UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ISOLASI SENYAWA ...

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

ISOLAT MEC-1 DARI KAPANG ENDOFIT LUMUT

HATI Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

SKRIPSI

PUTRI SITI HAWA

11141020000073

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

JAKARTA

AGUSTUS 2018

ii


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

ISOLAT MEC-1 DARI KAPANG ENDOFIT LUMUT

HATI Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

PUTRI SITI HAWA

11141020000073

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

JAKARTA

AGUSTUS 2018

iii


HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri dan semua sumber baik yang dikutip maupun

dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

NAMA : Putri Siti Hawa

NIM : 11141020000073

TANDA TANGAN :

TANGGAL : Agustus 2018

iv


HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Putri Siti Hawa

NIM : 11141020000073

Program Studi : Farmasi

Judul Skirpsi : Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder Isolat MEC-1 Dari Kapang

Endofit Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume &

Nees

Disetujui oleh :

Pembimbing I

Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D.,Apt.

NIP. 197806302006042001

Pembimbing II

Saiful Bahri, M.Si.

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Ilmu Kesehatan


Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt.

NIP. 197404302005012003

v


HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :


NIM : 11141020000073




Nees

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima

sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan ,

Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D.,Apt. ( )

Pembimbing II : Saiful Bahri, M.Si. ( )

Penguji I : Vivi Anggia, M.Farm., Apt. ( )

Penguji II : Via Rifkia, M.Farm. ( )

Ditetapkan di :

Tanggal :

vi


ABSTRAK


NIM : 11141020000073




Nees

Hampir seluruh tumbuhan terasosiasi dengan satu atau lebih kapang endofit yang

dapat digunakan sebagai sumber alternatif penghasil metabolit sekunder. Kapang

endofit hasil isolasi dari lumut hati Marchantia emarginata diketahui memiliki

aktivitas antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan

mengidentifikasi metabolit sekunder dari kapang Colletotrichum truncatum yang

berasosiai dengan tumbuhan lumut hati Marchantia emarginata. Metode

fermentasi yang digunakan adalah fermentasi statis selama 21 hari. Pengujian

antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH (2,2 –Diphebyl-1-picrylhydrazil)

hasil pengujian aktivitas antioksidan menunjukan senyawa hasil isolasi memiliki

nilai IC50 143,17 µg/mL dan nilai AAI 0,68. Melalui proses rekristalisasi pada

ekstrak etil asetat diperoleh kristal senyawa murni seberat 40,6 mg dengan nilai

Rf 0,675. Struktur senyawa dianalisis dengan FTIR dan 1H-NMR. Dari hasil 1H-

NMR, senyawa diketahui memiliki nilai pergeseran kimia khas (δH) pada 4,765

ppm sebagai identitas metabolit yang dihasilkan dari kapang endofit.

Kata kunci : antioksidan, Colletotrichum truncatum, fermentasi statis, isolasi,

lumut hati

vii


ABSTRACT

Name : Putri Siti Hawa

Study Program : Pharmacy

Tittle : Isolation of Secondary Metabolites Compound from

MEC-1 Endophyte Isolates of Marchantia emarginata

Liverworts

Almost all plants are associated with one or more endhopytic fungi can be used as

alternative source of secondary metabolites. Endophytic fungi isolated from

Marchantia emarginata liverworts known to have antioxidant activity. The

purpose of this study is isolation and identification of secondary metabolites from

Colletotrichum truncatum associate with Marchantia emarginata liverworts.

Fermentation method used static fermentation for 21 days. Antioxidant activity

test using DPPH (2,2 –Diphebyl-1-picrylhydrazil) as free radicals, an antioxidant

assay showed the IC50 value of isolated compound is 143,17 µg/mL and

Antioxidant Activity Index (AAI) value is 0,68. Isolation of secondary metabolites

compound from ethyl asetate extract trough the recrystallization process gave a

40,6 mg pure crystal compound with Rf 0,675. Chemical structure of compound

was determined by using FTIR and 1H-NMR. Analysis results of 1H-NMR

indicates that chemical shift (δH) of compound at 4,75 ppm is the identity of

metabolites produced from endophytic fungi.

Kata kunci : antioxidant, Colletotrichum truncatum, isolation, liverworts, static

fermentation

viii


KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji dan syukur kami ucapkan kehadirat Allah SWT atas

segala berkah dan karunia-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi

dengan judul “Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder Isolat MEC-1 Dari

Kapang Endofit Lumut Hatai Marchantia emarginata Reinw., Blume &

Nees”. Penulisan skripsi ini dalam rangka menyelesaikan tugas akhir yang

merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada

Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini dapat terselesaikan tak lepas dari

bantuan dan bimbingan berbagai pihak. Oleh karena itu penulis mengucapkan

terima kasih kepada:

1. Ibu Ismiarni Komala, Ph.D., Apt., selaku pembimbing 1 dan Bapak Saiful

Bahri yang sudah banyak mecurahkan ilmu dan waktunya untuk

mebimbing, mengarahkan, memberikan masukan dan saran mulai dari

pengajuan proposal skripsi, selama proses penelitian, hingga skripsi ini

selesai.

2. Bapak Prof. Dr. H. Arief Sumantri, M.Kes., selaku Dekan Fakultas Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si.,Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi

Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Kedua orang tua Bapak Noor Tomas Bangbang dan Ibu Wiwi yang tak

henti-hentinya memberikan dukungan baik berupa doa dan materil yang

menjadi motivasi terbesar saya untuk segera menyelesaikan skripsi ini.

5. Adik-adik saya Dea, Tika, Ibnu, Siti, dan Hadi yang tiada hari terus

menghantui saya untuk segera lulus dan wisuda.

6. Sahabat Happy Ke-11an yang sudah menemani dan mewarnai hari-hari

selama perkuliahan.

ix


7. Teman seatap “The Kons” Rika, Maya,dan Nuril terima kasih untuk 3

tahun hidup bersama yang serasa nano-nano rame rasanya.

8. Dina si sahabat seper-jajan-an yang selalu mau diajak kemana saja saat

stress skripsi melanda.

9. Sahabat Rempong Saydoy,Dian, dan Mae yang selalu memotivasi saya

untuk semangat lulus mengejar jodoh yang haqiqi.

10. Sekelompok sahabat pecinta korea yang selalu memberi pesan semangat

disela kesibukan masing-masing.

11. Pejuang Kapang Nehta dan Ferani dengan segala kerecehan kita bersama,

kalian partner terbaik.

12. Kawan seper-bimbing-an luluk, ica, dan cina yang saling bantu selama

proses penelitian ini.

13. Teman-teman Farmasi 2014 yang sudah berjuang dan bertahan hingga

akhir.

14. Kak Novi, Kak Walid, Mba Rani yang telah memberi bantuan selama

penelitian.

15. Bapak dan Ibu staf serta rekan-rekan mahasiswa di Program Studi Farmasi

Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Jakarta.

16. Seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut

membantu terselesaikanya skripsi ini.

Penulis sangat menyadari bahwa masih terdapat banyak kekurangan pada

penyusunan skripsi ini. Maka dari itu, penulis mengharapkan saran dan kritik

membangun demi menyempurnakan skripsi ini. Dengan penuh kerendahan hati,

penulis berharap skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi mahasiswa farmasi

khususnya, bagi masyarakat, serta bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Ciputat,29 Agustus 2018

Penulis

x


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS

AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:


NIM : 11141020000073


Fakultas : Ilmu Kesehatan (FIKES)

Jenis Karya : Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul :

ISOLASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER ISOLAT

MEC-1 DARI KAPANG ENDOFIT LUMUT HATI

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syariif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Dengan demikian persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada tanggal : Agustus 2018

Yang menyatakan,

(Putri Siti Hawa)

xi


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..............................................iv

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................v

ABSTRAK ..........................................................................................................vi

ABSTRACT .......................................................................................................vii

KATA PENGANTAR .....................................................................................viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .......................x

DAFTAR ISI .......................................................................................................xi

DAFTAR TABEL..... ........................................................................................xiv

DAFTAR GAMBAR .........................................................................................xv

DAFTAR LAMPIRAN.. ..................................................................................xvi

BAB I PENDAHULUAN .....................................................................................1

1.1 Latar Belakang ...........................................................................................1

1.2 Perumusan Masalah ...................................................................................2

1.3 Tujuan Penelitian .......................................................................................3

1.4 Manfaat Penelitian .....................................................................................3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................4

2.1 Kapang Endofit ..........................................................................................4

2.1.1 Definisi Kapang Endofit ................................................................4

2.1.2 Kultur dan Karakterisasi Kapang Endofit .....................................4

2.1.3 Potensi Kapang Endofit .................................................................5

2.2 Lumut Hati (Marchantia emarginata) ......................................................6

2.2.1 Klasifikiasi .....................................................................................6

2.2.2 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologi ......................................6

2.3 Antioksidan ...............................................................................................7

2.3.1 Definisi Antioksidan ......................................................................7

xii


2.3.2 Uji Aktivitas dengan Metode DPPH .............................................8

2.4 Fermentasi dan Kurva Tumbuh ................................................................9

2.4.1 Fermentasi ....................................................................................9

2.4.2 Kurva Tumbuh ............................................................................11

2.5 Pelarut .....................................................................................................12

2.5.1 Metanol .......................................................................................12

2.5.2 Etil Asetat ....................................................................................13

2.5.3 n-heksan ......................................................................................13

2.6 Ekstraksi .................................................................................................13

2.6.1 Pengertian Ekstraksi ...................................................................13

2.6.2 Metode ekstraksi .........................................................................13

2.7 Kromatografi ..........................................................................................15

2.7.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................15

2.8 Rekristalisasi ..........................................................................................16

2.9 Penentuan Struktur Senyawa Hasil Isolasi .............................................17

2.9.1 FTIR (Fourier Transform Infrared) ...........................................17

2.9.2 Spektroskopi 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ............17

2.10 Spektofotometer UV-vis ........................................................................18

BAB III Metode Penelitian ..............................................................................19

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................19

3.2 Alat dan Bahan .......................................................................................19

3.2.1 Alat .............................................................................................19

3.2.2 Sampel Uji ..................................................................................19

3.2.3 Media Pertumbuhan Kapang Endofit .........................................20

3.2.4 Bahan Kimia ...............................................................................20

3.2.5 Instrumen ....................................................................................20

3.3 Prosedur Penelitian .................................................................................20

3.3.1 Pembuatan Media ........................................................................20

3.3.2 Kultur Kapang Endofit ................................................................21

3.3.3 Karakterisasi Kapang Endofit ......................................................21

3.3.4 Identifikasi Kapang Endofit .........................................................21

3.3.5 Fermentasi dan Kurva Tumbuh ...................................................21

xiii


3.3.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi ..........................................................22

3.3.7 Isolasi dan Pemurnian Senyawa ..................................................23

3.3.8 Uji Aktivitas dengan DPPH ........................................................23

3.3.9 Penentuan Struktur Senyawa Hasil Isolasi ..................................25

BAB IV Hasil dan Pembahasan .......................................................................26

4.1 Hasil Pengamatan Kapang Endofit .........................................................26

4.2 Identifikasi Kapang .................................................................................27

4.3 Kurva Tumbuh ........................................................................................27

4.4 Fermentasi dan Hasil Ekstraksi ...............................................................28

4.5 Uji Antioksidan Menggunakan DPPH ....................................................30

4.5.1 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fermentasi ...........30

4.5.2 Uji Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Senyawa Isolasi ..............33

4.6 Isolasi dan Pemurnian Senyawa .............................................................35

4.7 Identifikasi Struktur Senyawa Hasil Isolasi ...........................................37

4.7.1 FTIR (Fourier Transform Infrared) .........................................37

4.7.2 Spektroskopi 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance) .............38

BAB V Penutup .................................................................................................42

5.1 Kesimpulan .............................................................................................42

5.2 Saran .......................................................................................................42

Daftar Pustaka ..................................................................................................43

Lampiran ..........................................................................................................50

xiv


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Tabel Kekuatan Antioksidan Berdasarkan IC50 ............................9

Tabel 4.1 Sifat Antioksida Berdasarkan Nilai IC50 .......................................33

Tabel 4.2 Hasil Uji Kuantitatif Aktivitas Antioksidan ..................................35

Tabel 4.3 Karakteristik Kristal dari Ekstrak Etil Asetat Isolat MEC-1

(C1EA) ..........................................................................................36

Tabel 4.4 Daftar Bilangan Gelombang dari Berbagai Jenis Ikatan .............37

Tabel 4.5 Data Bilangan Gelombang Spektrum FTIR Senyawa C1EA ......38

Tabel 4.6 Pergeseran Kimia 1H-NMR Pada Senyawa Organik ..................39

Tabel 4.7 Pergeseran Kimia (δH) Senyawa C1EA ......................................39

xv


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ..........................6

Gambar 2.2 Struktur Senyawa Marchantin A ....................................................7

Gambar 4.1 Isolat MEC-1 tampak (a) depan (b) sebalik ................................26

Gambar 4.2 Mikroskopis Isolat MEC-1 (a) perbesaran 10x (b) perbesaran

40x .................................................................................................27

Gambar 4.3 Kurva Pertumbuhan Kapang Selama 21 Hari .............................28

Gambar 4.4 KLT Ekstrak Metanol ..................................................................31

Gambar 4.5 KLT Ekstrak Etil Asetat ...............................................................31

Gambar 4.6 KLT Ekstrak n-Heksan .................................................................32

Gambar 4.7 Reduksi DPPH Oleh Senyawa Aktif Antioksidan ........................32

Gambar 4.8 KLT Senyawa C1EA .....................................................................36

Gambar 4.9 Spektrum FTIR C1EA ...................................................................38

Gambar 4.10 Spektrum 1H-NMR Senyawa C1EA ............................................40

Gambar 4.11 Struktur senyawa isokumarin kapang Colletotrichum sp..............40

xvi


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Bagan Alur Penelitian ...................................................................49

Lampiran 2 Hasil Identifikasi Kapang .............................................................50

Lampiran 3 Hasil Penimbangan Bobot Kering Biomassa ...............................51

Lampiran 4 Hasil Fermentasi Isolat MEC-1 ....................................................53

Lampiran 5 Hasil Ekstrak Fermentasi Isolat MEC-1 ......................................54

Lampiran 6 Panjang Gelombang Maksimal DPPH .........................................55

Lampiran 7 Hasil Uji Antioksidan Kuantitatif Senyawa C1EA ......................56

Lampiran 8 Perhitungan Konsentrasi Hambat 50% (IC50) dan Indeks Aktivitas

Antioksidan Senyawa C1EA ........................................................57

Lampiran 9 Hasil Uji Antioksidan Kuantitatif Vitamin C ..............................58


Antioksidan Vitamin C .................................................................59

Lampiran 11 Spektrum FTIR Seyawa C1EA .....................................................60

Lampiran 12 Spektrum 1H-NMR Senyawa C1EA ............................................61


BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Salah satu jenis lumut hati yang ditemukan di Indonesia adalah

Marchantia emarginata dan sejauh ini sulit menemukan publikasi terkait spesies

lumut hati tersebut. Berdasarkan penelitian sebelumnya oleh Sukandar (2017),

diketahui bahwa isolat kapang dari spesies lumut hati ini memiliki potensi

antioksidan yang cukup baik. Oleh karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut

terkait senyawa aktif antioksidan yang dikandung oleh isolat kapang lumut hati

Marchantia emarginata. Pemanfaatan kapang endofit merupakan alternatif

sumber metabolit yang diambil dari tumbuhan, dikarenakan kendala ketersediaan

hayati yang terbatas dan siklus hidup tumbuhan yang relatif lama (Prihatiningtias,

2007).

