UM ESTUDO DA FOLHA DE Morinda citrifolia L. (NONI) - UFMT

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA

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Sinop-MT

2015/1

UM ESTUDO DA FOLHA DE Morinda citrifolia L. (NONI): DA

ANATOMIA ÀS ATIVIDADES BIOLÓGICAS

BIANCA DOS ANJOS PILONI

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA

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Sinop-MT

2015/1

UM ESTUDO DA FOLHA DE Morinda citrifolia L. (NONI): DA

ANATOMIA ÀS ATIVIDADES BIOLÓGICAS

BIANCA DOS ANJOS PILONI

Trabalho de Curso apresentado ao Curso de

Farmácia da Universidade Federal de Mato Grosso

– UFMT, Campus de Sinop para obtenção do título

de Farmacêutico, sob a orientação da Professora

Dra. Claudia dos Reis e coorientação da Professora

Dra. Pacífica Pinheiro Cavalcanti.

Sinop, Junho de 2015.

Dedico este trabalho à minha família, que se fez

presente em todos os momentos, apesar da

distância, que com muito carinho me apoiou

durante minha jornada acadêmica e não mediu

esforços para que eu alcançasse o meu sonho.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por me conceder a oportunidade, saúde e

perseverança para realizar este trabalho. E por ter colocado pessoas, verdadeiros anjos, em

meu caminho para torna-lo possível.

À minha família pelo incentivo, paciência, amor e carinho. Por participar ativamente

na execução de minha pesquisa. Obrigada por ser o melhor exemplo do que é ser família.

À minha orientadora, professora Dra. Claudia dos Reis, pela confiança depositada em

mim e pelos ensinamentos transmitidos. Obrigada pelas oportunidades de trabalho, não apenas

neste projeto, mas durante toda minha graduação e pela amizade construída durante esses

anos. Você é um grande exemplo que levarei por toda minha vida.

À professora Dra. Pacífica Pinheiro Cavalcanti pela experiência proporcionada e pelo

conhecimento transmitido, colaborando para o enriquecimento de minha formação.

À professora Dra. Carla Regina Andrighetti, por disponibilizar seu tempo, seus

conhecimentos, seu laboratório, pela confiança, sendo sua contribuição de suma importância

para que esta pesquisa fosse concluída.

Às professoras Dras. Marina Mariko Sugui e Valéria Dornelles Gindri Sinhorin pela

disponibilidade de materiais para execução do projeto.

Aos colegas e amigos, Isabela Daynara Teixeira Diodato, Rafael Morales e Valfran

Lima, por serem os anjos colocados por Deus em meu caminho, me auxiliando durante meu

projeto.

Ao Emilio Schafer Dilly, pela paciência, carinho, compreensão e ajuda durante todo o

trabalho.

Aos amigos, colegas de graduação e todos aqueles que se fizeram presentes em minha

jornada.

A vocês, meu muito obrigada!

"O Farmacêutico faz misturas agradáveis, compõe

unguentos úteis à saúde, e seu trabalho não

terminará, até que a paz divina se estenda sobre a

face da terra." (Eclesiástico 38, 7-8)

RESUMO

PILONI, B. A. Um estudo da folha de Morinda citrifolia L. (Noni): da anatomia às

atividades biológicas. 2015. 70 p. Trabalho de Curso de Farmácia – Universidade Federal de

Mato Grosso, Campus de Sinop.

Palavras-chaves: noni, compostos secundários, ensaios comportamentais.

INTRODUÇÃO: Morinda citrifolia L. (noni) é um arbusto de pequeno a médio porte com

folhas grandes, permanentes e elípticas. A espécie é nativa do sudeste da Ásia e se adaptou

muito bem ao clima brasileiro. Aproximadamente 160 compostos foram identificados nas

diversas partes da noni, sendo que a maioria deles pertence ao grupo dos compostos fenólicos,

ácidos orgânicos e alcaloides. Por esse motivo, a planta apresenta uma ampla gama de

atividades biológicas e valor nutricional, oferecendo benefícios à saúde, com atividades

antioxidante, antiinflamatória, analgésica, imunomoduladora, antibacteriana, antitumoral, entre

outros. Mesmo assim, os estudos com essa planta ainda são muito recentes, sendo poucos os

relatos sobre sua folha. OBJETIVOS: realizar uma caracterização anatômica e química das

folhas de noni, além de avaliar a eficácia do extrato da folha no tratamento da depressão,

ansiedade, compulsão e memória, e toxicidade em camundongos Swiss. MATERIAIS E

MÉTODOS: Foram coletadas folhas adultas de 30 indivíduos, no Município de Sinop-MT. Para

o estudo anatômico, realizou-se cortes transversais e paradérmicos da lâmina foliar,

posteriormente corados com Safranina e analisados em microscópio óptico. Testes

histoquímicos foram realizados com reagentes específicos para verificar as substâncias

presentes. O extrato hidroalcoólico foi obtido por maceração e foi realizada a triagem

fitoquímica. Para testes toxicológicos agudo e subcrônico, foram realizados testes hipocráticos

e avaliação sérica de ALT e AST em camundongos Swiss, após tratamento, via oral, com

extrato. Para avaliação das atividades antidepressiva, ansiolítica, anticompulsiva e memória,

foram realizados ensaios comportamentais com camundongos Swiss. Após administração do

extrato, os animais foram submetidos aos testes de atividade de locomoção espontânea, labirinto

em cruz elevado, nado forçado, esquiva inibitória do tipo “step down” e teste de esconder

esferas. Os dados foram analisados por Kruskal-Walis seguido por post-hoc de Dunn para teste

de esquiva inibitória do tipo “step-down” e análise de variância de uma via (ANOVA) seguido

por post-hoc de Student Newman-Keuls para demais testes comportamentais e toxicológico.

RESULTADOS: A folha é hipostomática, com estômatos paracíticos; epiderme unisseriada em

ambas as faces, com cutícula espessa na face adaxial e tricomas tectores uniseriados com

aproximadamente 6 células. Apresenta mesofilo dorsiventral e cristais de oxalato de cálcio em

forma de ráfides e drusas. Na região da nervura central, observa-se colênquima e parênquima

fundamental em ambas as faces e feixe vascular colateral. Tanto o mesofilo quanto a região do

feixe vascular apresentam células secretoras. Os testes histoquímicos e a triagem fitoquímica

demonstraram presença de compostos fenólicos, lignina, alcalóides, saponinas e heterosídeos

cardioativos. Os testes toxicológicos apresentaram valores alterados de ALT e AST séricos. Os

ensaios comportamentais apresentaram valores estatisticamente significativos para testes de

nado forçado, esquiva inibitória do tipo “step-down” e teste de esconder esferas.

CONCLUSÕES: O estudo anatômico apresenta caracteres estruturais que contribuem na

identificação da planta medicinal. Os testes histoquímicos e triagem fitoquímica possibilitaram

a confirmação da presença de compostos secundários na folha de noni. Os estudos

demonstraram possível hepatotoxicidade e sugestiva atividade antidepressiva, anticompulsiva

e estimulante da memória do extrato de noni.

ABSTRACT

PILONI, B. A. A study the of Morinda citrifolia L. (Noni) leaf: from anatomy to biological

activities. 2015. 70 p. Course Work of Pharmacy - Federal University of Mato Grosso, Sinop

Campus.

Keywords: noni, secondary compounds, behavioral tests

INTRODUCTION: Morinda citrifolia L. (noni) is a small to medium sized shrub with large

leaves, permanent and elliptical. The species is native of the Southeast Asia and has been

adapted very well to the Brazilian climate. Approximately 160 compounds have been identified

in various parts of the noni, and most of them belong to the group of phenolic compounds,

organic acids and alkaloids. For this reason, the plant produces a wide range of biological

activity and nutritional value, offering health benefits, with antioxidant, anti-inflammatory,

analgesic, immunomodulatory, antibacterial, antitumor activities, among others. Still, studies

with this plant are very recent, with a few reports of its leaf. OBJECTIVE: perform an

anatomical and chemical characterization of noni leaves, in addition to evaluating the

effectiveness of the leaf extract for treating depression, anxiety, compulsion and memory, and

toxicity in Swiss mices. MATERIALS AND METHODS: Adult leaves of 30 individuals were

collected in the city of Sinop-MT. For anatomical study, there was cross-sections and

paradermal of the leaf blade, then stained with Safranin and analyzed in light microscope.

Histochemical tests were carried out with specific reagents to verify the substances. The

hidroalcoholic extract was obtained by maceration and realized his phytochemical screening.

For acute and subchronic toxicological tests, Hippocratic tests were avaliated of ALT and AST

assessment in Swiss mice, after treatment with extract. For evaluate antidepressant activity,

anxiolytic, an anticompulsive and memory, behavioral tests were performed with Swiss mice.

After administration of the extract, the animals were subjected to the test spontaneous

locomotor activity, elevated plus maze, forced swimming, inhibitory avoidance of the "step

down" and testing to hide balls. Data were analyzed by Kruskal-Wallis followed by Dunn's

post-hoc test for inhibitory avoidance of the "step-down" and analysis of variance (ANOVA)

followed by post hoc Student-Newman-Keuls test for other behavioral and toxicological.

RESULTS AND DISCUSSION: The leaf is hipostomatic with paracytic stomata; uniseriate

epidermis on both sides, with dense cuticle on the adaxial surface and glandular trichomes with

uniseriate about six cells. Mesophyll presents dorsiventral and calcium oxalate crystals in the

form of raphides and Druze. In the region of the midrib, it is observed collenchyma and

fundamental parenchyma on both sides and collateral vascular bundle. As the mesophyll as the

region of the vascular bundle presents secretory cells. The histochemical tests and

phytochemical screening showed the presence of phenolic compounds, lignin, alkaloids,

saponins and cardioactive glycosides. Toxicological tests showed abnormal values of serum

ALT and AST. Behavioral tests showed statistically significant values for forced swimming

test, inhibitory avoidance of the "step-down" test and to hide balls. CONCLUSION: The

anatomical study has structural features that contribute to the identification of the medicinal

plant. The histochemical tests and phytochemical screening made it possible to confirm the

presence of secondary compounds in the noni leaf. Studies have shown possible hepatotoxicity

and possibility antidepressant activity, anticompulsive and stimulating the memory from the

noni extract.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Imagens de Morinda citrifolia; A) Árvore e suas ramificações; B) Inflorescência; C)

Frutos em diferentes estágios de maturação; D) Disposição de folhas, inflorescência e fruto. 20

Figura 2. Delineamento do estudo ........................................................................................... 30

Figura 3. Aparato utilizado para o teste de Atividade Locomotora Espontânea ..................... 38

Figura 4. Aparato utilizado para o teste LCE .......................................................................... 39

Figura 5. Aparato utilizado no teste de Nado Forçado ............................................................ 40

Figura 6. Aparato utilizado para teste de esconder esferas ..................................................... 41

Figura 7. Aparato utilizado para o teste de Esquiva Inibitória do tipo “step down” ............... 42

Figura 8. Seções transversal e paradérmica da folha de Morinda citrifolia. A) estômatos

presentes na face abaxial da folha. B) estômatos paracíticos. .................................................. 43

Figura 9. Seção transversal da folha de Morinda citrifolia. Epiderme unisseriada, cutícula

espessa na face adaxial, mesofilo dorsiventral e ráfides .......................................................... 44

Figura 10. Seções transversais da folha de Morinda citrifolia. A) Tricomas tectores

uniseriados. B) Bordo preenchido por colênquima .................................................................. 44

Figura 11. Seções transversais da folha de Morinda citrifolia. Cristais de Oxalato de cálcio. A)

Ráfide. B) Drusas ..................................................................................................................... 45

Figura 12. Seção transversal da folha de Morinda citrifolia. Região da nervura central

mostrando: feixe vascular colateral, células secretoras, colênquima e parênquima fundamental

