Návod k použití ve vašem jazyce vyhledejte na Fungitell.com. URČENÉ POUŽITÍ Test Fungitell ® je kolorimetrický test na bázi proenzymu (zymogenu) proteázy pro kvalitativní detekci (1→3)-β-D-glukanu v séru pacientů s příznaky invazivní plísňové infekce, nebo pacientů, kteří jsou k tomuto onemocnění predisponováni na základě svého zdravotního stavu. Sérová koncentrace (1→3)-β-D- glukanu, hlavní složky buněčné stěny různých zdravotně důležitých plísní 1 , se může použít jako pomůcka při diagnóze hluboce usazených mykóz a fungémií 2 . Pozitivní výsledek neindikuje, který rod plísní může způsobovat infekci. Titry (1→3)-β-D-glukanu je třeba používat společně s dalšími diagnostickými postupy, například mikrobiologickou kultivací, histologickým vyšetřením nebo bioptickými vzorky a radiologickým vyšetřením. DŮLEŽITÉ UPOZORNĚNÍ Tyto informace poskytněte lékaři, který si test vyžádal: Některé plísně, např. rod Cryptococcus, který produkuje velmi nízké hladiny (1→3)-β-D-glukanu, nemusí způsobit dostatečně velké zvýšení hladiny (1→3)-β-D-glukanu v séru, aby bylo tímto testem detekováno 3,4 . U infekcí plísněmi řádu mucorales, např. Absidia, Mucor a Rhizopus 1,4 , o kterých není známo, že by produkovaly (1→3)-β-D-glukan, byly také pozorovány nízké titry (1→3)-β-D-glukanu v séru. Dále také kvasinková fáze blastomycetové dermatitidy produkuje málo (1→3)-β-D-glukanu a nemusí být testem detekována 5 . Do hlášení výsledků testu Fungitell ® zahrňte toto prohlášení. SOUHRN A VYSVĚTLENÍ Výskyt plísňových infekcí oportunními patogeny, obzvláště u pacientů se sníženou imunitou, se zvyšuje 6,7,8 . Invazivní plísňová onemocnění, jako oportunní infekce, se často vyskytují u pacientů s hematologickou malignitou a u pacientů s AIDS a jsou příčinou rostoucího počtu nozokomiálních infekcí, obzvláště u příjemců transplantovaných orgánů a dalších pacientů užívajících imunosupresivní terapii 9,10 . Mnohá plísňová onemocnění vznikají vdechováním plísňových spor z půdy, zbytků rostlin, klimatizačních systémů a/nebo exponovaných povrchů. Některé oportunní plísně jsou přítomny v lidské kůži (nebo na jejím povrchu), ve střevech a sliznicích 11,12 . Diagnózy invazivních mykóz a fungémií jsou obvykle založeny na nespecifických diagnostických nebo radiologických technikách. K dostupným diagnostickým metodám nedávno přibyly biologické markery plísňové infekce 2 . Mezi oportunní plísňové patogeny patří Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Acremonium spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Exserohilum rostratum a Pneumocystis jirovecii. Test Fungitell ® detekuje (1→3)-β-D-glukan produkovaný těmito a dalšími organismy 1,8,13,14 . PRINCIP METODY Test Fungitell ® měří (1→3)-β-D-glukan. Test je založen na modifikaci dráhy limulus amebocyt lyzátu (LAL) 15,16,17,18 , obrázek 1. Reagencie Fungitell ® je modifikována tak, aby byla vyloučena její reaktivita s bakteriálním endotoxinem, aby reagovala pouze na (1→3)-β-D-glukan prostřednictvím faktorem G mediované strany dráhy. (1→3)-β-D-glukan aktivuje faktor G, proenzym serinproteázy. Aktivovaný faktor G přeměňuje neaktivní prekurzor koagulačního enzymu na aktivní koagulační enzym, který štěpí para- nitroanilid (pNA) z chromogenického substrátu peptidů Boc-Leu-Gly-Arg-pNA a vytváří chromofor, para- nitroanilin, který je absorbován při 405 nm. Níže popsaný kinetický test Fungitell ® je založen na stanovení rychlosti zvyšování optické hustoty produkované vzorkem. Tato