Sebagaimana firman Allah SWT dalam surat al-A’raf ayat 56 yang artinya :

“Janganlah kamu membuat kerusakan di muka bumi, sesudah (Allah)

memperbaikinya. Berdoalah kepada-Nya dengan rasa takut (tidak akan

diterima) dan penuh harap (akan dikabulkan). Sesungguhnya, rahmat Allah

sungguh dekat dengan orang-orang yang berbuat baik”.

Dijelaskan di dalam Al-qur’an bahwa Allah menghendaki manusia untuk

berfikir dan mengkaji, serta menemukan sesuatu yang baru dalam

mengembangkan ilmu pengetahuan dengan memanfaatkan hasil alam sebaik

mungkin tanpa mengeksploitasi alam secara berlebihan. Salah satu alternatif

sumber bahan baku adalah dengan memanfaatkan kapang endofit dalam jaringan

tanaman yang dapat menghasilkan senyawa metabolit sekunder sejenis seperti

pada tumbuhan inang (Strobel, 2004).

Hampir seluruh tumbuhan secara umum dan alami berasosiasi dengan satu

atau lebih kapang endofit (Schulz dan Boyle, 2006). Produksi senyawa bioaktif

pada kapang endofit dalam keadaan bebas menggunakan medium sintetis

memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan pada sistem simbiotik.

2


Dalam keadaan bebas lebih mudah menstandarisasi baik media tumbuh maupun

produksi senyawa bioaktif oleh kapang, sekaligus waktu yang dibutuhkan lebih

pendek untuk inkubasi dibandingkan pada sistem simbiotik yang bergantung pada

tumbuhan inang. Diduga bahwa seluruh bagian tumbuhan merupakan habitat bagi

berbagai macam kapang endofit. Hal tersebut sudah dilaporkan oleh Strobel dan

Daisy (2003), bahwa kapang endofit potensial sebagai penghasil metabolit

sekunder.

Berbagai jenis tumbuhan terutama tumbuhan obat dapat digunakan sebagai

sumber isolat kapang endofit. Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa

metabolit sekunder yang berbeda dari tumbuhan inang. Keunikan ini disebabkan

oleh lingkungan mikroorganisme endofit berbeda dengan kapang pada umumnya

sehingga proses adaptasi kapang endofit terhadap lingkunganya seringkali

menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki struktur dan karakter yang

berbeda dibandingkan dengan kapang isolat umum (Nair, dkk.2000)

Berdasarkan penelitian yang sudah dilakukan sebelumnya oleh Sukandar

(2017) diperoleh tiga jenis kapang endofit hasil isolasi dari lumut hati Marchantia

emarginata, yaitu kode MEB-1, MEC-1 ,dan MEC-2 yang memiliki potensi

sebagai senyawa antioksidan setelah difermentasi dengan metode shaker dan diuji

dengan DPPH. Kemudian dipilih salah satu isolat yakni MEC-1 yang diketahui

dari penelitian sebelumnya ekstrak hasil fermentasi dengan metode shaker

berjumlah sedikit. Untuk ekstrak metanol 566 mg, ekstrak etil asetat 126,9 mg,

dan ekstrak n-heksan 526 mg. Pada penelitian ini dipilih metode fermentasi statis

untuk mendapatkan ekstrak dalam jumlah yang lebih banyak, selanjutnya

dilakukan identifikaksi struktur dari senyawa metabolit sekunder.

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan penelitian yang sudah dilakukan sebelumnya, diketahui isolat

kapang endofit dari lumut hati (Marchantia emarginata) memiliki potensi sebagai

antioksidan setelah difermentasi dengan metode shaker dan diuji dengan DPPH.

Hasil ekstraksi yang diperoleh dari fermentasi shaker kurang optimal ,oleh sebab

itu dilakukan penelitian lebih lanjut isolasi metabolit sekunder dari isolat kapang

endofit MEC-1 lumut hati (Marchantia emarginata) dengan menggunakan

3


metode fermentasi statis. Kemudian dilakukan identifikasi struktur dari senyawa

hasil isolasi tersebut.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dilaksanakanya penelitian ini adalah untuk menjawab permasalahan

yang telah disebutkan sebelumnya, sebagai berikut.

1. Isolasi metabolit sekunder dari kapang endofit (MEC-1) lumut hati

(Marchantia emarginata).

2. Identifikasi struktur dari senyawa hasil isolasi

1.4 Manfaat Penelitian

Peneliti berharap dengan dilakukanya penelitian ini, dapat memberi

manfaat di bidang penemuan obat khususnya struktur senyawa obat dari kapang

endofit.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kapang Endofit

2.1.1 Definisi Kapang Endofit

Kapang Endofit adalah mikroorganisme unik yang terdapat dalam

tumbuhan. Kata endofit berasal dari bahasa Yunani, ‘endo’ berarti di dalam dan

‘fit’ (phyte) berarti tumbuhan. Mikroba endofit merupakan mikroorganisme yang

hidup dalam jaringan tanaman baik bersifat netral, menguntungkan maupun

merugikan (Ghimire dan Hyde, 2004; Backman dan Sikora,2008). Istilah endofit

digunakan untuk menunjukan suatu organisme hidup baik bakteri atau kapang

yang berukuran mikroskopis dan sebagian atau keseluruhan hidupnya berada di

dalam jaringan tanman (xylem dan phloem), daun, akar, buah, dan batang (Strobel

dan Daisy, 2003).

Melimpahnya kandungan nutrisi dan mikroorganisme di dalam tanah

mengakibatkan tumbuhnya kapang di dalam jaringan tanaman. Kapang dapat

masuk ke dalam tanaman dengan cara masuknya hifa ke dalam akar melalui

rongga intrasel epidermis sehingga mengakibatkan sel akar berlubang dan terjadi

penetrasi hifa (Handayani, 2011 dalam Rahmahwaty,2012). Kapang endofit yang

berhasil diisolasi dari tanaman inangnya dapat menghasilkan senyawa metabolit

sekunder yang sama dengan yang dihasilkan oleh tanaman aslinya (Radji,2005).

Hal ini dibuktikan oleh penelitian yang dilakukan oleh Germaine dkk

(Agusta,2009), salah satu cara kapang endofit untuk beradaptasi yaitu mengadopsi

beberapa informasi genetika (DNA) dari tanaman inang, seperti kapang endofit

yang berhasil diisolasi dari tumbuhan Taxus yang memiliki kemampuan untuk

memprodukfi Taxol. Kapang endofit dapat diisolasi dari bagian organ tumbuhan

yang masih segar dan telah disteril permukaan.

2.1.2 Kultur dan Karakterisasi Kapang Endofit

Media yang digunakan dalam proses isolasi kapang endofit adalah media

yang kaya nutrisi sehingga memungkinkan mempercepat perkembangan kapang

5


endofit (Agusta, 2009), media yang umum digunakan untuk proses kultur kapang

adalah Potato Dextrose Agar (PDA). Isolat kapang dikultur dalam media PDA

kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3-7 hari dimana pertumbuhan

kapang dapat mulai terlihat di hari ketiga. Isolat dapat diidentifikasi berdasarkan

ciri-ciri makroskopis dan mikroskopisnya (Nasih,2009).

Identifikasi kapang endofit yang dilakukan adalah pengamatan karakter

morfologi kapang. Pengamatan morfologi kapang menggunakan biakan kapang

endofit umur lima hari dari hasil proses kultur. Pengamatan morfologi kapang

meliputi warna dan permukaan koloni, garis-garis radial dari pusat koloni ke arah

tepi koloni, dan lingkaran-lingkaran konsentris. Pengamatan mikroskopis preparat

meliputi bentuk hifa, ada atau tidaknya rhizoid, bentuk sel reproduksi seksual dan

aseksualnya (Gandjar,1999).

Pengamatan morfologi mikroskopis kapang harus menggunakan preparat

yang dibuat terlebih dahulu untuk diamati dengan mikroskop binokuler , dengan

cara Hafsari dan Asterina (2013). Inokulum kapang pada media agar diambil dari

cawan petri menggunakan jarum ose. Potongan media tersebut diletakan diatas

gelas objek steril. Gelas objek ditutup dengan gelas penutup kemudian tekan

secara perlahan. Mengamati morfologi jamur (bentuk hifa, konidia, dan spora)

yang terbentuk dengan menggunakan mikroskop binokuler dengan perbesaran

400x.

2.1.3 Potensi Kapang Endofit

Banyak penelitian telah membuktikan bahwa kapang endofit mempunyai

aktivitas antibiotik dan aktivitas biologis yang luas. Kapang endofit juga sumber

potensial untuk antibiotik-antibiotik yang unik (Nair, dkk.,2000). Keunikan ini

disebabkan oleh habitat mikroorganisme endofit terhadap habitatnya seringkali

menghasilkan metabolit yang mempunyai struktur dan karakter yang berbeda jika

dibandingkan dengan kapang isolat umum.

Ghimire dan Hyde (2004) dalam reviewnya mencatat beberapa fungsi

endofit selain yang tersebut di atas, yaitu: mengurangi infeksi nematoda,

meningkatkan ketahanan tanaman terhadap stress, memproduksi metabolit

sekunder seperti alkaloid, paxilline, lolitrems dan steroid-steroid kelompok

6


tertraenone. Melalui kemajuan bioteknologi, saat ini endofit dimanfaatkan sebagai

sarana produksi antibiotik untuk keperluan obat dan farmasi, biomasa dan biofuel

serta sarana transgenik gengen ketahanan. Zhao dkk., mendaftar sejumlah kapang

endofit yang berpotensi menghasilkan senyawa-senyawa antikanker maupun

antimikroba seperti paclitaxel, podophyllotoxin, camptothecine, vinblastine,

hypericin dan diosgenin secara lengkap sehingga sangat bermanfaat bagi dunia

farmasi dan kedokteran (Novitasari, 2016). Sementara Aly dkk., mencatat sekitar

100 senyawa metabolit dihasilkan oleh endofit yang bermanfaat bagi dunia

farmasi maupun pertanian selama selama kurun 2000-2007, dan meningkat

dengan jumlah yang sama hanya dalam satu tahun (Novitasari, 2016).

2.2 Lumut Hati (Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees)

2.2.1 Klasifikasi

Secara taksonomi, menurut Goffinet & Shaw (2009) Marchantia

emarginata Reinw., Blume & Nees diklasifikasikan sebagai berikut kerajaan:

Plantae, divisi: Marchantiophyta, kelas: Marchantiopsida, ordo: Marchantiales,

famili: Marchantiaceae, genus: Marchantia, spesies: Marchantia emarginata

Reinw., Blume & Nees.

Gambar 2.1 Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

(Sumber : Sukandar, 2017)

2.2.2 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologi

Lumut kaya akan kandungan yang berkhasiat obat dan juga mengandung

flavonoid sebagai kadungan aktif yang bermanfaat melawan berbagai macam

mikroorganisme asing. Lumut berperan sebagai antioksidan karena memiliki

7


aktivitas mengikat radikal bebas karena mengandung senyawa flavonoid, tanin

dan fenol. Diantara berbagai macam lumut, spesies lumut hati memiliki peranan

penting dalam bidang penelitian. Kandungan kimia yang banyak terdapat pada

spesies lumut hati antara lain flavonoid, triterpenoid, dan steroid. Flavonoid terdiri

dari quercetin, luteolin, apigenin, o-glikosida, dan c-glikosida. Lumut diketahui

memiliki aktivitas antibakteri dan anti kanker (Gupta, dkk.,2015).

Spesies Marchantia emarginata mengandung senyawa antara lain

isolepidozen, barbaten, isobazzanen, germacren D, β-elemen, dan γ-cuprenen

(Ludwiczuk,dkk., 2008). Selain itu, Asakawa (2009) menyebutkan Marchantia

emarginata juga mengandung senyawa Marchantin A yang menunjukan aktivitas

antibakteri,antijamur dan memiliki potensi sebagai antioksidan.