.................................................................................................................................................. 45

Figura 13. Teste de floroglucina para determinação de lignina .............................................. 46

Figura 14. Teste de cloreto férrico para determinação de compostos fenólicos totais ............ 47

Figura 15. Teste de Dragendorff para determinação de alcaloides ......................................... 47

Figura 16. Teste de Sudan para determinação de lipídios ....................................................... 48

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na atividade locomotora espontânea

em camundongos, no teste de campo aberto ............................................................................ 51

Gráfico 2. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação da porcentagem de

entradas em braço aberto, no teste de labirinto em cruz elevado ............................................. 52

Gráfico 3. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação da frequência de

entradas em braço fechado, no teste de labirinto em cruz elevado........................................... 52

Gráfico 4. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação da porcentagem de

tempo em braço aberto, no teste de labirinto em cruz elevado ................................................. 53

Gráfico 5. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação do tempo de

imobilidade de camundongos avaliados no teste de esquiva nado forçado por 3 min ............. 54

Gráfico 6. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação do número de esferas

escondidas pelos camundongos, no teste de avaliação da compulsão ...................................... 55

Gráfico 7. Efeito do tratamento crônico do extrato da folha de Morinda citrifolia na MCD (1,5

horas) e MLD (24 horas) de camundongos avaliados no teste de esquiva “step-dow” por 3 min

.................................................................................................................................................. 56

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Caracterização histoquímica das folhas de Morinda citrifolia ................................ 46

Tabela 2. Triagem fitoquímica do extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia .................... 48

Tabela 3. Toxicidade Aguda: Valores médios da dosagem sérica (± desvio padrão) de ALT e

AST (UI/L) em camundongos tratados com extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia...... 50

Tabela 4. Toxicidade Subcrônica: Valores médios da dosagem sérica (± desvio padrão) de ALT

e AST (UI/L) em camundongos tratados com extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia ... 50

LISTA DE ABREVIATURAS

A.C. – Antes de Cristo

AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

AINES – Antiinflamatório Não Esteroidal

ALT – Alanina Amino Transferase

ANOVA – Análise de Variância

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AST – Aspartato Amino Transferase

CNMT – Centro Norte Mato-Grossense

COX-1 – Ciclo-Oxigenase-1

COX-2 – Ciclo-Oxigenase-2

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

DP – Desvio Padrão

EBA – Entrada em Braço Aberto

EBF – Entrada em Braço Fechado

EPM – Erro Padrão Médio

LCE – Labirinto em Cruz Elevado

LDL – Lipoproteínas de Baixa Densidade

LPO – Peroxidação Lipídica

MCD – Memória de Curta Duração

MLD – Memória de Longa Duração

MT – Mato Grosso

OMS – Organização Mundial da Saúde

RDC – Resolução da Diretoria Colegiada

SAR – Radicais Ânions Superóxido

SD – Sedentário

SNC – Sistema Nervoso Central

TNJ – Tahitian Noni® Juice

TOC – Transtorno Obsessivo-Compulsivo

TBA – Tempo em Braço Aberto

TBF – Tempo em Braço Fechado

UFMT – Universidade Federal de Mato Grosso

SUMÁRIO

RESUMO 8

ABSTRACT 9

LISTA DE ILUSTRAÇÕES 10

LISTA DE GRÁFICOS 11

LISTA DE TABELAS 12

LISTA DE ABREVIATURAS 13

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 16

2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 18

2.1. Plantas medicinais ............................................................................................................. 18

2.2. Noni (Morinda citrifolia L.) .............................................................................................. 19

2.2.1. Classificação botânica .................................................................................................... 19

2.2.2. Aspectos botânicos ......................................................................................................... 20

2.2.3. Constituição química ...................................................................................................... 21

2.2.4. Atividade biológica......................................................................................................... 21

2.2.5. Farmacocinética .............................................................................................................. 24

2.2.6. Toxicidade ...................................................................................................................... 25

2.3. Psicopatologias .................................................................................................................. 25

2.3.1.Depressão ........................................................................................................................ 26

2.3.2. Ansiedade ....................................................................................................................... 27

2.3.2.1. Transtorno Obsessivo-Compulsivo ............................................................................. 27

2.3.3. Memória ......................................................................................................................... 28

3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 29

3.1. Objetivo geral .................................................................................................................... 29

3.2. Objetivos específicos ......................................................................................................... 29

4. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 30

4.1. Delineamento do Estudo.................................................................................................... 30

4.2. Coleta e Identificação ........................................................................................................ 30

4.3. Análise Anatômica ............................................................................................................ 31

4.4. Análise Histoquímica ........................................................................................................ 31

4.4.1. Lignina ............................................................................................................................ 31

4.4.2. Compostos Fenólicos ...................................................................................................... 31

4.4.3. Alcalóides ....................................................................................................................... 31

4.4.4. Lipídios ........................................................................................................................... 32

4.5. Obtenção do extrato ........................................................................................................... 32

4.6. Triagem fitoquímica do extrato ......................................................................................... 32

4.6.1 Alcalóides ........................................................................................................................ 32

4.6.2 Taninos ............................................................................................................................ 33

4.6.3 Heterosídeos Cardioativos ............................................................................................... 33

4.6.5 Flavonóides ...................................................................................................................... 34

4.6.6 Antraquinonas .................................................................................................................. 34

4.6.7 Saponinas ......................................................................................................................... 34

4.7. Animais Experimentais...................................................................................................... 35

4.8. Estudo Toxicológico .......................................................................................................... 35

4.8.1 Toxicidade Aguda - Teste Hipocrático ............................................................................ 35

4.8.2 Toxicidade Subcrônica .................................................................................................... 35

4.9. Estudo Comportamental .................................................................................................... 36

4.9.1. Teste de Atividade Locomotora Espontânea .................................................................. 37

4.9.2. Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE) ................................................................... 38

4.9.3. Teste de Nado Forçado ................................................................................................... 39

4.9.4. Teste de Esconder Esferas (“marble-burying test”) ....................................................... 40

4.9.5. Teste de Esquiva Inibitória do tipo “step-down” ............................................................ 41

4.10. Análise Estatística ........................................................................................................... 42

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 43

5.1. Análise Anatômica ............................................................................................................ 43

5.2. Análise Histoquímica ........................................................................................................ 45

5.3. Triagem Fitoquímica do Extrato Hidroalcoólico............................................................... 48

5.4. Estudo Toxicológico.......................................................................................................... 49

5.5. Estudo Comportamental.................................................................................................... 51

5.5.1. Teste de Atividade Locomotora Espontânea.................................................................. 51

5.5.2. Teste de Labirinto em Cruz Elevado (LCE)................................................................... 51

5.5.3. Teste de Nado Forçado.................................................................................................... 53

5.5.4. Teste de Esconder Esferas (“marble-burying test")........................................................ 54

5.5.5. Teste de Esquiva Inibitória do tipo “step-down”............................................................ 55

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................................. 57

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 58

ANEXO A................................................................................................................................ 70

16

1. INTRODUÇÃO

Ao longo de muitas gerações, o homem percebeu que as plantas poderiam provocar

reações benéficas no organismo, capazes de resultar na recuperação da saúde. Entretanto,

percebeu, também, que poderiam ser nocivas, sendo capazes de matar e de produzir alucinações

(LORENZI et al., 2002).

O uso de plantas medicinais a fim de promover a recuperação da saúde já vem sendo

relatado desde 4.000 A.C., quando o efeito da planta era descoberto por experimentação, na

base de tentativa e erro (HARAGUCHI et al., 2010).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), grande parte da população dos países

em desenvolvimento depende da medicina tradicional para sua atenção primária. Cerca de 80%

dos indivíduos desses países utiliza práticas tradicionais nos seus cuidados básicos de saúde e

85% usa plantas ou preparações destas para alívio de alguma doença ou sintoma desagradável

(BRASIL, 2006).

O problema é que a utilização das plantas é, muitas vezes, supervalorizada no uso

tradicional com base nos seus efeitos medicinais. Entretanto, a validação científica dos

fitoterápicos é obrigatória para a utilização correta das plantas medicinais ou de seus compostos

ativos, sendo que, para que isso ocorra, esses produtos devem ter a eficácia avaliada e

confirmada, além de cumprir todos os critérios de segurança e eficácia dos produtos sintéticos

(BRITO et al., 2009).

Nesse sentido, muito tem se falado e estudado sobre a espécie Morinda citrifolia L.,

conhecida popularmente como noni. Estudos já realizados conferem à noni atividade

antioxidante, antiinflamatória, analgésica, imunomoduladora, antibacteriana, antitumoral, entre

outros (WANG et al., 2002).

Entre os compostos presentes nesta espécie, relatam-se: glicosídeos, polissacarídeos,

compostos iridóides, alcalóides, flavonóides, ácidos graxos, antraquinonas, entre outros

(WANG et al., 2000; LIU et al., 2001; FURUSAWA et al., 2003; SU et al., 2005).

Porém, mesmo com o elevado uso deste vegetal pela população, a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA, 2008), com o intuito de proteger e promover a saúde dos

usuários, determinou que os produtos contendo noni não devem ser comercializados no Brasil

como alimento até que os requisitos legais, que exigem a comprovação de sua segurança de

uso, sejam atendidos.

17

Entretanto, a população continua fazendo uso indiscriminado da noni, considerando-a

uma planta milagrosa e acreditando que seja eficaz para o tratamento de aproximadamente 120

enfermidades, não levando em consideração sua possível toxicidade (RODRIGUEZ, 2004).

Os estudos relacionados à noni ainda são muito recentes, sendo que a maior parte deles

faz referência ao fruto. Ainda há poucos estudos relatados sobre sua folha.

Assim, o intuito dessa pesquisa é fornecer mais informações botânicas sobre a espécie

e contribuir para futuros estudos sobre seu potencial medicinal.

18

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Plantas medicinais

Através da Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) 26 de 13/05/2014, ficou definido

que planta medicinal é qualquer espécie vegetal, cultivada ou não, utilizada com propósitos

terapêuticos (ANVISA, 2014). Segundo Simões (2007), as plantas medicinais possuem

substâncias usadas como ponto de partida para a síntese de produtos químicos e farmacêuticos.

Essas substâncias, denominadas metabólitos secundários, são responsáveis pelo efeito

terapêutico que a planta medicinal apresenta.

Estima-se que, aproximadamente, 40% dos medicamentos atualmente disponíveis

foram desenvolvidos, direta ou indiretamente, a partir de fontes naturais assim subdivididos:

25% de plantas, 12% de microorganismos e 3% de animais (CALIXTO et al., 2001).

Avalia-se que, no Brasil, 25% dos 8 bilhões de dólares do faturamento da indústria

farmacêutica no ano de 1996, foram originados de medicamentos derivados de plantas,

ocorrendo um crescimento de 10% ao ano as vendas neste setor (GUERRA et al., 2001).

No final da década de 1970, a OMS, criou o Programa de Medicina Tradicional que

recomenda aos estados-membros o desenvolvimento de políticas públicas. Esse programa tem

a finalidade de facilitar a integração da medicina tradicional e da medicina complementar

alternativa nos sistemas nacionais de atenção à saúde, além de promover o uso racional dessa

integração (BRASIL, 2006).

No intuito de estabelecer as diretrizes para a atuação do governo na área de plantas

medicinais e fitoterápicos, foi publicado o decreto número 5813, de 22 de junho de 2006, que

aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, a fim de implementar ações

capazes de promover melhorias na qualidade de vida da população brasileira (BRASIL, 2006).

Vale ressaltar que, por mais que algumas plantas sejam tradicionalmente utilizadas,

muitas não possuem sua ação cientificamente comprovada, principalmente para uso por

gestantes e lactentes. Recomenda-se, assim, que antes da utilização de qualquer planta

medicinal ou fitoterápico, o usuário obtenha o diagnóstico correto da doença a ser tratada e a

prescrição por um profissional de saúde especialista na área e habilitado para tal

(HARAGUCHI et al., 2010).