rychlost je interpretována proti standardní křivce k získání odhadu koncentrace (1→3)-β-D-glukanu ve vzorku. MATERIÁLY DODÁVANÉ V SOUPRAVĚ FUNGITELL® Souprava Fungitell ® je určena pro diagnostické použití in vitro. Níže uvedené materiály dodávané s každou soupravou vystačí k testu 110 jamek na dvou mikrotitračních destičkách (55 jamek v každé destičce): 1. Reagencie Fungitell ® , lyofilizovaný LAL specifický pro (1→3)-β-D-glukan (dvě injekční lahvičky) 2. Pyrosol ® , rekonstituční pufr (dvě injekční lahvičky). Další injekční lahvičky rekonstitučního pufru Pyrosol ® (katalogové číslo BC051) je možné koupit zvlášť. 3. Glukanový standard s obsahem (1→3)-β-D-glukanu uvedeným na označení (dvě injekční lahvičky) 4. Voda pro reagencie (RGW) (dvě láhve) 5. Alkalický roztok pro předběžnou úpravu (dvě injekční lahvičky) Žádné z výše uvedených materiálů, s výjimkou standardu, neobsahují interferující úrovně (1→3)-β-D- glukanu. POTŘEBNÉ MATERIÁLY, KTERÉ NEJSOU SOUČÁSTÍ SOUPRAVY Žádné materiály nesmějí obsahovat interferující glukan. Sklo musí být depyrogenované suchým teplem po dobu minimálně 7 hodin při minimální teplotě 235 °C (nebo validovaný ekvivalent), aby bylo považováno za vhodné k použití. 1. Pipetové špičky* (250 μl - kat. č. PPT25, 1 000 μl - kat. č. PPT10) 2. Pipety vhodné k pipetování objemů 5–25 μl a 10–1 000 μl 3. Opakovací pipeta se stříkačkovými špičkami vhodná k pipetování 100 μl 4. Testovací zkumavky* pro přípravku řady glukanových standardů (kalibrační křivka) a pro kombinaci reagencií k přípravě séra. (12 x 75 mm - kat. č. TB240 nebo 13 x 100 mm - kat. č. TB013) 5. Čtečka inkubačních destiček (37 °C) schopná odečítat při 405 nm (pokud možno schopná monitorování dvou vlnových délek při 405 nm a 490 nm) s dynamickým rozsahem minimálně 2,0 jednotky absorbance, ve spojení s vhodným počítačovým softwarem pro kinetické testy. 6. Sterilní bezglukanové skladovaci zkumavky se šroubovacím uzávěrem pro alikvotování vzorků (zkumavky certifikované jako zkumavky neobsahující RNázu, DNázu a pyrogen většinou neobsahují interferující hladiny (1→3)-β-D-glukanu). 7. Parafilm ® 8. 96jamkové destičky Microplates* *Tyto výrobky dodávané společností Associates of Cape Cod, Inc., (ACC) jsou certifikovány jako produkty neobsahující interferující hladiny glukanů Pozor - skleněné piety s vatovou zátkou a špičky mikropipet s flitrem z celulózy jsou potenciálními zdroji kontaminace glukanem. VAROVÁNÍ A UPOZORNĚNÍ Tento výrobek je určen pro DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO. Test Fungitell ® vyžaduje přísnou pozornost technice a testovacímu prostředí. Důkladné vyškolení technika v metodě testu a vyhnutí se kontaminaci prostředí jsou kriticky důležité faktory pro účinnost testu. 1. Některé druhy plísní produkují velmi nízké hladiny (1→3)-β-D-glukanu, které test Fungitell ® obvykle nedetekuje. Patří mezi ně rody Cryptococcus 3,4 a Mucorales, např. Absidia, Mucor a Rhizopus 1,4 . Kromě toho blastomycetová dermatitida ve své kvasinkové formě produkuje nízké hladiny (1→3)-β-D-glukanu, a proto není obvykle testem Fungitell ® detekována 5 . 2. Nikdy nepipetujte žádné materiály ústy. V prostorách, ve kterých se manipuluje se vzorky nebo s reagenciemi soupravy, nekuřte, nejezte ani nepijte. Dodržujte místní bezpečnostní předpisy a předpisy společnosti. 