Gambar 2.2 Struktur Senyawa Marchantin A (Sumber : Huang, dkk., 2010)

2.3 Antioksidan

2.3.1 Definisi Antioksidan

Antioksidan didefinisikan senyawa yang mampu menunda, memperlambat

atau menghambat terbentuknya reaksi radikal bebas (peroksida) dalam oksidasi

lipid (Pokorny,dkk.,2001 dalam Senja, 2014). Radikal bebas adalah suatu

senyawa atau molekul yang mengandung satu atau lebih elektron yang tidak

berpasangan pada orbital luarnya. Adanya elektron tidak berpasangan

menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara

menyerang dan mengikat elektron yang berada disekitarnya sehingga dapat

memicu timbulnya penyakit (Sunarni, dkk.,2007).

Antioksidan memiliki dua fungsi utama, yakni berfungsi sebagai pendonor

atom hidrogen (fungsi primer) dan memperlambat laju autooksidasi (fungsi

8


sekunder). Mekanisme antioksidan terjadi melalui reaksi inisiasi dan reaksi

propagasi. Reaksi inisiasi merupakan tahap terbentuknya radikal bebas, dan reaksi

propagasi merupakan tahap diubahnya radikal bebas menjadi radikal bebas lain

yang lebih stabil (Gordon,1990; Shebis,dkk.,2013)

2.3.2 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara in vitro dengan

metode DPPH (2,2 difenil-1-pikrilhidrazil). Metode DPPH memberikan informasi

reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan

serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap.

Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang

kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah

elektron yang diambil (Sunarni, dkk.,2007).

Metode DPPH merupakan metode in vitro yang sering dipilih sebagai

metode pengujian aktivitas antioksidan karena sederhana, mudah, cepat, peka dan

memerlukan sedikit sampel. (Sunarni, dkk.,2007). Pertama-tama dibuat variasi

konsentrasi sampel uji dengan pelarut etanol. Kedalam variasi konsentrasi sampel

uji dimasukan 1 mL DPPH 0,25 mM, campuran dikocok hingga homogen dan

didiamkan selama 30 menit. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 515 nm. Selain itu juga dilakukan pengukuran absorbansi terhadap

kontrol negatif yaitu larutan DPPH tanpa penambahan larutan uji, dan Larutan

vitamin c sebagai kontrol positif dengan variasi konsentrasi sama seperti sampel

uji (Senja, dkk.,2014 dengan modifikasi).

Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan I (%) dan diukur menggunakan

rumus sebagai berikut (Huang, dkk., 2010;Komala, dkk.,2015).

I (%) = [1-(A515 sampel/ A515 kontrol)] x 100%

Keterangan :

I (%) = Persen inhibisi untuk menyatakan aktivitas antioksidan.

A515 sampel = Absorbansi sampel pada panjang gelombang 515 nm.

A515 kontrol = Absorbansi kontrol pada panjang gelombang 515 nm.

9


Tabel 2.1 Tabel Kekuatan Antioksidan Berdasarkan IC50

(Sumber : Molyneux,2004)

2.4 Fermentasi dan Kurva Tumbuh

2.4.1 Fermentasi

Menurut Murtini (2011), proses fermentasi berperan terhadap terjadinya

degradasi sebagian senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana

sehingga menjadi lebih larut. Selain itu fermentasi juga mendegradasi senyawa

kimia seperti tanin, polifenol, asam fitat oleh enzim-enzim mikroba. Fermentasi

dapat menghasilkan biomassa, enzim, metabolit baik primer seperti etanol, asam

sitrat, polisakarida, dan vitamin serta meabolit sekunder (Stanbury, 1984 dalam

Sulistyaningrum, 2008). Sebagian besar fungi endofit menghasilkan metabolit

sekunder jika dikultur dan difermentasi, tetapi temperatur, komposisi media dan

intensitas cahaya sangat menentukan jumlah dan komponen yang dihasilkan oleh

fungi endofit (Cai dkk.,2012).

Menurut Kumala (2014), fermentasi dapat dibedakan menjadi dua

berdasarkan jenis media yang digunakan yaitu sebagai berikut.

1. Fermentasi media padat adalah proses fermentasi dengan substrat tidak

larut dan tidak mengandung air bebas, tetapi cukup mengandung air untuk

keperluan mikroorgnisme. Mikroorganisme ditumbuhkan pada permukaan

media padat, sehingga fermentasi jenis ini disebut fermentasi permukaan.

Fermentasi media padat digunakan untuk produksi enzim dan asam

organik yang menggunakan kapang.

2. Fermentasi media cair adalah proses fermentasi dengan substrat yang larut

atau tersuspensi dalam fase cair. Fermentasi media cair disebut fermentasi

Nilai IC50 Sifat Antioksidan

< 50 ppm Sangat Kuat

50-100 ppm Kuat

100-150 ppm Sedang

150-200 ppm Lemah

10


3. kultur terendam. Sebagai inokulum pada fermentasi ini digunakan bakteru,

kapang, dan khamir.

Menurut Kumala (2014), fermentasi dapat dibagi menjadi dua berdasarkan

metodenya yaitu fermentasi metode goyang (agitasi) dan fermentasi metode diam

(statis). Fermentasi metode diam menggunakan labu erlenmeyer atau tabung

reaksi besar sebagai wadah yang didiamkan selama masa inkubasi tanpa

goncangan. Sementara, fermentasi metode goyang menggunakan alat pengocok

rotary yang akan memutar kultur secara perlahan di dalam labu.

Pada metode fermentasi statis, lapisan membran yang terbentuk akan

membantu mikroorganisme memperoleh kadar oksigen yang tinggi pada

permukaan, dan berperan sebagai lapisan pelindung terhadap kekeringan, inhibitor

alami, dan radiasi .Pada mikroorganisme yang menghasilkan selulosa, membran

terbentuk lebih tinggi pada metode statis dari pada metode goyang dimana kadar

oksigen dihasilkan dari aerasi paksa untuk meningkatkan respirasi

mikroorganisme. Karena laju produksi membran selulosa per luas permukaan

kultur statis hampir konstan, laju produksi per volume kultur dapat ditingkatkan

dengan jumlah kultur sesedikit mungkin (D. Klemm,dkk., 2005 dalam Chawla,

dkk., 2009).

Respon mikroorganisme sangat cepat terhadap perubahan lingkungan baik

berupa induksi dan represi sintesis protein dan perubahan morfologi sel.

Parameter-parameter perubahan lingkungan utama yang mempengaruhi proses

fermentasi yaitu (Chao dkk,2000 dalam Chawla dkk, 2009)

1. Suhu

Pengaruh suhu sangat penting terhadap pertumbuhan dan produksi

selulosa. Berdasarkan penelitian umumnya, maksimal suhu produksi selulosa

adalah 28oC dan 30oC.

2. pH

Optimum pH media kultur untuk memproduksi selulosa adalah antara 4.0-

6.0, produksi selulosa menurun pada pH dibawah 4.0. Nilai pH meningkat

selama proses fermentasi akibat dari akumulasi asam glukonik, asam asetik

11


atau asam laktik pada media kultur (broth). Maka dari itu penting untuk

mengatur pH pada rentang yang optimal.

3. Kadar Oksigen

Kadar oksigen pada media kultur sangat penting mempengaruhi produksi

selulosa. Diketahui bahwa kadar oksigen yang tinggi pada medium dapat

meningkatkan asam glukonik ketika glukosa digunakan sebagai sumber

karbon dan hal tersebut dapat menurunkan produksi selulosa. Sementara kadar

oksigen yang rendah mengakibatkan medium tidak dapat menyediakan cukup

oksigen bagi kultur untuk tumbuh dan menghasilkan selulosa.

2.4.2 Kurva Tumbuh

Pertumbuhan adalah pertambahan teratur semua komponen suatu

organisme. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan

mikroorganisme dapat dibedakan menjadi faktor fisik dan faktor kimia termasuk

nutrisi dalam media kultur. Faktor fisik meliputi temperatur, pH, tekanan osmotik,

dan cahaya. Faktor kimia meliputi karbon, oksigen, mikroelemen atau unsur

kelumit (trace element), dan faktor-faktor pertumbuhan organik (Pratiwi, 2008).

Ada empat macam fase pertumbuhan mikroorganisme yaitu (Pratiwi,

2008).

1. Fase lag merupakan fase adaptasi atau fase penyesuaian mikroorganisme

pada lingkungan baru. Ciri fase lag adalah tidak adanya peningkatan

jumlah sel, yang ada hanyalah peningkatan ukuran sel.

2. Fase log (fase eksponensial) merupakan fase di mana mikroorganisme

tumbuh pada kecepatan maksimum, tergantung pada genetika

mikroorganisme, sifta media, dan kondisi pertumbuhan. Sel baru terbentuk

pada laju konstan dan massa yang bertambah secara eksponensial.

3. Fase stasioner merupakan fase di mana pertumbuhan mikroorganisme

berhenti dan terjadi keseimbangan antara jumlah sel yang memebelah

dengan jumlah sel yang mati. Pada fase ini terjadi akumulasi produk

buangan dengan jumlah sel yang mati.

12


4. Fase kematian, pada fase ini jumlah sel yang mati meningkat. Faktor

penyebabnya adalah ketidak tersediaan nutrisi dan akumulasi produk

buangan yang toksik.

2.5 Pelarut

Untuk mendapatkan ekstraksi yang menyeluruh dan mendapatkan

senyawa-senyawa yang mempunyai aktivitas farmakologi, maka pemilihan

pelarut yang digunakan untuk mengekstraksi merupakan faktor yang penting.

Pelarut ideal yang sering digunakan adalah pelarut bersifat polar karena

merupakan pelarut pengekstraksi terbaik untuk hampir semua senyawa dengan

berat molekul rendah. Jenis pelarut pengekstraksi juga mempengaruhi jumlah

senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak, sesuai konsep like dissolve like,

dimana senyawa yang bersifat polar akan larut dalam pelarut polar dan senyawa

yang bersifat non polar akan larut dalam pelarut non polar (Arifianti, dkk., 2014).

2.5.1 Metanol

Metanol merupakan pelarut yang bersifat universal mampu melarutkan

hampir semua senyawa oranik baik yang bersifat polar maupun non polar.

Metanol memiliki titik didih rendah yakni 64,5oC, sehingga memudahkan untuk

dilakukan pemisahan (Tanaya, dkk., 2015).

2.5.2 Etil Asetat

Etil asetat merupakan pelarut yang bersifat semi polar, mampu menarik

senyawa-senyawa semi polar seperti fenol dan terpenoid (Pranoto, dkk.,2012)

2.5.3 n-heksan

n-heksan merupakan senyawa yang bersifat non polar. Dalam keadaan

standar senyawa n-heksan merupakan cairan tak berwarna yang tidak larut dalam

air dan dapat melarutkan senyawa-senyawa bersifat non polar (Munawaroh,

dkk.,2010).

13


2.6 Ekstraksi

2.6.1 Pengertian Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang

sesuai, kemudian pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa

diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Dirjen

POM, 1995). Ekstraksi merupakan salah satu teknik pemisahan kimia untuk

memisahkan atau menarik satu atau lebih komponen atau senyawa-senyawa

(analit) dari suatu sampel dengan menggunakan pelarut tertentu yang sesuai

(Leba, 2017). Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai kesetimbangan antara

konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam sel tanaman. Setelah

proses ekstraksi, pelarut dipisahkan dari sampel dengan penyaringan. Ekstrak

awal sulit dipisahkan melalui teknik pemisahan tunggal untuk mengisolasi

senyawa tunggal. Oleh karena itu, ekstrak awal perlu dipisahkan ke dalam ekstrak

yang memiliki polaritas dan ukuran molekul yang sama.

2.6.2 Metode Ekstraksi

Pemilihan metode ekstraksi tergantung pada sifat bahan dan senyawa yang

akan diisolasi. Sebelum memilih suatu metode, target ekstraksi perlu ditentukan

terlebih dahulu. Ekstraksi padat-cair atau leaching merupakan proses transfer

secara difusi analit dari sampel yang berwujud padat ke dalam pelarutnya.

Ekstraksi dari sampel padatan dapat dilakukan jika analit yang diinginkan dapat

larut dalam pelarut pengekstraksi. Pada ekstraksi ini prinsip pemisahan didasarkan

pada kemampuan atau daya larut analit dalam pelarut tertentu. Dengan demikian

pelarut yang digunakan harus mampu menarik komponen analit dari sampel

secara maksimal. Mekanisme ekstraksi ini dimulai dengan adsopsi pelarut oleh

permukaan sampel, diikuti digusi pelarut ke dalam sampel dan pelarut analit oleh

pelarut (interaksi analit dengan pelarut). Selanjutnya terjadi difusi analit-pelarut

ke permukaan sampel dan desorpsi analit-pelarut dari permukaan sampel kedalam

pelarut. Perpindahan analit-pelarut dari permukaan sampel berlangsung sangat

cepat ketika terjadi kontak antara sampel dengan pelarut. Berdasarkan metode

14


yang digunakan, ekstraksi padat cair dibedakan menjadi maserasi, perkolasi, dan

sokletasi (Leba, 2017).

Metode maserasi dilakukan dengan memasukkan serbuk tanaman dan

pelarut yang sesuai ke dalam wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar.

Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai kesetimbangan antara konsentrasi

senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam sel tanaman. metode maserasi

dapat menghindari rusaknya senyawa-senyawa yang bersifat termolabil

(Mukhriani, 2014). Sementara pada metode perkolasi, serbuk sampel dibasahi

secara perlahan dalam sebuah perkolator (wadah silinder yang dilengkapi dengan

kran pada bagian bawahnya). Kelebihan dari metode ini adalah sampel senantiasa

dialiri oleh pelarut baru. Sedangkan kerugiannya adalah jika sampel dalam

perkolator tidak homogen maka pelarut akan sulit menjangkau seluruh area.