19

2.2. Noni (Morinda citrifolia L.)

Morinda citrifolia, conhecida como noni, é nativa do sudeste da Ásia e tem sido utilizada

pelos habitantes das ilhas do Pacífico, Ásia, Austrália e América do Sul por centenas de anos

(ANDRADA et al., 2007). Essa planta também é chamada Mulberry indiano, Ba Ji Tian, Nono

ou Nonu, Cheese Fruit e Nhau em várias culturas em todo o mundo (WANG et al., 2002).

Na Polinésia, é uma das plantas mais populares e tradicionais, sendo utilizada por mais

de 2.000 anos pela população. Entre os colonizadores polinésios, é uma das mais valorizadas,

sendo utilizada como medicamento e corante (WANG et al., 2002). Além disso, possui uma

ampla gama de atividade biológica e valor nutricional, apresentando benefícios de saúde para

cancro, infecções, artrite, diabetes, asma, hipertensão e dor (NELSON, 2006).

Os cultivos comerciais de noni podem ser encontrados no Taiti, Havaí e outros países

da Polinésia, onde se fabricam a maioria dos sucos comercializados no mundo (SILVA et al.,

2012).

Praticamente todas as partes da planta são aproveitadas e, a cada uma delas, são

atribuídas propriedades medicinais diferentes. A casca, cuja propriedade é adstringência, é

utilizada popularmente no tratamento da malária; as folhas são usadas como analgésico e para

inflamações externas; as flores são empregadas no tratamento de inflamações oculares; o

extrato das raízes no tratamento da hipertensão e as sementes, como laxante (RODRIGUEZ e

PINEDO, 2004).

Por não possuir histórico de uso no Brasil, a comercialização de qualquer produto

contendo noni, só é permitida após a comprovação de sua segurança e seu registro na ANVISA,

conforme determinado na Resolução nº. 16/1999 e RDC nº. 278/2005, respectivamente

(ANVISA, 2008).

2.2.1. Classificação botânica

Reino: Plantae

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

Ordem: Gentianales

Família: Rubiaceae

Gênero: Morinda

Espécie: M. citrifolia

Nome científico: Morinda citrifolia L.

20

O nome botânico para o gênero foi derivado de duas palavras latinas, Morus, que

significa amora e indicus, que significa indiana. A denominação do gênero faz referência à

semelhança do fruto de noni ao da amoreira (Morus alba L.) e a denominação da espécie, indica

a semelhança de suas folhas com algumas espécies de citros (NELSON et al., 2006).

2.2.2. Aspectos botânicos

Morinda citrifolia é um arbusto de pequeno a médio porte e folhas grandes permanentes

e elípticas (SMITH, 1988). As inflorescências axilares apresentam-se em capítulos solitários e,

algumas vezes, em número de 2 ou 3 por axila. As flores tubulares, sésseis e unidas basalmente

apresentam corola branca ou esverdeada. Os frutos ovais dispostos ao longo dos ramos possuem

uma superfície grumosa e variam de cor verde para amarelo ou branco opalescente, quando

maduros. A polpa de cor creme, carnosa e suculenta, apresenta sabor e odor não muito

agradáveis, lembrando o sabor de queijo maturado. As sementes, mais de 100 em um fruto

grande, são triangulares e alongadas, marrons e medem entre 3 e 10 mm de comprimento

(VEIGA et al., 2005).

Frequentemente, essa espécie cresce em regiões costeiras ao nível do mar e em áreas

florestais com cerca de 400 metros acima do nível do mar (WANG et al., 2002). Desenvolve-

se bem em solos vulcânicos ricos em minerais, mas, também, em solos arenosos ou muito

úmidos (McCLATHEY, 2002).

Figura 1. Imagens de Morinda citrifolia; A) Árvore e suas ramificações; B) Inflorescência; C) Frutos em diferentes

estágios de maturação; D) Disposição de folhas, inflorescência e fruto (acervo próprio)

21

2.2.3. Constituição química

Aproximadamente 200 compostos foram identificados nas diversas partes da noni,

sendo que a maioria deles pertence ao grupo dos compostos fenólicos, ácidos orgânicos e

alcalóides. Os componentes principais identificados foram: escopoletina, ácido octoanóico,

potássio, vitamina C, terpenóides, alcalóides, antraquinonas (como nordamnacantal,

morindone, rubiadina e éter rubiadina-1-metilo, glicosídeo de antraquinona), β-sitosterol,

caroteno, vitamina A, quinolina, lucidin, digoxina, glicósidos de flavona, ácido linoleico,

alizarina, aminoácidos, glucose, acubin, L-asperulosideo, ácido capróico, ácido caprílico, ácido

ursólico, rutina e uma proxeronine putativa (KRISHNAIAH et al., 2012; SINGH, 2012).

Segundo Chan-Blanco (2006 apud MARQUES, 2009), as proteínas representam 11,3%

da matéria seca do suco. Os principais aminoácidos presentes são o ácido aspártico, o ácido

glutâmico e a isoleucina. Apresenta, também, elevada porcentagem de minerais: 8,4% da

matéria seca, sendo os principais o potássio, enxofre, cálcio e fósforo. As principais vitaminas

encontradas no fruto são ácido ascórbico (158mg/100g matéria seca) e provitamina A.

2.2.4. Atividade biológica

De acordo com a medicina tradicional e popular, a noni vem sendo utilizada para o

tratamento de alergia, artrite, asma, câncer, depressão, diabetes, hipertensão, distúrbios

menstruais e musculares, obesidade, úlceras gástricas, dores de cabeça, inibição sexual, insônia,

estresse, problemas respiratórios, AIDS, esclerose múltipla e dependência de drogas

(LAVAUT, 2003).

A ação analgésica da noni foi comprovada por testes realizados por irritação peritoneal

por ácido acético e ensaio por placa quente. Os estudos utilizando extrato da raiz da planta

mostraram atividades sedativas semelhantes a da morfina, sendo sua maior ação periférica do

que central, esse efeito pode ter-se dado pelo resultado da sinergia entre os componentes

presentes na planta (RODRIGUEZ et al., 2012).

Segundo Wang (2002), a atividade antibacteriana da planta está associada à presença de

compostos fenólicos como acubin, L-asperulosideo, alizarina e algumas antraquinonas. Estes

compostos são eficazes contra cepas de bactérias infecciosas, tais como a Pseudomonas

aeruginosa, Proteus morgaii, Staphylococcus aureus, Bacillis subtilis, Escherichia coli,

Salmonella e Shigella, além do tratamento de infecções da pele, resfriados, febres, e outros

problemas de saúde causados por bactérias.

22

Em estudo realizado por Costa (2011), com extrato aquoso de polpa, semente e casca da

noni, determinou-se relativa atividade antifúngica para os fitopatógenos: Aspergillus terreus,

Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum, com melhor atividade inibitória para o fungo

Aspergillus japonicus.

Em estudo com Fusarium spp, a noni não apresentou inibição do crescimento in vitro

dos fungos de nenhuma espécie isolada. Já duas espécies de Aspergillus, a A. terreus e A.

uniseriado, foram sensíveis a extratos aquosos e hidroalcoólicos de noni (OLIVEIRA et al.,

2011; ALVES et al., 2011).

Em pesquisa realizada a fim de detectar a atividade do extrato de noni sobre Ascaridia

galli, o extrato, tanto aquoso quanto etanólico, com concentração a 10% in vivo, demonstrou

baixa eficiência. Não descartando a possibilidade de extratos com concentrações mais elevadas

apresentarem atividade anti-helmíntica efetiva. No teste in vitro, os extratos demonstraram ser

pouco efetivos sobre a taxa de mortalidade (BRITO et al., 2009).

Já nos testes de Murdiati et al. (2000 apud BRITO et al., 2009) foi pesquisada a atividade

anti-helmíntica da noni em caprinos e ovinos, sobre Haemonchus contortus e afirmaram que,

no teste in vitro, o extrato clorofórmico de noni foi eficiente na morte de parasitos adultos e no

desenvolvimento dos ovos.

Em outro teste, realizado por Kesehatan (2003 apud BRITO et al., 2009), foi obtido

100% de mortalidade sobre Ascaris suum, em teste in vitro com extrato de noni com

concentração de 60%. O extrato etanólico de folhas da noni causa paralisia induzida e morte do

verme nematóide parasita humano, Ascaris lumbricoides, dentro de um dia (RAJ, 1975).

Li e seus colaboradores (2002) realizaram um estudo a fim de investigar uma possível

atividade inibitória da enzima cicloxigenase de 24 espécies de plantas australianas e chinesas,

eles demonstraram a atividade inibitória do extrato do fruto de noni sobre a COX-1. A

seletividade da inibição da COX-2 versus COX-1 do suco TAHITIAN NONI®

Juice (TNJ) in

vitro foi investigada por Su e seus colaboradores (2001) que puderam comparar suas atividades

com alguns tradicionais antiinflamatórios não esteroidais (AINES), como aspirina,

indometacina e um inibidor seletivo da COX-2, o celecoxibe. Os resultados mostraram que a

seletividade para a inibição da COX-2 do TNJ é comparável com aquela do celecoxibe.

Analisando a atividade antioxidante de extratos polares e não polares de raiz, folha e

fruto de noni, Zin e colaboradores (2002) chegaram ao resultado de que os extratos não polares

das três partes da planta demonstraram possuir alta atividade antioxidante quando comparados

com os antioxidantes clássicos como o α-tocoferol e di-tercbutilmetil-fenol (BHT).

23

Cerca de 19 compostos da noni foram isolados por Su e seus colaboradores (2005), todos

foram avaliados quanto a sua atividade antioxidante. Oito compostos mostraram possuir potente

atividade antioxidante: narcissosideo, borreriagenina, citidineo, deacetilasperulosideo,

dehidromethoxigaertnerosideo, epi-dihidrocornina, metil α-Dfructofuranosideo e metil β-D-

fructofuranosideo.

Wang e colaboradores (2001a) avaliaram o potencial antioxidante do TNJ (in vitro), e a

atividade antioxidante do suco foi semelhante aos efeitos da vitamina C, pó de semente de uva

e extrato da casca de pinheiro. Sendo que a atividade para combater radicais ânions superóxido

(SAR) do TNJ mostrou ser maior do que a atividade presente na vitamina C, no pó de semente

e também no extrato da casca de pinheiro. Mostrando, assim, possuir um grande potencial para

combater radicais livres de oxigênios reativos. No teste in vivo foi utilizado um modelo de lesão

aguda no fígado através da adição de tetracloreto de carbono (CCl4) em ratas fêmeas. A adição

de 10% de TNJ no bebedouro de água dos animais durante 12 dias foi capaz de reduzir os níveis

de radicais ânions superóxido (SAR) e peroxidação lipídica (LPO) para 20% e 50% após três

horas da administração de CCl4, comparado com o grupo controle.

Umezawa e colaboradores (1992) isolaram um composto a partir de raízes de noni

chamado 1-metoxi-2-formil-3-hidroxiantraquinona que suprimiu o efeito citopático da infecção

de células MT-4 de HIV, sem inibir o crescimento das células.

No International Chemical Congress of the Pacific Basin Societies (2000), reunião em

Honolulu, Saludes e colegas informaram que noni foi capaz de matar o Mycobacterium

tuberculosis. A concentração de extratos de folhas de noni matou 89% das bactérias presentes

em tubo de ensaio, quase tão eficaz como um fármaco anti-tuberculose líder, Rifampcina, que

tem uma taxa de inibição de 97% na mesma concentração.

