Ultimo Informe de Micro.3

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CURVA DE CRECIMIENTO Y EFECTO DE pH SOBRE CULTIVOS DE VARIOS TIPOS DE BACTERIASHolman Jiovanny Mesa M. *

Recibido el 28 de Abril de 2010. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de ciencias, Departamento de Química. *[email protected]

En microbiología, el crecimiento se refiere al aumento en el número de células, que en realidad se observa como un aumento en el tamaño de una población y puede ser expresada en función del número de individuos y como biomasa total. El crecimiento en un medio de cultivo monofásico (no renovado) tiene tres fases: la fase de latencia (lag) , la fase logarítmica, la fase estacionaria y la fase de muerte, este crecimiento se puede medir por métodos directos e indirectos. Las condiciones fisicoquímicas del medio de cultivo como es el pH del medio hacen que algunos microorganismos crezcan adecuadamente en uno u otro pH.

El cultivo de bacterias en un determinado medio no renovable o monofásico presenta tres fases : la fase de latencia (lag) donde las células se adaptan al medio y el crecimiento es lento, puede ser breve o larga depende del cultivo y de las condiciones de crecimiento, es larga cuando las células necesitan recuperar la síntesis de metabolito; fase exponencial donde las células se dividen de a dos en dos , es la etapa donde las células están mejor fisiológicamente y la mejor fase para estudios enzimáticos y estructurales; la fase estacionaria, donde la velocidad de crecimiento es similar a la de muerte de células ya que los nutrientes son limitados, y finalmente la fase de muerte, donde las células mueren por falta de nutrientes como lo muestra la figura No. 1

Figura No.1 curva de crecimiento de un microorganismo en un medio de cultivo tipo batch o monof sicoá

Este crecimiento se puede monitoreándose midiendo el cambio en el número de células de manera directa o indirecta.

a) Método directo : Se puede llevar a cabo en muestras líquidas por cámaras de recuento especiales, en donde se realiza el conteo por rejillas de volumen determinado por medio del microscopio, lo cual facilita la conversión a número de células por mL, sin embargo el conteo de células por microscopía presenta la desventaja de no distinguir entre células vivas y muertas, además de tener baja precisión debido a la

presencia de células muy pequeñas, y se requiere de microscopio de contraste de fases cuando las células no se tiñen, como lo muestra la figura No. 2

b)

Figura No.2. conteo de células totales en placa

Por otra parte, el conteo de células viables corrige éste error, ya que cuenta sólo aquellas que son capaces de crear colonias. De aquí parten los métodos de extensión y vertido en placa: el primero de ellos consiste en incubar las células haciendo una extensión sobre un medio de agar y posteriormente se cuentan las colonias que se desarrollaron en la placa; el segundo método consiste en añadir el medio estéril sobre la muestra del microorganismo y se procede al conteo en la superficie del medio.

Figura No.2. Recuento de células viables por medio de cultivo en placa

Para llevar a cabo una curva de crecimiento es necesario hacer la siembra del cultivo en varias diluciones con el fin de poder escoger entre las placas que tengan un rango de 30 a 300 colonias. Dentro de éste órden, el recuento puede ser exacto, y la posibilidad de interferencia en el crecimiento de un organismo por otro es mínimo como lo muestra la figura No. 3

Figura No.3 diluciones y siembra de cultivos en placa como método de conteo de células viables

Universidad Nacional de Colombia laboratorio de Microbiología, [2010], [vol1], 00–00 | 1

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Método Indirecto: Está relacionado con la turbidez. Cuando las células están suspendidas en el medio líquido dispersan la luz y generan turbidez, la cual puede cuantificarse por medidas fotométricas o espectrofotométricas. La absorbancia de las soluciones celulares es proporcional a la cantidad de células, aunque antes de cualquier ensayo debe planearse una curva de calibración en donde se pueda relacionar exactamente el número de células con las medidas de absorbancia. Su ventaja radica en que no afecta la naturaleza celular y pueden repetirse las medidas para aumentar la precisión.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.10.20.30.40.50.60.70.80.9

Figura No 4. Curva de crecimiento para un cultivo de E-Coli en TSB con conteo de células por el método directo