Selain itu, metode ini juga membutuhkan banyak pelarut dan memakan banyak

waktu. Metode sokletasi dilakukan dengan menempatkan serbuk sampel dalam

sarung selulosa (dapat digunakan kertas saring) dalam klonsong yang ditempatkan

di atas labu dan di bawah kondensor. Pelarut yang sesuai dimasukkan ke dalam

labu dan suhu penangas diatur di bawah suhu reflux. Keuntungan dari metode ini

adalah proses ektraksi yang kontinyu, sampel terekstraksi oleh pelarut murni hasil

kondensasi sehingga tidak membutuhkan banyak pelarut dan tidak memakan

banyak waktu. Kerugiannya adalah senyawa yang bersifat termolabil dapat

terdegradasi karena ekstrak yang diperoleh terus-menerus berada pada titik didih

(Mukhriani, 2014).

Ekstraksi cair-cair atau disebut juga ekstraksi pelarut merupakan metode

pemisahan yang didasarkan pada fenomena distribusi atau partisi suatu analit

diantara dua pelarut yang tidak saling campur. Ekstraksi ini dilakukan untuk

mendapatkan suatu senyawa dari campuran berfasa cair dengan pelarut lain yang

berfasa cair. Prinsip dasar dari pemisahan ini adalah perbedaan kelarutan suatu

senyawa dalam dua pelarut yang berbeda. Proses ekstraksi cair-cair melibatkan

ekstraksi analit dari fasa air ke dalam pelarut organik yang bersifat non polar atau

agak polar seperti heksan, metilbenzene atau diklorometan. Pada ekstraksi cair-

cair alat yang digunakam adalah corong pisah. Corong pisah adalah alat yang

digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran antara

15


dua fasa pelarut dengan densitas atau massa jenis yang berbeda yang tidak saling

bercampur (Leba,2017).

2.7 Kromatografi

Kromatografi adalah pemisahan campuran senyawa dalam suatu sampel

berdasarkan perbedaan interaksi sampel dengan fasa diam dan fasa gerak. Fasa

diam dapat berupa padatan atau cairan yang diletakkan pada permukaan fasa

pendukung. Fasa gerak dapat berupa gas atau cairan. Sesuai dengan definisinya

kromatografi dapat digunakan sebagai cara pemisahan namun pada

perkembanganya, teknik ini dapat dipakai sebagai metode analisis baik kualitatif

maupun kuantitatif.

Faktor-faktor yang dapat diambil sebagai pertimbangan untuk menentukan

jenis kromatografi antara lain (Panji,2012).

1. mudah tidaknya teknik ini dilakukan, terutama untuk teknik kromatografi

yang konvensional seperti kromatografi kertas, kolom ,ataupun lapis tipis.

2. Maksud dari pemisahan yang akan dilakukan. Apabila sulit dilakukan

dengan cara konvensional dapat dipertimbangkan untuk menggunakan

instrumen.

3. Bentuk senyawa yang akan dipisahkan.

2.7.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Teknik KLT merupakan suatu cara pemisahan komponen senyawa kimia

di antara dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam (Kartasubrata, 1987). Teknik

tersebut hingga saat ini masih digunakan untuk mengidentifikasi senyawa-

senyawa kimia, karena murah, sederhana, serta dapat menganalisis beberapa

komponen secara serempak (Hernani, 1999).

Teknik standar dalam melaksanakan pemisahan dengan KLT diawali

dengan pembuatan lapisan tipis adsorben pada permukaan plat kaca. Tebal lapisan

bervariasi, bergantung pada analisis yang akan dilakukan (kualitatif atau

kuantitatif). Tebal pelapis umumnya 0,2 mm, sementara pelat preparatif tebalnya

1 hingga 2 mm. Senyawa uji diujikan pada pelat di posisi 1 hingga 2 cm dari

ujung bawah pelat sebagai totolan (spot) atau pita kontinyu (continous band).

16


Pelat kemudian disimpan di dalam wadah berisi pelarut yang telah ditentukan

sehingga pelarut akan bermigrasi dan memisahkan komponen-komponen

campuran senyawa berdasarkan polaritas. Aplikasi KLT sangatlah luas .

Senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap serta terlalu labil untuk

kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT. Selain itu dapat digunakan untuk

memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut (Heinrich, 2012).

2.8 Rekristalisasi

Rekristalisai adalah teknik pemurnian suatu zat padat dari pengotornya

dengan cara mengkristlakan kembali zat tersebut setelah dilarutkan dalam pelarut

yang sesuai. Prinsip dasar dari proses rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan

antara zat yang akan dimurnikan dengan zat pengotornya. Karena konsentrasi total

pengotor umunya lebih kecil dari konsentrasi zat yang dimurnikan, dalam

temperatur rendah zat pengotor akan tetap dalan bentuk larutan sementara zat

yang berkonsentrasi tinggi akan mengendap. Proses rekristalisasi ini berhubungan

dengan reaksi pengendapan. Endapan merupakan zat yang memisah dari suatu

fase padat dan keluar ke dalam larutanya. Endapan terbentuk jika larutan bersifat

terlalu jenuh dengan zat yang bersangkutan (Pinalia,2011).

Menurut Williamson (1999) dalam rekristalisasi ada tujuh langkah yang

dilakukan yaitu: pemilihan pelarut, melarutkan zat terlarut, pnghilangan warna

larutan, pemindahan zat padat, mengkristalkan larutan, menggunakan filtrasi

untuk pencucian kristal, mengeringkan produk.

Faktor utama proses rekristalisasi adalah pemilihan pelarut. Ada beberapa

syarat yang harus diperhatikan dalam pemilihan pelarut sebagai berikut (Pinalia,

2011).

1. partikel zat terlarut tidak larut pada pelarut dingin dan melarut pada

pelarut panas.

2. Titik didih pelarut harus rendah.

3. Titik didih pelarut harus lebih rendah dari titik leleh zat yang akan

dimurnikan agar zat yang dilarutkan tidak terurai saat

pemanasanberlangsung.

4. Pelarut hanya melarutkan zat akan dimurnikan.

17


5. Pelarut tidak bereaksi dengan zat yang dilarutkan.

6. Kelarutan.

2.9 Penentuan Sturktur Senyawa Hasil Isolasi

2.9.1 FTIR (Fourier Transform Infrared)

FTIR berkaitan dengan vibrasi molekul. Energi vibrasi lebih rendah

dibandingkan energi elektronik yang berkaitan dengan spektroskopi UV-Vis.

Sementara, panjang gelombang sinar IR lebih panjang dibandingkan dengan

panjang gelombang sinar UV-Vis. Satu kali pemindaian menggunakan FTIR

membutuhkan waktu 10 menit. Sumber cahaya infra merah memancarkan radiasi

dengan bilangan gelombang 4600-400 cm-1, dibagi menjadi dua berkas dengan

intensitas yang sama menghasilkan suatu pola interferensi (interferogram).

Kemudian transformasi Fourier pada interferogram diubah menjadi suatu plot

serapan berupa spektrum (Williams dan Fleming,2008).

Penyiapan cuplikan sampel berbentuk cair relatif sederhana cukup dengan

diletakkan diantara dua lempeng NaCl dengan konsentrasi 1-5%, sementara untuk

sampel berbentuk padat dapat diletakkan dala kisi KBr pelet . Untuk pembuatan

KBr pelet, cuplikan dicampur dengan KBr pada konsentrasi cuplikn 0,1-2,0 %

berat campuran. Campuran digerus dalam mortar agat dan ditekan sehingga

menghasilkan lempeng yang transparan. Bentuk lempeng yang transparan

menunjukan bahwa tidak ada udara yang terjebak pada lempeng KBr

(Panji,2012).

2.9.2 Spektroskopi 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Resonansi magnetik inti yang dikenal ada dua macam, yaitu Resonansi

Magnet Inti Atom Hidrogen/Proton Magnetic Resonance (H-NMR) dan

Resonansi Magnet Inti Atom Karbon (13C-NMR). Namun sampai saat ini

penggunaan H-NMR jauh lebih luas dibandingkan dengan C-NMR. Aplikasi

NMR antara lain untuk (Panji, 2012)

a. Penentuan struktur senyawa organik,

b. Elusidasi mekanisme reaksi, dan

c. Elusidasi aspek-aspek stereokimia dalam senyawa organik.

18


Umumnya, jumlah sampel yang digunakan untuk pengukuran spektrum 1H

cukup menggunakan 10 mg sampel, biasanya membutuhkan 16 pemindaian

selama satu menit. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang tidak menimbulkan

sinyal pada spektrum NMR. Pelarut yang paling banyak digunakan adalah CDCl3,

tetapi pelarut polar seperti d6-DMSO [(CD3)2SO] dan D2O juga biasa digunakan

untuk senyawa polar (Panji,2012).

Langkah yang dilakukan dalam menginterpretasikan spektrum 1H-NMR

adalah jumlah sinyal menggambarkan seberapa banyak jenis proton yang berada

pada molekul analit. Kedudukan sinyal menggambarkan jenis lingkungan kimia

tempat proton tersebut berada. Intensitas sinyal menggambarkan jumlah dari

proton pada lingkungan kimi tertentu. Pemecahan puncak (splitting)

menggambarkan lingkungan kimia proton lainnya yaitu proton yang berdekatan

(bertetangga) (Silverstein, dkk., 1991).

2.10 Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri UV-Vis adalah ilmu mengenai pengukuran spektrum

serapan suatu senyawa organik terhadap energi cahaya UV (Ultra Violet) dan

tampak. Pengukuran ini dilakukan menggunakan spektrofotometer. Penyerapan

sinar UV dan cahaya tampak akan menghasilkan transisi elektronik pada molekul

senyawa organik. Spektrum cahaya tampak berada pada rentang 400 nm (ungu)

hinga 750 nm (merah), sementara spektrum sinar UV berada pada rentang 200

hingga 400 nm. Berdasarkan panjang gelombang sumber radiasi pada

spektrofotometer UV-Vis terbagi dua yaitu lampu deuterium dan tungstent.

Lampu deuterium menhasilkan sinar 160-500 nm. Lampu tungsten digunakan

pada daerah sinar tampak 350-3500 nm. Intensitas serapan/absorbansi yang diukur

dinyatakan dengan hukum Lamber Beer sebagai berikut (Supratman,2010).

A = Ɛ B C

Keterangan :

A = Serapan/absorbansi,

Ɛ = Absortivitas molar,

B = Tebal kuvet,

C = Konsentrasi komponen.


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada Februari hingga Agustus 2018 di Laboratorium

Mikrobiologi, dan Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Ilmu

Kesehatan (FIKES) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Pada penelitian ini digunakan alat-alat yaitu cawan Petri (Anumbra®),

neraca analitik, spatula, gelas ukur (Pyrex®), labu Erlenmeyer (Pyrex®), beaker

glass (Pyrex®), tabung reaksi (Pyrex®), hotplate (Cimarec®), magnetic stirrer,

sumbat kapas, alumunium foil, karet, plastic sheet, autoklaf (ALP Co., Ltd.),

mikropipet dan tip, corong, labu ukur, pinset, gunting, kertas saring, platic wrap,

ose, sedota steril, kaca obyek, pipet tetes, cover glass, Laminar Air Flow, Cabinet,

bunsen, shaker, mikroskop cahaya, botol, corong pisah, vial, kolom kromatografi,

pipa kapiler, kaca arloji, cawan penguap, pelat KLT, bejana KLT, vaccum rotary

evaporator, dan lampu UV.

3.2.2 Sampel Uji

Sampel uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah kapang hasil isolasi

dari tanaman lumut hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees yaitu

isolat MEC-1 yang diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Tanaman lumut hati

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees tersebut diambil pada tanggal 2

Februari 2017 di jalur menuju Air Terjun Cigamea, Desa Gunungsari, Kecamatan

Pamijahan, Kabupaten Bogor, Provinsi Jawa Barat. Sampel isolat kapang MEC-1

kemudian diidentifikasi di LIPI Cibinong.

20


3.2.3 Media Pertumbuhan Kapang Endofit

Media tumbuh kapang endofit yang digunakan pada penelitian yaitu

Potato Dextrose Agar (PDA) dan PDY broth (Potato Dextrose Broth (PDB),

yeast extract), dan aquadest.

3.2.4 Bahan Kimia

Metanol, etil asetat, n-heksan, aquades, metanol pro analisa, lempeng

KLT, DPPH (2,2 difenil-1-pikrilhidrazil).

3.2.5 Instrumen

Spektrofotometer UV-Vis,FTIR,dan 1H-NMR.

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pembuatan Media

1. Pembuatan Media PDA (Potato Dextrose Agar)

Media PDA dibuat berdasarkan Ramadhan (2011). Ditimbang 39 gram

PDA, ditambahkan 1 liter akuades, dipanaskan di atas hotplate dan diaduk

dengan magnetic stirrer sampai homogen. Setelah itu, disterilisasi menggunakan

autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC. Media dituang ke dalam cawan

sebanyak ±10 mL secara aseptis dan dibiarkan memadat pada suhu ruang. Agar

miring dibuat dengan menuangkan media PDA yang masih cair ke dalam tabung

reaksi lalu dimiringkan hingga memadat pada suhu ruang.

2. Pembuatan Media PDY (Potato Dextrose Yeast)

Media PDY merupakan media PDB (potato dextrose broth) yang

ditambahkan yeast etract. Media PDY dibuat berdasarkan Ramadhan (2011),

dengan ditimbang sebanyak 24 g PDB dan dilarutkan di dalam 1000 ml akuades

menggunakan erlenmeyer kemudian ditambahkan 2 g yeast extract sebagai

sumber nitrogen. Larutan dihomogenisasi menggunakan hot plate dan magnetic

stirer kemudian dituang ke dalam botol besar sebanyak 100 ml. Media PDY lalu

disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama ± 15 menit pada

tekanan 1,5 atm.

