UJI STERILITAS Achmad Fauzi Al’amrie, S.Farm
UJI STERILITAS
Achmad Fauzi Al’amrie, S.Farm
PENCEGAHAN TERHADAP KONTAMINASI MIKROBA
PENGUJIANSTERIL
kondisi aseptik
untuk menghindari kontaminasi
Media kultur dan suhu inkubasifluid thioglycollate medium terutama ditujukan untuk kultur bakteri anaerob. Namun, dapat juga mendeteksi bakteri aerob.
Fluid thioglycollate medium diinkubasi pada suhu 30-35oC.
Soybean-casein digest medium untuk pengkayaan jamur dan bakteri aerob.
soybean-casein digest medium diinkubasi pada suhu 22,5oC.
Fluid Thioglycollate MediumL-Cystine 0.5 g
Sodium chloride 2.5 g
Dextrose Monohydrate/anhydrous 5.5/5.0 g
agar 0.75 g
Yeast Extract (water-soluble) 5.0 g
Pancreatic Digest of casein 15.0 g
Sodium thioglycolic Acid 0.5 g
Or Thioglycolic Acid 0.3 mL
Resazurin Sodium Solution (1 in 1000),freshly prepared
1.0 mL
Purified Water 1000mL
Soybean-Casein digest Medium
Pancreatic Digest Of Casein 17.0 g
Papaic Digest of Soybean Meal 3.0 g
Sodium Chloride 5.0 g
Dibasic Potassium Phosphate 2.5 g
Dextrose Monohydrate/Anhydrous
2.5/2.3 g
Purified Water 1000 mL
Media untuk penisilin atau sefalosporin
Media pengujian untuk penisilin atau sefalosporin menggunakan fluid thioglycollate medium dan soybean-casein digest medium
Penambahan β-laktam secara aseptis untuk menonaktifkan penisilin atau sefalosporin
Metode uji kesesuian menggunakan staphylococcus aureus sebagai pembanding (konsentrasi β-laktam harus tepat)
Mikroorganisme yg digunakan dalam pengujian pertumbuhan dan metode uji kesesuaianAerobicbacteria
staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Anaerobic bacterium
Clostridium sporogenes ATCC 19, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437, NBRC 14293
Fungi
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis (aspergillus Niger)
ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
Pengujian pertumbuhan aerob, anaerob, dan jamur
•Penyiapan media
•Mikroorganisme yang digunakan dalam pengujian : Clostridium sporogenes, pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus.
Preparasi
•media thioglycollate untuk sporogenes clostridium (tidak lebih dari 100 cfu)
•pemipetan soybean-casein digest medium untuk Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis, dan Candida albicans.
Pengkayaan
•Untuk bakteri tidak lebih dari 3 hari
•Untuk jamur tidak lebih dari 5 hari
Inkubasi
CAIRAN PENGENCER DAN PENCUCI UNTUK FILTRASI MEMBRANE
fLUID A
1 gram jaringan hewan yang
telah diuraikan oleh enzim
pepsin
ad air sampai 1 liter
saring atau sentrifugasi, pH diatur 7.1 ± 0.2
Sediaan uji yang mengandung senyawa
gol. Penisilin/Sefalosporin
(beta laktma)
+ enzim penisilinase
Lanjutan...fLUID B
1 liter Fluid A
+ 1 ml tween 80
pH diatur 7.1 ± 0.2.
Digunakan bila
mengandung lesitin atau
sediaan minyak atau
untuk uji peralatan steril dengan menggunakan penyaring membran
fLUID K
1 gram jaringan hewan yang
telah diuraikan oleh enzim
pepsin
+ 3 gram beef extract
ad air sampai 1 liter
pH diatur 6.9 ± 0.2
setelah sterilisasi
Semua cairan pembilas harus
disterilkan dengan otoklaf
Lanjutan.....
Uji Kesesuaian Metode•Inoku
lasi mikroorganisme ke dalam pengencer steril untuk membilas filter
Filtrasi membran
•Inokulasi mikroorganisme ke dalam media
Inokulasi langsung
Ada pertumbuha
n mikroorgani
sme
Bandingkan dengan kontrol
media tanpa produk
Uji sterilitas tanpa
modifikasi
Tidak ada pertumbuha
n mikroorgani
sme
Bandingkan dengan kontrol
media tanpa produk
Lakukan modifikasi
kondisi dan ulang uji
kesesuaian metode
Uji kesesuaian
metode
Produk baru
Terdapat perubahan
kondisi pengujian
Jumlah Sediaan yang Akan Diuji
Jumlah jumlah sediaan yang diuji tercantum pada tabel 3 kecuali bila dinyatakan lain
Bila jumlah sampel mencukupi (lihat tabel 2), sampel dapat dibagi kedalam beberapa bagian untuk ditambahkan kedalam media spesifik pengujian dapat menggunakan dua atau lebih media spesifik).