La figura No. 4 representa el crecimiento bacteriano realizado en el laboratorio de microbiología, mediante el método indirecto con medidas de absorbancia donde se muestra una fase de latencia más larga. Sin embargo, estas medidas tienen cierto rango de arbitrariedad ya que no existe una curva de calibración que relacione directamente el número de células con el valor de absorbancia o transmitancia. Asimismo, el conteo depende del Límite de detección del método y la calibración del equipo, por lo que, es probable que la fase latencia sea más corta que la mostrada en el método directo debido a que las células muy pequeñas no logran dispersar la luz lo suficiente para dar una lectura en el detector, o porque las células dispersan la luz en una dirección diferente de la del detector. Una desventaja adicional que puede poseer éste método es que no distingue entre células vivas y muertas, ya que ambas se pueden encontrar en la suspensión y pueden dispersar la luz , debido a esto se ve la diferencia entre las dos graficas que confirma la ventaja del

crecimiento de las colonias como una herramienta para identificar las células viables.

Posteriormente, llega la fase exponencial que comprende entre la cuarta y la novena hora a partir de la siembra, para el caso de células totales y de 6 a 9 horas para el caso de las células viables . En ésta fase la replicación celular es más rápida y comprende el siguiente esquema que se muestra en el figura No.

a)

b)Figura 5. Resultado de varias duplicaciones celulares. b) Representación de la división celular. Las bacterias se reproducen por bipartición. El ADN (cromosoma bacteriano) se une a un mesosoma y se duplica. Posteriormente, la membrana plasmática se invagina y se produce un tabique de separación, lo que da lugar a dos células hijas, cada una de ellas con una réplica exacta del cromosoma de la célula madre.

Como cada célula produce a su vez dos células el crecimiento obedece a una ecuación del tipo 2n, donde n es el número de veces en el que hay duplicación celular. Esta fase comprende el 75% del tiempo total del ensayo y a partir de ella es posible calcular el tiempo de generación g el cual expresa una medida del tiempo necesario para que una población duplique su número de células; Tomando el valor de CFU/mL tanto en un punto de la fase exponencial como en el tiempo cero se calcula el valor de g con la siguiente fórmula:

1,25∗108=2n∗3,10∗104

2n=1,25∗108

3,10∗104 =4∗103

n= log 4∗103

log 2=12

Laboratorio de Inorganica[2009], [I], Universidad Nacional de Colombia [2009]

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http://www.iesbanaderos.org/html/departamentos/bio-geo/Apuntes/Bio/T16_Microb/4%20Bacterias.htm#Mesosomas



g= tn= 9

12=0,75horas

Para el caso de cuatro horas que dura aproximadamente la fase exponencial el tiempo de generación es de: 0.33 horas aproximadamente de 20 minutos ; como se puede observar las curva estas no llegan a la fase estacionaria ya que tuvieron una fase de latencia alto esto se debe posiblemente a problemas con la incubación de las colonias , por tanto no podemos decir cuanto tiempo duro la fase exponencial para realizar mejor los cálculosLa diferencia de las curva por el método de células viables y por absorbancia radica en el conteo ya que por el método indirecto se cuenta células totales mientras que por el método directo se cuentan células viables..Cuestionario

1. Calcular el tiempo de generación g a partir de los siguientes datos:

Al comienzo el crecimiento exponencial cuando t = 0, la concentración de células fue 2.500 por mL. Al tiempo igual a 8horas la concentración de células fue 10.000 por mL.

X = 2nX0

En este caso X = 10.000 y X0 = 2.500

2 generaciones en 8 representan:

2. Cuáles son las causas potenciales para que ocurra una fase de latencia en un medio de crecimiento bacteriano?

La fase de latencia puede ser breve o larga dependiendo de las condiciones del cultivo. La causa de la generación de ésta fase es que por lo general los cultivos en un principio no cuentan con los nutrientes necesarios para que las células se reproduzcan inmediatamente, por lo cual se requiere tiempo para que se sinteticen componentes indispensables para la división. Adicionalmente, puede encontrarse una fase más larga cuando las células han sido sometidas a condiciones desfavorables como radiación o calor, por lo tanto requieren de un tiempo inicial de recuperación. Si el cultivo es demasiado pobre las células requerirán más tiempo para completar el conjunto de enzimas que le permitan la síntesis de metabolitos esenciales que no se encuentran en el medio.