21


3.3.2 Kultur Kapang Endofit

Hasil kapang isolat tunggal dari ekstrak tanaman lumut hati Marchantia

emarginata Reinw., Blume & Nees yaitu MEC-1 diambil sedikit hifanya dari

stock culture menggunakan pinset steril lalu diinokulasikan ke media PDA baru

dan diinkubasi selama 7 hari di suhu ruang (Hafsari dan Asterina, 2013). Isolat

yang telah murni dipindahkan ke media PDA lain sebagai working culture dan

media PDA miring sebagai stock culture (Kumala dan Siswanto,2007).

3.3.3 Karakterisasi Kapang Endofit

Untuk mengetahui karakteristik kapang endofit MEC-1 dilakukan

pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan makroskopis

kapang meliputi warna dan permukaan koloni, garis-garis radial dari pusat koloni

ke arah tepi koloni, dan lingkaran-lingkaran konsentris. Pengamatan mikroskopis

preparat meliputi bentuk hifa, ada atau tidaknya rhizoid, bentuk sel reproduksi

seksual dan aseksualnya (Gandjar,1999).

Pengamatan morfologi mikroskopis kapang harus dibuat terlebih dahulu

preparat untuk pengamatan yang menggunakan mikroskop binokuler berdasarkan

Hafsari dan Asterina (2013) dengan modifikasi. Inokulum kapang pada media

agar diambil dari cawan petri menggunakan jarum ose. Potongan media tersebut

diletakan di atas gelas objek steril. Gelas objek ditutup dengan gelas penutup

kemudian tekan secara perlahan. Mengamati morfologi jamur (bentuk hifa,

konidia, dan spora) yang terbentuk dengan menggunakan mikroskop binokuler

dengan perbesaran 10x dan 40x

3.3.4 Identifikasi Kapang Endofit

Untuk mengetahui spesies isolat MEC-1 kapang endofit dari tumbuhan

lumut hati Marchantia emarginata dilakukan identifikasi di Indonesian Culture

Collection (InaCC) LIPI, kawasaan Cibinong Bogor.

3.3.5 Fermentasi dan Kurva Tumbuh

Kapang yang sudah diremajakan selama 7 hari pada media PDA di cawan

petri diambil menggunakan sedotan steril sebanyak 10 cuplikan. Kapang lalu

22


ditumbuhkan secara triplo di dalam media PDY sebanyak 100 ml. Medium berisi

kapang dalam kondisi statis dan diletakkan pada suhu ruang (Zaini, 2012 dalam

Zakiyah, 2015). Proses fermentasi ini berlangsung selama ± 21 hari (Kharismaya,

2010; Bungihan, dkk., 2013 dalam Zakiyah, 2015).

Pengukuran pertumbuhan kapang dilakukan berdasarkan metode Subowo

(2010) dengan modifikasi. Isolat kapang endofit MEC-1 ditumbuhkan pada media

cair PDY. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 21 hari.

Pengukuran bobot biomassa kapang dilakukan setiap 3 hari. Miselia kapang yang

tumbuh di dalam media PDY kemudian disaring dengan menggunakan kertas

saring dan dikeringkan dalam oven selama 24 jam pada suhu 105oC. Bobot kering

miselia ditentukan dengan menghitung selisih bobot antara kertas kering kosong

dengan kertas saring yang berisi miselia.

3.3.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi

Hasil fermentas berupa filtrat (ekstrak air) dan miselium (biomassa)

dipisahkan menggunakan kertas saring. Bagian biomassa kapang dicampur

kembali dengan pelarut metanol (Bungihan, dkk., 2013), campuran dikocok agar

tercampur sempurna. Ekstrak didiamkan selama ± 7 hari kemudian disaring.

Sementara bagian supernatan dipartisi bertingkat menggunakan pelarut dengan

kepolaran yang berbeda. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut

heksan,etil asetat, dan metanol. Hasil fermentasi pertama dilarutkan menggunakan

heksan, hasil kedua menggunakan etil asetat, dan hasil ketiga mengguakan

metanol. Masing-masing ekstraksi dilakukan sebanyak 3 kali dengan

perbandingan pelarut = 1:1 (Kharismaya, 2010 dengan modifikasi).

Seluruh filtrat masing-masing pelarut dipekatkan menggunakan rotary

evaporator. Ektrak dengan heksan dipekatkan pada suhu 68oC, sedangkan hasil

ekstraksi dengan etil asetat dipekatkan pada suhu ≤ 60°C (Winarno,

2006;Bungihan,dkk., 2013). Bobot ekstrak yang diperoleh dari selisih antara

bobot botol berisi ekstrak dan bobot botol kosong (Azhari, 2012).

23


3.3.7 Isolasi dan Pemurnian Senyawa

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Pengujian dengan KLT dilakukan dengan menggunakan plast silikagel 60

GF sebagai fasa diam. Plat silika dibuat dengan panjang 5 cm dan lebar 1 cm dan

diberi batas atas dan bawah 0,5 cm. Dilakukan berbagai komposisi untuk

menentukan eluen yang optimum.

KLT diujikan terhadap ketiga ekstrak yaitu ekstrak metanol, etil asetat dan

n-heksan. Ekstrak yang akan diuji dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (larutan

uji), kemudian ditotolkan pada tanda batas bawah plat KLT menggunakan pipa

kapiler. Setelah totolan kering, dilakukan pengelusian di dalam bejana KLT yang

telah dijenuhkan dan ditutup rapat. Setelah eluen mencapai batas atas, lempeng

dikeluarkan dan dikeringkan. Bercak diamati dengan menggunakan lampu UV

pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.

2. KLT Dua Dimensi

Plat KLT dipotong dengan ukuran 5x5 cm. Kemudia sampel ditotol pada

plat dan dielusi menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetet (4:1). Setelah eluen

mencapai batas atas, plat KLT siputar 90 derajat dan dielusi kembali dengan eluen

yang sama. Kemudian pengamatan bercak pada plat KLT dilakukan pada panjang

gelombang 254 nm dan 366 nm di bawah lampu UV.

3. Rekristalisasi

Hasil ekstrak dimurnikan dengan proses rekristalisasi. Senyawa yang

masih terdapat zat pengotor dilarutkan dengan pelarut yang sesuai kemudian

ditambahkan pelarut lain yang memiliki perbedaan kepolaran. Kemudian

disimpan pada temperatur rendah, kemudian kristal yang terbentuk dipisahkan

dari pengotornya.

3.3.8 Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH

1. Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan

Pengujian aktivitas antioksidan secara kualitatif dilakukan menggunakan

metode Ridho,dkk. (2013) dengan modifikasi. Ekstrak MEC-1 etil asetat hasil

rekristalisasi dilarutkan dalam heksan, kemudian ditotolkan pada plat KLT dengan

24


ukuran 1 x 5 cm dengan jarak elusi 4 cm. Fase gerak yang digunakan untuk

mengelusi yaitu heksan:etil asetat (4:1) sebanyak 5 ml. Bercak yang dihasilkan

ditandai pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. Kemudian disemprotkan

larutan DPPH 0,2% pada plat KLT dan dibiarkan selama 30 menit terhindar

kontak langsung dengan cahaya. Daya antioksidan ditandai dengan berkurangnya

intensitas warna ungu dari larutan DPPH.

2. Uji Kuantitatif Antioksidan

Uji kuantitatif antioksidan dengan metode berdasarkan Komala,dkk (2015)

terhadap isolat senyawa aktif antioksidan dari ekstrak etil asetat kapang MEC-1.

Pengukuran absorbansi menggunakan spektosfotometer UV-vis dengan kuvet 1x1

dan tinggi 5 cm. Sampel terlebih dahulu dibuat variasi konsentrasi (100 ppm; 50

ppm; 25 ppm; 12,5 ppm; 6,25 ppm) di dalam 4 mL metanol kemudian di

tambahkan reagen DPPH 0,25 mM (sebanyak 4,9 mg DPPH dilarutkan ke dalam

50 mL metanol). Campuran sampel yang dibuat dikocok kuat-kuat dan disimpan

dalam kondisi gelap selama 30 menit. Kemudian dibuat kontrol postif

menggunakan vitamin C dengan perlakuan yang sama seperti sampel. Selanjutnya

sampel dan kontrol positif diukur serapanya dengan spektrofotometri UV-vis

dengan panjang gelombang maksimum DPPH yang ditentukan dari blanko.

Blanko dibuat dengan memipet 1 mL larutan DPPH 0,25 mM dan dicukupkan

volumenya sampai 5 mL dengan metanol pro analisa dalam labu terukur. Larutan

kemudian dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit, selanjutnya serapan

diukur dengan spektrofotometri UV-vis untuk menentukan panjang gelombang

maksimum DPPH.

Aktivitas antioksidan dihitung dengan menggunakan persamaan berikut

(Huang, dkk., 2010; Komala, dkk., 2015).

I (%) =[1-(A sampel/ A blanko)] x 100%

Keterangan :

I (%) = Persen inhibisi untuk menyatakan ktivitas antioksidan

A sampel = Absorbansi sampel pada panjang gelombang maksimum DPPH

A blanko = Absorbansi blanko pada panjang gelombang maksimum DPPH

25


IC50 (Inhibition Concentration) atau EC50 (Efficient Concentration) adalah

konsentrasi senyawa yang mampu menangkap 50% radikal DPPH. Nilai IC50

dihitung menggunakan kurva kalibrasi linear dengan memplotkan konsentrasi

sampel berbanding dengan efek antioksidan. Kemudian dihitung Indeks Aktivitas

Antioksidan (Antioxidant Activity Index/AAI) dengan menggunakan rumus

sebagai berikut (Komala, dkk.,2015)

AAI = konsentrasi DPPH akhir (μg/ml) : IC50 (μg/ml)

3.3.9 Penentuan Sturktur Senyawa Hasil Isolasi

1. FTIR (Fourier Transform Infrared)

Senyawa hasil isolasi dianalisis presipitan dengan FTIR pada bilangan

gelombang 400-4000 cm-1. Hasil spektrum yang diperoleh kemudian digunakan

untuk menentukan gugus fungsi yang terdapat pada senyawa hasil isolasi

(Azhari,2012).

2. Spektroskopi 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Senyawa isolat yang telah didapatkan kemudian diidentifikasi struktur

molekul dengan menggunakan instrumen yaitu 1H-NMR (Proton Nuclear

Magnetic Resonance) dengan sistem konsol D22, yang beroperasi pada frekuensi

500 MHz (1H) dan 125 MHz (13C). Analisis sampel dilakukan di Laboratorium

Spektroskopi Massa dan NMR Institut Teknologi Bandung. Hasil spektrum yang

diperoleh digunakan untuk menentukan stuktur senyawa hasil isolasi.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan Kapang Endofit

Secara makroskopis isolat MEC-1 memiliki permukaan koloni berwarna

hijau kecoklatan dengan tepi tidak rata berwarna putih. Warna koloni sebalik

kehijauan di bagian pusat dan dikelilingi warna putih gading, krem dibagian tepi.

Koloni memiliki lingkaran konsentris. Terdapat garis radial dari pusat koloni ke

tepi koloni. Tekstur permukaan berbutir-butir (granular) hitam, tipis,dan licin.

Diameter rata-rata kapang MEC-1 pada hari ke tujuh adalah 5,6 cm. Secara

mikroskopis, isolat MEC-1 memiliki hifa hialin hijau, bercabang, dan terdapat

konidia berbentuk lonjong (mikrokonidia). Karakteristik ini sesuai dengan

penelitian sebelumnya oleh Sukandar (2017), sehingga dapat disimpulkan bahwa

kapang yang dikultur adalah sama dengan isolat kode MEC-1 awal.

(a) (b)

Gambar 4.1 Isolat MEC-1 tampak (a) depan dan (b) sebalik

27


3

1 2

(a) (b)

Keterangan : (1) Hifa bercabang, (2) konidia lonjong, dan (3) septat pada hifa.

Gambar 4.2 Mikroskopis Isolat MEC-1 (a) Perbesaran 10x dan (b) Perbesaran

40x

4.2 Identifikasi Kapang

Hasil identifikasi dari Indonesian Culture Collection (InaCC) LIPI

menunjukan spesies isolat MEC-1 adalah Colletotrichum truncatum dapat dilihat

pada Lampiran 2. Colletotrichum merupakan genus kapang yang bersimbiosis

dengan tanaman sebagai endofit atau fitopatogen (Widowati,dkk.,2016).

Tianpanich, dkk., melaporkan telah mengisolasi dan mengidentifikasi 5 senyawa

turunan isocoumarins dan phtalide baru dari kapang endofit Colletotrichum sp.

yang menunjukan aktivitas antioksidan,sitotoksik, dan radikal bebas. Phtalide

alami dapat ditemukan pada tumbuhan dan kapang serta mempunyai aktivitas

biologis dengan spektrum yang luas (Widowati,dkk.,2016).

Pawle dan Singh (2014) menyatakan bahwa ekstrak etil asetat dari

Colletotrichum sp. memiliki aktivitas antioksidan karena mengandung senyawa

fenolik dan flavonoid yang menunjukan aktivitas yang baik melawan radikal

DPPH (1,1-diphenyl-2picryl-hydrazyl) dan ABTS (2,2’-azino-bis(3-

ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)).

4.3 Kurva Tumbuh

Kurva tumbuh dibuat untuk mengetahui waktu fermentasi statis yang

optimal dimana pertumbuhan kapang sudah masuk dalam fasa stasioner. Kapang

difermentasi statis dengan perbandingan 50 mL media PDY dalam wadah 250 mL

28


dan ditanam sebanyak 5 cuplikan. Kapang difermentasi selama 21 hari dengan

penimbangan bobot kering dilakukan setiap tiga hari, dimana biomassa kapang di

keringkan pada oven suhu 105oC selama 24 jam (Lampiran 3). Pembuatan kurva

tumbuh ini dilakukan berdasarkan metode Subowo (2010) dengan modifikasi.