3. Pro provádění testu zajistěte čisté prostředí. Používejte materiály a reagencie certifikované jako materiály a reagencie bez detekovatelných hladin (1→3)-β-D-glukanu na pozadí. Mějte na paměti, že glukan, stejně jako plísňová kontaminace z lidského těla, oděvů, nádob, vody a vzdušných prachových částic, mohou interferovat s testem Fungitell ® . Buněčné materiály, např. gáza, papírové utěrky a papírová lepenka, mohou zvyšovat obsah (1→3)-β-D-glukanu v prostředí, kde se test provádí. 4. Nepoužívejte reagencie po datu exspirace. 5. Zabarvené nebo turbidní vzorky, např. vysoce hemolyzované, lipemické nebo obsahující příliš velké množství bilirubinu, mohou opticky interferovat s testem. Při testování takových vzorků je třeba výsledky testu zkontrolovat z hlediska optické interference a/nebo neobvyklých kinetických vzorů. 6. Při manipulaci s pacientskými vzorky používejte vhodný ochranný oděv a rukavice bez pudru. 7. Sérum pacientů na hemodialýze může obsahovat vysoké hladiny (1→3)-β-D-glukanu, pokud jsou pro dialýzu používány některé celulózové membrány 19,20,38 . Hemolýza s polysulfonovými, triacetát celulózovými membránami nebo s polymethyl metakrylátovými membránami s testem zjevně neinterferuje. 8. Chirurgické gázy a houby mohou uvolňovat vysoké hladiny (1→3)-β-D-glukanu, které mohou přispět k přechodnému pozitivnímu výsledku testu Fungitell ® z důvodu kontaminace, jak bylo pozorováno u pacientů po chirurgickém zákroku 21,22 . 9. Produkty krevní frakcionace, např. nitrožilní imunoglobulin a albumin, mohou také obsahovat zátěž (1→3)-β-D-glukanu, která při injekci nebo infuzi zvýší titry (1→3)-β-D-glukanu v séru na řadu dní 23 . 10. Soupravy s poškozeným obsahem nepoužívejte. 11. Materiály vystavené potenciálně kontaminovaným (patogenní látky obsahujícím) kapalinám je třeba zlikvidovat způsobem odpovídajícím místním předpisům. UCHOVÁVÁNÍ REAGENCIÍ Všechny reagencie uchovávejte v původním obalu, v temnu a při teplotě 2 °C–8 °C. Rekonstituovanou reagencii Fungitell ® uchovávejte při teplotě 2 °C–8 °C a použijte ji do 2 hodin. Alternativně můžete rekonstituovanou reagencii Fungitell ® zmrazit a uchovávat při teplotě -20 °C po dobu dvaceti dnů. Rozmrazte jen jednou a použijte. MANIPULACE SE VZORKY 1. Odběr vzorků: Krevní vzorky pro přípravu séra se mohou odebírat do sterilních zkumavek na přípravu séra nebo do zkumavek pro separaci séra (SST). 2. Uchovávání vzorků: Vzorky séra se mohou před provedením testu dočasně uchovávat při teplotě 2 °C–8 °C, nebo se mohou dlouhodobě skladovat zmražené při teplotě -20 °C nebo nižší. 3. Označování vzorků: Vzorky musí být zřetelně označeny v souladu se schválenou praxí zdravotnického zařízení. POSTUP Poznámka: Nastavení se u různých přístrojů a softwaru může lišit. Obecně platí následující pravidla: Software čtečky destiček nastavte tak, aby data byla shromažďována v režimu v mean. Správná nastavení vyhledejte v příručce k softwaru, aby bylo zajištěno, že vypočtená hodnota se rovná průměrné rychlosti změny optické hustoty pro všechny shromážděné datové body. Interval odečítání detektoru nastavte na minimum povolené softwarem/přístrojem po dobu 40 minut testu. Softwarové nastavení vlnové délky má být 405 nm minus pozadí při 490 nm. Pokud není k dispozici duální odečet vlnové délky, odečtěte test při 405 nm. Inkubační teplotu nastavte na 37 °C. Míchání/protřepání destičky nastavte tak, aby nastalo 5–10 sekund před zahájením odečtu. Vyberte nastavení vytváření křivky lineární/lineární nebo ekvivalent. Odečet by měl začít bez prodlevy. 