3. Cuales son las causas potenciales para que ocurra una fase de muerte en el cultivo de crecimiento bacteriano?

Después de que las células han alcanzado la fase estacionaria puede llegar el agotamiento de los nutrientes esenciales para la supervivencia, por lo cual las células no pueden desarrollar más metabolitos y mueren. Del mismo modo, el metabolismo celular por lo general comprende la expulsión de desechos al medio de cultivo, que por lo general son tóxicos para la célula. De ésta manera, si hay bastante población la cantidad de desechos tóxicos es suficiente para causar la muerte de algunas de las células.

4. Cuáles son algunos de los errores potenciales asociados a la dilución y el sembrado?

El conteo por éste método puede conllevar a errores experimentales propios de quien realiza el conteo, ya que no es una técnica estándar. Adicionalmente, algunas colonias pueden pasar desapercibidas debido a su tamaño muy pequeño, así como las colonias grandes y en altas cantidades pueden fusionarse y contarse como una sola. Lo ideal en este caso es practicar diluciones que permitan establecer un número entre 30 y 300 colonias diferenciables y de tamaño adecuado.

El crecimiento de algunos microorganismos como bacterias, mohos y levaduras se ve afectado por muchos factores en el medio. Uno de ellos, el cual es objeto de estudio en este trabajo experimental, es el pH. Por lo general los cultivos se llevan a cabo a un pH cercano a la neutralidad, sin embargo, los microorganismos pueden desarrollar mecanismos en los cuales pueden sobrevivir a valores de pH diferentes, independientemente de su resistencia a las temperaturas extremas. De ésta manera es posible clasificarlos como alcalófilos (sobreviven en pH básicos), acidófilos (sobreviven en pH ácidos) y neutralófilos (sólo sobreviven a pH cercanos a 7.0). Como se ve en la figura No. 6

Figura No.6. tipos de colonias dependiendo del pHEn este caso, se pretende evaluar el crecimiento bacteriano de tres tipos de microorganismos: Escherichia Coli, Enterococcus Faecalis y levadura (Saccharomyces cerevisiae) en valores de pH 3, 6, 7 y 9. La medida cualitativa indirecta del aspecto turbio de las soluciones permitirá evaluar cuál es el pH al cual crecen los tres microorganismos. De esta manera, se involucrarán los conceptos de medidas de crecimiento bacteriano y efecto del pH en el mismo.


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a) B)

c)

figura No. 7. Muestra imágenes microscópicas de a)

Escherichia Coli. b) Enterococcus Faecalis. c) Saccharomyces cerevisiae(levadura)

Para caracterizar el crecimiento de los microorganismos se tiene en cuenta un signo (+) si hubo un pequeño crecimiento (++) se hubo un buen crecimiento y (+++) un muy buen crecimiento; la figura No. 8 Muestra el crecimiento de los organismos a un pH 7.

Figura No.9 Muestra los cultivos para el tubo de la derecha((Saccharomycescerevisiae)), centro(Enterococcus faecalis y derecha(E. Coli) a pH 7

Figura No.10. Muestra los cultivos para el tubo de la derecha((Saccharomycescerevisiae)), centro(Enterococcus faecalis y derecha(E. Coli) a pH 6



La tabla No. 1 se muestra las características de cada uno de los microorganismos a diferentes pH, con su rangorizacion.

pH 3 pH 6 pH 7 pH 9

Enterococcus

faecalis

Hay algo de turbidez (++)

Se algo de

turbidez (++)

Se presenta precipit

ado blanco(+++)

Hay precipitado blanco en mayor cantidad que en

los demás tubos(+++)

E. Coli Poca turbidez

(+)

Ligeramente

turbio, en

menisco se

encuentra un

Mas turbio que a pH 6,

precipitado en

menisco y en el

Menor turbidez que los

dos anteriores tubos pero se ve un

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precipitado color blanco

(+)

fondo del tubo(+++)

pequeño precipitado en el

fondo del tubo(++)

Levadura

(Saccharomyces

cerevisiae)

Precipitado

blanco en

menor cantidad que en los otros tubos(++)

Precipitado

blanco, en

mayor cantidad que a pH

7(+++)

No se presenta

casi turbidez

(+)

Se presenta poca turbidez en el fondo (++)

Tabla No. 1. Muestra las características de cada uno de los microorganismos a diferentes pH

El precipitado y la turbidez observada en los tubos corresponden directamente al crecimiento o no de las células del correspondiente microorganismo. De acuerdo a estos resultados, se puede decir que E. faecalis es un microorganismo alcalófilo, ya que hay mayor crecimiento a pH 9; la E. coli es un microorganismo neutrófilo, pues tiene crecimiento optimo a pH 7, ya que según lo reportado en g el pH optimo de crecimiento está en un intervalo de pH entre 4.4 y de 9.0 a una temperatura de 37°C. De la levadura se puede decir que es un microorganismo neutrófilo, ya que tuvo mayor crecimiento a pH 6 pero que tolera condiciones ácidas en el medio.