Bila jJumlah sediaan yang diuji tercantum dalam tabel 3 kecuali dinyatakan lainumlah sampel tidak mencukupi untuk dilakukan pembagian, gunakan dua kali jumlah sampel yang tercantum pada tabel 3.
UJI STERILITAS UNTUK PRODUK YANG AKAN DIUJI
Pengujian Sampel
Filtrasi Membran
sediaan yang mudah disaring; sediaan
yang berkadar alkohol tinggi atau
sediaan mengandung minyak; sediaan yang larut dalam pelarut
air atau minyak, sediaan yang tidak
memiliki efek antimikrobial pada kondisi pengujian. Inokulasi Langsung
Media Kultur
Filtrasi Membran
Digunakan membran filter dengan ukuran pori tidak lebih besar dari 0,45 µm.
Mis
aln
ya
Filtrat Cellulose nitrate yang digunakan untuk sampel larutan, minyak, dan larutan kadar alkohol lemah
Filtrat Cellulose acetate yang digunakan untuk larutan dengan kadar alkohol tinggi
LARUTAN
Gunakan sejumlah sampel sesuai dengan tebel 2 dan
3 (jika perlu dilakukan pengenceran)
Dilakukan penyaringan
Pindahkan membran pada media pertumbuhan yang sesuai secara aseptik atau potong membran menjadi 2 bagian dan masukkan
membran ke dalam media masing-masing yang
sesuai
Inkubasi media tidak lebih dari 14 hari
PADATAN YANG TERLARUT
Larutkan sejumlah sampel (sesuai dengan tabel 2 dan 3) dengan pelarut yang sesuai misalnya aqua pro injeksi, salin steril, atau fluid A
Lakukan prosedur yang seperti tercantum untuk sampel larutan dengan menggunakan membran dan pelarut yang sesuai.
Gunakan sejumlah produk untuk masing-masing media tidak lebih
dari jumlah yang tercantum dalalm tabel 2 dan 3
Minyak dan cairan berminyak yang mempunyai viskositas yang
rendah masih mungkin dapat disaring tanpa pengenceran
melalui membran
Minyak dengan viskositas tinggi jika perlu diencerkan terlebih dahulu dengan menggunakan pengencer steril yang sesuai misalnya isopropyl myristate
yang menunjukkan tidak mempunyai aktivitas antimikroba
ketika dalam kondisi uji
Biarkan minyak berpenetrasi melewati membran
saring dengan menggunakan tekanan atau dihisap secara
perlahan
Cuci membran minimal tiga kali dengan cara melewatkan kurang lebih 100 ml larutan steril yang
sesuai misalnya Fluid A ke dalam membran dimana larutan
tersebut mengandung emulgator yang sesuai misalnya polisorbat 80 dengan konsentrasi 10 g per
L (Fluid K)
Pindahkan membran ke dalam media pertumbuhan, inkubasi seperti pada sampel larutan
MINYAK DAN CAIRAN BERMINYAK
SALEP DAN KRIM
Gunakan sejumlah produk untuk masing-masing media tidak lebih dari jumlah yang
tercantum dalalm tabel 2 dan 3
Salep dengan basis lemak dan emulsi air dalam minyak dapat diencerkan sampai 1 % ke dalam isopropyl myristate
dengan pemanasan jika diperlukan tetapi tidak lebih dari 40o, kecuali jika diperlukan
pemanasan lebih dari 44o
Saring secepat mungkin
Dilakukan prosedur seperti yang tercantum untuk sampel
minyak dan cairan berminyak.
SEDIAAN SOLID UNTUK INJEKSI SELAIN ANTIBIOTIK
Preparasi sampel sesuai dengan yang
tercantum dalam label, kemudian
dilakukan prosedur seperti yang tercantum
untuk sampel larutan atau minyak dan
cairan berminyak. (catatan: jika diperlukan,
dapat ditambahkan pengencer untuk
membantu ketika proses penyaringan).
ANTIBIOTIK SOLID UNTUK INJEKSI
Produk dengan isi < 5 g
Dari 20 wadah masing-masing masukkan sekitar 300 mg sediaan solid ke dalam 500 ml wadah steril
secara aseptik
Larutkan dengan 200 ml Fluid A dan dihomogenkan
Untuk liquid atau suspensi, masukkan sejumlah sampel ekuivalen
dengan 300 mg sediaan solid ke dalam 500 ml wadah steril, larutkan
dengan 200 ml Fluid A dan dihomogenkan
Kemudian lakukan prosedur sesuai dengan yang tercantum untuk sampel
larutan atau minyak dan cairan berminyak.