O mecanismo do efeito preventivo do TNJ foi investigado no estágio inicial da

carcinogênese, sugeriram que a prevenção de formação de adutos de DNA-carcinogênicos

(marcador que prevê a possibilidade de desenvolvimento de câncer) e a atividade antioxidante

do TNJ podem contribuir para o efeito quimiopreventivo (WANG e SU, 2001).

A partir de estudos realizados para prevenção da formação de carcinógeno-DNA aduto

químico de ratos SD (sedentário) fêmeas, foi constatado que o TNJ foi capaz de reduzir a

formação de adutos de DNA, através de 7,12-dimetilbenz (a)-anthracen (DMBA), de 80% no

rim, 42% no fígado, 41 % no pulmão e 26% no coração. (PRYOR, 1997; WANG et al., 2001b).

Em pesquisa realizada por Hirazumi e colaboradores (1994) a noni-ppt, um

polissacarídeo extraído da noni, foi capaz de prolongar significativamente a vida de ratos em

até 75% com o carcinoma de Lewis do pulmão implantado em comparação com o grupo de

24

controle. Concluiu-se que a noni-ppt parece suprimir o crescimento do tumor indiretamente por

estimular o sistema imune (HIRAZUMI et al., 1996).

Os extratos metanólico e de acetato de etila de frutos de noni mostraram 88 e 96% de

inibição, respectivamente, de cobre, induzindo a oxidação do LDL (lipoproteínas de baixa

densidade), prevenindo, assim, a arteriosclerose. A atividade destes extratos é devida,

principalmente, ao seu número de grupos hidroxila fenólicos presentes nas ligninas isoladas

(KAMIYA et al., 2004).

Hirazumi e Furusawa (1999) estudaram a possível ação imunomodulatória em modelo

de carcinoma pulmonar peritoneal de Lewis. Onde a administração terapêutica de TNJ ativou

as células do exudato peritoneal aumentando o tempo de sobrevivência dos camundongos. O

TNJ ativou o sistema imune do hospedeiro e também foi capaz de estimular a liberação de

mediadores de células efetoras murine, incluindo fator alfa de necrose tumoral (TNF-α),

interleucina-1-beta (IL-1β), interferon-gama (IFN-γ), óxido nítrico (NO) entre outros.

Na Universidade de Illinois, College of Medicine, Wang e colegas (2002) observaram

que o timo dos animais tratados com o TNJ havia ampliado. O timo é o órgão relacionado a

produção de células T envolvidas no processo de envelhecimento e imunidade do organismo.

O TNJ pode melhorar a função imunológica, estimulando o crescimento do timo, e, portanto,

afetando as atividades anti-envelhecimento e anticancerígena, e proteger as pessoas de outra

doença degenerativa.

2.2.5. Farmacocinética

Em estudo farmacocinético de noni, realizado por Wang (2002), pela administração por

via oral de noni em ratos SD fêmeas, utilizando como marcador uma substância presente na

planta, a escopoletina, sendo monitorado no plasma e vários órgãos ao longo do tempo. A

farmacocinética da escopoletina em noni foi calculada como se segue: a concentração

plasmática atingiu um pico às 2 horas após a administração oral de noni. Seu nível diminuiu

para 50% em 4 horas. Apenas 12% e 2% da escopoletina foi deixado no plasma após 12 e 24 h,

respectivamente. A absorção foi rápida, com pico de concentração de 50% alcançado em apenas

30 min. A fim de manter um nível sanguíneo elevado de escopoletina, o suco de noni deve ser

administrado a cada 2 a 4 horas. Para a manutenção da saúde global, o suco deve ser

administrado a cada 12 horas. Os resultados demonstram que a frequência é mais importante

do que a quantidade de suco ingerida. A concentração de escopoletina em vários órgãos indica

que a noni é absorvida em tecidos diferentes aproximadamente uma hora após a administração.

25

O pico de concentração em diferentes tecidos ocorreu a cerca de 3 horas, com um rápido

declínio. Curiosamente, o nível de escopoletina em tecido mamário foi relativamente mais

elevado do que qualquer outro tecido.

2.2.6. Toxicidade

No XV Congresso Brasileiro de Toxicologia, um trabalho experimental investigou os

possíveis efeitos adversos do extrato aquoso do fruto de noni sobre a prenhes e parturição de

ratas progenitoras (MULLER et al., 2007; ANVISA, 2008). A partir do trabalho concluiu-se

que a exposição ao extrato seco do fruto de noni pode provocar efeitos adversos na gestação

desses animais em doses de 7,5 mg/kg, esses possivelmente relacionados com as atividades

antiestrogênica, antiangiogênica e inibidora da COX-2 presentes na planta (ANVISA, 2008).

O primeiro caso de hepatotoxicidade relacionado ao consumo de noni foi descrito no

ano de 2005 (MILLONIG et al., 2005), onde um homem de 45 anos apresentando níveis

elevados de transaminases foi encaminhado à Divisão Clínica de Gastroenterologia e

Hepatologia da Universidade Médica de Insbruque, Áustria. Após o paciente admitir estar

realizando ingestão diária do suco de noni, foi realizado uma biópsia hepática, comprovando a

intoxicação ocorrida. Um mês após a retirada do consumo de noni, os níveis de transaminases

foram normalizados.

Geralmente os compostos que causam a hepatotoxicidade são desconhecidos, porém a

presença de alcalóides pirrolizidínicos em sua composição pode ser a possível causa da

hepatotoxidade no caso da noni (ANDRADA et al., 2007).

2.3. Psicopatologias

Segundo a OMS, os transtornos mentais e neurológicos são responsáveis por cerca de

1% das mortes, tornando-os problemas prioritários de saúde no mundo todo. O prolongamento

da expectativa de vida e o envelhecimento da população em geral nos países desenvolvidos e

em desenvolvimento levam a um aumento na prevalência de doenças crônicas e progressivas

(WHO, 2007).

Tem sido relatado que em situações estressantes ocorre diminuição no metabolismo

cerebral de radicais livres, espécies químicas que contém um ou mais elétrons desemparelhados

e têm sido implicados na patogênese de muitas doenças. São instáveis e podem reagir com

26

diversos compostos celulares (FREEMAN e KELLER, 2012). Esse composto é capaz de reagir

com diversas moléculas cerebrais, danificando-as, durante o estabelecimento de transtornos

psicossociais (BARBOSA et al., 2010).

Dentre as medidas neuroprotetoras, a atividade física é considerada como uma das mais

importantes e acessíveis formas de prevenir e proteger as funções cerebrais (PIETRELLI et al.,

2012). Estando relacionada com o fato de estimular a neurogênese e melhorar os níveis de

antioxidantes no cérebro, levando a um controle mais efetivo da produção de radicais livres

(GERECKE, 2013).

2.3.1. Depressão

A depressão é considerada o mais comum dos distúrbios afetivos, podendo variar de

alterações muito leves até depressão grave, que leva a alucinações e delírios (RANG et al.,

2011).

Os transtornos significativos do humor incluem a síndrome da depressão maior e

transtorno bipolar. A síndrome da depressão maior está associada a um risco mais elevado de

automutilação ou suicídio, bem como a mortalidade por doenças clínicas sensíveis ao estresse,

complicações clínicas do uso abusivo de álcool ou drogas ilícitas, ou por acidentes. O transtorno

bipolar caracteriza-se por alta probabilidade de recidivas da depressão grave e de excitação

maníaca, com manifestações psicóticas (BRUNTON et al., 2006).

Várias tem sido as abordagens para tratamento da depressão, incluindo abordagem

psicológica e medicamentosa. O tratamento psicológico breve, de 16 a 20 sessões, inclui terapia

cognitivo-comportamental, aconselhamento, tratamento de resolução de problemas e terapia

interpessoal. O aconselhamento para pacientes com depressão leve e moderada mostra-se tão

eficaz quanto a terapia medicamentosa, em torno de um ano após a intervenção (FUCHS et al.,

2014). A maior parte dos antidepressivos tem ações importantes no metabolismo das

monoaminas neurotransmissoras e seus receptores, principalmente a norepinefrina e serotonina.

O tratamento medicamentoso apresenta resultados em torno de dois meses do início da terapia

(BRUNTON et al., 2006).

27

2.3.2. Ansiedade

A resposta ao medo normal a estímulos ameaçadores compreende vários mecanismos,

como comportamentos defensivos, reflexos autônomos, despertar e alerta, liberação de

corticosteroides e emoções negativas. Em estados de ansiedade, estas reações ocorrem

independentes de eventos externos. O termo “ansiedade” é aplicado a inúmeras desordens

distintas. Estas desordens podem ser dividas em desordens que envolvem medo e a ansiedade

generalizada (RANG et al., 2011).

A distinção entre o estado de ansiedade patológica e um considerado normal não é bem

esclarecido, mas representa o ponto em que os sintomas se tornam exagerados e acabam por

interferir no cotidiano do indivíduo (CASTILLO et al., 2000).

Não importa qual seja o fator desencadeante, a ansiedade apresenta como agente

etiológico o desequilíbrio entre mediadores estimulantes e depressores centrais. Ainda não se

conhece todos os fatores envolvidos, assim como as estruturas e os mecanismos de ação a nível

de receptores (SILVA, 2006).

O tratamento deste transtorno envolve desde abordagens psicológicas a tratamento

medicamentoso. Atualmente o tratamento medicamentoso com ansiolíticos tradicionais

(benzodiazepínicos e barbitúricos) mudou para o tratamento com fármacos que também são

utilizados no tratamento de outras desordens do Sistema Nervoso Central (SNC), como

antidepressivos, antiepiléticos e antipsicóticos, e também agonistas do receptor 5-

hidróxitriptamina (5-HT)1A

, como a buspirona. Estes medicamentos, ao contrário dos

ansiolíticos, estes não apresentam efeitos hipnóticos (RANG et al., 2011). Ainda assim, seu

tratamento é paliativo, atenuando o quadro de desequilíbrio do indivíduo (SILVA, 2006).

2.3.2.1. Transtorno Obsessivo-Compulsivo

O transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) é um transtorno de ansiedade que

caracteriza-se pelo pensamento ou imagens consideradas sem sentido ou repugnantes e rituais

ansiosos em que determinadas ações são realizadas de maneira repetitiva, sem nenhuma

finalidade (SILVA, 2006). Apresenta-se como uma desordem extremamente complexa que

envolve diversas manifestações neurológicas, incluindo sintomas neuropsicológicos, tais como,

déficit cognitivo e não-cognitivo, estereotipia (KORFF e HARVEY, 2006).

O TOC está relacionado a uma qualidade de vida reduzida, assim como altos níveis de

prejuízo social e profissional. Quando o transtorno inicia-se na infância ou na adolescência, os

28

indivíduos podem experimentar dificuldades de desenvolvimento, evitando socialização com

colegas (DSM-V, 2014).

O transtorno depressivo geralmente acompanha o transtorno obsessivo-compulsivo e,

nesses casos, um tratamento eficaz da depressão, com frequência, leva a uma melhora dos

sintomas relacionados ao TOC (GELDER et al., 2006).

2.3.3. Memória

A memória é definida como a capacidade de reter uma informação para que, quando

necessário, se possa evocar a informação aprendida anteriormente. Esta é uma habilidade de

extrema importância para a realização de tarefas diárias (IZQUIERDO et al., 2002).

O processo de formação da memória engloba um conjunto de estruturas anatômicas e

funcionais do sistema nervoso central (SNC) que funcionam independentemente, mas de forma

cooperativa (IZQUIERDO, 2011). O hipocampo é considerado a estrutura cerebral mais

importante envolvida no processo de formação e armazenamento da memória, dessa forma a

capacidade de reter informações depende da integralidade do hipocampo (LARKIN et al.,

2014).