Kurva tumbuh pada Gambar 4.2 menunjukan hari fermentasi (sumbu x)

dan perolehan bobot kering biomassa (sumbu y). Berdasarkan kurva tersebut

terlihat fase stasioner dimulai dari hari ke-15 hingga hari ke-21 karena

pertumbuhan kapang mulai melambat secara signifikan. Pentingnya diketahui fase

stasioner karena pada fase ini sumber energi berkurang dan mikroorganisme

menghasilkan senyawa metabolit sekunder. Fase ini ditandai dengan pertumbuhan

mikroorganisme yang terhenti dan terjadi keseimbangan antara jumlah sel yang

membelah dengan jumlah sel yang mati (Pratiwi, 2008).

Gambar 4.3 Kurva Pertumbuhan Kapang Selama 21 hari

4.4 Fermentasi dan Hasil Ekstraksi

Fermentasi dilakukan menurut metode Kharismaya (2010) dan Zaini

(2012), diambil sebanyak 10 cuplikan kultur kapang MEC-1 per 100 ml media

PDY (Potato Dextrose Yeast) dalam botol berukuran 500 mL. Berdasarkan kurva

tumbuh yang diperoleh, fermentasi dilakukan dalam kondisi statis selama 21 hari.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 20 25

Bo

bo

t K

erin

g B

iom

assa

(gr

)

Hari

29


Tujuan dilakukan fermentasi adalah untuk menarik senyawa metabolit sekunder

yang aktif sebagai antioksidan dari isolat MEC-1.

Dalam proses fermentasi ini digunakan media fermentasi PDY yang terdiri

dari ekstrak kentang 200 g, dextrose 200 g, dan yeast extract 2 g. Medium PDY

mengandung sumber karbon yang berasal dari kentang dan dextrose, serta sumber

nitrogen berasal dari ekstak khamir. Sel-sel mikroba sebagian besar terdiri dari

karbon dan nitrogen,sehingga kedua senyawa tersebut merupakan komponen

terpenting yang harus terdapat dalam media pertumbuhan (Kusumaningtyas,

dkk.,2010 dalam Maryanti,2015).

Media PDY termasuk dalam kategori medium fermentasi cair yang

memiliki beberapa keunggulan yaitu, memberikan kondisi optimum untuk

pertumbuhan, jenis dan konsentrasi komponen-komponen medium dapat diatur

sesuai keinginan, dan pemakain medium lebih efisien (Ansori, 1992 dalam

Sulistyaningrum, 2008). Medium ini dipilih agar produksi biomassa dan senyawa

bioaktif menjadi lebih optimal.

Metode fermentasi yang digunakan adalah metode statis. Berdasarkan

Azhari (2014) metode statis menghasilkan senyawa yang jauh lebih banyak

dibandingkan dengan metode dinamis (shaker). Pada fermentasi statis dengan

menggunakan medium cair, miselium terlihat sebagai lapisan pada bagian

permukaan medium yang semakin hari semakin tebal. Hifa vegetatif tumbuh ke

dalam medium seperti akar–akar yang bercabang. Seiring pertumbuhan kapang

akan tampak perbedaan pada medium berupa perubahan warna. Hal ini

menunjukan adanya produksi senyawa bioaktif yang diekskresikan ke dalam

medium pertumbuhan (Gandjar, dkk.,2006).

Isolat MEC-1 menghasilkan miselium seperti kapas berwarna putih pada

permukaan medium. Bentuk seperti kapas ini merupakan spora atau konidia

tunggal yang tumbuh menjadi miselium. Pertumbuhan ini tampak mulai dari hari

ke tujuh yang makin menebal setiap harinya. Seiring dengan pertumbuhan

miselium juga tampak perubahan warna pada medium pertumbuhan, dimana

warna medium berubah semakin jernih dan terdapat semburat warna jingga.

Gambar hasil fermentasi isolat MEC-1 dapat dilihat pada Lampiran 4.

30


Proses ekstraksi ini bertujuan untuk menarik senyawa metabolit sekunder

dari media fermentasi. Hasil fermentasi dipisahkan antara medium dengan

biomassa menggunakan corong Buchner. Berdasarkan Kumala (2014), ekstrak

heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol diperoleh dari hasil partisi

bertingkat supernatan yang sudah dipekatkan menggunakan vacuum rotary

evaporator. Sementara untuk menarik sisa senyawa dilakukan remaserasi

biomassa yang direndam metanol selama tujuh hari dan dipekatkan dengan

vacuum rotary evaporator. Ekstrak n-heksan yang diperoleh berwarna putih

kecoklatan dengan bobot 360 mg , ekstrak etil asetat yang diperoleh berwarna

jingga kecoklatan dengan bobot 1,62 g, dan ekstrak metanol berwarna coklat

pekat dengan bobot 603,2 mg . Gambar ekstrak yang diperoleh dapat dilihat pada

Lampiran 5.

4.5 Uji Antioksidan Menggunakan DPPH

4.5.1 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fermentasi

Uji pendahuluan secara kualitatif dengan DPPH bertujuan untuk

mengetahui ekstrak yang menunjukan aktivitas antioksidan yang baik terhadap

radikal bebas (DPPH). Pengujian ini dilakukan sesuai metode Ridho, dkk. (2013)

larutan DPPH 0,2% diseprotkan pada ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan

ekstrak metanol yang ditotolkan pada plat KLT dan telah dielusi dengan fase

gerak n-heksan : etil asetat (4:1). Metode uji aktivitas antioksidan dengan DPPH

(2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) dipilih karena metode ini sederhana, cepat, mudah,

dan peka. Secara luas dapat digunakan untuk menguji kemampuan senyawa yang

berperan sebagai pendonor elektron dengan menggunakan bahan dalam jumlah

yang sedikit (Molyneux,2004 dalam Ridho, dkk.,2013).

31


(a) (b) (c)

Gambar 4.4 KLT Ekstrak Metanol

(a) Pada panjang gelombang 254 nm, (b) pada panjang gelombang 365

nm, (c) uji kualitatif antioksidan dengan DPPH

(a) (b) (c)

Gambar 4.5 KLT Ekstrak Etil Asetat



32


(a) (b) (c)

Gambar 4.6 KLT Ekstrak n-Heksan



Berdasarkan gambar di atas ekstrak etil asetat terlihat memiliki aktivitas

antioksidan yang baik. Hal ini sesuai dengan penelitian yang sudah dilakukan

sebelumnya oleh Devi dan Singh (2014), dimana aktivitas antioksidan ditunjukan

oleh ekstrak etil asetat kapang Colletrichum sp. Hasil positif ditandai dengan

adanya bercak kuning pucat atau putih yang dapat dilihat pada plat KLT.

Terbentuknya bercak kuning pucat atau putih dikarenakan pada ekstrak etil asetat

Colletrichum truncatum terdapat senyawa antioksidan yang dapat mendonorkan

atom hidrogen menyebabkan DPPH tereduksi dan terjadi perubahan warna ungu

dari larutan DPPH menjadi kuning atau putih (Prakash,2001 dalam Ridho,

dkk.,2013). Berikut adalah proses DPPH tereduksi oleh senyawa antioksidan.

Gambar 4.7 Reduksi DPPH oleh senyawa antioksidan

(Sumber: Prakash,2001)

33


4.5.2 Uji Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fermentasi

Uji lebih lanjut kekuatan inhibisi senyawa aktif antioksidan kapang MEC-

1 (C1EA) terhadap radikal DPPH dilakukan secara kuantitatif mengacu pada

penelitian Komala, dkk. (2015). Prinsip dari metode pengujian aktivitas

antioksidan secara kuantitatif adalah pengukuran penangkapan radikal bebas

DPPH oleh suatu senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dengan

menggunakan spektrofotometri UV-vis, radikal bebas stabil dicampur dengan

senyawa antioksidan yang memiliki kemampuan mendonorkan hidrogen yang

kemudian akan meredam radikal bebas (Molyneux,2004 dalam Ridho, dkk.,2013).

Hasil dari pengukuran ini untuk menentukan nilai aktivitas peredaman radikal

bebas yang dinyatakan dengan nilai IC50 (Inhibition Concentration) .

Sebelum pengujian disiapkan larutan induk sampel 1000 ppm, dengan

melarutkan 10 mg kristal ekstrak etil asetat MEC-1 (C1EA) dalam 10 mL

metanol pro analisa. Kemudian dibuat variasi konsentrasi 100; 50; 25; 12,5; dan

6,25 µg/mL dengan mengencerkan larutan induk 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; dan

0,0312 mL pada labu ukur 5 mL. Alasan pembuatan variasi konsentrasi

berdasarkan kepada penggolongan antioksidan Molyneux (2004).

Pengujian antioksidan secara kuantitatif menggunakan larutan DPPH 0,25

mM dengan melarutkan 4,9 mg DPPH ke dalam 50 mL metanol pro analisa.

Larutan DPPH uji berkonsentrasi 0,25 mM dipilih berdasarkan Sharma dan Bhat

(2009), diketahui profil absorbansi DPPH yang dilarutkan dalam metanol paling

baik pada rentang konsentrasi 0,01-0,2 mM. Sementara hasil absorbansi terukur

yang diperoleh pada konsentrasi 0,25 mM yakni diantara 0,4-0,9. Jika absorbansi

di bawah 0,4 perbedaan antara sampel dan blanko sulit dibedakan dan jika

absorbansi di atas 0,9 memungkinkan ketidak akuratan (Hartwig, dkk.,2012).

Panjang gelombang maksimum (λmax) diukur menggunakan

spektofotometer UV-vis terhadap blanko. Blanko dibuat dengan melarutkan 1 mL

larutan DPPH 0,25 mM dalam 4 mL metanol pro analisa. Panjang gelombang

yang diperoleh 515,8 nm dengan absorbansi 0,434 seperti pada Lampiran 6. Hal

ini sesuai dengan literatur dimana DPPH memiliki panjang gelombang maksimum

515-520 (Locatelli, dkk.,2009).

34


Larutan uji dibuat dengan mencampur 4 mL larutan sampel dengan 1 mL

larutan DPPH 0,25 mM. Kemudian dikocok hingga homogen dan didiamkan

selama 30 menit dalam ruangan gelap. Pengukuran larutan uji dilakukan setelah

30 menit agar terjadi reaksi antara DPPH sebagai radikal bebas dengan sampel

yang diuji.

Hasil absorbansi rata-rata yang diperoleh tertera pada Tabel 4.2 dengan

perhitungan pada Lampiran 8. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan persen

inhibisi (I%) yang dihitung dengan rumus. Kemudian nilai konsentrasi hambat

50% (IC50) dihitung berdasarkan persamaan regresi dari kurva linier antara

konsentrasi sampel uji dengan persen inhibisi. Nilai IC50 dari senyawa C1EA

adalah 143,17 μg/mL. Dari nilai IC50 yang kemudian dihitung nilai indeks

aktivitas antioksidan (Antioxidant Activity Index/AAI) dengan menggunakan

rumus. Berdasarkan perhitungan nilai AAI senyawa C1EA adalah 0,68. Merujuk

dari Scherer dan Godoy (2009) nilai AAI tersebut termasuk dalam golongan

antioksidan sedang.

Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini adalah vitamin C.

Vitamin C merupakan antioksidan alami yang memiliki 4 gugus hidroksil.

Penggunaan kontrol positif adalah sebagai pembanding untuk mengetahui

seberapa kuat potensi antioksidan senyawa C1EA. Apabila nilai IC50 sampel sama

atau mendekati nilai IC50 kontrol maka dapat disimpulkan bahwa sampel dapat

menjadi alternatif antioksidan yang sangat kuat. Pemilihan vitamin C sebagai

kontrol positif karena vitamin C adalah antioksidan kuat yang bereaksi cepat

dengan radikal bebas DPPH (Ridho, dkk.,2013).

Kontrol positif dibuat dengan variasi konsentrasi 1,2,3,4, dan 5 μg/mL

dengan rata-rata absorbansi terdapat pada Tabel 4.2 dan perhitungan pada

Lampiran 10. Nilai IC50 vitamin C adalah 3,648 μg/mL dengan nilai AAI sebesar

26,864 yang menunjukan aktivitas antioksidan vitamin C yang sangat kuat.

Berdasarkan perbandingan nilai AAI yang diperoleh, sangat tampak bahwa

aktivitas antioksidan senyawa C1EA tidak sekuat aktivitas antioksidan vitamin C.

35


Tabel 4.1 Hasil Uji Kuantitatif Antioksidan

Sampel Konsentrasi Absorbansi

Rata-Rata I (%) IC50 AAI

C1EA

Blanko 0,428 -

143,17

μg/mL 0,68

100 μg/mL 0,275 35,747

50 μg/mL 0,306 28,504

25 μg/mL 0,347 18,925

12,5 μg/mL 0,369 13,785

6,25 μg/mL 0,391 8,644

Vitamin C

Blanko 0,43 -

3,64

μg/mL 26,86

5 μg/mL 0,13 69,767

4 μg/mL 0,2 53,488

3 μg/mL 0,251 41,628

2 μg/mL 0,318 26,046

1 μg/mL 0,37 13,953

Tabel 4.2 Tabel Sifat Antioksidan Berdasarkan Nilai AAI

(Sumber: Scherer dan Godoy, 2009)

4.6 Isolasi dan Pemurnian Senyawa

Isolasi senyawa pada ekstrak etil asetat isolat MEC-1 diawali dengan

melakukan rekristalisasi untuk menghilangkan pengotor dari ekstrak. Hal ini

dikarenakan karakteristik ekstrak yang memadat di suhu rendah dan mencair di

suhu ruang. Rekristalisasi dilakukan dengan mencampur dua pelarut yang tidak

saling melarutkan, yaitu pelarut heksan dan metanol. Dari proses rekristalisasi ini

diperoleh kristal ekstrak etil asetat kapang MEC-1 berwarna putih dengan

karakteristik pada Tabel 4.3.