Produk dengan isi ≥ 5 g
Dari 6 wadah masing-masing masukkan sekitar 1 g sediaan solid
ke dalam 500 ml wadah steril secara aseptik
Larutkan dengan 200 ml Fluid A dan dihomogenkan
Untuk liquid, masukkan sejumlah sampel ekuivalen dengan 1 g sediaan solid ke dalam 500 ml wadah steril, larutkan dengan 200 ml Fluid A dan
dihomogenkan
Kemudian lakukan prosedur sesuai dengan yang tercantum untuk sampel
larutan
ANTIBIOTIK SOLID, BULK, DAN CAMPURAN
Secara aseptik ambil sejumlah sampel
sesuai dengan tabel 2, ekuivalen dengan 6 g
sediaan solid, masukkan dalam 500 ml
wadah steril. Larutkan dalam 200 ml Fluid A
dan dicampur. Kemudian lakukan prosedur
sesuai dengan yang tercantum untuk
sampel larutan.
PRODUK AEROSOL STERIL
Untuk produk aerosol steril, bekukan wadah
dengan menggunakan alcohol-dry ice
sampai -20o selama kurang lebih 1 jam.
Tambahkan 100 ml Fluid D ke dalam wadah
dan homogenkan secara perlahan.
Kemudian lakukan prosedur sesuai dengan
yang tercantum untuk sampel larutan atau
minyak dan cairan berminyak.
ALAT DENGAN LABEL STERIL
Secara aseptik lewatkan Fluid D melewati
alat yang akan diuji. Tampung fluid ke
dalam wadah steril, dan kemudian lakukan
prosedur sesuai dengan yang tercantum
untuk sampel larutan atau minyak dan
cairan berminyak.
Cara Inokulasi Langsung pada Media
med
ium
Pindahkan sejumlah sampel yang akan diuji sesuai dengan tabel 2 dan tabel 3 secara langsung pada media sampai volume produk tidak lebih dari 10% dari volume medium atau bila dinyatakan lain.
netralisasi
Senyawa penetralisir
Pengenceran dengan media
• Cairan berminyak• Salep dan Krim• Benang Bedah dan Benang Operasi Lainnya• Sediaan Solid• Kapas yang Dimurnikan, Kasa, Perban Bedah
dan Bahan Lain Sejenis• Alat Steril
Penelusuran dan interpretasi Hasil
Kesimpulan pemeriksaan media sebagai bukti makroskopik pertumbuhan mikroba dilihat selama interval masa inkubasi
Jika bahan yang diuji terdapat kekeruhan, sehingga adanya pertumbuhan mikroba tidak dapat segera ditentukan oleh pemeriksaan visual, maka 14 hari setelah awal pemindahan porsi inkubasi (masing-masing tidak kurang dari 1 ml) ke vessels dari media yang sama
inkubasi original dan transfer vessels tidak kurang dari 4 hari
Jika tidak ada bukti pertumbuhan mikroba ditemukan
Jika bukti pertumbuhan mikroba ditemukan, kecuali dapat dibuktikan dengan jelas bahwa tes itu tidak valid untuk penyebab yang tidak terkait dengan produk yang akan diperiksa
Jika tidak ada bukti pertumbuhan mikroba ditemukan dalam tes ulang, yang diperiksa produk sesuai dengan tes untuk sterilitas
produk diperiksa
sesuai dengan
tes untuk sterilitas
Jika ada bukti pertumbuhan mikroba ditemukan
Jika pertumbuhan mikroba ditemukan dalam tes ulang,
produk yang diperiksa tidak sesuai dengan tes untuk sterilitas.
Tes mungkin dianggap tidak valid hanya jika satu atau lebih kondisi berikut ini terpenuhi:
Jika data pemantauan mikrobiologi dari fasilitas pengujian sterilitas
menunjukkan kesalahan
Jika sebuah tinjauan prosedur pengujian
yang digunakan
selama pengujian tersebut
mengungkapkan
kesalahan
Jika Pertumbuhan
mikroba ditemukan
dalam kontrol negative
Jika setelah penentuan identitas
mikroorganisme terisolasi
dari tes, pertumbuhan
spesies ini dianggap
menegaskan kesalahan
sehubungan dengan
material dan atau teknik
yang digunakan
dalam melakukan
prosedur uji sterilitas.Jika tes ini dinyatakan tidak sah, hal ini diulang dengan
jumlah yang sama seperti pada unit pengujian awal
PENERAPAN UJI UNTUK SEDIAAN
PARENTERAL, SEDIAAN MATA DAN
SEDIAAN LAIN UNTUK MEMENUHI UJI STERILITAS
•Bila menggunakan teknik filtrasi membran, gunakan, bila memungkinkan, seluruh isi kontainer, tetapi tidak kurang dari jumlah yang disyaratkan dalam Tabel 2, diencerkan bila perlu sekitar 100 mL dengan larutan steril yang cocok, seperti Fluid A.
•Bila menggunakan teknik inokulasi langsung media, gunakan jumlah sampel sesuai dengan tabel 2, kecuali dinyatakan lain. Tes sterilitas bakteri dan jamur dilakukan pada sampel yang sama dari produk yang akan diperiksa. Ketika volume atau jumlah dalam wadah tunggal tidak cukup untuk melaksanakan tes ini,maka isi dari dua atau lebih wadah yang digunakan untuk mengokulasi media yang berbeda