A memória de curto prazo recebe as informações já codificadas pelos mecanismos de

reconhecimento de padrões da memória sensorial-motora, responsável pelo processamento

inicial da informação sensorial e sua codificação, e retém estas informações por alguns

segundos, até minutos, para que estas sejam utilizadas, descartadas ou mesmo organizadas para

serem armazenadas. A memória de longo prazo recebe as informações da memória de curto

prazo e as armazena. Esta, possui capacidade ilimitada de armazenamento e as informações

ficam nela armazenadas por tempo também ilimitado (AGUIAR, 2008).

As alterações da memória são conhecidas pelos termos "amnésia" e "dismnésia", que

estão relacionados com a intensidade e o comprometimento da memória, sendo a dismnésia

relativa a perturbações variáveis e amnésia a perda global das funções de memória recente. O

mecanismo neuropsicológico da síndrome amnésica é baseado na transferência deficiente de

itens da memória imediata para o armazenamento de curto-prazo (MARKOWITSCH e

PRITZEL, 1985).

29

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Caracterizar anatômica e quimicamente as folhas de noni (Morinda citrifolia), além de

verificar a eficácia do extrato da folha de noni no tratamento da depressão, ansiedade,

compulsão e memória, e avaliar sua toxicidade em camundongos Swiss.

3.2. Objetivos específicos

– Caracterizar anatomicamente as folhas adultas de Morinda citrifolia, com o intuito de

se obter maiores informações sobre a sua composição histológica;

– Verificar as estruturas secretoras presentes nas folhas;

– Efetivar testes histoquímicos para averiguar a ocorrência de quais substâncias são

secretadas pela planta;

– Realizar a extração e triagem fitoquímica preliminar do extrato hidroalcoólico das

folhas de noni;

– Avaliar a toxicidade aguda e subcrônica do extrato hidroalcoólico da folha de Morinda

citrifolia;

– Averiguar os efeitos antidepressivos e ansiolíticos do extrato hidroalcoólico de

Morinda citrifolia nos testes de Atividade Locomotora Espontânea, Labirinto em Cruz Elevado

e Nado Forçado;

– Investigar os efeitos anticompulsivos do extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia

no teste de Esconder Esferas (marble-burying test);

– Descrever os efeitos do extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia na memória de

camundongos no teste de Esquiva Inibitória do tipo “step-down”.

30

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Delineamento do Estudo

Para a realização do estudo seguiu-se o organograma descrito pela Figura 2.

Figura 2. Delineamento do estudo

4.2. Coleta e Identificação

Foram coletadas folhas adultas de 30 indivíduos de Morinda citrifolia cultivadas nos

canteiros públicos, bem como nas residências de moradores de Sinop (MT), em Junho de 2014.

Nessas coletas foram obtidas a maior quantidade possível de folhas e, após processamento

adequado, foram submetidas às análises anatômica e histoquímica, além da obtenção de extrato.

A espécime testemunha (11º51’30,3”S/55º28’53,28”W) foi herborizada e incluída no acervo

do Herbário Centro Norte Mato-Grossense (CNMT), da Universidade Federal de Mato Grosso

(UFMT), sob número de tombo 6556.

31

4.3. Análise Anatômica

As amostras foram fixadas em uma solução de álcool 70% (JOHANSEN, 1940). Foram

feitos cortes transversais à mão-livre da lâmina foliar, com o auxílio de uma lâmina de barbear.

Após, os cortes foram diafanizados em hipoclorito de sódio a 20%, corados com Safranina,

montados em gelatina glicerinada, entre lâmina e lamínula e vedados com esmalte incolor.

O material foi analisado em microscópio óptico e as imagens capturadas através de um

computador acoplado ao microscópio.

4.4. Análise Histoquímica

Foram feitos cortes transversais à mão-livre da lâmina foliar, com o auxílio de uma

lâmina de barbear, em material fresco. Posteriormente, foram feitos testes com reagentes

específicos para verificar a ocorrência de substâncias presentes nas folhas, como descrito a

seguir.

O material foi analisado em microscópio óptico e as imagens capturadas através de um

computador acoplado ao microscópio.

4.4.1. Lignina

Os cortes foram tratados com Floroglucina 2% + Ácido Clorídrico 25%. Análise

positiva com formação de cor roseada (JOHANSEN, 1940).

4.4.2. Compostos Fenólicos

Os cortes foram tratados com Cloreto Férrico 10%. Análise positiva com formação de

cor verde escuro (JENSEN, 1962).

4.4.3. Alcalóides

Os cortes foram tratados com reagente de Dragendorff. Análise positiva com formação

de cor laranja-acastanhada (JOHANSEN, 1940).

32

4.4.4. Lipídios

Os cortes foram tratados com solução de Sudan III. Análise positiva com formação de

cor avermelhada (MILLER et al., 1968).

4.5. Obtenção do extrato

Para obtenção do extrato, o material coletado foi submetido à secagem em estufa a 40°C,

moído e extraído três vezes por maceração com etanol 80%, na proporção de 1:10

(droga:solvente), por quinze dias à temperatura ambiente, sendo agitado diariamente. O extrato

foi filtrado com papel de filtro e em seguida concentrado usando evaporador rotatório sob

pressão reduzida.

A partir de 1 Kg de folha seca triturada obteve-se 175,55g de extrato bruto. Seu

rendimento foi de 17,55%.

4.6. Triagem fitoquímica do extrato

A triagem fitoquímica foi feita de acordo com manual descrito por Duarte e

colaboradores (2010), com breves modificações.

4.6.1 Alcalóides

Alguns miligramas do extrato foram adicionados a 10 mL de ácido sulfúrico a 1%,

aqueceu-se por 2 minutos, filtrou-se em algodão e após resfriamento, o filtrado foi dividido em

duas porções.

Pesquisa direta: o filtrado foi dividido em quatro tubos de ensaio, um tubo foi utilizado

com branco e aos demais foi acrescentado 2 gotas de reagente Dragendorff, Mayer e

Bouchardat. Análise positiva com formação de turvação a precipitação.

Pesquisa confirmatória: adicionou-se ao filtrado hidróxido de amônio diluído até atingir

pH básico e em seguida acrescentado 7 mL de diclorometano. Extraiu-se

cautelosamente por 10 minutos, a camada orgânica foi decantada para uma cápsula de

porcelana e evaporada em banho-maria. O resíduo foi dissolvido com 5 mL de ácido

sulfúrico a 1% e distribuído em 4 tubos de ensaio, um tubo foi utilizado como branco e

33

aos demais foi acrescentado 2 gotas de reagente Dragendorff, Mayer e Bouchardat.

Análise positiva com formação de turvação a precipitação.

4.6.2 Taninos

Alguns miligramas de extrato foram dissolvidos com 10 mL de água destilada e

aquecidos por 2 minutos, filtrou-se em algodão para um cálice e volume preenchido para 25

mL com água destilada. Distribuiu-se 12 mL do filtrado em 3 tubos de ensaio e executou-se as

reações de identificação.

Reação com gelatina: adicionou-se 3 gotas de solução gelatina 2%. Reação positiva com

formação de turvação a precipitação.

Reação com metais pesados: adicionou-se 3 gotas de solução acetato de chumbo a 10%.

Reação positiva com formação de turvação a precipitação.

Identificação de taninos condensados e/ou hidrolisáveis: adicionou-se 3 gotas de

solução de cloreto férrico a 2%. Formação de coloração azul: positivo para taninos

hidrolisáveis ou gálicos. Formação de coloração verde: positivo para taninos

condensados ou catéquicos.

4.6.3 Heterosídeos Cardioativos

Alguns miligramas de extrato foram adicionados a 10 mL de solução de álcool etílico a

70%, agitados e fervidos por 2 minutos em banho-maria. Adicionou-se 10 mL de água destilada

e 2 gotas de solução de acetato de chumbo a 10%, agitou-se fortemente e após repouso filtrou-

se por papel de filtro pregueado. Adicionou-se ao filtrado 8 mL de diclorometano e procedeu-

se extração cautelosamente. A camada orgânica foi decantada em três cápsulas de porcelana e

o solvente evaporado em banho-maria. Os resíduos passaram pelas reações de identificação.

Reação de Keller-Kiliani: adicionou-se 3 mL do reativo de Keller à cápsula e misturou-

se com bastão de vidro. A mistura foi vertida lentamente para um tubo de ensaio

contendo 2 mL de reativo de Kiliani. Reação positiva com formação de anel castanho-

avermelhado na região de contato entre as fases.

Reação de Pesez: adicionou-se a cápsula três gotas de ácido fosfórico concentrado e

misturou-se com bastão de vidro. A mistura foi observada sob luz ultra-violeta

(=365nm). Reação positiva com fluorescência amarelo-esverdeada.

34

Reação de Baljet: adicionou-se à cápsula 2 gotas de solução etanólica de ácido pícrico

0,5% e 2 gotas de hidróxido de potássio 1N. Reação positiva com aparecimento de

coloração alaranjada.

4.6.5 Flavonóides

Alguns miligramas de extrato foram adicionados a 10 mL de álcool etílico a 70%,

fervidos por 2 minutos em banho-maria e filtrados por algodão. Após foi realizada a reação de

identificação.

Reação de Shinoda: em tubo de ensaio 2mL do extrato alcoólico foram adicionados a

seis fragmentos de magnésio metálico e 1 mL de ácido clorídrico concentrado. Reação

positiva com formação de coloração rósea a vermelha.

4.6.6 Antraquinonas

Reação de Bornträger com prévia hidrólise ácida: alguns miligramas do extrato foram

adicionados a 8 mL de solução álcool etílico a 25% em um tubo de ensaio, fervidos em

chama por 1 minuto, filtrados por algodão para tubo de ensaio contendo 4 mL de solução

de ácido sulfúrico a 5 % e aquecidos levemente. Após resfriado adicionou-se 5 mL de

diclorometano, extraiu-se cuidadosamente por 3 minutos, decantou-se a camada

orgânica para tubo de ensaio e adicionou-se 5 mL de solução de hidróxido de amônio

diluído. Agitou-se fortemente e deixou-se em repouso. Reação positiva com formação

de coloração rósea ou avermelhada na fase aquosa.

4.6.7 Saponinas

Reação por agitação: alguns miligramas do extrato foram dissolvidos em 10 mL de água

destilada, fervidos por 2 minutos. Após resfriado agitou-se energicamente por 15

segundos. Reação positiva com formação forte de espuma persistente por mais de 15

minutos.

35

4.7. Animais Experimentais

Antes de qualquer experimento envolvendo animais de laboratório, foi enviado um

pedido de aprovação para o Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de

Mato Grosso (UFMT), para poder iniciar os experimentos adequadamente. O pedido foi

aprovado em 27 de Novembro de 2014, sob o número de protocolo 23108.704284/14-6

(ANEXO A).

Foram utilizados camundongos Swiss machos, adultos, com média de 35g, provenientes

do Biotério da UFMT, Campus Universitário de Cuiabá. Os animais foram mantidos em

condições padronizadas, com ciclo de luz claro/escuro de 12 horas, com água e ração ad libitum.

4.8. Estudo Toxicológico

4.8.1 Toxicidade Aguda - Teste Hipocrático

Foram utilizados cinco grupos, com seis camundongos por grupo. Os animais foram

tratados as 14h, com extrato de Morinda citrifolia nas doses 250, 500, 1000 e 2000 mg/kg, via

oral (gavagem), em dose única. Um grupo controle recebeu veículo (água destilada). Após os

tratamentos, todos os animais foram observados individualmente em campo aberto nos tempos

zero, 5, 10, 15 e 30 min.; 1, 2, 4 e 8 h e uma vez a cada dia, durante o período de 14 dias para

verificação de possíveis alterações (JACOBSON-KRAM e KELLER, 2001).

Após período de observação, os animais foram sedados com Sevoflurano e/ou

Isoflurano (via inalatória) para coleta de sangue por punção cardíaca. Posteriormente, fez-se o

doseamento de aspartato amino transferase (AST ou TGO) e alanina amino transferase (ALT

ou TGP), realizado em duplicata, a fim de avaliar a condição hepática dos animais, através da

metodologia cinética UV no equipamento Bioplus Bio 2000 juntamente com os kits AST/GOT

Liquiform e ALT/GPT Liquiform (Labtest). Após a coleta, os animais foram eutanasiados,

ainda sedados, por deslocamento cervical.