1. Příprava glukanového standardu dodávaného v soupravě. a. Rozpusťte jednu injekční lahvičku glukanového standardu v objemu RGW uvedeném na injekční lahvičce, aby vznikl roztok v koncentraci 100 pg/ml. Standard rekonstituujte promícháním na třepačce po dobu minimálně 30 sekund při střední až středně vysoké rychlosti (roztok 1). Roztok glukanu je nutno skladovat při teplotě 2 °C–8 °C a použít do 3 dnů. Níže uvedené kroky b - e ukazují příklad postupu vytvoření standardní křivky. b. Připravte standard v koncentraci 50 pg/ml (roztok 2) smícháním 500 μl RGW a 500 μl roztoku 1 v bezglukanové zkumavce (roztok 2). Promíchejte na třepačce alespoň 10 sekund. c. Připravte standard v koncentraci 25 pg/ml (roztok 3) smícháním 500 μl RGW a 500 μl roztoku 2 v bezglukanové zkumavce (roztok 3). Promíchejte na třepačce alespoň 10 sekund. d. Připravte standard v koncentraci 12,5 pg/ml (roztok 4) smícháním 500 μl RGW a 500 μl roztoku 3 v bezglukanové zkumavce (roztok 4). Promíchejte na třepačce alespoň 10 sekund. e. Připravte standard v koncentraci 6,25 pg/ml (roztok 5) smícháním 500 μl RGW a 500 μl roztoku 4 v bezglukanové zkumavce (roztok 5). Promíchejte na třepačce alespoň 10 sekund. 2. Otevřete alkalický roztok pro předběžnou úpravu. Alkalický roztok pro předběžnou úpravu séra přeměňuje trojitě šroubovicové glukany na jednovláknové glukany 17,18 , které jsou v testu reaktivnější. Kromě toho alkalický pH slouží k inaktivaci sérové proteázy a inhibitorů, které mohou interferovat s testem 24 . Injekční lahvičku zlikvidujte (v souladu s laboratorními postupy), pokud nebude použita v dalším testu. Pokud použita bude, přikryjte ji Parafilmem (použijte tu stranu Parafilmu, která byla zakryta papírovou fólií). 3. Do nastavení softwaru zadejte standardní koncentrace, tj. 500, 250, 125, 62,5 a 31 pg/ml. Povšimněte si, že zadané standardní koncentrace jsou pětkrát vyšší než koncentrace připravené v bodě 1 výše. Je to proto, že objem standardu použitého v testu je 25 μl na jamku, což je pětinásobek objemu použitého vzorku séra (viz bod 4.b. níže). V softwaru nastavte uspořádání mikrotitrové destičky, kde budou standardy (St), negativní kontroly (Neg) a 21 neznámých (Uk) testovány v duplikátech, jak je uvedeno dále: Poznámka 1: Je možné použít vnější jamky, pokud bylo prokázáno, že funkce vnějších jamek je srovnatelná s funkcí vnitřních jamek. Poznámka 2: Aby nedošlo k náhodné kontaminaci, po přidání vzorků a reagencií do jamek zakryjte mikrodestičku víkem. Před umístěním desky do čtečky víko sejměte, abyste předešli optické interferenci z kondenzace. Poznámka 3: Ve standardní křivce se nepoužívají negativní kontroly. 4. Přidání séra a reagencie pro předběžnou úpravu. a. Zmražené vzorky séra nechte rozmrazit při pokojové teplotě. Všechny vzorky dobře promíchejte na třepačce - minimálně 30 sekund při střední až středně vysoké rychlosti. b. Přeneste 5 μl vzorku séra do každé z určených jamek (Uk) minimálně v duplikátech. Opakujte u každého vzorku séra. c. Do každé jamky obsahující sérum přidejte 20 μl reagencie pro předběžnou úpravu séra. Ujistěte se, že kapičky séra a reagencie pro předběžnou úpravu jsou ve vzájemném kontaktu. Poznámka: Kroky b a c je možné provést v obráceném pořádku podle preferencí technika. d. Destičkou třeste po dobu 5–10 sekund, aby se obsah dobře promíchal (můžete použít funkci třesení destičkou čtečky), poté inkubujte po dobu 10 minut při 37 °C v inkubační čtečce destiček. 