Nilai AAI Sifat Antioksidan

> 2,0 Sangat Kuat

1,0-2,0 Kuat

0,5-1,0 Sedang

< 0,5 Lemah

36


Kristal yang diperoleh diuji dengan KLT dan hasil KLT menunjukan satu

spot pada panjang gelombang 365 nm. Dari hasil satu spot ini mengindikasikan

bahwa senyawa sudah murni, hal tersebut didukung dengan hasil pengamatan

KLT dua dimensi. KLT dua dimensi merupakan teknik kromatografi dengan elusi

secara dua arah. Hasil KLT dua dimensi menunjukan bercak tunggal dengan nilai

Rf 0,675. Melalui satu kali proses rekristalisasi sudah diperoleh senyawa murni

sehingga tidak diperlukan proses isolasi lebih lanjut.

Tabel 4.3 Krakteristik Kristal dari Ekstrak Etil Asetat Isolat MEC-1 (C1EA)

(a) (b) (c)

Gambar 4.8 KLT Senyawa C1EA

Pada panjang gelombang 254 nm, (b) Pada panjang gelombang 365 nm (c) KLT

dua dimensi

Bentuk Kristal

Warna Putih

Kelarutan

Larut dalam etil asetat dan n-heksan

Bau Berbau khas

Bobot 50,6 mg

Eluen n-heksan etil asetat (4:1)

Rf 0,675

37


4.7 Identifikasi Struktur Senyawa Hasil Isolasi

4.7.1 FTIR (Fourier Transform Infrared)

Identifikasi struktur pertama menggunakan instrumen FTIR (Fourier

Transform Infrared). Identifikasi setiap absorbsi ikatan yang khas dari setiap

gugus fungsi merupakan basis interpretasi spektrum IR seperti pada Tabel 4.4.

Hasil spektrum transmitansi IR sampel diperlihatkan pada Gambar 4.10.

Tabel 4.4 Daftar Bilangan Gelombang dari Berbagai Jenis Ikatan

(Sumber : Dachriyanus,2004)

Hasil spektrum FTIR menunjukan bahwa senyawa C1EA memiliki gugus

pita absorbansi –OH pada bilangan gelombang 3443,28 dan memiliki gugus pita

absorbansi ikatan C rangkap pada bilangan gelombang 2361,41 dan 1635,34

(Lampiran 11).

Gambar 4.9 Spektrum FTIR Senyawa C1EA

Bilangan Gelombang

(ν, cm-1)

Jenis Ikatan

3750-3000 regang –OH, N-H

3000-2700 regang -CH3, -CH2-, C-H, C-H aldehid

2400-2100 regang -C≡C-, C≡N

1900-1650 regang C=O (asam, aldehid, keton, amida, ester,

anhidrida

1675-1500 regang C=C (aromatik dan alifatik), C=N

1475-1300 C-H bending

1000-650 C=C-H, Ar-H bending

38


Tabel 4.5 Data Bilangan Gelombang Spektrum FTIR Senyawa C1EA

4.7.2 Spektroskopi 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Penentuan struktur dilakukan menggunakan 1H-NMR (Nuclear Magntic

Resonance). Instrumen ini dapat memberikan informasi berupa nilai pergeseran

kimia dari proton dalam suatu struktur molekul. Nilai pergeseran kimia yang

diperoleh mencirikan bagian dari struktur molekul dapat membantu

mengidentifikasi tiap gugus suatu senyawa. Analisis 1H-NMR menggunakan

pelarut CDCl3, sistem konsol DD2, beroperasi pada frekuensi 500 MHz (1H) dan

125 MHz (13C).

Tabel 4.6 Pergeseran Kimia 1H-NMR Pada Senyawa Organik

(Sumber : Field, dkk.,2007)

Proton –OH pada alkohol, fenol atau asam karboksiat, proton –SH pada tiol, proton –NH pada

amina dan amida tidak memiliki range pergeseran kimia tetap

Senyawa C1EA yang dianalisis dengan spektroskopi 1H-NMR

menunjukan spektrum seperti pada Lampiran 12. Hasil analisis mengindikasikan

bahwa senyawa C1EA memiliki 1 metil (CH3) pada δH 0,90 (t,3H,CH3); metilen

(CH2) pada masing-masing pergeseran kimia 1,27 (s,22H,11CH2) dan pada δH

1,60 (s,8H,4CH2); dan pada δH 4,76 terdapat –OCH3 (s,9H, -OCH3)

Bilangan Gelombang

(v,cm-1)

Jenis Ikatan

3443,28 regang O-H, N-H

2921,63 regang –CH3, -CH2-, C-H, C-H

aldehid

2852,2

1635,34 regang C=C (aromatik dan alifatik),

C=N

Group δ 1H

(ppm dari TMS)

Trimetilsilen (CH3)4Si 0

Gugus Metil terikat pada atom C terhibridisasi sp3 0.8- 1.2

Gugus Metilen terikat pada atom C terhibridisasi sp3 1.0-1.5

Gugus Metin terikat pada atom C terhibridisasi sp3 1.2-1.8

Proton Asetilen 2-3.5

Proton Oleofinik 5-8

Proton Aromatik dan Heterosiklik 6-9

Proton Aldehid 9-10

39


mengindikasikan nilai pergeseran kimia yang khas dimiliki oleh metabolit dari

endofit.

Gambar 4.10 Spektrum 1H-NMR Senyawa C1EA

Tabel 4.7 Pergeseran Kimia (δH) Senyawa C1EA

No. Pergeseran

Kimia (δH)

Perkiraan

Jumlah H

Perkiraan Gugus

Fungsi

1. 4.765 (s,9H,) 3 OCH3

2. 1.604 (s,8H) 4 CH2 (alifatik)

3. 1.274 (s,22H) 11 CH2 (alifatik)

4. 0.902 (t,3H) CH3

40


Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Tianpanich (2011) berhasil

mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa turunan isocoumarins dan pthalide

baru dari kapang endofit Colletotrichum sp. dimana struktur senyawa tersebut

diperkirakan memiliki kemiripan struktur dengan hasil 1H-NMR senyawa C1EA.

Gambar 4.11 Struktur Senyawa Isokumarin Kapang Colletotrichum sp.

(Sumber : Tianpanich, 2011)

Merujuk pada struktur diatas, perbedaan terdapat pada senyawa C1EA

yang memiliki 3 gugus metoksi dengan kemungkinan berikatan pada gugus

aromatik. Pada spektrum 1H-NMR tidak muncul puncak dengan pergeseran kimia

yang menunjukan adanya gugus aromatik, hal ini dapat terjadi apabila tidak ada

proton aromatik (atom H) yang berikatan dengan gugus tersebut. Selain itu, pada

spektrum hanya tampak nilai pergeseran kimia rantai alifatik. Untuk memperoleh

data yang lebih lengkap terkait struktur senyawa C1EA diperlukan pengujian

lebih lanjut dengan menggunakan instrumen 13C-NMR, NMR dua dimensi, dan

instrumen pendukung lainnya.


BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. Spesies isolat MEC-1 adalah Colletotrichum truncatum. Hasil fermentasi

diperoleh tiga ekstrak masing-masing seberat 360 mg ekstrak n-heksan,

1,62 g ekstrak etil asetat, dan 603,2 mg ekstrak metanol setelah

difermentasi selama 21 hari.

2. Berdasarkan hasil terbaik dari uji kualitatif antioksidan, isolasi dilakukan

terhadap ekstrak etil asetat. Melalui proses rekristalisasi diperoleh

senyawa murni C1EA seberat 50,6 mg dengan hasil uji kuantitatif aktivitas

antioksidan terhadap radikal bebas DPPH yaitu nilai IC50 143,17 µg/mL

dan nilai AAI 0,68 yang termasuk ke dalam antioksidan sedang

(moderate).

3. Analisis 1H-NMR senyawa C1EA tampak nilai pergeseran kimia (δH)

pada 4,765 mengindikasikan pergeseran kimia yang unik dari metabolit

sekunder endofit.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan optimasi proses fermentasi dan ekstraksi kapang

Colletotrichum truncatum.

2. Perlu dilakukan isolasi senyawa metabolit sekunder lainya dari ekstrak

aktif antioksidan kapang Colletotrichum truncatum.

3. Perlu dilakukan analisis lebih lanjut mengenai struktur senyawa C1EA

dengan menggunakan instrumen lain seperti NMR dua dimensi, 13C-NMR

dan instrumen pendukung lainya.


DAFTAR PUSTAKA

Agusta, Andria. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: Penerbit ITB.

Arifianti, L., R.D. Oktarina, dan I. Kusumawati. 2014. Pengaruh Jenis Pelarut

Pengektraksi Terhadap Kadar Sinensetin Dalam Ekstrak Daun

Orthosiphon stamineus Benth. E-Journal Planta Husada Vol.2, No.1.

Asakawa, Y., dkk.2009.”Bryophytes: Bio- and Chemical Diversity , Bioactivity,

and Chemosystematics”.Heterocycles 77 (1): 99-150.

Azhari, A.2012. Aktivitas Sitotoksik dan Apoptosis Sel Khamir Ekstrak Kloro-

form Kapang Endofit Evodia suaveo-lens. Skripsi. Departemen Biokimia.

Fakultas MIPA. IPB. Bogor.

Azhari, Azmi.2014. Aktivitas Sitotoksik Senyawa Metabolit Sekunder Kapang

Endofit Evodia suaveolens Dengan Metode Bslt (Brine Shrimp Lethality

Test).Skripsi. IAIN Syekh Nurjati.Cirebon.

Backman P.A. and R. A. Sikora. 2008. Endophytesan emerging tool for biological

control.Biological Control 46:1-3.

Brand-Williams, W., dkk.. 1995. “Use of a Free Radical Method to Evaluate

Antioxidant Activity”. LWT - Food Science and Technology 28 (1): 25–30.

doi:10.1016/S0023-6438(95)80008-5.

Bungihan, M., Tan, A. M., Takayama, H., Cruz, D. E., & Nonato, G. M. (2013).

A new macrolide isolated from the endophytic fungus Colletotrichum sp.

Philippine Science Letters 6 (1), 57-73.

Cai, M., X. Zhou, J. Lu, W. Fan, J. Zhou, C. Niu, L. Kang, X. Sun, and Y. Zhang.

2012. An integrated control strategy for the fermentation of the marine-

derived fungus Aspergillus glaucus for the production of anti-cancer

polyketides (short commu-nication). J. Marine Biotechno-logy. DOI

10.1007/s10126-012-9435-6.

Chawla, Prashant R., Bajaj, Ihwar B., Survase, Shrikant A., dan Singhal, Rekha

S.2009.Microbial Cellulose: Fermentative Production and Applications.

Food Technol. Biotechnol. 47 (2) 107–124 (2009) ISSN 1330-9862.

Dachriyanus.2014.Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi.

LPTIK Universitas Andalas.ISBN 978-602-60613-5-5.

43


Devi, N. N., dan Singh, M. S.2014.Bioactivity of Endophytic Fungus

Colletotrichum loeosporioides Isolated From Phlogacanthus thyrsiflorus

Nees. International Research Journal of Biological Sciences. ISSN 2278-

3202. Dirjen POM.1995.Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta: Departemen

Kesehatan RI.

Field L D., S., Sternhell.,dan J R Kalman.2007.Organic Structures from Spectra

Fourth Edition.New york: John Wiley and Sons Ltd.

Gandjar, I., R.A. Samson, K. van den Tweel-Vermeulen, A. Oetari, dan I.

Santoso. 1999. Pengenalan kapang tropik umum. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia.

Ghimire S.R. and K. D. Hyde. 2004. Fungal Endophyte. In. A.Varma, L. Abbott,

D.Werner, R.Hampp (Eds.). Plant Surface Microbiology. Springer-Verlag

Berlin Heidelberg. Pp. 281-292.

Goffinet, B., dan Shaw, A. J., ed.. 2009. Bryophyte Biology, 2nd ed.. New York:

Cambridge University Press.

Gordon, M. H.. 1990. The Mechanism of Antioxidants Action in Vitro. Dalam

B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidants. London: Elsevier Applied

Science.

Gupta, Subash Kumar., Sharma, Anand., Moktan, Saurav.2015.A Review of

Some Species of Marchantia With Reference to Distribution,

Characteriztion, and Importance.India : University of North Bengal.

Hafsari, Anggita R., Asterina, Isma.. 2013. “Isolasi Dan Identifikasi Kapang

Endofit dari Tanaman Obat Surian”. Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan

Teknologi UIN Sunang Gunung Djati Bandung. ISSN: 1979-8911.

Hartwig, V. G., dkk.. 2012. “A Novel Procedure to Measure The Antioxidant

Capacity of Yerba Maté Extracts”. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 32

(1): 126-133. ISSN 0101-2061.

Heinrich, M., dkk.2012.Fundamentals of Phamacognosy and Phytotherapy 2nd

Edition.London : Churcill Livingstone.

Hernani. 1999. Teknik identifikasi bahan aktif pada tumbuhan obat. Makalah pada

44


Seminar Pendalaman Materi di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan

Obat, Bogor. 13 hlm.

Huang, W.J., 2010. “Marchantia emarginata subsp. Tosana Induces Apoptosis in

Human MFC-7 Breast Cancer Cells”. Cancer Letters 291 (1). Elsevier

Ireland Ltd: 108-19. Doi: 10.1016/j.canlet.2009.10.006.

Kartasubrata, Y. 1987. Dasar-dasar kromatografi. Makalah pada Kursus Metode

Analisis Instrumental. Pusat Penelitian dan Pengembangan Kimia

Terapan, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bandung. 17 hlm.

Kharismaya, W. (2010). Biotransformasi palmatin oleh jamur endofit dari tum-

buhan akar kuning (Arcangelisa flava L. Merr). [Skripsi]. Departemen

Farma-si. Fakultas Kedokteran dan ilmu Kesehatan. Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah. Jakarta.

Kumala, S.2014. Mikroba Endofit: Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang

Farmasi. Jakarta: ISFI.

Kumala, S., dan Siswanto, E. B.2007.”Isolation and Screening of Endophytic

Microbes from Morinda citrifolia and Their Ability to Produce Anti-

Microbial Substance”.Microbiology Indonesia 1 (3): 3-6. ISSN 1978-

3477.

Komala, I., dkk.. 2015. “Antioxidant and Anti-Inflammatory Activity of The

Indonesian Ferns, Nephrolepis falcata and Pyrrosia lanceolata”

International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 7 (12):

12–15. ISSN- 0975-1491.

Leba, Maria Aloisia Uron.2017.Buku Ajar Ekstraksi dan Real Kromatografi.

Yogyakarta : Penerbit Deepublish.

Locatelli M., Gindro R.,Travaglia F.,Coisson JD.,Rinaldi M.,Arlorio

M.2009.Study of DPPH-Scavenging Activity: Development of a free

software for the correct interpretation of data.Food Chemistry: 114,889-

897.

Ludwiczuk, A.,dkk.2008.”Volatile Components from Selected Mexican,

Ecuadorian, Greek, German and Japanese Liverworts”. Natural Product

Communications 3 (2): 133-140.

Maryanti,Ati.2015.Isolasi dan Karakterisasi kapang Endofit dari Ranting

45


Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa) dan Uji Aktivitasnya Sebagai

Antibakteri.Skripsi.UIN Syarif Hidayatullah: Jakarta.

Molyneux, Philip. 2004. “The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl-

Hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity”. Songklanakarin

Journal of Science and Technology 26 (2): 211–19.

doi:10.1287/isre.6.2.144.

Mukhriani.2014. Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, Dan Identifikasi Senyawa

Aktif. Makassar : Jurnal Kesehatan Volume VII No. 2/2014.

Munawaroh, Safaatul dkk.2010.Ekstraksi Minyak Daun Jeruk Purut (Citrus

hystrix D.C) dengan Pelarut Etanol dan n-Heksan.Semarang: Jurnal

Kompetensi Teknik.

Murtini ES, Radite AG,Sutrisno, A.2011.Karakteristik Kandungan Kimia dan

Daya Cerna Tempe Sorgum Coklat (Sorghum bicolor).J Tecnol Industri

Pangan 22:150-155.

Nair S, Sasirekha N, Appunu C, Bharathkumar, Loganathan, Rameshkumar N,

Sridhar R, Subathra G Prabhavathy VR. 2000. Microbial diversity in

Mangroveecosystem: A Review. Biobytes 3:1-6

Nasih. A. 2009. Isolasi Dan Identifikasi Jamur Endofit Pada Daun Mimba

(Azadirachta Indica A. Juss) Sebagai Penghasil Senyawa Antifungi

Terhadap Jamur Candida albicans Dan Aspergillus niger. [Skripsi].

Malang : Universitas Islam Negri Malang.

Novitasari, Mega R.,dkk.2016.”Analisis GC-MS Senyawa Aktif Antioksidan

Ekstrak Etil Asetat Daun Libo (Ficus variegata Blume)”. Jurnal Sains dan

Kesehatan p-ISSN: 2303-0267, e-ISSN: 2407-6082.

Panji, Tri.2012.Teknik Spektroskopi untuk Elusidasi Struktur Molekul.Yogyakarta:

Graha Ilmu.

Pawle, G. & Singh,S.K.(2014).Antioxidant Potential of Endophytic Fungus

Colletotrichum species isolated from Polygata elongata. International

Journal of Pharma and Bio Sciences.5(3), 313-319.

Pinalia, Anita.2011.Penentuan Metode Rekristalisasi yang Tepat Untuk

Meningkatkan Kemurnian Kristal Amonium Perklorat.Majalah Sains dan

Teknologi Dirgantara Vol. 6 no.20.

46


Pratiwi, Sylvia T.2008.Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Penerbit Erlangga.

Pranoto, EunikaNoviana, dkk.2012.Kajian Aktivitas Bioaktif Ekstrak Teripang P

asir (Holothuria scabra) terhadap Jamur Candida albicans.Semarang:

Jurnal Prikanan, Volume 1, Nomor 2.

Prihatiningtias W. 2007. Prospek mikroba endofit sebagai sumber senyawa

bioaktif. Majalah Obat Tradisional 12(42).

Radji, Maksum.2005.”Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam

Pengembangan Obat Herbal”.Majalah Ilmu Kefarmasian II (3): 113-26.

ISSN : 1693-9883.

Rahmawaty. 2012. Potensi Aspergillus niger dan Penicillium spp. Sebagai

Endosimbion Pelarut Fosfat Pada Akar Serealia. [Skripsi]. Bogor : Institut

Pertanian Bogor.

Ramadhan, M. Gama.2011.”Skrining dan Uji Aktivitas Penghambatan α-

Glukosidase dari Kapang Endofit Daun Johar (Cassia siamea Lamk.)”

Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas

Indonesia, Depok.

Ridho, Ery Al.,Sari, Rafika.,dan Wahdaningsih, Sri.2103.Uji Aktivitas

Antioksidan Ekstrak Metanol Buah Lakum Dengan Metode DPPH (2,2-

DIFENIL-1-PIKRILHIDRAZIL).Universitas Tanjungpura.

Scherer, R. dan Godoy, H. T.. 2009. “Antioxidant Activity Index (AAI) by The 2,2-

Diphenyl-1-Picrylhydrazyl Method”. Food Chemistry 112 (3): 654-658.

Schulz B, Boyle C.2006.The endophytic continuum. Mycol Res 109:661-686.

http://dx.doi.org/10.1017/S095375620500273X.

Senja, R. Y.,Issusilaningtyas, E.,Nugroho, A. K., dan Setyowati, E.

P.2014.Perbandingan Metode Ekstraksi dan Variasi Pelarut Terhadap

Rendemen dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kubis Ungu (Brassica

oleracea). Traditional Medicine Journal, 19(1).

Shebis, Y., dkk.. 2013. “Natural Antioxidants: Function and Sources”. Food and

Nutrition Sciences 4: 643–49. doi:10.4236/fins.2013.46083.

Silverstein, R. M.,Basseler, G. C.,Morril, T. C.1991.Spectrometric Identification

of Organic Compound (5th Edition).New York: John Wiley & Sons Inc.

Strobel, G.2004. Natural Products From Endophytic Microorganism. J. Nat

47


Prod. Vol 67.257-268.

Strobel GA, Daisy B. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their

natural products. Microbiol Mol Biol Rev 67:491502.http://dx.doi.org/

10.1128/MMBR.67.4.491-502.2003.

Subowo, Y.B. 2010. Uji aktivitas enzim selulase dan ligninase dari bebe-rapa

jamur dan potensinya sebagai pendukung pertumbuhan tanaman terong

(Solanum molongena). Berita Biologi, 10(1):1-6.

Sukandar, Puspa Novidianti.2017.Isolasi dan Uji Aktivitas Antioksidan Kapang

Endofit Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees.

Skripsi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah,

Jakarta.

Sulistyaningrum,L. S.2008.”Optimasi Fermentasi Asam Kojat Oleh Galur Mutan

Aspergillus flavus NTGA7A4UVE10”.Skripsi , Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam UI, Depok.

Sunarni, T., Pramono, S., Asmah, R. 2007,Flavonoid antioksidan penangkap

radikal dari daun kepel(Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f.& Th.),

M.F.I., 18 (3) : 111-116.

Supratman, Unang. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik (Metode

Spektroskopi untuk Penentuan Struktur Senyawa Organik). Bandung:

Widya Padjadjaran.

Tanaya, Vivi, dkk.2015. Ekstrak Semi Polar dari Daun Mangga Kasturi

(Mangifera

casturi Kosterm). Malang: Kimia Student Journal, Vol. 1 No.1.

Tianpanich, K.,Prachya, S.,Wiyakrutta, S.,Mahidol, C.,Ruchirawat, S.,&

Kittakoop, P.(2011). Radical Scavenging and Antioxidant Activities of

Isocoumarins and a Phthalide from the Endophytic Fungus Colletotrichum

sp.Journal of Natural Product.74,79-81.

Widowati, Tiwit., Bustanussalam, Sukiman, Harmastini.,dan Simanjuntak,

Partomuan.2016.Isolasi dan Identifikasi Kapang Endofit dari Tanaman

Kunyit (Curcuma longa L.) Sebagai Penghasil Antioksidan.LIPI : Bogor.

Williamson.1999.Macroscale and Microscale Organic Experiments.Houghton

Mifflin Company, USA.

48


Winarno, E. K. (2006). Produksi alkaloid oleh mikroba endofit yang diisolasi dari

batang kina Cinchona ledgeriana Moens dan Cinchona Pubescens Vahl

(Rubiaceae). Jurnal Kimia Indonesia. 1(2), 59-66.

Zaini, N. C., Indrayanto, G., & Sugiyanto, N. E. N. (2012). Produksi antibiotika

baru dari jamur endofit Cladosporium oxysporum dari tumbuhan Aglaia

odorata Lour. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.

Zakiyah, Alfida.,Radiastuti, Nani.,dan Sumarlin La Ode.2015. Aktivitas

Antibakteri Kapang Endofit Dari Tanaman Kina (Cinchona calisaya

Wedd.). Al-Kauniyah Jurnal Biologi Volume 8 Nomor 2.


LAMPIRAN

Lampiran 1 Bagan Alur Penelitian

Isolat Kapang Endofit MEC 1

Kultur Kapang Endofit Kapang MEC 1

Identifikasi Kapang Endofit

Dilakukan di InaCC LIPI Cibinong

Fermentasi dan Kurva Tumbuh Kapang Endofit MEC 1

Ekstraksi Kapang Endofit MEC 1

Ekstrak n-heksan Ekstrak Etil Aseta Ekstrak Metanol

Isolasi dan Pemurnian Senyawa

Penentuan Struktur Senyawa Hasil Isolasi

FTIR dan NMR

Uji DPPH Kualitatif dan Kuantitatif

50


Lampiran 2 Hasil Identifikasi Kapang

51


Lampiran 3 Hasil Penimbangan Bobot Kering Biomassa

Hari Berat Gambar

Ke-0

0,45 gram

Ke-3

0,58 gram

Ke-6

0,67 gram

Ke-9

0,83 gram

52


Ke-12

0,89 gram

Ke-15

0,99 gram

Ke-18

1,02 gram

Ke-21

1,04

53


Lampiran 4 Hasil Fermentasi Isolat MEC-1

Gambar pH Organoleptis

5-6

Medium berwarna kuning jernih

dengan semburat jingga. Miselium

seperti kapas berwarna putih tumbuh

pada permukaan dan mengambang di

dalam medium.

54


Lampiran 5 Hasil Ekstrak Fermentasi Isolat MEC-1

Ekstrak

Fermentasi

Bobot Ekstrak

Fermentasi Gambar Organoleptis

Metanol

603,2 mg

Kental, warna

coklat pekat

Etil Asetat

1,62 gram

Cair, warna jingga

kecoklatan

n-Heksan

360 mg

Padat, warna putih

kecoklatan

55


Lampiran 6 Panjang Gelombang Maksimum DPPH

56


Lampiran 7 Hasil Uji Antioksidan Kuantitatif Senyawa C1EA

Konsentrasi Absorbansi Absorbansi

Rata-Rata I %

Blanko 0,426 0,428 -

0,434

100 μg/mL 0,282 0,275 35,7

0,268

50 μg/mL 0,300 0,306 28,5

0,313

25 μg/mL 0,348 0,347 18,9

0,345

12,5 μg/mL 0,373 0,369 13,8

0,365

6,25 μg/mL 0,397 0,391 8,6

0,386

y = 0,2766x + 10,398R² = 0,9203

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi

Senyawa C1EA

57



Antioksidan senyawa C1EA

IC50 → y = 0,2766x + 10,398

50 = 0,2766x + 10,398

X = 39,602/50

X = 143,174 µg/mL

Konsentrasi DPPH = 4,9 mg/ 50 mL

= 98 µg/mL

AAI = Konsentrasi DPPH/ IC50

= 98 µg/mL/ 143,174 µg/mL

= 0,68

Persamaan regresi linier : y = 0,2766x + 10,398

R2 : 0,9203

58


Lampiran 9 Hasil Uji Antioksidan Kuantitatif Vitamin C

y = 13,907x - 0,7446R² = 0,9974

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi

Vitamin C

Konsentrasi Absorbansi I (%)

Blanko 0,43

5 μg/mL 0,13 69,7

4 μg/mL 0,2 53,5

3 μg/mL 0,251 41,6

2 μg/mL 0,318 26,0

1 μg/mL 0,37 13,9

59



Antioksidan Vitamin C

IC50 → y = 13,907x – 0,7446

50 = 13,907x – 0,7446

X = 50,7446/50

X = 3,648 µg/mL

Konsentrasi DPPH = 4,9 mg/ 50 mL

= 98 µg/mL

AAI = Konsentrasi DPPH/ IC50

= 98 µg/mL/ 3,648 µg/mL

= 26,864

Persamaan regresi linier : y = 13,907x – 0,7446

R2 : 0,9974

60


Lampiran 11 Spektrum FTIR Senyawa C1EA

61


Lampiran 12 Spektrum 1H-NMR Senyawa C1EA

62


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ISOLASI SENYAWA ...

Documents