4.8.2 Toxicidade Subcrônica

Foram utilizados três grupos, com dez camundongos por grupo. Os animais foram

tratados com extrato de Morinda citrifolia nas doses de 100 e 250 mg/Kg/dia, via oral

(gavagem), por 30 dias. Um grupo controle recebeu veículo (água destilada). Após o período

36

de tratamento, os animais foram observados individualmente em campo aberto para verificação

da atividade locomotora espontânea (REIS et al., 2000).

Após período de observação os animais foram sedados com Sevoflurano e/ou Isoflurano

(via inalatória) para coleta de sangue por punção cardíaca. Posteriormente, fez-se o doseamento

de aspartato amino transferase (AST ou TGO) e alanina amino transferase (ALT ou TGP),

realizados em duplicata, a fim de avaliar a condição hepática dos animais, através da

metodologia cinética UV no equipamento Bioplus Bio 2000 juntamente com os kits AST/GOT

Liquiform e ALT/GPT Liquiform (Labtest). Após a coleta, os animais foram eutanasiados,

ainda sedados, por deslocamento cervical.

4.9. Estudo Comportamental

Para a realização dos testes de atividade locomotora espontânea, labirinto em cruz

elevado, nado forçado e teste de esconder esferas, foram utilizados 50 camundongos, divididos

em 5 grupos contendo 10 animais cada, conforme a distribuição abaixo:

- Grupo I: recebeu apenas veículo (água destilada), como controle negativo;

- Grupo II: recebeu extrato da folha de Morinda citrifolia (100 mg/Kg);

- Grupo III: recebeu extrato da folha de Morinda citrifolia (250 mg/Kg);

- Grupo IV: recebeu Imipramina (antidepressivo/anticompulsivo), como controle positivo (30

mg/Kg);

- Grupo V: recebeu Diazepam (ansiolítico), como controle positivo (1mg/Kg);

Para a realização do teste de esquiva inibitória tipo “step-down” foram utilizados 40

camundongos, divididos em 4 grupos contendo 10 animais cada:

- Grupo VI: recebeu apenas veículo (água destilada), como controle negativo;

- Grupo VII: recebeu extrato da folha de Morinda citrifolia (100 mg/Kg);

- Grupo VIII: recebeu extrato da folha de Morinda citrifolia (250 mg/Kg);

- Grupo IX: recebeu Cafeína (memória), como controle positivo (10 mg/Kg).

As substâncias foram inoculadas por via oral (gavagem), durante 30 dias e em seguida

os grupos de I a V foram submetidos aos seguintes experimentos: Teste da Atividade

Locomotora Espontânea, Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE), Teste do Nado Forçado

37

e Teste de Esconder Esferas. Os grupos VI a IX foram submetidos ao Teste de Esquiva Inibitória

do tipo “step-down” (LUCENA, 2010; TASSET et al., 2012).

Após a realização dos testes comportamentais, os animais foram eutanasiados por

aprofundamento da anestesia e deslocamento cervical. Para a anestesia foram utilizados os

fármacos Sevoflurano e/ou Isoflurano, via inalatória.

4.9.1. Teste de Atividade Locomotora Espontânea

Para este ensaio foi necessário, a construção de uma caixa de 35 cm de diâmetro e 35

cm de altura, onde o chão foi dividido em 12 repartições (Figura 3).

PROCEDIMENTOS: Os camundongos foram levados no local do teste uma hora antes

do início dos experimentos, para se habituarem ao novo ambiente. O teste começou quando o

camundongo passou com as quatro patas dentro de um dos quadrantes da caixa, cada animal foi

testado por 5 minutos. Foi contado o número de cruzamentos nos quadrantes da caixa. Os

ensaios foram realizados durante o dia, para acompanhar o ciclo circadiano, e evitar alterações

que poderiam interferir nos resultados.

FUNDAMENTO: Esse experimento tem como finalidade a observação da atividade

locomotora do animal. Assim como o homem, o animal também pode reagir de forma aversiva

ao andar em um ambiente novo, uma característica de congelamento, para tentar diminuir sua

localização visual e auditiva e evitar possíveis predadores, porém, rapidamente muda sua

atitude anterior e tende a explorar o local onde se encontra (LUCENA, 2010; LUCIA et al.,

2005).

38

Figura 3. Aparato utilizado para o teste de Atividade Locomotora Espontânea (acervo próprio)

4.9.2. Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)

Os animais avaliados foram colocados em um labirinto de madeira em forma de cruz,

que contém dois braços abertos (50 x 10cm) e dois fechados (50 x 10 x 40cm) elevados a 50cm

do solo (Figura 4).

PROCEDIMENTO: O roedor foi posicionado com a cabeça voltada para um dos braços

fechados, podendo andar livremente durante 5 minutos. Após esse tempo o equipamento foi

limpo com álcool 10%. Foi monitorado o número de entradas nos braços abertos (EBA), o

tempo de permanência nos braços abertos (TBA), o número de entradas nos braços fechados

(EBF), e o tempo de permanência nos braços fechados (TBF), para obter os índices de

ansiedade.

FUNDAMENTO: A porcentagem de EBA é calculada com relação ao número total de

entradas nos braços [(EBA/EBA+EBF)x100], e a porcentagem de TBA é calculada em relação

ao tempo total do experimento [(TBA/TBA+TBF)x100]. O índice ansiolítico é determinado

pelo aumento ou diminuição das porcentagens de EBA e TBA, sabendo que o animal tem

aversão natural aos braços abertos, e que se for obrigado a permanecer neles, possivelmente

demonstrará sinais de medo, como defecação e congelamento, caso contrário, certamente ficará

mais tempo nos braços fechados (LUCENA, 2010; CARVALHO et al., 2012; RODRIGUES et

al., 2011).

39

Figura 4. Aparato utilizado para o teste LCE (acervo próprio)

4.9.3. Teste de Nado Forçado

Nesse teste foi usado um cilindro de vidro, com 30cm de diâmetro e 50cm de altura,

preenchido com água até a marca de 40cm, a uma temperatura de 25ºC (Figura 5).

PROCEDIMENTO: Os camundongos foram colocados nesse cilindro, obrigados a

nadar sem possibilidade de fuga, durante 5 minutos.

FUNDAMENTO: É observado o desenvolvimento de ansiedade e depressão. Nos

primeiros minutos há o comportamento de fuga, com nado em volta da circunferência do

cilindro ou a tentativa de subida ao longo dos lados internos do cilindro, caracterizando um

momento de ansiedade. Nos últimos minutos o rato fica num estado de imobilidade, mantendo

apenas os movimentos necessários para sobrevivência, demonstrando sinais de depressão. É

avaliado de acordo com o aumento ou diminuição do tempo de nado (LUCENA, 2010;

MENEZES et al., 2008).

40

Figura 5. Aparato utilizado no teste de Nado Forçado (acervo próprio)

4.9.4. Teste de Esconder Esferas (“marble-burying test”)

Foram utilizadas caixas de policarbonato de 27 x 16 x 13 cm as quais foram forradas

com uma camada de 5 cm de maravalha sobre a qual foram distribuídas ao acaso 25 esferas de

vidro com 1,5 cm de diâmetro. Essas caixas foram cobertas com uma placa de acrílico

transparente com pequenos furos para ventilação (Figura 6).

PROCEDIMENTO: Após 30 minutos do tratamento cada animal foi colocado em uma

caixa individual e ao término de 30 minutos ele foi retirado e o número de esferas de vidro

escondidas pelos animais foi registrado. Foram consideradas escondidas as esferas que foram

completamente cobertas pela maravalha (PULTRINI et al., 2006). Considerando a grande

variabilidade no número de esferas escondidas entre um animal e outro, foram submetidos ao

procedimento experimental apenas aqueles que esconderam durante os três dias consecutivos

anteriores ao teste, pelo menos 13 das 25 esferas (BROEKKAMP et al., 1986; NJUNG´E e

HANDLEY, 1991).

FUNDAMENTO: Roedores exibem o comportamento de esconder (enterrar) objetos

aversivos como uma fonte de choque, alimentos nocivos ou objetos inanimados como as esferas

de vidro (BROEKKAMP et al., 1986).

41

Figura 6. Aparato utilizado para teste de esconder esferas (acervo próprio)

4.9.5. Teste de Esquiva Inibitória do tipo “step-down”

O equipamento usado consiste de uma caixa de vidro e plástico (50 x 25 x 25cm), cujo

chão apresenta barras de alumínio de 1mm de diâmetro com espaçamentos de 1cm de distância,

conectado a um estimulador elétrico. Do lado esquerdo da caixa tem uma plataforma (25 x 8 x

5cm) (Figura 7).

PROCEDIMENTO: No primeiro dia do teste os camundongos foram colocados no

equipamento durante 3 minutos para se familiarizar com o ambiente novo. No segundo dia o

animal foi posicionado na plataforma com o rosto virado para o lado oposto do pesquisador, e

no momento em que o rato colocou as quatro patas no assoalho de grade, recebeu um choque

de 0,4 mA/s. O camundongo foi retirado da caixa, e depois de 1 hora e meia foi reposicionado

na plataforma, de acordo com o padrão para avaliação da memória de curta duração (MCD), o

intervalo de 180 segundos foi determinado como tempo máximo de espera (latência) para

descida do animal para plataforma, evidenciando a esquiva inibitória “step-down”, como

indicativo de retenção de memória.

Para a avaliação de memória de longa duração (MLD), no terceiro dia, o animal foi

colocado novamente na plataforma. No padrão, o camundongo também levou no máximo 180

segundos, para se aventurar na grade do assoalho. Esse intervalo de tempo, em que o animal se

sentiu seguro para descer, foi usado como indicativo de retenção de memória de longa duração

(LUCENA, 2010; RODRIGUES et al., 2011).

FUNDAMENTO: A medida da latência avaliada no teste da esquiva inibitória do tipo

“step-down” tem sido um modelo experimental usado por muitos laboratórios na avaliação dos

estudos envolvendo aprendizagem e memória, onde um choque de baixa intensidade serve de

42

estímulo aversivo para que o animal deixe de executar uma determinada tarefa que foi a ele

apresentada através do mecanismo de retenção da memória (MAIA et al., 2009).

Figura 7. Aparato utilizado para o teste de Esquiva Inibitória do tipo “step down” (acervo próprio)

4.10. Análise Estatística

Para verificar diferenças significativas entre os grupos estudados, para parâmetros

bioquímicos, foi aplicada a Análise de Variância de Uma Via (ANOVA), seguida pela avaliação

post-hoc de Student Newman Keuls, para comparação entre os grupos. Os dados foram

expressos pela média ± DP (desvio padrão). Considerou-se resultado estatisticamente

significativo quando p<0,05.

As comparações estatísticas para os testes de Atividade Locomotora Espontânea, Nado

Forçado e Labirinto em Cruz Elevado, foram realizadas através da Análise de Variância de Uma

Via (ANOVA), seguidas pela avaliação post-hoc de Student Newman Keuls, para comparação

entre os grupos. Os dados foram expressos pela média ± EPM (erro padrão médio) de 10

animais por tratamento, sendo o nível de significância estatística utilizado de p<0,05.

Para teste de esquiva inibitória foram realizados cálculos para evidenciar as medianas,

com seus intervalos interquartis das latências de descida da plataforma para serem aplicadas à

análise estatística não paramétrica de Kruskal-Wallis, seguida pela avaliação post-hoc de Dunn.

Considerou-se resultado estatisticamente significativo quando p<0,05.