5. Rekonstituce reagencie Fungitell ® . Poznámka: Tento krok lze pohodlně provést v době, kdy probíhá inkubace v rámci předběžné úpravy. Konzistentnost času rekonstituce zvýší reprodukovatelnost, protože reakce testu Fungitell ® začíná po rekonstituci, i když na nízké úrovni. a. Rekonstituujte jednu injekční lahvičku reagencie Fungitell ® přidáním 2,8 ml RGW a poté přidáním 2,8 ml rekonstitučního pufru Pyrosol pomocí pipety o objemu 1 000 μl. Injekční lahvičku zakryjte Parafilmem tou stranou Parafilmu, která byla zakryta papírovou fólií. Injekční lahvičkou jemně zakružte, aby se obsah zcela rozpustil - nemíchejte na třepačce. 6. Přidání negativních kontrol a glukanových standardů. Na konci inkubace v rámci předběžné úpravy séra (krok 3. d) vyjměte destičku ze čtečky inkubačních destiček a do destičky přidejte standardy a negativní kontroly. Doporučený vzor koncentrace standardu: a. Přidejte 25 μl RGW do jamek G2 a G3. b. Přidejte 25 μl roztoku standardu 5 v koncentraci 6,25 pg/ml do jamek F2 a F3. c. Přidejte 25 μl roztoku standardu 4 v koncentraci 12,5 pg/ml do jamek E2 a E3. d. Přidejte 25 μl roztoku standardu 3 v koncentraci 25 pg/ml do jamek D2 a D3. e. Přidejte 25 μl roztoku standardu 2 v koncentraci 50 pg/ml do jamek C2 a C3. f. Přidejte 25 μl roztoku standardu 1 v koncentraci 100 pg/ml do jamek B2 a B3. 7. Přidání reagencie Fungitell ® a proces inkubace destičky. a. Přidejte 100 μl reagencie Fungitell ® do každé jamky (obsahující negativní kontroly, standardy a vzorky) pomocí krokové (opakovací) pipety. b. Destičku zavíčkovanou víkem vložte do čtečky mikrodestiček (ekvilibrované na 37 °C). Poznámka: Víko nechejte sundané, pokud čtečka destiček nemá možnost pozastavení před čtením, a protřepejte po dobu 5 - 10 sekund. Proveďte odečet destičky bez víka při 405 nm minus 490 nm, po dobu 40 minut při teplotě 37 °C. Pokud není k dispozici odpočet pozadí (při 490 nm), odečet při 405 nm je akceptovatelný. Pokud ve čtečce mikrodestiček není k dispozici funkce třesení destičky, můžete použít externí třepačku na mikrodestičky. c. Shromážděte data a analyzujte následovně: Prozkoumejte pole optické hustoty testovaných vzorků a hledejte kinetické vzory odlišující se od hladkého zvyšování srovnatelného se standardy. Zneplatněte pole indikující optickou interferenci (např. jejich kinetické vzory nesledují vzory standardů). Vypočítejte průměrnou rychlost změny optické hustoty (mili- jednotky absorbance za minutu) u všech bodů mezi 0 a 40 minutami (provádí software). Interpolujte koncentrace (1→3)-β-D-glukanu ve vzorcích ze standardní křivky (provádí software). INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Výsledky testu Fungitell ® jsou určeny k použití jako pomůcka při diagnóze invazivní plísňové infekce. Výsledky jsou vyjádřeny v pg/ml séra v rozsahu od nedetekovatelných (<31 pg/ml) po >500 pg/ml a jsou vytištěny softwarem nebo odečteny ze standardní křivky. Přesné hodnoty nad 500 pg/ml vyžadují naředění vzorku RGW a opakované testování. Laboratoř provádějící test musí informovat objednávajícího lékaře, že ne všechny plísňové infekce způsobí zvýšené hladiny (1→3)-β-D-glukanu v séru. Některé plísně, např. rod Cryptococcus 3,4 , produkují velmi nízké hladiny (1→3)-β-D-glukanu. Není známo, že by houby řádu mucorales, např. Absidia, Mucor a Rhizopus, 1,4 produkovaly (1→3)-β-D-glukan. Podobně blastomycetová dermatitida ve své kvasinkové fázi produkuje velice málo (1→3)-β-D-glukanu a pacienti s blastomykózou mají obvykle nedetekovatelné hladiny (1→3)-β-D-glukanu v testu Fungitell ®5 . NEGATIVNÍ VÝSLEDEK Hodnoty (1→3)-β-D-glukanu <60 pg/ml jsou interpretovány jako negativní výsledky. NEROZHODNÝ VÝSLEDEK Hodnoty od 60 do 79 pg/ml označují možnou plísňovou infekci. Doporučuje se další odběr vzorků a testování séra. Časté odběry vzorků a testování zvyšují výtěžnost pro diagnózu. POZITIVNÍ VÝSLEDEK Hodnoty ≥ 80 pg/ml jsou interpretovány jako pozitivní. Pozitivní výsledek znamená, že byl detekován (1→3)-β-D-glukan. Pozitivní výsledek nedefinuje přítomnost onemocnění a je třeba jej použít spolu s dalšími klinickými nálezy k určení diagnózy. KONTROLA KVALITY • Korelační koeficient (r) standardní křivky (lineární vs. lineární) má být ≥ 0,980. • Jamky s 25 μl RGW jsou negativní kontroly. Negativní kontroly mají mít hodnoty skutečné rychlosti optické hustoty (mili-jednotky absorbance za minutu) nižší než 50 % nejnižšího standardu. Pokud tomu tak není, test je třeba opakovat s novými reagenciemi. • Práce s problematickými vzorky. Pokud analytický pracovník zpozoruje neobvyklou kinetiku optické hustoty v testu u vzorku, který je zkalený, zabarvený nebo turbidní (např. vzorky, které jsou silně hemolyzované, lipemické nebo obsahují nadměrné množství bilirubinu), vzorek musí být naředěn RGW a znovu testován. Ředění musí být bráno v úvahu při hlášení výsledků - výsledek je nutno znásobit ředícím faktorem. Typicky se ředící faktor zadává při nastavení softwaru pro vzorek a korekce se aplikuje automaticky. • Je možné provést analýzu kontrolních vzorků na úrovních cut-off a s vysoce pozitivní hladinou pro ověření, že reagencie a test fungují správně. Každý uživatel testu musí zavést program kontroly kvality pro zajištění správného provedení testu v souladu s předpisy platnými pro danou lokalitu. OMEZENÍ TESTU 1. Tkáňové lokace plísňové infekce 10 , zapouzdření a množství (1→3)-β-D-glukanu produkovaného některými plísněmi mohou ovlivnit sérovou koncentraci tohoto analytu. Snížená schopnost některých plísňových infekcí zvyšovat hladinu (1→3)-β-D-glukanu v krevním řečišti může snížit schopnost detekce těchto infekcí. Cryptococcus spp. produkuje nízké hladiny (1→3)-β-D- glukanu 3,4 . Není známo, že by houby řádu mucorales, včetně Absidia spp., Mucor spp. a Rhizopus spp., produkovaly (1→3)-β-D-glukan 1,4 . Blastomycetová dermatitida ve své kvasinkové fázi produkuje málo (1→3)-β-D-glukanu a výsledky testu jsou obvykle negativní 5 . 2. Některé osoby mají zvýšené úrovně (1→3)-β-D-glukanu, které spadají do neurčité zóny. V takových případech se doporučuje další sledování a testování. 3. Četnost testování pacientů závisí na relativním riziku plísňové infekce. U rizikových pacientů se doporučují odběry minimálně dvakrát až třikrát týdně. 4. Pozitivní výsledky byly zjištěny u pacientů na hemodialýze 19,20 , pacientů léčených některými frakcionovanými krevními produkty, např. sérovým albuminem a imunoglobuliny, 25 a u vzorků TEST 29. března 2018 PN001268-cs Rev6 Návod k použití Test na (13)- β-D-Glukan v séru 42 Telefon: +1 (508) 540-3444 Bez poplatku: +1 (888) 395-2221 Fax: +1 (508) 540-8680 Technická podpora: +1 (800) 848-3248 Zákaznické služby: +1 (800) 525-8378 OBRÁZEK 1 Dráha limulus amebocyt lyzátu Endotoxin (lipopolysacharid, LPS) Koagulační enzym (1→3)-β-D-Glukan Aktivovaný faktor C Faktor B Faktor C Aktivovaný faktor B Prekurzor koagulačního enzymu Aktivovaný faktor G Faktor G Boc-Leu-Gly-Arg-pNA (umělý substrát) Boc-Leu-Gly-Arg + pNA Deaktivovaná dráha