x g durante 3 min
a 4 °C. La pastilla recuperada se lavó dos veces con etanol a 75% y se resuspendió en 100 µl de NaOH 8 mM
(Ausubel et al., 1989).
Un fragmento del gen de la proFO fue amplificado por PCR usando iniciadores degenerados (amplifican un
dominio fuertemente conservado de la proFO en dípteros) usados previamente en Anopheles gambiae (Müller,
que amplifican un fragmento de actina de Anopheles albimanus. La amplificación se realizó a través de 28 ciclosde 3 min a 94 °C, 1 min a 50 °C y 2 min a 72 °C (oligos amablemente donados por el D. en C. J. Martínez
Barnetche).
Secuenciación de los fragmentos de cDNA y DNA genómico amplificados. Los productos amplificados que
presentaron el tamaño esperado fueron purificados y clonados mediante el sistema TA CloningMR (Invitrogen),
de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los fragmentos de DNA de las clonas obtenidas se secuenciaron
con el método de amplificación por PCR en presencia de dideoxinucleótidos como terminadores de la reacción
(Big DyeMR Applied Biosystems). Como iniciadores de la reacción de secuenciación se usaron los oligonucleótidos
M13 (forward y reverse). Las reacciones fueron analizadas con el secuenciador automático ABI-PRISMMR (PE
Biosystems).
Análisis de secuencias. Las secuencias de DNA obtenidas se tradujeron en los marcos de lectura posibles por
medio del programa Sixframe, y las secuencias de DNA y productos de traducción deducidos se compararoncon las secuencias almacenadas en los bancos de datos GenBank Invertebrates y Swissprot mediante los pro-
gramas BlastX y BlastN. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las clonas (proFO 900 y proFO
680) de D. coccus se hizo utilizando el programa de alineamiento múltiple CLUSTALW (Múltiple Sequence
Alignment). Basados en las similitudes de secuencia entre las proFO, se construyeron árboles filogenéticos
utilizando el programa PHYLIP (Felsenstein, 1993). Estos programas y bases de datos se encuentran dispo-
nibles en los portales de internet del National Center for Biotechnology Information (NCBI) http://
ncbi.nlm.nih.gov y San Diego Supercomputing Center (SDSC) http:// workbench.sdsc.edu.
Figura 1. Amplificación por PCR de la proFO de D.coccus a partir
de DNA genómico
El DNA genómico de D. coccus fue usado como molde para ampli-
ficar mediante PCR un fragmento de la proFO, para la cual se uti-
lizaron los oligos PO-CuA y PO-CuB del modo descrito en el apar-
tado de Metodología. Carril 1: escalera de moléculas de DNA en
múltiplos de 100 pb, utilizada como marcador de tamaño molecular.
Carril 2: amplificación en la cual se usó como molde DNA genómico
de D. coccus. Carril 3: reacción de control negativo de PCR, carente
de DNA molde. Las muestras fueron analizadas en un gel de agarosa
a 1.5% preparado en amortiguador TAE 1X.
Resultados
Amplificación y análisis de un fragmento de la proFO
de D. coccus. A partir del DNA genómico de D.
coccus, se amplificó un fragmento de aproxima-
damente 900 pb (proFO-900) de la enzima PROFO
(Figura 1). Por otra parte, utilizando el cDNA de
D. coccus como molde, se obtuvo un producto de
680 pb (proFO-680) (Figura 5). Los dos fragmentos
fueron secuenciados.
Ambas amplificaciones poseen un marco de lectu-
ra abierto (ORF) que puede codificar para un seg-
mento de proteína de 295 aminoácidos (Figura 2).
El amplificado proFO-900 mostró, además, una se-cuencia no codificante de 165 pb (Figura 4). Al com-
parar la proFO de D. coccus con las bases de datos
de invertebrados, se observó que posee una
homología de 23.6% con la proFO-A1 de Drosophila
melanogaster (Fujimoto et al., 1995); 21.1% con la
proFO-2 de Bombyx mori (Ashida et al., 1998); 35.3%
con la proFO-2 de hemocitos de larvas de Sarcophaga
bullata (Chase, Raina, Bruno y Sugumaran, 2000), y
La secuencia de la proFO de D. coccus mostró características típicas de las proFO descritas: los residuos del
aminoácido 393 al aminoácido 418, que forman uno de los sitios de unión al cobre, son similares, en especial
las posiciones para los residuos metionina-arginina-ác. aspártico y prolina, que están conservados en las cua-
tro especies de insectos descritas anteriormente (Figura 2) (Chase et al., 2000). Al generar el árbol filogenético
mediante el programa PHYLIP, la proFO de D. coccus fue agrupada próxima a la proFO de S. bullata en unarama independiente a las otras proFO (Figura 3).
Figura 2. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de proFO de diferentes insectos
Figura 3. Relaciones de parentesco entre las proFOs de diferentes insectos
La secuencia de aminoácidos deducida de las clonas proFO de D. coccus se alineó, mediante el programa CLUSTAL W, con las proFOs indicadas
de B. mori, An. gambiae, S. bullata y D. melanogaster. Los números señalados sobre los alineamientos corresponden a la numeración de
aminoácidos de la proFO de S. bullata tomada como referencia. = indica el sitio de unión al cobre; * = residuos idénticos; := grupos
fuertemente conservados; .= grupos débilmente conservados.. —— = “Gap” entre las secuencias.
Los alineamientos entre las proFOs de insectos fueron procesados mediante el paquete de programas PHYLIP para generar un árbol filogenético.