43

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Análise Anatômica

As características anatômicas observadas nas folhas de Morinda citrifolia corroboram

com os encontrados em outros trabalhos de anatomia foliar de espécies da família Rubiaceae

(PEREIRA et al., 2003; MORAES et al., 2011).

A folha de Morinda citrifolia é hipostomática (Figura 8A), apresenta epiderme

unisseriada em ambas as faces, com cutícula espessa na face adaxial (Figura 9), e alguns

tricomas tectores unisseriados, formados por aproximadamente 6 células (Figura 10A). Folhas

hipostomáticas e cutícula espessa, principalmente na face adaxial, são características de plantas

que vivem em ambiente seco, com pouca disponibilidade de água, pois auxiliam o vegetal na

redução da transpiração cuticular (CUTTER, 1986 e 1987). Além disso, os tricomas tectores

possuem papel importante na redução da perda d’água pela transpiração e também para isolar

o mesofilo do calor e/ou luz excessiva (APEZZATO-DA-GLÓRIA e CARMELLO-

GUERREIRO, 2006).

Os estômatos são do tipo paracítico (Figura 8B), o que reforça os resultados de Pereira

et al. (2003) e Moraes et al. (2011), para as espécies da família Rubiaceae.

Figura 8. Seções transversal e paradérmica da folha de Morinda citrifolia. A) estômatos presentes na face abaxial

da folha. B) estômatos paracíticos. PL=parênquima lacunoso; est=estômato

Seu mesofilo é dorsiventral, com duas camadas de parênquima paliçádico e sete a oito

camadas de parênquima lacunoso (Figura 9). Pereira et al. (2003) e Moraes et al. (2011),

também observaram esse tipo de mesofilo em espécies dos gêneros Psychotria e Palicourea.

44

Figura 9. Seção transversal da folha de Morinda citrifolia. Epiderme unisseriada, cutícula espessa na face adaxial,

mesofilo dorsiventral e ráfides. PL=parênquima lacunoso; PP=parênquima paliçádico; cut=cutícula;

epi=epiderme; ráf=ráfide.

O bordo da folha encontra-se preenchido por colênquima (Figura 10B).

Figura 10. Seções transversais da folha de Morinda citrifolia. A) Tricomas tectores uniseriados. B) Bordo

preenchido por colênquima. CO=colêmquima; cut=cutícula.

No mesofilo, encontra-se cristais de oxalato de cálcio, em forma de ráfides (Figuras 9 e

11A) e drusas (Figura 11B). Cristais de oxalato de cálcio no mesofilo, são importantes contra

herbívoros, por sua propriedade irritante. Folhas de espécies expostas à herbivoria apresentam

maior número de cristais, comparadas com as não atacadas (KARBAN e MEYER, 1989).

45

Figura 11. Seções transversais da folha de Morinda citrifolia. Cristais de Oxalato de cálcio. A) Ráfide. B) Drusas.

cs=células secretoras

Na região da nervura central, observa-se cinco a seis camadas de colênquima e

parênquima fundamental em ambas as faces (Figura 12). O feixe vascular é colateral e as células

secretoras também estão presentes tanto na nervura quanto na região entre a nervura e o bordo

da folha (Figuras 11A e 12).

Figura 12. Seção transversal da folha de Morinda citrifolia. Região da nervura central mostrando: feixe vascular

colateral, células secretoras, colênquima e parênquima fundamental. CO=colênquima; PF=parênquima

fundamental; cs=células secretoras; flo=floema; xil=xilema

5.2. Análise Histoquímica

Os resultados dos testes histoquímicos da folha de M. citrifolia encontram-se dispostos

na Tabela 1:

46

Tabela 1. Caracterização histoquímica das folhas de Morinda citrifolia

Composto Teste Coloração

Tecidos/Regiões

Epiderme Feixe

vascular

Colênquima Parênquima

fundamental

Lignina Floroglucina Roseada - + - -

Fenóis Cloreto Férrico Verde-escuro + + + -

Alcalóides Dragendorff Laranja-acastanhado - + + +

Lipídios Sudan III Avermelhada + + - -

(+) presença; (-) ausência

O reagente floroglucina indica presença de lignina a região do xilema no feixe vascular

(Figura 13). A lignificação ocorre predominantemente em células do tecido vascular,

encontrada em quase todos os órgãos, mais abundantemente em caules e raízes (RAES et al.,

2003). Segundo Sarkanem e Ludwig (1971) a lignina impermeabiliza a parede celular,

melhorando o transporte de água e soluções pelo sistema vascular. As ligninas são compostos

fenólicos que não se apresentam em forma livre nos tecidos vegetais, são polímeros complexos

de grande rigidez e resistência mecânica, e sua hidrólise alcalina libera uma grande variedade

de derivados dos ácidos benzóico e cinâmico (RIBÉREAU-GAYON, 1968).

Figura 13. Teste de floroglucina para determinação de lignina (reação positiva: coloração roseada). xil=xilema.

O cloreto férrico demonstra coloração verde-escuro na região do feixe vascular,

colênquima e epiderme da nervura central, indicando reação positiva para compostos fenólicos

totais (Figura 14). Esta classe de produtos é uma das que apresenta o maior grupo de substâncias

conhecidas no reino vegetal e encontram-se disponíveis nos frutos, vegetais, sementes, flores e

cascas. As substâncias fenólicas mais encontradas em plantas são: ácidos fenólicos, flavonóides

e taninos (SIMÕES et al., 2007).

47

Figura 14. Teste de cloreto férrico para determinação de compostos fenólicos totais (reação positiva: coloração

verde-escura). CO=colênquima; FV=feixe vascular; cut=cutina

O reagente de Dragendorff apresenta reação positiva para alcalóides na região do feixe

vascular, parênquima fundamental e colênquima da nervura central da folha (Figura 15). Os

alcalóides são compostos com uma grande diversidade estrutural e distribuição restrita na

natureza, representando o grupo de metabólitos com maior significância farmacêutica

(SIMÕES, 2007).

Figura 15. Teste de Dragendorff para determinação de alcaloides (reação positiva: coloração laranja-acastanhada).

CO=colênquima; FV=feixe vascular; PF=parênquima fundamental

O reativo de Sudan indica presença de lipídios na cutícula secretada pela epiderme da

folha e feixe vascular (Figura 16). A epiderme foliar coberta por cutícula lipídica forma uma

barreira mecânica contra a penetração de fungos e a ação de insetos herbívoros, sendo a

principal defesa física contra estresse biótico e abiótico (KERSTIENS, 1996).

48

Figura 16. Teste de Sudan para determinação de lipídios (reação positiva: avermelhada). FV=feixe vascular;

cut=cutícula.

5.3. Triagem Fitoquímica do Extrato Hidroalcoólico

A triagem fitoquímica do extrato hidroalcoólico de folhas de M. citrifolia revela a

presença de alcalóides, heterosídeos cardioativos e saponinas (Tabela 2).

Tabela 2. Triagem fitoquímica do extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia

Composto Teste Extrato Hidroalcólico

Morinda citrifolia L.

Alcalóides Dragendorff

Mayer

Bouchardat

+

+

-

Taninos Gelatina

Metais pesados

-

-

Heterosídeos Cardioativos Keller-Kiliani

Pesez

Baljet

+

+

-

Flavonoides Shinoda -

Antraquinonas Bornträger -

Saponinas Agitação +

(+) presença; (-) ausência

Alcalóides puderam ser visualizados empregando o reativo de Dragendorff e Mayer. A

especificidade destes reativos não é absoluta, uma vez que reações falsamente positivas podem

ser dadas na presença de proteínas, purinas, algumas cumarinas, hidroxiflavonas e lignanas.

Portanto, o resultado negativo neste teste indicaria a ausência de alcalóides, e a positividade

indica provável presença destes metabólitos no extrato vegetal (BRUNETON, 1991).

Para pesquisa de heterosídeos cardioativos, positivou-se as reações de Keller-Kiliani e

Pesez. Porém, a reação de Baljet foi negativa. As reações para caracterização destes compostos

49

evidenciam partes da molécula do glicosídeo isoladamente, a reação de Keller-Kiliani está

relacionada com a presença de desoxiaçúcares na extremidade glicídica da molécula; a reação

de Pesez determina a presença do núcleo esteroidal; e a reação de Baljet está relacionada com

o anel lactônico pentacíclico (cardenolídeo) (SIMÕES, 2007). Os heterosídeos cardioativos são

compostos que agem aumentando a força de contração sistólica. O aumento da contratilidade

do coração provoca o esvaziamento mais completo do ventrículo e o encurtamento do período

de sístole. Assim, o coração tem mais tempo para repousar entre as contrações. Plantas com

esses compostos são utilizadas principalmente no tratamento de insuficiência cardíaca

(ROBBERS, 1997).

O teste para saponinas também foi positivo. As saponinas agem sobre membranas,

causando a desorganização das membranas das células sanguíneas (ação hemolítica) ou das

células branquiais em peixes (ação ictiotóxica), além de se complexarem com esteroides, razão

pela qual frequentemente apresentam ação antifúngica e hipocolesterolemiante (PERES, 2004).

Estudos realizados por Lima (2013) identificaram a presença de alcalóides e

heterosídeos cardioativos nos frutos verdes e maduros de Morinda citrifolia, porém não foi

detectada a presença de saponinas em ambos os frutos.

Em triagem fitoquímica realizada com extrato aquoso das folhas de M. citrifolia foi

possível observar a presença de alcalóides, cumarinas, flavonóides, taninos, saponinas,

esteróides e triterpenos (SERAFINI et al., 2011).

5.4. Estudo Toxicológico

O extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia administrado por via oral, no tratamento

agudo e subcrônico, não provocou alterações comportamentais ou ocorrência de morte em

nenhum camundongo dos grupos tratados.

Os animais testados com extrato do grupo de intoxicação aguda tiveram os resultados

do doseamento bioquímico (ALT, AST) comparados com o controle negativo, constatando

diferença estatística significativa nos valores de ALT entre todos os grupos tratados com extrato

e o grupo controle negativo. E também nos valores de AST entre o grupo controle e os grupos

que receberam extrato nas concentrações 1000 mg/Kg e 2000 mg/kg (Tabela 3).

50

Tabela 3. Toxicidade Aguda: Valores médios da dosagem sérica (± desvio padrão) de ALT e AST (UI/L) em

camundongos tratados com extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia

Parâmetro Controle 250 mg/Kg 500 mg/Kg 1000 mg/Kg 2000 mg/Kg p*

ALT 58,28±10,94 76,99±11,31ª 87,22±12,03ª 81,98±17,41ª 76,21±16,19ª 0,0004

AST 91,66±16,96 100,1±10,61 93,24±13,25 121,5±9,170ª 162,4±47,31ª 0,0001

* teste de ANOVA. (p<0,05). ª diferença estatística em relação ao respectivo controle

Os grupos testados da intoxicação subcrônica também tiveram seus valores de

doseamento bioquímico comparados com o grupo controle, constatando diferença estatística

significativa para valores de ALT entre o grupo controle e os grupos tratados com extrato

(Tabela 4).

Tabela 4. Toxicidade Subcrônica: Valores médios da dosagem sérica (± desvio padrão) de ALT e AST (UI/L)

em camundongos tratados com extrato hidroalcoólico de Morinda citrifolia

Parâmetro Controle 100 mg/Kg 250 mg/Kg p*

ALT 49,64±12,57 89,96±21,76ª 91,67±16,43ª 0,0001

AST 91,66±16,96 113,7±39,50 106,3±35,28 0,3116

* teste de ANOVA. (p<0,05). ª diferença estatística em relação ao respectivo controle

O tratamento com extrato foi capaz de causar aumento da concentração plasmática das

enzimas AST e ALT, o que sugere uma possível toxicidade causada ao fígado dos animais

tratados.