E. faecalis, tiene alta tolerancia al medio alcalino porque, como otros Enteroccus, su hábitat natural es el intestino grueso de los mamíferos, donde los desechos de la digestión tiene un pH ligeramente alcalino al ser neutralizados luego de salir del estomago y el intestino delgado. Lo mismo sucede con E. coli, ya que también vive el intestino de los animales, aunque su tolerancia no es tan alta.

Es de notar que las bacterias no tuvieron un alto crecimiento a pH ácido mientras que S. cerevisiae sí, pero a pH básico esta situación se invierte, esto se puede deber que los hongos generalmente viven en ambientes de descomposición donde el pH es ácido, de manera que pueden crecer en condiciones ligeramente ácidas.

Cuando los microorganismos están expuestos a condiciones que no son las apropiadas, posiblemente su estructura celular y de sus proteínas cambian afectando su funcionalidad de manera que la célula muere, así se explica que las bacterias estudiadas no puedan crecer a pH ácido y la levadura no crezca a pH básico.

Cuestionario1. Explique el mecanismo por el cual los buffers

previenen cambios drásticos en el pH

Los buffers previenen los cambios drásticos de pH porque son compuestos capaces de aceptar iones hidronio (H+) de compuestos ácidos o donarlos a compuestos básicos, de manera que se mantiene la neutralidad en al solución.

2. Explique porque es necesario incorporar buffer en el medio donde los microorganismos están creciendo

Durante la actividad metabólica de cualquier microorganismo, los compuestos de desechos suelen ser productos ácidos, de la degradación de carbohidratos, o básicos, de la degradación de proteínas; como estos desechos son liberados al medio de cultivo, el pH de este puede cambiar, afectando así el crecimiento optimo de las células. Una manera de evitar esta situación es adicionando una solución buffer que neutraliza los compuestos ácidos y básicos, manteniendo así un pH casi constante en el medio de cultivo.

3. ¿Por qué los aminoácidos y proteínas son considerados buffers naturales?

Los aminoácidos son compuestos con 2 o mas grupos aceptores o donores de H+ (grupo amino y grupo carboxil), de manera que pueden considerarse buffers y como las proteínas están hechas de aminoácidos, se aplica la misma situación para ellas.

4. Explique porque los microorganismos difieren en su requerimiento de pH

El requerimiento de pH es diferentes en distintos microorganismos porque esta dado por el ambiente en el que vivan, ya que este define el tipo y estructura de las proteínas que el microorganismos debe fabricar para su sobrevivencia.

5. ¿Todos los microorganismos crecerán óptimamente a pH neutro? Explique

No necesariamente, ya que depende del medio en el que el microorganismo viva y de la estabilidad de sus componentes (membrana celular, proteínas) a ese pH.

Notas y referenciasa http://bc.inter.edu/facultad/yserrano/factoresfisicosqui.htm (8/04/10)En esta página de internet se encuentran los efectos de agentes microbianos y de metales sobre el microorganismo.

b MADIGAN, T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª Edición. Pearson Prentice Hall. Páginas 1,103-105, 723

c. HOGG STUART, Essential Microbiology,. John Wiley & Sons, Ltd.,2005 Páginas 102, 345

d. http://www.plataformasinc.es/index.php/esl/Multimedia/Imagenes/Banco-de-imagenes/El-polvo-de-interiores-es-una-abundante-fuente-de-bacteria (8/04/10)

f. PELCZAR, M. J.; REID, R.; Microbiología. Editorial Mc Graw-Hill. México. 1966. Páginas 13, 15, 59,60.

g. http://grad.uprm.edu/tesis/oquendorodriguez.pdf


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http://grad.uprm.edu/tesis/oquendorodriguez.pdf

http://www.plataformasinc.es/index.php/esl/Multimedia/Imagenes/Banco-de-imagenes/El-polvo-de-interiores-es-una-abundante-fuente-de-bacteria



http://bc.inter.edu/facultad/yserrano/factoresfisicosqui.htm