A ALT é uma enzima encontrada predominantemente no fígado. Em geral, a elevação

de ALT deve-se a presença de hepatopatia. Já a AST é uma enzima encontrada em vários órgãos

e tecidos, incluindo fígado, coração, músculo esquelético e eritrócitos. A elevação da AST de

origem hepática é devida a algum grau de lesão hepatocelular aguda. Após uma lesão

hepatocelular aguda de qualquer etiologia, a AST é liberada das células lesadas (RAVEL,

2014).

Sendo assim, o aumento da ALT tem maior significância clínica como sinal de lesão

hepática, pois a elevação dos níveis de AST sérico pode ser relacionada a lesões em outros

órgãos. Além disso, até a hemólise macroscópica causa sua falsa elevação (FISCHBACH,

2010).

Levantamentos realizados sobre o consumo da polpa de noni relacionados com níveis

elevados dessas transaminases, evidenciaram a hepatotoxicidade do fruto (MILLONIG et al.,

2005). Estudos indicam que a presença de alcalóides pirrolizidínicos em sua composição pode

ser a possível causa da hepatotoxidade, no caso da noni (ANDRADA et al., 2007).

51

5.5. Estudo Comportamental

5.5.1. Teste de Atividade Locomotora Espontânea

No teste de campo aberto, a ANOVA não demonstra diferença estatística entre os grupos

analisados, mostrando que não há comprometimento da mobilidade dos animais após

tratamento (Gráfico 1).

Gráfico 1. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na atividade locomotora espontânea em camundongos,

no teste de campo aberto. Os resultados foram expressos como a média ± E.P.M. dos resultados (n=10), onde,

Teste de ANOVA seguido pelo teste de post-hoc de Student Newman-Keuls. CN=controle negativo,

IMP=imipramina, DZP=diazepam.

O teste de campo aberto é um modelo de locomoção e sedação podendo ser utilizado

tanto para verificar os efeitos de substâncias sobre a memória espacial e/ou efeitos sedativos

sobre o sistema motor dos animais. A tendência natural do animal em ambiente novo é a de

explorá-lo, apesar do conflito com o medo provocado pela novidade (MONTGOMERY, 1958).

Neste caso, os camundongos foram avaliados quanto a integridade do sistema motor, que

poderiam vir a interferir na execução dos demais testes comportamentais.

Desta forma, o extrato de Morinda citrifolia, não modificou a atividade locomotora dos

animais, assim como as demais substâncias administradas.

5.5.2. Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)

No teste para a avaliação da ansiedade, a ANOVA mostrou diferença estatística para a

porcentagem de entrada em braço aberto para o grupo tratado com extrato com concentração

de 100 mg/Kg (Gráfico 2) e redução da frequência de entrada em braço fechado para as duas

52

concentrações de extrato avaliadas (Gráfico 3). A ANOVA não demonstrou diferença estatística

para a porcentagem de tempo de permanência em braço aberto (Gráfico 4). O diazepam,

utilizado como controle positivo, não apresentou diferença estatística, em nenhuma das

análises, quando comparado com o controle negativo.

Gráfico 2. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação da porcentagem de entradas em braço

aberto, no teste de labirinto em cruz elevado. Para análise comparativa foi usado o diazepam (DZP, 1 mg/Kg) e

água destilada (CN, controle negativo). Os resultados foram expressos como a média ± E.P.M. dos resultados

(n=10), onde, *p<0,05 ≠ CN. Teste de ANOVA seguido pelo teste de post-hoc de Student Newman-Keuls.

Gráfico 3. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação da frequência de entradas em braço

fechado, no teste de labirinto em cruz elevado. Para análise comparativa foi usado o diazepam (DZP, 1 mg/Kg) e

água destilada (CN, controle negativo). Os resultados foram expressos como a média ± E.P.M. dos resultados

(n=10), onde, *p<0,05 ≠ CN. Teste de ANOVA seguido pelo teste de post-hoc de Student Newman-Keuls.

53

Gráfico 4. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação da porcentagem de tempo em braço aberto,

no teste de labirinto em cruz elevado. Para análise comparativa foi usado o diazepam (DZP, 1 mg/Kg) e água

destilada (CN, controle negativo). Os resultados foram expressos como a média ± E.P.M. dos resultados (n=10).

Teste de ANOVA seguido pelo teste de post-hoc de Student Newman-Keuls.

Segundo Rodgers e colaboradores (1997), os principais parâmetros no Labirinto em

Cruz Elevado associados à ansiedade são a frequência de entradas e o tempo de permanência

nos braços abertos, considerados de modo relativo ao total de entradas e ao tempo total de

permanência no labirinto. Deste modo, é possível afirmar que o tratamento com extrato de noni

não modificou os parâmetros avaliados para ansiedade no Labirinto em Cruz Elevado.

O número de entrada nos braços fechados é definido por Rodgers e colaboradores (1997)

como um parâmetro de avaliação de atividade locomotora que, quando alterado, pode interferir

na análise dos resultados da atividade ansiolítica. Os resultados deste parâmetro (Gráfico 3),

mostram que o tratamento com extrato de noni não interferiu com a atividade locomotora,

confirmando a ausência de atividade sobre o sistema motor já observada anteriormente no teste

atividade locomotora espontânea (Gráfico 1).

5.5.3. Teste de Nado Forçado

Na avaliação de tempo de imobilidade, a ANOVA detectou diferença estatística entre o

grupo tratado com extrato na concentração de 250 mg/Kg em relação aos grupos controle

negativo e positivo. A imipramina, utilizada como controle positivo, não apresentou diferença

quando comparada ao controle negativo (Gráfico 5).

54

Gráfico 5. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação do tempo de imobilidade de camundongos

avaliados no teste de esquiva nado forçado por 3 min. Para análise comparativa foi usado a imipramina (IMP, 10

mg/Kg) e água destilada (CN, controle negativo). Os resultados foram expressos como a média ± E.P.M. dos

resultados (n=10), onde, *p<0,05 ≠ CN e #p<0,05 ≠ IMP. Teste de ANOVA seguido pelo teste de post-hoc de

Student Newman-Keuls.

O tempo de imobilidade é o principal parâmetro avaliado no teste de nado forçado e é

utilizado como um indicador de desespero comportamental, relacionado com a impossibilidade

de escape durante a situação experimental (GUTIÉRREZ-GARCIA; CONTRERAS, 2009).

Assim, a diminuição do tempo de imobilidade observado na dose de 250mg/kg do extrato de

noni, sugere atividade compatível com a redução do desespero comportamental, parâmetro

experimental associado à atividade antidepressiva.

5.5.4. Teste de Esconder Esferas (“marble-burying test”)

No teste para avaliação da compulsão, a ANOVA demonstrou diferença estatística do

grupo que recebeu o extrato na concentração de 100 mg/Kg em relação ao grupo controle

negativo, onde um número menor de esferas foi escondido pelos camundongos do grupo que

recebeu o extrato. A imipramina, utilizada como controle positivo, apresentou diferença

estatística significativa quando comparado com o controle negativo. Não houve diferença

estatística significativa entre o grupo que recebeu extrato na concentração de 100 mg/Kg em

relação ao grupo controle positivo. (Gráfico 6).

55

Gráfico 6. Efeito do extrato da folha de Morinda citrifolia na avaliação do número de esferas escondidas pelos

camundongos, no teste de avaliação da compulsão. Para análise comparativa foi usada a imipramina (IMP, 10

mg/Kg) e água destilada (CN, controle negativo). Os resultados foram expressos como a média ± E.P.M. dos

resultados (n=10), onde, *p<0,05 ≠ CN. Teste de ANOVA seguido pelo teste de post-hoc de Student Newman-

Keuls.

O teste de esconder esferas é caracterizado por avaliar o comportamento do animal no

que diz respeito à tentativa de esconder objetos potencialmente “perigosos” (LAPA et al.,

2008). Estando mais relacionado com o transtorno obsessivo-compulsivo do que com o

transtorno de ansiedade generalizada, como é o Labirinto em Cruz Elevado (ICHIMARU et al.,

1995). Uma vez que os animais que são submetidos aos procedimentos experimentais não

apresentam comportamento de habituação quando expostos as esferas de vidro, continuando a

enterrar mesmo sendo reexpostos em dias consecutivos. Este comportamento está relacionado

a compulsões (NJUNG’E; HANDLEY, 1991).

O tratamento com extrato de noni na concentração de 100 mg/Kg mostrou atividade

sobre o procedimento experimental associado ao transtorno obsessivo compulsivo, sendo esta

atividade estatisticamente semelhante à atividade da imipramina, sem ter tido qualquer indício

de atividade sobre o procedimento que avalia o transtorno de ansiedade generalizada ou que

mostra interferência sobre a atividade locomotora.

5.5.5. Teste de esquiva do tipo “step-down”

O resultado do tratamento do extrato de Morinda citrifolia (100 e 250 mg/Kg), em

comparação com controles positivo e negativo, na memória espacial de curta e longa duração

no teste da esquiva inibitória tipo “step down”, está demonstrado no Gráfico 7.

56

Gráfico 7. Efeito do tratamento crônico do extrato da folha de Morinda citrifolia na MCD (1,5 horas) e MLD (24

horas) de camundongos avaliados no teste de esquiva “step-dow” por 3 min. Para análise comparativa foi usado a

cafeína (CAF, 10 mg/Kg) e água destilada (CN, controle negativo). Os dados estão expressos como as medianas e

seu intervalo enterquartis dos resultados (n=10), onde, *p<0,05 ≠ CN (1,5 horas) e #p<0,05 ≠ CN (24 horas). Teste

de Kruskal-Wallis seguido pelo teste post-hoc de Dunn's.

Observou-se diferença estatística significativa com o aumento do tempo de latência,

apresentando melhora da memória espacial de curta e longa duração, no grupo tratado com o

extrato na concentração de 250 mg/Kg, comparado com o grupo controle negativo.

Já o grupo tratado com extrato na concentração de 100 mg/Kg apresentou diferença

estatística significativa com aumento do tempo de latência apenas 24 horas após estímulo

aversivo aplicado, demonstrando melhora da memória espacial de longa duração.

A cafeína, utilizada como controle positivo, apresentou diferença estatística

significativa quando comparada com o grupo controle negativo.

O consumo de cafeína está relacionado com mecanismos de aprendizado e memória,

diretamente. Estudos mostram que esta substância altera a neurogênese de células do

hipocampo, de forma dose-dependente. (HAN et al., 2007; WENTZ e MAGAVI, 2009).

Investigações em humanos revelaram que a cafeína reforça o desempenho na evocação de

memórias de curto e longo prazo e eleva a eficiência na codificação (RIEDEL, et al., 1995;

SMITH, et al., 1999).

57

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estudo anatômico apresenta caracteres estruturais comuns à família que contribuem

na identificação da planta medicinal;

Os testes histoquímicos e a triagem fitoquímica possibilitaram a confirmação da

presença de compostos secundários na folha de noni, que também auxiliam na

identificação da planta. Entretanto ainda são necessárias análises confirmatórias para

comprovar a presença destes compostos;

Os estudos toxicológicos demonstraram hepatotoxicidade gerada pelo consumo do

extrato da folha, não sendo dose-dependente. Para complementação dos estudos, ainda

são necessários estudos histopatológicos dos órgãos (fígado, rins, cérebro e coração)

dos camundongos utilizados, a fim de avaliar possíveis lesões ocorridas;

A folha possui grande potencial terapêutico como espécie medicinal, uma vez que os

tratamentos com os extratos, nos testes comportamentais, apresentaram sugestiva

atividade antidepressiva (concentração de 250 mg/Kg); anticompulsiva (concentração

de 100 mg/Kg) e ação estimulante da memória (concentrações de 100 e 250 mg/Kg);

A hepatotoxicidade causada pela administração do extrato hidroalcoólico de noni deve

ser levada em consideração antes de iniciar-se o seu consumo visando sua atividade

biológica.

58

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO A