-
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2015 – 2016
Tumorcel exosoombiogenese en het actine cytoskelet:
verkenning van de interconnectie gebruikmakend van
cortactine nanobodies
Delphine Devriese
Promotor: Prof. dr. Jan Gettemans
Prof. dr. Els Van Damme
Tutor: Prof. dr. Jan Gettemans
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en
genbiotechnologie
-
De auteur en promotors geven de toelating deze scriptie voor
consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk
ander gebruik valt onder
de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van
resultaten uit deze scriptie.
Gent, juni 2016
De promotors,
Prof. dr. Jan Gettemans Prof. dr. Els Van Damme
De auteur,
Delphine Devriese
-
Woord vooraf Dit voorwoord zou ik willen richten aan alle mensen
die mij bijgestaan hebben en een
steentje bijgedragen hebben om deze thesis tot een goed einde te
brengen. Met dit werk
rond ik mijn opleiding als bio-ingenieur af en door hun hulp kon
ik dit met een goede ervaring
afsluiten.
Ik had graag mijn promotors prof. dr. Jan Gettemans en prof. dr.
Els Van Damme willen
bedanken om mij de kans te geven een stap in het
wetenschappelijk onderzoek te zetten. Zo
kon ik een jaar lang proeven van de onderzoekswereld binnen het
boeiende labo van prof.
dr. Jan Gettemans.
Els Beghein wil ik uitgebreid bedanken voor alle hulp doorheen
het jaar. Ze leerde me de
technieken aan die ik nodig had in het labo en ook daarbuiten
was ze van grote hulp. Ze was
altijd bereid mijn vragen te beantwoorden en problemen op te
lossen. Bovendien stond ze
steeds paraat om de thesis na te lezen en feedback te leveren.
Mede door deze goede
begeleiding kon ik afgelopen jaar als een positieve ervaring
beleven. Daarnaast richt ik ook
een dankwoord aan Isabel, Laurence, Adriaan, Anneleen, Olivier,
Thijs en Tim die me goed
opgevangen hebben in de groep. Ze vormden allen samen een toffe
bende en er heerste
een aangename sfeer. Hiertoe droegen ook mede-thesisstudenten
Jasmien en Lien bij.
Een dankjewel gaat ook uit naar mijn ouders. Ze steunden me niet
alleen dit jaar maar
doorheen elk studiejaar. Mijn zus Joke verdient hier zeker ook
een plaatsje. Bij haar kon ik
steeds terecht en ze nam de moeite om mijn thesis na te lezen.
Als laatste had ik mijn vriend
Toon graag bedankt. Doorheen het jaar heeft hij altijd een
luisterend oor geboden en
klaargestaan voor mij. Hij wist me steeds te motiveren en tot
rust te brengen bij stress
momenten.
Bedankt iedereen!
-
4
Inhoudsopgave Samenvatting
........................................................................................................................
8
Inleiding
.................................................................................................................................
9
1 Literatuurstudie
.............................................................................................................10
1.1 Kanker: globaal overzicht
.......................................................................................10
1.2 Exosomen
..............................................................................................................12
1.2.1 Inleiding
...........................................................................................................12
1.2.2 Endocytotische pathway
..................................................................................12
1.2.3 Intraluminale vesikel-/exosoomvorming
...........................................................13
1.2.3.1 ESCRT-afhankelijk
...................................................................................13
1.2.3.2 ESCRT-onafhankelijk
...............................................................................16
1.2.3.3 Gemengd model
.......................................................................................16
1.2.4 Exosoomsecretie
.............................................................................................17
1.2.5 De rol van exosomen in kanker
.......................................................................18
1.3 Het actinecytoskelet
...............................................................................................19
1.3.1 Algemeen
........................................................................................................19
1.3.1.1
Inleiding....................................................................................................19
1.3.1.2 Actine
.......................................................................................................19
1.3.1.3 Actinebindende proteïnen
........................................................................19
1.3.1.4 Actinerijke protrusies
................................................................................20
1.3.2 Cortactine
........................................................................................................21
1.3.3 Invadopodia
....................................................................................................22
1.3.3.1
Inleiding....................................................................................................22
1.3.3.2 Precursorvorming
.....................................................................................22
1.3.3.3 Actinepolymerisatie
..................................................................................23
1.3.3.4 Rekrutering proteasen
..............................................................................25
1.3.3.5 Verband tussen invadopodia en exosomen
..............................................26
1.4 Nanobodies
............................................................................................................27
2 Materialen en methoden
................................................................................................29
2.1 Verband tussen cortactine en exosomen
................................................................29
2.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies
................................29
2.1.1.1 Celcultuur
.................................................................................................29
2.1.1.2 Antilichamen
............................................................................................29
2.1.1.3 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie
...........................................29
2.1.1.4 Western blot
.............................................................................................30
2.1.1.5 Exosoomkwantificatie via nanoparticle tracking analysis
..........................31
2.1.1.6 Statistische analyse
.................................................................................31
2.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met
shRNA ...............31
2.1.2.1 Celcultuur
.................................................................................................31
2.1.2.2 Transfectie
...............................................................................................31
2.1.2.3 Cellen lyseren en eiwitconcentratie bepalen
.............................................31
2.1.2.4 Antilichamen
............................................................................................32
2.1.2.5 Western blot
.............................................................................................32
2.1.2.6 Immunostaining en fluorescentiemicroscopie
...........................................32
-
5
2.2 Verband tussen invadopodia en exosomen
............................................................33
2.2.1 Celcultuur
........................................................................................................33
2.2.2 Antilichamen
...................................................................................................33
2.2.3 Immunostaining en fluorescentiemicroscopie
..................................................33
2.2.4 Kwantificatie en statistische analyse
...............................................................34
3 Resultaten
.....................................................................................................................35
3.1 Verband tussen cortactine en exosomen
................................................................35
3.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies
................................35
3.1.1.1 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie
...........................................35
3.1.1.2 Western blot ter detectie zuiverheid OptiPrep
densiteitsgradiënt
ultracentrifugatie
........................................................................................................37
3.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met
shRNA ...............38
3.1.2.1 Western blot na cotransfectie
...................................................................38
3.1.2.2 Immunostaining na cotransfectie
..............................................................39
3.1.2.3 Western blot na enkele transfectie
...........................................................40
3.2 Verband tussen invadopodia en exosomen
............................................................42
3.2.1 Nabijheid invadopodia en exosomen na immunostaining
................................42
3.2.1.1 Parentale MDA
cellen...............................................................................42
3.2.1.2 CRN Nb expressie
...................................................................................42
3.2.2 MT1-MMP, invadopodia en exosomen
............................................................45
3.2.2.1 Nabijheid MT1-MMP, invadopodia en exosomen
.....................................45
3.2.2.2 Degradatie assay
.....................................................................................46
3.2.3 Controles
.........................................................................................................46
3.2.3.1 Andere merkers
........................................................................................46
3.2.3.2 CD63 en het Golgi-apparaat
.....................................................................46
3.2.3.3 Immunostaining met secundair antilichaam
..............................................47
3.2.4 Invadopodiavorming op polystyreen
................................................................47
4 Discussie
.......................................................................................................................50
4.1 Verband tussen cortactine en exosomen
................................................................50
4.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies
................................50
4.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met
shRNA ...............52
4.2 Verband tussen invadopodia en exosomen
............................................................54
5 Algemene conclusie
......................................................................................................56
6 Ideeën voor verder onderzoek
.......................................................................................57
Referenties
...........................................................................................................................58
Addendum.........................................................................................(elektronisch
beschikbaar)
-
6
Lijst met afkortingen AAA ATPases associated with diverse
cellular activities
ABP actinebindende proteïnen
ADAM A disintegrin and metalloproteinase
ADF actin-depolymerizing factor
ALIX apoptosis-linked gene 2-interacting protein X
AMSH associated molecule with the SH3 domain of STAM
ARF6 ADP ribosylation factor 6
Arg Abl-related gene
Arp2/3 actin-related protein 2 and 3
CD cluster of differentiation
CH constant domain of heavy chain
CHMP charged multivesicular body protein
CL constant domain of light chain
CIP4 Cdc42 interacting protein 4
CRN cortactine
dox doxycycline
DRF diaphanous-related formin
EAP ELL-associated protein
ECM extracellulaire matrix
EGFR epidermal growth factor receptor
EMT epitheel-mesenchym transitie
Ena/VASP enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein
ER endoplasmatisch reticulum
ESCRT endosomal sorting complex required for transport
EV extracellulaire vesikels
Fab fragment antigen-binding
F-actine filamenteus actine
FC fragment crystallizable
FH2 formin homology 2
FSN fascine
G-actine globulair actine
GAP GTPase activating protein
GEF guanine exchange factors
GLUE GRAM-like ubiquitin-binding motif in EAP45
GSN gelsoline
HB-EGF heparin binding epidermal growth factor
HDAC6 histon deacetylase 6
HPV humaan papillomavirus
HRS hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase
substrate
IARC International Agency for Research on Cancer
ILV intraluminale vesikels
MMP matrix metalloproteïnase
MT1-MMP membrane type 1 matrix metalloproteinase
MV microvesikels
MVB multivesicular body sorting factor
MVE multivesikulair endosoom
-
7
Nb Nanobody
Nck1 non-catalytic region of tyrosine kinase 1
NHE-1 sodium/hydrogen exchanger 1
NTA amino-terminal acidic
N-WASP neuraal WASP
NZF Npl4-type zinc finger
PA fosfatidezuur
PDGFR platelet-derived growth factor receptor
PET positron emissive tomografie
PI fosfatidylinositol
PLD2 fosfolipase D2
PX phox homoloog
RAB RAS-related in brain
Rb retinoblastoma proteïne
RNAi RNA interference
SCAR/WAVE suppressor of cAMP receptor/WASP family verprolin
homologous
SH3 Src homoloog 3
SHIP2 SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase 2
SNARE soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment
protein receptors
STAM signal transducing adaptor molecule
Tspan8 tetraspanine 8
TGF transforming growth factor
TGN trans-Golgi netwerk
TSG101 tumor susceptibility gene 101
TTP trombotische trombocytopenische purpura
USP8/UBPY ubiquitin specific peptidase 8
VAMP vesicle-associated membrane protein
VH variable domain of heavy chain
VHH variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies
VL variable domain of light chain
VPS vacuolar protein sorting
vWF von Willebrand factor
WASH Wiskott-Aldrich syndrome protein and Scar homolog
WASP Wiskott-Aldrich syndrome protein
WHO World Health Organisation
WIP WASP-interacting protein
-
8
Samenvatting Exosomen zijn extracellulaire vesikels die
endosomaal van oorsprong zijn en een grootte
hebben van 30 tot 100 nm. Er wordt hen een functie in
intercellulaire communicatie
toegeschreven. Zo dragen ze in de ontwikkeling van kanker bij
aan de wederzijdse
communicatie tussen de verschillende cellen aanwezig in de tumor
micro-omgeving. De
belangrijkste doodsoorzaak van kanker is metastase. Hierbij zijn
actinerijke protrusies,
invadopodia genaamd, belangrijke mediatoren. Zij zorgen voor de
afbraak van de
extracellulaire matrix (ECM) en het doorbreken van de basale
membranen. Het protease
MT1-MMP speelt hierin een prominente rol. Er werd een mogelijk
verband gesuggereerd
tussen invadopodia en voornoemde exosomen. Exosomen zouden
preferentieel ter hoogte
van invadopodia gesecreteerd worden en zouden actief MT1-MMP
bevatten dat bijdraagt
aan ECM degradatie en afbraak van de basale membranen. Dit
mogelijk verband werd
verder onderzocht waarbij gebruikgemaakt werd van nanobodies
(Nbs). Dit zijn geïsoleerde
antigeenbindende domeinen van Camelidae zware keten
antilichamen. Nbs gericht tegen
functionele domeinen van cortactine (CRN), een essentiële
component in invadopodia-
vorming en –functie, werden hiervoor aangewend.
In een eerste reeks van experimenten werd aangetoond dat
interferentie met het CRN NTA
domein enerzijds en met het CRN SH3 domein anderzijds via Nbs
leidde tot een daling van
het aantal vrijgestelde exosomen. Aangezien CRN essentieel is
voor invadopodia en voor de
gebruikte Nbs reeds bewezen werd dat deze interfereren met
invadopodiavorming en –
functie, versterkte deze waargenomen daling het vermoeden van
een mogelijk verband
tussen invadopodia en exosomen. Later zullen deze resultaten
geverifieerd worden via
RNAi. Hiervoor werden gepaste shRNA-constructen
geselecteerd.
Een CRN effect op het gereduceerd aantal vrijgestelde exosomen,
onafhankelijk van zijn
functie in context van invadopodia, kon door bovenstaande
experimenten niet uitgesloten
worden. Daarom werd het verband ook meer rechtstreeks benaderd.
Er werd aangetoond
dat CD63-positieve exosomen steeds terug te vinden zijn in de
nabijheid van invadopodia.
De twee CRN Nbs leidden tot een toename in het
spreidingsoppervlak van de invadopodia
overheen de cel. Na expressie van deze Nbs werd ook een
spreiding van de CD63-positieve
exosomen waargenomen waarbij deze nog steeds gelegen waren
binnen de invadopodia-
zone. Een extra argument voor het gepostuleerde verband tussen
invadopodia en exosomen
werd zo aangeleverd.
Wat betreft de functionaliteit van de exosomen in context van
invadopodia, werd onderzocht
hoe MT1-MMP zich lokaliseerde t.o.v. invadopodia enerzijds en
CD63-positieve exosomen
anderzijds. In beide gevallen kon colokalisatie waargenomen
worden. Bovendien werd
aangetoond dat exosomen MT1-MMP bevatten en dat dit in staat is
bij te dragen aan ECM
degradatie.
Deze resultaten sterken de hypothese van een mogelijk verband
tussen invadopodia en
exosomen en dienen als basis voor verder onderzoek naar deze
interconnectie.
-
9
Inleiding Kanker is één van de grootste oorzaken van ziekte en
dood wereldwijd. Normale cellen
zullen zich hierbij omvormen tot kankercellen die gekenmerkt
worden door een abnormale,
buitensporige groei. In een tumor zijn naast kankercellen ook
verschillende andere celtypes
aanwezig die bijdragen tot de ontwikkeling van een tumor.
Wederzijdse communicatie tussen
kankercellen en hun tumor micro-omgeving wordt onder andere door
exosomen
bewerkstelligd. Exosomen zijn extracellulaire vesikels met een
grootte van 30 tot 100 nm en
hebben een endosomale oorsprong. Ze worden gevormd als
intraluminale vesikels (ILV’s)
tijdens maturatie van vroege tot late endosomen. De aanwezigheid
van ILV’s zorgt ervoor
dat het late endosoom ook aangeduid wordt als multivesikulair
endosoom (MVE). ILV’s
kunnen enerzijds gevormd worden met behulp van de endosomal
sorting complex required
for transport (ESCRT) complexen. Anderzijds bestaan ook
mechanismen onafhankelijk
hiervan. MVE’s kunnen zich naar het plasmamembraan begeven en
hiermee fusioneren.
Daarbij worden de ILV’s vrijgesteld in het extracellulair milieu
en worden dan exosomen
genoemd.
Na bepaalde tijd zullen kankercellen uit de primaire tumor
breken en zich via het bloed- of
lymfevatenstelsel verspreiden naar andere organen, wat aangeduid
wordt als metastase. Dit
is de belangrijkste doodsoorzaak van kanker. Voor metastase is
afbraak van de basale
membranen en de extracellulaire matrix (ECM) nodig. Dit wordt
bewerkstelligd met behulp
van actinerijke protrusies die gevormd worden door invasieve
kankercellen en aangeduid
worden als invadopodia. Deze bestaan uit een actinekern omgeven
door verschillende
eiwitten die bijdragen tot hun vorming en maturatie, zoals
cortactine, cofiline, N-WASP, het
Arp2/3 complex en Tks5. Gematureerde invadopodia zijn in staat
de ECM af te breken
waarbij het matrix metalloproteïnase MT1-MMP een belangrijke rol
vervult. Reeds
verschillende routes voor het rekruteren van MT1-MMP ter hoogte
van het plasmamembraan
van invadopodia werden beschreven. Recent werd gesuggereerd dat
MT1-MMP-bevattende
exosomen vrijgesteld worden ter hoogte van invadopodia en dat
deze bijdragen tot
invadopodiamaturatie en ECM degradatie.
Nanobodies zijn geïsoleerde antigeenbindende domeinen van
Camelidae zware keten
antilichamen. Hiermee werd de interconnectie tussen deze
actinerijke protrusies en
exosomen verder onderzocht. Twee nanobodies gericht tegen
verschillende functionele
domeinen van cortactine, een cruciale component binnen
invadopodiavorming en –functie,
werden hiervoor aangewend.
-
10
1 Literatuurstudie
1.1 Kanker: globaal overzicht
Kanker behoort tot één van de grootste oorzaken van ziekte en
dood wereldwijd. In 2012
waren er ongeveer 14 miljoen gevallen van kanker bekend en
zorgde deze ziekte nog voor
8,2 miljoen doden [1]. Kanker houdt in dat normale (meestal
epitheliale) cellen zich
omvormen tot kankercellen die gekenmerkt worden door een
abnormale, buitensporige
groei. Dit leidt tot een grote massa aan kankercellen, anders
gezegd een tumor. Deze
abnormale groei kan op elke plaats in het lichaam voorkomen. Een
tumor blijft groeien en zal
naburige weefsels binnendringen. Cellen uit deze tumor zullen
zich na verloop van tijd ook
verspreiden via het bloed- of lymfevatenstelsel naar andere
organen om daar aanleiding te
geven tot een secundaire tumor. Dit laatste wordt metastase
genoemd en is de belangrijkste
doodsoorzaak van kanker. Het type kanker wordt steeds bepaald
aan de hand van waar hij
oorspronkelijk is ontstaan, ongeacht de plaats van deze
secundaire tumoren [1], [2]. De
meest voorkomende kankers in 2012 waren: long- (1,59 miljoen
doden), lever- (745 000
doden), maag- (723 000 doden), darm- (694 000 doden), borst-
(521 000 doden) en
slokdarmkanker (400 000 doden) [1].
Het proces waarbij normale cellen zich omvormen tot
kankercellen, bestaat uit meerdere
stappen. Deze omvorming gebeurt onder invloed van een samenspel
tussen interne
genetische factoren en externe factoren. Bewezen risicofactoren
zijn: UV-straling,
ioniserende straling, asbest, roken, alcohol, bepaalde
chronische infecties, hepatitis, humaan
papillomavirus (HPV), obesitas, onvoldoende beweging en leeftijd
[2]. Voor een volledig
overzicht van mogelijke risicofactoren wordt verwezen naar de
classificatie van de
organisatie International Agency for Research on Cancer (IARC),
de afdeling binnen de
World Health Organisation (WHO) die instaat voor
kankeronderzoek. Hierbij worden
risicofactoren ingedeeld als bewezen carcinogeen, waarschijnlijk
carcinogeen, mogelijks
carcinogeen, waarschijnlijk niet carcinogeen en niet
classificeerbaar [3].
Omvorming van een normale cel tot kankercel gaat gepaard met
genetische veranderingen.
Mutaties zorgen enerzijds voor oncogenen die een dominerende
functie verkrijgen en
anderzijds voor het verlies van functie van tumorsuppressor
genen. Hanahan en Weinberg
beschrijven zes essentiële veranderingen die plaatsvinden bij de
ontwikkeling van kanker.
Een eerste verandering houdt in dat kankercellen minder
afhankelijk worden van
groeisignalen uit hun omgeving door zelf in hun groeisignalen te
voorzien. Enerzijds kunnen
ze zelf groeifactoren aanmaken (autocriene stimulatie) en
anderzijds kunnen ze stromale
cellen aanzetten tot secretie van groeifactoren (paracriene
stimulatie). Een tweede
verandering in kankercellen is de ongevoeligheid voor
antigroeisignalen. Groei in normale
cellen wordt op verschillende manieren geblokkeerd, bijvoorbeeld
via de retinoblastoma
proteïne (Rb)-pathway wat een rol speelt bij de overgang van een
delende cel naar een
rustfase G0 of bij contact-inhibitie. Deze mechanismen zijn op
één of andere manier
verstoord in kankercellen. Een derde verandering zorgt ervoor
dat apoptose of
geprogrammeerde celdood vermeden wordt. Naast apoptose blijken
ook autofagie en
necrose een rol te hebben in de ontwikkeling van een tumor. Een
vierde verandering die
cellen ondergaan is het verkrijgen van het vermogen om oneindig
te vermenigvuldigen. Om
een snelle klonale expansie mogelijk te maken dat leidt tot een
macroscopische tumor, is
angiogenese noodzakelijk. Dit is de vijfde verandering in de
vorming van kanker. Tumoren
activeren een zogenaamde angiogenic switch door het evenwicht te
veranderen tussen
-
11
enerzijds induceerders en anderzijds inhibitoren. Een zesde en
laatste verandering is de
invasie van het omliggende weefsel en uiteindelijk metastase.
Deze laatste verandering
bestaat uit verschillende stappen waarbij er eerst een lokale
invasie plaatsvindt, waarna
intravasatie van de kankercellen in bloed- of lymfevaten
gebeurt. Extravasatie in een nieuw
weefsel zal dan aanleiding geven tot micrometastasen waarbij
kankercellen eerst kleine
nodules vormen. Deze kunnen uitgroeien tot macroscopische
tumoren wat aangeduid wordt
als kolonisatie [4], [5].
Naast deze zes veranderingen worden twee hallmarks gedefinieerd
die voorgaande
veranderingen in staat stellen te ontwikkelen. Enerzijds zal het
genoom instabieler worden
waardoor DNA gevoeliger wordt voor mutaties. Anderzijds kunnen
immuuncellen
tumorigenese promoten via ontstekingsreacties die bijvoorbeeld
groeifactoren en andere
moleculen aanleveren. Twee bijkomende veranderingen sinds de
eerste review van
Hanahan en Weinberg worden ook als essentieel gezien. De eerste
houdt een verandering
van het energiemetabolisme in, waarbij kankercellen hun
energieproductie grotendeels
beperken tot glycolyse, zelfs in de aanwezigheid van zuurstof.
In een tweede verandering
wordt de destructie van de kankercellen door het immuunsysteem
vermeden, dit door
bijvoorbeeld immunosuppressieve factoren te secreteren [5].
Zoals blijkt uit de veranderingen, zijn niet enkel de
kankercellen zelf van belang bij de
ontwikkeling van een tumor maar ook omliggende cellen. Hanahan
en Weinberg spreken van
een tumor micro-omgeving (Figuur 1) [5]. Kankerontwikkeling
bestaat dus uit veel
verschillende aspecten die samen een complex geheel vormen.
Figuur 1: Tumor micro-omgeving. Een tumor bestaat uit
kankercellen die de basis vormen van de ziekte
en de specifieke oncogene en tumorsuppressor mutaties dragen.
Daarnaast zijn ook kanker stamcellen,
endotheelcellen (cfr. angiogenese als een essentiële
verandering), pericyten, immuuncellen (zowel tumor
antagoniserende als tumor stimulerende leukocyten),
kanker-geassocieerde fibroblasten, stamcellen en
progenitorcellen aanwezig in de tumor micro-omgeving [5].
-
12
1.2 Exosomen
1.2.1 Inleiding
Exosomen zijn extracellulaire vesikels met een diameter van 30
tot 100 nm en zijn van
endosomale oorsprong. Ze worden gevormd als intraluminale
vesikels (ILV) in het
multivesikulair endosoom (MVE) en komen in het extracellulair
milieu door fusie van dit MVE
met het plasmamembraan. Zo mediëren exosomen intercellulaire
communicatie. Eiwitten
afkomstig van endosomen, het plasmamembraan en het cytosol
worden teruggevonden in
exosomen. Voorbeelden van eiwitten die voorkomen in exosomen
zijn componenten van de
endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)
complexen, adhesiemoleculen
zoals tetraspaninen en integrinen, eiwitten van het cytoskelet
en eiwitten met een rol in
antigeenpresentatie. Daarnaast bevatten ze ook mRNA en miRNA.
Hun membraan is
aangerijkt in sfingomyeline, fosfatidylserine, cholesterol en
ceramide [6], [7]. Enkele van deze
componenten spelen een rol in de exosoomvorming en –secretie en
komen verder aan bod.
Exosomen zijn slechts één van de voorkomende extracellulaire
vesikels (EV). Ook
microvesikels (MV) en apoptotic blebs behoren tot deze groep.
MV’s zijn vesikels met een
diameter van 150 tot 1000 nm. Ze ontstaan door knopvorming van
het plasmamembraan en
afscheiding in het extracellulair milieu. Apoptotic blebs zijn
blaasjes afgescheiden door een
apoptotische cel en hebben een diameter van 1 tot 5 µm [6], [7].
Er dient opgemerkt te
worden dat isolatie van een bepaald EV subtype soms resulteert
in een aanrijking i.p.v. een
volledige isolatie van het subtype en dat bij de isolatie van
EV’s het moeilijk is een
onderscheid te maken tussen de verschillende subtypes [7].
1.2.2 Endocytotische pathway
De endocytotische pathway start met endocytose, waarbij het
celmembraan naar binnen toe
plooit en er een vesikel afgescheiden wordt in het cytoplasma.
Verschillende pathways voor
endocytose zijn bekend, waarvan de clathrinegemedieerde pathway
de meest gekende is.
Andere pathways die endocytose bewerkstelligen, zijn
caveolair-type endocytose,
CLIC/GEEC-type endocytose en ARF6-afhankelijke endocytose [8].
De cargo van een
endocytotisch vesikel bestaat uit o.a. nutriënten,
receptor-ligand complexen, lipiden,
membraanproteïnen, componenten van de extracellulaire matrix
(ECM), virussen, enz. [9].
Deze endocytotische vesikels fusioneren met vroege endosomen.
Een endosoom bestaat uit
tubulaire en vacuolaire domeinen. Op het membraan van dit
endosoom, vooral in het
tubulaire gedeelte, zijn microdomeinen aanwezig die voor
sortering zorgen. Vesikels worden
ter hoogte van deze microdomeinen gecreëerd die de cargo,
gerekruteerd aan dit
microdomein, naar zijn specifieke bestemming brengen. Het
grootste deel van de cargo
wordt gerecycleerd. Dit is bijvoorbeeld het geval voor
componenten van het plasma-
membraan en housekeeping receptoren. Vesikels kunnen ook
uitgewisseld worden met het
trans-Golgi netwerk (TGN) [9], [10]. Het vacuolair domein van
het vroege endosoom
matureert tot het late endosoom. Deze maturatie gaat gepaard met
veranderingen, o.a. de
overschakeling van RAB5 naar RAB7, het vormen van intraluminale
vesikels (ILV’s),
verzuring en fosfatidylinositol (PI) conversie. Tijdens
maturatie zullen de endosomen ook een
nettobeweging ondergaan van de periferie naar de perinucleaire
regio [9]. Door de
vesikelvorming in het lumen worden late endosomen ook wel
multivesikulaire endosomen
(MVE) genoemd. MVE’s kunnen samensmelten met lysosomen waarbij
de inhoud van de
vesikels afgebroken wordt. Daarnaast kunnen MVE’s migreren naar
het plasmamembraan
en ermee fusioneren. ILV’s worden zo vrijgesteld en worden dan
exosomen genoemd [7].
-
13
1.2.3 Intraluminale vesikel-/exosoomvorming
1.2.3.1 ESCRT-afhankelijk
ILV’s kunnen enerzijds gevormd worden met behulp van de
endosomal sorting complex
required for transport (ESCRT) complexen. Anderzijds bestaan ook
mechanismen
onafhankelijk hiervan en worden verderop besproken (sectie
1.2.3.2). De ESCRT-
afhankelijke pathway start met ESCRT-0. Dit complex bindt en
clustert geübiquitinileerde
cargo componenten [7]. Vervolgens bindt ESCRT-I enerzijds aan
ESCRT-0, anderzijds aan
de geübiquitinileerde componenten. ESCRT-I interageert met
ESCRT-II en samen induceren
ze knopvorming in het endosoom. Deze twee complexen zijn
gelokaliseerd aan de nek van
de gevormde knop en zorgen voor stabilisatie van de nek (Figuur
2). Vervolgens zal ESCRT-
III het gevormde vesikel klieven (Figuur 2b). Vacuolar protein
sorting 4 (VPS4) zorgt in een
finale stap voor de disassemblage en recyclage van ESCRT-III. Om
deze pathway te
ontrafelen werd en wordt nog steeds de gist Saccharomyces
cerevisiae gebruikt als model.
De gist vacuole is het equivalent van het lysosoom en zijn
biogenese is gelinkt aan deze van
MVE’s [11]. De basisfuncties van de ESCRT-0, -I, -II en –III
complexen in deze biogenese
zijn geconserveerd en dus gelijkaardig voor alle eukaryoten [7],
[12]. ESCRTs zijn niet enkel
belangrijk bij de sortering van geübiquitinileerde cargo naar
het lysosoom en bij de vorming
van exosomen, maar spelen ook een rol tijdens de cytokinese, bij
knopvorming van virussen
ter hoogte van het plasmamembraan en bij enkele andere processen
[13]. In de volgende
beschrijving worden de benamingen van de humane eiwitten
gebruikt. De verschillende
componenten worden opgelijst in Tabel 1 waarbij ook hun
overeenkomstige benaming in gist
wordt gegeven.
Figuur 2: (a) ESCRT-I en –II met zijn verschillende componenten.
(b) Hoe ESCRT-I en –II als supercomplex
gelokaliseerd zijn aan de nek tijdens de vorming van een ILV en
hoe ESCRT-III de membranen naar elkaar
toe brengt (figuur aangepast uit [11]).
-
14
Tabel 1: Componenten ESCRT complexen – humaan en gist
homologen
Humane eiwitten Gist eiwitten
ESCRT-0 HRS Vps27 STAM Hse1
ESCRT-I TSG101 Vps23 VPS28 Vps28 VPS37 Vps37 MVB12 Mvb12
ESCRT-II EAP30 Vps22 EAP45 Vps36 EAP20 Vps25
ESCRT-III CHMP6 Vps20 CHMP4 Snf7 CHMP3 Vps24 CHMP2 Vps2
Andere VPS4 Vps4
ESCRT-0 is een complex dat bestaat uit hepatocyte growth
factor-regulated tyrosine kinase
substrate (HRS) en signal transducing adaptor molecule (STAM).
Beide componenten
bevatten ubiquitinebindende domeinen. De affiniteit van HRS voor
ubiquitine is groter dan
deze van STAM, waaruit kan verondersteld worden dat HRS de
belangrijkste rol speelt bij de
functie van ESCRT-0 en STAM eerder een accessorisch eiwit is
[14]. Zoals eerder
aangehaald, zijn er verschillende microdomeinen terug te vinden
op het membraan van de
vroege endosomen. Zo zijn er in het vacuolaire domein
clathrinebevattende microdomeinen
aanwezig. HRS bindt en rekruteert geübiquitinileerde eiwitten
ter hoogte van deze
clathrinebevattende microdomeinen en verhindert zo recyclage van
de cargo naar het
plasmamembraan [15]. STAM zal naast het binden van ubiquitine,
ook deübiquitinilatie-
enzymen rekruteren, wat een regulerende functie heeft bij
sortering [11], [14].
Deübiquitinilasen belangrijk in deze context zijn het associated
molecule with the SH3
domain of STAM (AMSH) [16] en ubiquitin specific peptidase 8
(USP8/UBPY) [17] (zie
verder).
Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is een eiwit behorende
tot het ESCRT-I complex. Er
werd aangetoond dat interactie tussen TSG101 en HRS nodig is om
geübiquitinileerde
moleculen te sorteren in de ILV’s van het MVE. HRS rekruteert
TSG101 en TSG101 zal
vervolgens binden met het ubiquitine label [18]. Het ESCRT-I
complex bestaat daarnaast
nog uit de subunits VPS28, VPS37 en multivesicular body sorting
factor 12 (MVB12) [19]. De
mens heeft twee isovormen voor VPS28, vier isovormen voor VPS37
en minstens drie
isovormen voor MVB12 [20]. Dit complex vormt samen een structuur
met een 13 nm-lange
steel en 5 nm-lang hoofd (Figuur 2a, stalk en head,
respectievelijk) [19]. ESCRT-II, een
volgend complex belangrijk in ILV-vorming, bestaat ook uit vier
subunits, meer bepaald ELL-
associated protein 30 (EAP30), EAP45 en tweemaal EAP20. Deze
vormen samen een Y-
vormige structuur (Figuur 2a) [21]. ESCRT-I en ESCRT-II zullen
samen knopvorming
induceren in het membraan van het endosoom en er werd aangetoond
dat deze complexen
gelokaliseerd zijn aan de nek van de knop [22]. Voor knopvorming
zullen ze samen één
supercomplex vormen (Figuur 2b). Hierbij zal de C-terminus van
VPS28 binden aan
ESCRT-II. De N-terminus van EAP45 bevat een zogenaamd GRAM-like
ubiquitin-binding
motif in EAP45 (GLUE)-domein. In dit domein zijn twee Npl4-type
zinc fingers (NZF1 en
NZF2) aanwezig. Specifiek gebeurt de binding van de C-terminus
van VPS28 met NZF1
(Figuur 2a) [23]. Er werd gezien dat dit supercomplex een
evenwicht heeft tussen open en
-
15
gesloten conformatie. Hieruit werd een model gesuggereerd voor
cargo transport. Wanneer
het complex van een open naar gesloten conformatie overgaat, zou
dit de cargo langs het
membraan richting de nek van de knop brengen [24].
Na knopvorming gebeurt afscheiding van het ILV door het
ESCRT-III complex. Het complex
heeft een kern bestaande uit charged multivesicular body protein
6 (CHMP6), CHMP4,
CHMP3 en CHMP2 [25]. De mens heeft drie isovormen voor CHMP4 en
twee isovormen
voor CHMP2 [11]. Dit is een dynamisch complex, in tegenstelling
tot voorgaande complexen,
en zal zich pas vormen wanneer nodig in het endosoom [25]. In
een eerste stap zal CHMP6
binden aan ESCRT-II, meer bepaald aan de EAP20 subunit [26].
CHMP6 doet dienst als
startplaats om oligomerisatie van CHMP4 op endosomen te
bewerkstelligen. Oligomerisatie
wordt beëindigd door binding van CHMP3. In een laatste
assemblagestap zal CHMP2
binden. Deze laatste rekruteert dan VPS4. CHMP4 is het meest
aanwezig en het meest
noodzakelijk voor de fissie [27]. Een model wordt voorgesteld
waarbij CHMP4-eenheden een
steeds smaller wordende spiraal vormen rond de nek totdat de
membranen dicht genoeg bij
elkaar gebracht zijn om fissie te bewerkstelligen [28]. Zoals
vermeld, wordt in een laatste
stap VPS4, een ATPase associated with diverse cellular
activities (AAA) ATPase,
gerekruteerd. Door energietoevoer zal disassemblage van het
ESCRT-III complex gebeuren
en is de vesikelvorming beëindigd [29].
Voordat het vesikel volledig afgesloten wordt, zal de cargo
ontdaan worden van zijn
ubiquitine label. In de gist Saccharomyces cerevisiae gebeurt
dit door het deübiquitinilase
Doa4, wat wordt gerekruteerd door Bro1 [30]. Bro1 is
geassocieerd met het ESCRT-III
complex en is vooral afhankelijk van Snf7 (CHMP4 homoloog in
gist). Bij disassemblage van
het ESCRT-III complex door Vps4 (VPS4 homoloog in gist), zal ook
Bro1 door Vps4
gerecycleerd worden [31]. Het menselijke homoloog voor Bro1 is
het apoptosis-linked gene
2-interacting protein X (ALIX). ALIX bindt met CHMP4. In
tegenstelling tot voorgaande
homologen, zal ALIX niet dezelfde functie uitoefenen bij de mens
als Bro1 in gist [12]. ALIX
is in staat het ESCRT-III complex te assembleren, onafhankelijk
van voorgaande ESCRT
complexen en cargo ubiquitinilatie, en werkt zo als een tweede
mechanisme voor sortering
[32]. De humane tegenhangers van Doa4 zijn de deübiquitinilasen
AMSH en UBPY. AMSH
interageert met verschillende subunits van het ESCRT-III complex
en verwijdert het
ubiquitine label van de cargo voordat ze volledig geïsoleerd
worden in het ILV.
Deübiquitinilatie wordt stopgezet wanneer VPS4 gerekruteerd
wordt [16]. UBPY werkt
volgens een ander mechanisme [17].
Aangezien ILV’s niet enkel aanleiding geven tot exosomen maar
ook een rol spelen in cargo
degradatie, werd nagegaan of dit mechanisme effectief leidt tot
exosoomvorming. Dit
gebeurde door silencing via RNA interference (RNAi) van
verschillende componenten van de
ESCRT complexen. Wanneer HRS en STAM1 uitgeschakeld werden,
resulteerde dit in
minder gesecreteerde exosomen. Ook bij het uitschakelen van
TSG101 werden minder
exosomen gesecreteerd, wat wijst op een ESCRT-afhankelijkheid.
Enkele eigenaardigheden
werden gezien in de studie, meer bepaald een stijging in
exosoomsecretie bij uitschakeling
van VPS4 en ALIX [33]. Baietti et al. bewezen eerder nochtans
dat ALIX essentieel is in
exosoombiogenese. Hierbij zou de connectie tussen ALIX en
syndecaan via syntenine een
rol spelen. Bovendien toonden ze aan dat VPS4 silencing wel
leidt tot een reductie in
exosoomsecretie [34].
-
16
1.2.3.2 ESCRT-onafhankelijk
Naast exosoomvorming via de ESCRT-afhankelijke pathway, werden
ook onafhankelijke
pathways beschreven. Een eerste onafhankelijke pathway is de
inductie van knopvorming
door ceramide in oligodendrogliale cellen. Hierbij zal cargo,
bestemd voor exosomen,
gerekruteerd worden ter hoogte van microdomeinen analoog aan
lipid rafts. Een model wordt
voorgesteld waarbij sfingolipiden, aanwezig aan een hoge
concentratie in deze lipid rafts,
worden omgezet naar ceramide door neutraal sfingomyelinase.
Ceramide veroorzaakt
vervolgens een spontane kromming in het membraan en induceert zo
knopvorming [35]. Een
tweede pathway waarbij een lipide een rol speelt in de spontane
knopvorming werd
beschreven door Ghossoub et al.. Het GTPase ADP ribosylation
factor 6 (ARF6) activeert
fosfolipase D2 (PLD2). Vervolgens metaboliseert PLD2
fosfatidylcholine tot fosfatidezuur
(PA). Net zoals ceramide induceert PA een kromming in het
membraan, met spontane
knopvorming tot gevolg. Bij ARF6-negatieve cellen werden niet
alle ESCRT-afhankelijke
processen geblokkeerd waardoor onafhankelijkheid van deze
pathway werd verondersteld.
Er dient echter opgemerkt te worden dat syntenine kan
interageren met PA en op genniveau
ook interageert met ARF6. Wegens de eerder aangetoonde
interactie tussen syntenine en
ALIX, kon ESCRT-afhankelijkheid hier niet volledig uitgesloten
worden [36].
Een tweede groep van ESCRT-onafhankelijke pathways blijken
afhankelijk van
tetraspaninen. Zo werd in melanomacellen aangetoond dat, naast
de ESCRT-afhankelijke
weg, een tweede mechanisme aanwezig is, waarbij de ILV-vorming
afhankelijk is van cluster
of differentiation 63 (CD63) [37]. CD82 en CD9 zijn twee
tetraspaninen die in de context van
β-catenine secretie via exosomen vernoemd werden. Deze eiwitten
zouden
exosoomvrijstelling stimuleren via de ceramide-afhankelijke
pathway [38]. Voor de vorming
van exosomen afkomstig van tumorcellen (rat adenocarcinoma
cellen) werd gezien dat het
tetraspanine 8 (Tspan8) instaat voor de sortering van
welbepaalde eiwitten en mRNA [39].
Verder werd ook het tetraspanine CD81 gerapporteerd als zijnde
belangrijk in de sortering
van specifieke componenten in exosomen. Eiwitten die interageren
met CD81 werden niet
waargenomen in de exosomen van CD81-deficiënte cellen [40]. Een
overzicht van
exosoomvorming wordt schematisch weergegeven in Figuur 3.
1.2.3.3 Gemengd model
Markus Babst stelde een model voor waarbij zowel de ESCRT
complexen, als de lipide-
afhankelijke knopvorming samenwerken in ILV-vorming. ESCRT-0 zou
geübiquitinileerde
eiwitten binden en clusteren ter hoogte van lipid rafts. De
lipid rafts hebben een specifieke
lipidesamenstelling die voor vervorming en invaginatie van het
membraan zorgt. Door de
aanwezigheid van de gerekruteerde geübiquitinileerde eiwitten en
de lipiden (bv. ceramide)
die voor vervorming van het membraan zorgen, worden ESCRT-I en
ESCRT-II gerekruteerd.
Deze complexen stabiliseren de nek van de gevormde invaginatie.
Verder volgt de ILV-
vorming de pathway beschreven onder ESCRT-afhankelijke
ILV-vorming [41].
-
17
Figuur 3: Overzicht exosoomvorming en –secretie. ILV’s worden
gevormd door knopvorming in het
vroege endosoom. Dit kan via de ESCRT-afhankelijke pathway en/of
onafhankelijk hiervan, m.b.v. lipiden
(ceramide, fosfatidezuur) en/of tetraspaninen (CD63, CD82, CD9,
Tspan8, CD81). Bij exosoomsecretie
spelen de RAB GTPasen en de SNARE proteïnen een rol. Daarnaast
kan het MVB samensmelten met het
lysosoom voor degradatie van de cargo. Ook microvesikels, een
tweede EV subtype, wordt hier
weergegeven [42].
1.2.4 Exosoomsecretie
Om de exosomen te secreteren, dienen de MVE’s zich eerst naar
het plasmamembraan te
begeven waar vervolgens fusie plaatsvindt en de ILV’s
vrijgesteld worden als exosomen.
Twee groepen moleculen worden geassocieerd met dit proces,
enerzijds de RAB GTPasen
en anderzijds de SNARE proteïnen (Figuur 3).
RAS-related in brain (RAB) eiwitten spelen een belangrijke rol
in intracellulair
vesikeltransport tussen verschillende compartimenten. Elk lid
van deze familie zal
preferentieel associëren met een bepaald intracellulair
compartiment [7]. RAB5 en RAB7
werden eerder ook al aangehaald als zijnde belangrijk in de
conversie van een vroeg naar
een laat endosoom (sectie 1.2.2). RAB11 werd als eerste
geassocieerd met exosomen door
Savina et al. [43]. Concreet werd hier aangetoond dat
overexpressie van een dominant
negatieve mutant van RAB11 resulteerde in de inhibitie van
exosoomsecretie in K562 cellen.
Later werd een tweede RAB proteïne, namelijk RAB35, een rol
toegeschreven in
exosoomsecretie. Meer specifiek zou dit een rol hebben in
docking van het MVE aan het
plasmamembraan [44]. Ook geassocieerd met het docken van het MVE
aan het
plasmamembraan is RAB27. Twee isovormen werden geïdentificeerd.
Silencing van zowel
Rab27a als RAB27b leidde tot verminderde exosoomsecretie. Rab27a
RNAi induceerde
daarenboven een vergroting van het MVE, terwijl RAB27b RNAi
leidde tot een herdistributie
van MVE’s in de perinucleaire regio [45]. RAB11 en RAB35 zijn
vooral terug te vinden bij
vroege endosomen en in de recyclage pathway terwijl RAB27 dan
weer gelokaliseerd is bij
de late endosomen en de secretorische pathway. Een hypothese
wordt vooropgesteld
waarbij of de ene of de andere RAB pathway gevolgd wordt en zo
aanleiding geeft tot
verschillende subtypes van exosomen afkomstig van verschillende
stadia in de endosoom-
maturatie [7].
-
18
Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein
receptors (SNARE) proteïnen
zijn gekend als mediatoren van membraanfusie [7]. Specifiek voor
de fusie tussen het MVE
en het plasmamembraan werd gesuggereerd dat het
vesicle-associated membrane protein 7
(VAMP7) hierin belangrijk zou zijn. Dit werd aangetoond voor de
vrijstelling van
acetylcholinesterase-bevattende exosomen in K562 cellen [46].
Een ander SNARE proteïne,
meer bepaald de R-SNARE YKT6, werd gerapporteerd als een
component nodig voor de
secretie van Wnt-bevattende exosomen tijdens de ontwikkeling van
Drosophila. Dit werd ook
aangetoond in humane cellen (HEK293) [47]. Er wordt gesteld dat
verschillende celtypes
andere SNARE’s gebruiken voor exosoomsecretie. Anderzijds zou
het ook kunnen dat
binnen hetzelfde celtype verschillende subtypes van MVE’s andere
SNARE’s gebruiken [7].
1.2.5 De rol van exosomen in kanker
Zoals reeds aangehaald, spelen exosomen een rol in
intercellulaire communicatie. Bij de
ontwikkeling van kanker zullen kankercellen communiceren met hun
tumor micro-omgeving,
o.a. door middel van exosomen, en vice versa (sectie 1.1). Een
eerste celtype zijn de
immuuncellen. Immuuncellen, meer bepaald dendritische cellen,
produceren exosomen voor
antigeenpresentatie. Een cellulaire immuunrespons wordt zo
teweeg gebracht tegen de
vormig van tumoren. Ook exosomen afkomstig van kankercellen
kunnen een dergelijke
cellulaire immuunrespons uitlokken. Daarnaast zijn er echter
exosomen die net het
immuunsysteem zullen onderdrukken. Dit laatste wordt door
Hanahan en Weinberg als een
essentiële verandering beschouwd in de ontwikkeling van kanker
(sectie 1.1). Tumorcel
exosomen kunnen ook differentiatie van fibroblast tot
myofibroblast stimuleren. Deze
myofibroblasten secreteren groeifactoren, matrixcomponenten en
proteasen die
tumorigenese stimuleren. Endotheelcellen in de micro-omgeving
worden geactiveerd door
stimulerende angiogenetische factoren afkomstig van kankercel
exosomen. Dit geeft
aanleiding tot angiogenese, een essentiële verandering in de
ontwikkeling van kanker
(sectie 1.1). Tussen kankercellen onderling wordt ook
gecommuniceerd. Kankercellen
binnen eenzelfde tumor zijn namelijk niet homogeen, ze brengen
verschillende oncogenen
tot expressie. Exosomen zullen een horizontale propagatie van
oncogenen mediëren. Als
laatste celtype dat wordt beïnvloed door kankercel exosomen
worden de beenmergcellen
vermeld. Exosomen afkomstig van primaire tumoren stimuleren
migratie van deze cellen
naar andere organen, waar ze vervolgens de basis zullen vormen
voor metastasen
(premetastatische niches). Kennis van de rol van exosomen in
kankerontwikkeling en hoe
deze exosomen tot stand komen kan leiden tot nieuwe
diagnostische en therapeutische
invalshoeken [48].
-
19
1.3 Het actinecytoskelet
1.3.1 Algemeen
1.3.1.1 Inleiding
Drie vezelige componenten behoren tot het cytoskelet, meer
bepaald actinefilamenten,
microtubuli en intermediaire filamenten. Hierbij zijn de
microtubuli belangrijk bij celtransport
en celdeling en dienen intermediaire filamenten vooral als
weerstand tegen mechanische
stress. Het actinecytoskelet zorgt voor de celmorfologie en
polariteit. Daarnaast is het ook
belangrijk bij endocytose, contractiliteit, celbeweging en
celdeling [49]–[51]. Op het
actinecytoskelet wordt verder ingegaan.
1.3.1.2 Actine
Actine is het meest voorkomende eiwit in de eukaryote cel.
Enerzijds is actine aanwezig in
een monomere globulaire vorm (G-actine), anderzijds in de
polymere filamenteuze vorm
(F-actine). Er bestaan verschillende actine isovormen, namelijk
de α-, β- en γ-isovormen.
Actine bevat twee groeven. In de ene groef zal ATP of ADP
gebonden zijn en de andere
groef bevat een bindingsplaats voor actinebindende proteïnen
(ABP’s). Schroefvormige
filamenten (F-actine) worden gevormd uit de actinemonomeren. Het
actinefilament is
gepolariseerd. Hierbij is er sprake van een positief (barbed) en
negatief (pointed) uiteinde.
Monomeren worden hoofdzakelijk toegevoegd aan het positieve
einde waardoor deze zijde
veel sneller aangroeit. Nadat het monomeer toegevoegd is, zal
hydrolyse van ATP
plaatsvinden. De ADP-gebonden vorm is minder stabiel dan de
ATP-gebonden vorm en zal
aan het negatieve uiteinde dissociëren. Ook aan de positieve
zijde kunnen monomeren
dissociëren maar additie van een monomeer gebeurt sneller dan
hydrolyse. De toevoeging
van monomeren aan de negatieve zijde is ook mogelijk maar dit
gebeurt hier trager en de
hydrolyse haalt de associatie in waardoor netto meer dissociatie
gebeurt. Dit steady-state
mechanisme van associatie en dissociatie wordt treadmilling
genoemd [51], [52].
1.3.1.3 Actinebindende proteïnen
Naast het proces van treadmilling zijn ook actinebindende
proteïnen (ABP’s) betrokken in de
dynamiek van actine. Naast associatie en dissociatie van actine
monomeren, helpen ze in de
organisatie van actine in hogere-orde netwerken.
Polymerisatie is energetisch ongunstig tot wanneer een kern van
drie monomeren gevormd
wordt. Actin-related protein 2 and 3 vormen samen het Arp2/3
complex en hebben een
gelijkaardige structuur als een actine dimeer. Wanneer ze
G-actine binden, wordt een kern
van drie monomeren nagebootst waardoor polymerisatie geïnitieerd
wordt. Dit complex blijft
aan het negatieve uiteinde en stimuleert zo aangroei van het
filament aan het positieve eind.
Het Arp2/3 complex kan bovendien associëren met een reeds
gevormd filament en zorgt zo
voor een vertakking in een hoek van 70°. Herhaaldelijke
vertakking resulteert in dendritische
netwerken. In vivo wordt de activiteit van Arp2/3 gestimuleerd
door andere eiwitten. Hierbij
zijn o.a. de Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASP) en de
suppressor of cAMP receptor /
WASP family verprolin homologous (SCAR/WAVE) proteïnen
belangrijk. Een andere
activator van Arp2/3 is cortactine (CRN) waar verder op wordt
ingegaan (sectie 1.3.2). Een
tweede groep eiwitten die een rol spelen in nucleatie zijn de
formines. Ze vormen dimeren.
Via hun formin homology 2 (FH2) domein blijven ze gebonden aan
het positieve uiteinde en
verhinderen zo de binding van capping proteïnen (zie verder)
[52], [53].
-
20
Naast nucleatie zijn er ook andere functies voor ABP’s. Zo zal
profiline binden aan G-actine
wat o.a. de uitwisseling van ADP voor ATP katalyseert en zo
polymerisatie stimuleert.
Daarnaast zorgt profiline ervoor dat monomeren enkel toegevoegd
worden aan het barbed
end. Thymosine bindt eveneens aan G-actine maar zal ervoor
zorgen dat dit monomeer niet
meer beschikbaar is voor polymerisatie. Capping proteïnen
verhinderen actine uitwisseling
aan barbed of pointed ends. Gelsoline (GSN) bijvoorbeeld bindt
aan het positieve uiteinde
om er monomeerbinding te verhinderen. Daarnaast kan GSN het
filament ook klieven. ABP’s
die zorgen voor depolymerisatie zijn de actin-depolymerizing
factor (ADF)/cofiline eiwitten.
Actinefilamenten kunnen ook georganiseerd worden in hogere-orde
netwerken, waarbij de
filamenten parallel aan elkaar gebundeld worden of waarbij
vertakkingen gevormd worden
tussen de verschillende filamenten. Een voorbeeld van zo’n ABP
dat helpt bij bundeling is
fascine (FSN). In andere gevallen doet actine dienst als
mechanische ondersteuning. Zo
gebruikt myosine, een motorproteïne, actinefilamenten als een
spoor waarover het beweegt
naar zijn doelorganel [53].
1.3.1.4 Actinerijke protrusies
Niet alleen de vorming van individuele filamenten maar ook van
hogere-orde netwerken
wordt bewerkstelligd door ABP’s, zoals reeds aangehaald in
voorgaand onderdeel.
Actinefilamenten vormen de basis voor verschillende
celprotrusies, elk met hun eigen
functies.
Figuur 4: Actinerijke protrusies (figuur aangepast uit [52],
[54]).
Lamellipodia en het lamellum bijvoorbeeld (Figuur 4, links) zijn
bladvormige actinestructuren
die gevormd worden aan de zijde van de cel waar ze zich
voortbeweegt (leading edge). Ze
bestaan elk uit een autonoom dendritisch netwerk van vertakte
actinefilamenten. De
lamellipodia bevinden zich het meest distaal en het lamellum
vormt de overgang naar de cel.
Een ander voorbeeld zijn de filopodia (Figuur 4, midden). Dit
zijn vingervormige
actinestructuren die uitsteeksels vormen en zich ook ter hoogte
van de leading edge
bevinden. Ze zijn vaak te vinden in de lamellipodiaregio. Ze
zouden er functioneren als
directionele sensoren. Filopodia bestaan uit parallelgebundelde
actinefilamenten. Een laatste
voorbeeld zijn de podosomen en invadopodia (Figuur 4, rechts).
Deze structuren worden
samen vermeld omdat deze moeilijk van elkaar te onderscheiden
zijn. Beide structuren
zorgen voor degradatie van de ECM en komen voor aan de ventrale
zijde van de cel. Naast
deze zelfde functionaliteit, hebben ze ook een gelijkaardige
compositie. Sommigen
argumenteren dan ook dat dit eigenlijk één en dezelfde
structuren zijn. Podosomen zijn de
degraderende protrusies voorkomend in normale cellen (bv.
macrofagen, dendritische cellen,
endotheelcellen en osteoclasten). Invadopodia zijn protrusies
voorkomend in kankercellen
(sectie 1.3.3). Verschillen werden waargenomen in hun dynamiek.
Podosomen hebben een
snelle turnover terwijl invadopodia uren stabiel blijven.
Daarnaast zijn invadopodia ook langer
dan podosomen. Een lengte beperkt tot 2 µm is geldig voor
podosomen terwijl invadopodia
langer dan 2 µm zijn. Er werd ook gesuggereerd dat invadopodia
deel uitmaken van een
superstructuur waarbij vanuit een kern verschillende
filamentachtige invadopodia
voortkomen. Dit werd niet gezien bij podosomen [52], [54].
-
21
1.3.2 Cortactine
Cortactine (CRN) is een activator van het Arp2/3 complex, zoals
reeds aangehaald in sectie
1.3.1.3, en is o.a. hierdoor een regulator in de vorming van
vertakte actinenetwerken. Deze
actinenetwerken zijn belangrijk in celbeweging en invasie via de
vorming van actinerijke
protrusies (sectie 1.3.1.4).
Het aminoterminaal uiteinde van CRN (Figuur 5) bestaat uit een
aminoterminaal zuur domein
(amino-terminal acidic, NTA) gevolgd door een tandem repeat
domein, waaraan F-actine zal
binden. Aan het NTA domein bindt het Arp2/3 complex. Het
carboxyterminaal uiteinde van
CRN (Figuur 5) bezit enkele fosforyleringsplaatsen en een Src
homoloog 3 (SH3) domein.
Aan het SH3 domein binden verschillende cytoskelet eiwitten,
membraantransport eiwitten
en signalisatie eiwitten. CRN doet zo dienst als scaffold tussen
deze SH3 domeinbindende
eiwitten en het actinecytoskelet. CRN is een belangrijke
regulator bij het vormen van vertakte
actinenetwerken. Het scaffold eiwit bindt Arp2/3 en F-actine en
brengt zo beide eiwitten
samen. CRN kan op zich Arp2/3 activeren, maar er gebeurt ook
regulatie door andere
actineregulerende eiwitten die aan het CRN SH3 domein binden
[55]. Voor het WASP
interacting protein (WIP) bijvoorbeeld werd aangetoond dat dit
tot een verhoogde activatie
van het Arp2/3 complex door CRN leidde wanneer gebonden aan het
CRN SH3 domein [56].
In een andere studie werd ook bij binding van neuraal WASP
(N-WASP, een lid van de
WASP familie) aan het CRN SH3 domein een verhoogde activiteit
van het Arp2/3 complex
waargenomen. CRN en N-WASP zijn dus op zichzelf activators maar
zullen elkaar
versterken wanneer N-WASP gebonden is aan CRN [57]. Daarbovenop
zorgt CRN voor
stabilisatie van actinevertakkingen. CRN heeft dus via meerdere
mechanismen een
regulerende rol bij het vormen van vertakte actinenetwerken
[55].
Figuur 5: Schematische voorstelling van CRN met belangrijke
domeinen. Enkele interactiepartners
belangrijk bij invadopodia (sectie 1.3.3) worden weergegeven.
Opmerking: Y470 en Y486 corresponderen
met Y466 en Y482 in de muis. (Figuur aangepast uit [55]).
Een voorbeeld van actinerijke protrusies waarin CRN een
belangrijke regulator is, zijn de
invadopodia. Op twee manieren is CRN essentieel tijdens
invadopodiavorming. Enerzijds
helpt CRN bij het vormen van de initiële kern en bij
actinepolymerisatie. Anderzijds reguleert
CRN membraantransport tijdens de rekrutering van proteasen [55].
Dit wordt verder
toegelicht in de volgende sectie.
-
22
1.3.3 Invadopodia
1.3.3.1 Inleiding
Invadopodia zijn actinerijke protrusies die gevormd worden door
kankercellen. Deze
structuren bewerkstelligen metastase door afbraak van de ECM en
basale membraan.
Hierdoor gebeurt intrede in de bloedvaten, wat intravasatie
genoemd wordt. Op die manier
kunnen de kankercellen zich over het volledige lichaam
verspreiden [58].
1.3.3.2 Precursorvorming
Om de vorming van invadopodia te initiëren is een stimulus
nodig. Verschillende stimuli
kunnen initiatie bewerkstelligen:
- Inductie van de epitheel-mesenchym transitie (EMT): EMT is een
belangrijk proces
tijdens de embryogenese. In dit proces zullen cellen mobieler
worden, cel-cel contacten
verliezen en veranderen in hun binding met matrix componenten.
Deze eigenschappen
zijn ook nodig voor invasie en metastase door tumorcellen en
transcriptiefactoren die
EMT induceren, zijn eveneens belangrijk en actief in de inductie
van invasie en
metastase. Twist1, een transcriptiefactor die EMT induceert, zal
de transcriptie van
platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) induceren. Dit
op zijn beurt resulteert in
Src (non-receptor tyrosine kinase)-activatie, wat leidt tot de
vorming van invadopodia
[59]. Transforming growth factor (TGF)-β werd gerapporteerd als
oncogeen waarbij het
EMT induceert en leidt tot een invasiever karakter van
kankercellen. Het focaal
adhesieproteïne Hic-5 zou hierbij een belangrijke rol spelen en
zijn fosforylering zou
afhankelijk zijn van Src [60].
- Hypoxie: Er werd aangetoond dat hypoxie invadopodiavorming
induceert. Hypoxie zou
de epidermal growth factor receptor (EGFR)-pathway activeren
waardoor op zijn beurt
histon deacetylase 6 (HDAC6) geactiveerd wordt. Deze activatie
leidt tot hypoxie-
geïnduceerde invadopodiavorming [61]. In een andere studie werd
aangetoond dat
hypoxie Notch-signalisatie induceert. Dit leidt tot heparin
binding epidermal growth factor
(HB-EGF) vrijstelling via het metalloproteïnase ADAM12, wat op
zijn beurt tot
invadopodiavorming leidt [62].
- Matrix metalloproteïnase (MMP) activiteit: Er is een positieve
feedback-loop waarbij
afbraakproducten van de ECM de vorming van nieuwe invadopodia
stimuleert [63].
- Groeifactoren: Uit voorgaande stimuli is duidelijk dat
groeifactoren een belangrijke rol
spelen in het stimuleren van invadopodiavorming. Deze
groeifactoren kunnen evenwel
autocrien vrijgesteld worden [64]. De EGFR-liganden zijn de best
gekarakteriseerde
groeifactoren. Deze induceren precursorvorming en activeren
pathways naar
actinepolymerisatie en matrixdegradatie. TGF-β en liganden van
PDGFR daarentegen
induceren invadopodiavorming in normale cellen [65].
Ondanks de verschillende stimuli, lijken alle pathways te
convergeren naar Cdc42, een
GTPase van de Rho familie. Verschillende guanine exchange
factors (GEFs) die Cdc42
activeren werden gerapporteerd in context van
invadopodiavorming, meer bepaald Vav1, β-
PIX en Fgd1. Elk van deze GEFs kan geactiveerd worden door het
non-receptor tyrosine
kinase Src [65]. Dit en volgende stappen worden schematisch
weergegeven in Figuur 6.
-
23
De initiële kern van het invadopodium bestaat uit actine, CRN,
cofiline, N-WASP en het
Arp2/3 complex. Actine en CRN arriveren eerst op de plaats van
initiatie waarbij CRN dienst
doet als scaffold waarop cofiline en N-WASP binden. Na vorming
van deze initiële kern, bindt
het adaptoreiwit tyrosine kinase substraat met vijf SH3 domeinen
Tks5 [66]. Tks5 bevat een
phox homoloog (PX) domein en vijf SH3 domeinen. Het derde SH3
domein zal interageren
met N-WASP [67]. Het PX domein bindt aan fosfatidylinositol
lipiden, meer specifiek
fosfatidylinositol 3-fosfaat (PI(3)P) en fosfatidylinositol
3,4-bifosfaat (PI(3,4)P2). Het vijfde
SH3 domein interageert met enkele ADAM metalloproteïnasen [68].
3 tot 4 minuten na
initiatie van de precursorvorming, is er een aanrijking van
PI(3,4)P2 aan het plasma-
membraan. Hieraan zal Tks5 binden met zijn PX domein, wat zorgt
voor stabilisatie van de
precursor [66], [69]. Er dient opgemerkt te worden dat Tks5
eerst als een scaffold
beschouwd werd dat de andere proteïnen, nodig voor
precursorvorming, rekruteerde. In
plaats van deze rol in initiatie, toonde Sharma et al. echter
aan dat Tks5 pas arriveerde na
vorming van de initiële kern, zoals hierboven beschreven [66],
[70]. De aanrijking in PI(3,4)P2
is ten gevolge van de rekrutering van het fosfatase SH2
domain-containing inositol 5-
phosphatase 2 (SHIP2) of synaptojanin 2 aan de precursor, wat
PI(3,4,5)P3 defosforyleert tot
PI(3,4)P2 [66], [69]. PI(3,4,5)P3 op zijn beurt zou het
resultaat zijn van de fosforylering van
PI(4,5)P2 door fosfatidylinositol 3-kinase (PI-3K). Dit kinase
zou geactiveerd worden door
groeifactoren [69]. In een volgende stap zal β1-integrine
gerekruteerd worden, wat
geactiveerd werd doorheen de precursorvorming. Het zorgt voor
verdere stabilisatie van de
precursor en triggert maturatie [71].
Figuur 6: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen
in precursorvorming.
1.3.3.3 Actinepolymerisatie
Het β1-integrine triggert maturatie via interactie met de
nonreceptor tyrosine kinase Arg (Abl-
related gene). Voor de activatie van Arg is cross-talk met de
EGFR nodig. Een model wordt
voorgesteld waarbij in een eerste stap β1-integrine bindt met
Arg, waardoor deze laatste een
conformationele verandering ondergaat en een autofosforylering
uitvoert van zijn
tyrosineresidue 272 (Y272). Arg verbreekt zo zijn inactieve
conformatie. In een tweede stap
zal EGFR-activatie een Src-gemedieerde fosforylering van Arg op
Y439 induceren waardoor
Arg volledig actief wordt [71]. Arg fosforyleert CRN op drie
tyrosineresiduen (Y421, Y466,
Y482). De fosforylering van Y421 en Y466 in CRN leidt tot de
rekrutering van het
adaptoreiwit non-catalytic region of tyrosine kinase 1 (Nck1),
wat op zijn beurt N-WASP bindt
en zo helpt bij de activatie van het Arp2/3 complex door N-WASP
[72]. Daarnaast zal de
fosforylering van CRN ervoor zorgen dat cofiline, gebonden aan
CRN, vrijgesteld wordt.
Cofiline wordt op die manier geactiveerd en zal door zijn
knipactiviteit vrije positieve
uiteinden creëren. Hierdoor zal Arp2/3-gemedieerde
actinepolymerisatie gefaciliteerd
worden. CRN wordt nadien terug gedefosforyleerd zodanig dat
cofiline opnieuw inactief
-
24
wordt, wat nodig is voor de stabilisatie van de invadopodium
precursor [73] (Figuur 7).
Recenter werd een ander model voorgesteld voor de verbreking van
de interactie tussen
cofiline en CRN. Het focale adhesieproteïne talin zou actine
binden tijdens de vorming van
de precursor. Bij de start van de maturatie zal talin ook binden
aan β1-integrine, wat leidt tot
een bijkomende stabilisatie. Deze binding leidt bovendien tot
een sterke interactie tussen
talin en moesin. Moesin zal op zijn beurt sodium/hydrogen
exchanger 1 (NHE-1) rekruteren.
Protonen worden getransporteerd naar buiten wat leidt tot
verzuring van de ECM en in het
cytoplasma zal de pH stijgen. Deze stijging zorgt voor een
verbreking van de inhibitorische
interactie tussen cofiline en CRN, waardoor cofiline vrije
positieve uiteinden kan creëren [74]
(Figuur 7). Een derde mechanisme dat voor de regulatie van
cofiline instaat, is via het Rho
GTPase RhoC. RhoC activeert LIMK via ROCK, waarbij LIMK cofiline
zal fosforyleren.
Fosforylering inactiveert cofiline. De gefosforyleerde vorm is
niet langer in staat om actine te
binden en dus om barbed ends te creëren. RhoC staat op zijn
beurt onder de regulatie van
p190RhoGEF en p190RhoGAP (GTPase activating protein, GAP), een
RhoC activator en
inactivator respectievelijk (Figuur 7). p190GEF is terug te
vinden rondom het invadopodium,
terwijl p190GAP in de kern van het invadopodium aanwezig is.
Buiten het invadopodium zal
RhoC dus geactiveerd worden waardoor cofiline hier niet actief
zal zijn. In de kern van het
invadopodium daarentegen, is RhoC niet actief [75]. Aangezien in
bepaalde cellijnen gezien
werd dat Arg p190RhoGAP kan fosforyleren/activeren onder de
regulatie van β1-integrine,
wordt gesuggereerd dat β1-integrine een master regulator is van
cofiline activiteit [65].
Figuur 7: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen
in actinepolymerisatie.
Naast het Arp2/3 complex, zijn ook eiwitten van de formine
familie belangrijk in
actinepolymerisatie. Diaphanous-related formins (DRFs) werden
gerapporteerd als zijnde
essentieel in de invadopodiavorming. Er wordt gesteld dat deze
instaan voor de elongatie
van invadopodia [76]. Het actinebundelend eiwit fascine (FSN) is
ook aanwezig in
invadopodia en heeft er o.a. een stabiliserende rol [77], [78].
Mena, een lid van de
enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP)
eiwitten, is een ander eiwit dat
met regulatie van actinepolymerisatie geassocieerd wordt. Een
opregulatie van Mena werd
gezien bij invasieve kankercellen. Ook een splice isovorm van
Mena (MenaINV) werd
teruggevonden bij een invasief karakter. Uit de studie blijkt
dat vooral MenaINV een
belangrijke regulator is in invadopodiavorming. Het zorgt voor
stabilisering van invadopodia,
reguleert de respons op EGF signalisatie en verhoogt
beweeglijkheid [79].
-
25
Vanaf dat invadopodia een bepaalde lengte bereiken door
actinepolymerisatie, werd gezien
dat ook microtubuli aanwezig zijn in invadopodia. Door hun rol
in intracellulair transport en
ook door de aanwezigheid van vesikels in mature invadopodia,
wordt gesteld dat deze
microtubuli specifieke eiwitten aanbrengen, zoals de MMP’s. In
de latere stadia van mature
invadopodia werden ook intermediaire filamenten waargenomen.
Deze zouden mechanische
stabiliteit verlenen [80].
1.3.3.4 Rekrutering proteasen
Een eerste groep belangrijk in invadopodiagemedieerde ECM
degradatie zijn de matrix
metalloproteïnasen (MMP’s). Hierbij speelt het membrane type 1
matrix metalloproteinase
(MT1-MMP), ook wel aangeduid als MMP14, een centrale rol [81].
Enerzijds staat dit
protease zelf in voor degradatie van de ECM [82], anderzijds zal
MT1-MMP twee andere
leden van de MMP’s activeren, namelijk MMP2 [83] en MMP9 [84].
Het is een
membraangebonden eiwit (cfr. membrane type) in tegenstelling tot
MMP2 en MMP9, die
gesecreteerd worden in het extracellulaire milieu [81]. In de
literatuur worden verschillende
routes beschreven waarlangs MT1-MMP wordt aangebracht. Bij een
eerste route zal
interactie tussen IQGAP en het membraangebonden exocyst complex
leiden tot rekrutering
van MT1-MMP vesikels. Deze interactie staat onder de controle
van de Rho GTPasen Cdc42
en RhoA [85] (Figuur 8a). Het exocyst complex interageert ook
met het Wiskott-Aldrich
syndrome protein and Scar homolog (WASH) eiwit, behorend tot de
familie van Arp2/3
activators. WASH is aanwezig in welbepaalde subdomeinen van
MT1-MMP-bevattende late
endosomen. WASH en het exocyst complex zouden samenwerken in de
controle van de
verbinding tussen late endosomen en het plasmamembraan. Op die
manier zou MT1-MMP
getarget worden naar het plasmamembraan ter hoogte van de
invadopodia [86] (Figuur 8b).
Vervolgens zou het SNARE eiwit VAMP7 nodig zijn voor de fusie
tussen de membranen [86],
[87]. CRN is ook betrokken in de regulatie en lokalisatie van
MT1-MMP secretie ter hoogte
van invadopodia. Het eiwit is dus niet enkel belangrijk tijdens
de vorming van invadopodia
maar ook voor hun functionaliteit. Bovendien speelt CRN een rol
in de secretie van MMP2 en
MMP9 [63], [78] (Figuur 8c). Daarnaast wordt MT1-MMP activiteit
geregeld door endocytose.
Cdc42 interacting protein 4 (CIP4) stimuleert endocytose en zal
dus zorgen voor
verminderde ECM degradatie. CIP4 (en bijgevolg ook endocytose)
wordt geïnhibeerd door
Src-gemedieerde fosforylering van CIP4 [88]. Endocytose van
MT1-MMP wordt ook
verhinderd door β1-integrine [89]. Integrinen spelen eveneens
mee in een laatste route voor
rekrutering van MT1-MMP. Door adhesie van integrinen aan
collageen zou MT1-MMP
gemobiliseerd worden via een RAB8-afhankelijke secretorische
pathway [90] (Figuur 8d).
Naast de MMP’s spelen ook andere proteasen mee in ECM
degradatie. A disintegrin and
metalloproteinase (ADAM) familie proteasen dragen hiertoe bij
[82]. Naast de protease
activiteit, kan ADAM binden aan Tks5 en werd ADAM12 reeds
vermeld met een rol in
precursorvorming onder invloed van hypoxie (sectie 1.3.3.2). Een
laatste groep die bijdraagt
tot ECM degradatie zijn de serine proteasen, waaronder seprase
[82].
-
26
Figuur 8: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen
in rekrutering proteasen.
1.3.3.5 Verband tussen invadopodia en exosomen
Hoshino et al. suggereerde een nauw verband tussen invadopodia
en exosomen. Eerst werd
aangetoond dat MVE’s dynamisch associëren met invadopodia [91].
Dat MVE’s (of anders
late endosomen) associëren met invadopodia, werd terzelfdertijd
ook aangetoond door
Monteiro et al. [86] (sectie 1.3.3.4). Vervolgens werd de
invloed van exosomen op
invadopodia bekeken. Hierbij werd aangetoond dat exosoomsecretie
essentieel is voor zowel
vorming als functie van de invadopodia. Er werd gepostuleerd dat
invadopodiamaturatie en
ECM degradatie afhankelijk zijn van de aanvoer van MT1-MMP (en
mogelijks ook andere
proteasen) via exosomen, waarbij het MT1-MMP zich in het
membraan van het exosoom
bevindt. Bovendien werd waargenomen dat toevoeging van
opgezuiverde exosomen de
vorming van invadopodia kan induceren. Daarnaast werd de invloed
van invadopodia op
exosoomsecretie bestudeerd. Hierbij werd verondersteld dat
invadopodia essentiële docking
sites zijn voor MVE’s en dat de aanwezigheid van invadopodia
nodig is voor
exosoomsecretie [91]. Dit alles leidde tot de conclusie dat er
een mogelijk verband bestaat
tussen invadopodia en exosomen.
-
27
1.4 Nanobodies
Figuur 9: Conventioneel antilichaam (links), zware keten
antilichaam (midden) en nanobody met
bijhorende eigenschappen (rechts) (figuur aangepast uit
[92]).
Leden van de Camelidae-familie (bv. kamelen, lama’s en alpaca’s)
bezitten naast
conventionele antilichamen, zoals ook bij de mens aanwezig,
antilichamen zonder een lichte
keten (of zware keten antilichamen). Conventionele antilichamen
(Figuur 9, links) bestaan
enerzijds uit een zware keten met vier domeinen waarvan één
domein (N-terminus) variabel
is (VH) en de drie andere constant zijn (CH). Anderzijds bezit
het antilichaam ook een lichte
keten bestaande uit twee domeinen, waarvan één variabel (VL) en
één constant domein (CL).
De variabele domeinen van beide ketens samen met het eerste
constante domein van de
zware keten en het constante domein van de lichte keten vormen
samen het
antigeenbindend fragment (Fab-fragment). De twee overige
constante domeinen van de
zware keten zijn belangrijk in het rekruteren van de
immuuncellen en voor effector functies
(FC-fragment). Zware keten antilichamen (Figuur 9, midden)
bestaan uit tweemaal één
variabel (variable domain of heavy chain of heavy chain
antibodies, VHH) en twee constante
domeinen (CH). Deze eenvoudigere structuren zijn ook volledig
functioneel waarbij het
variabele domein equivalent is aan Fab in het conventionele
antilichaam. Wanneer deze
variabele domeinen geïsoleerd worden, blijven ze stabiel en
behouden ze hun
antigeenbindend vermogen. Deze geïsoleerde variabele domeinen
worden nanobodies
(Nbs) (Figuur 9, rechts) genoemd. Ablynx is een biofarmaceutisch
bedrijf dat deze Nbs
ontwikkelt [92], [93].
Het screeningsproces start met het immuniseren van kamelen of
lama’s met antigenen.
Bloed wordt afgenomen en de lymfocyten worden hieruit
geïsoleerd. Hierna wordt het mRNA
uit de lymfocyten geëxtraheerd om te vermenigvuldigen en om te
zetten naar cDNA via RT-
PCR. Dit cDNA wordt dan gekloneerd in een faagdisplay vector om
hiermee E. coli te
transformeren en een bank aan te maken (tot ca. 107
transformanten). Deze bank wordt
vervolgens gescreend op binding tussen Nb en zijn ligand
(antigeen) via panning. Na twee of
drie rondes van panning zijn de antigeenspecifieke klonen
voldoende aangerijkt om
hieropvolgend een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uit
te voeren. Met behulp
van ELISA worden de individuele klonen gescreend op de productie
van antigeenspecifieke
Nbs. Op dit punt kan overgegaan worden tot productie van de Nbs.
Hiervoor worden de Nbs
gekloneerd in een microbieel systeem voor fermentatie [93],
[94].
-
28
Nbs kunnen gemakkelijk in microbiële systemen geproduceerd
worden (milligram
hoeveelheden). Andere voordelen zijn de kleine omvang die ervoor
zorgt dat ze op moeilijk
bereikbare plaatsen kunnen raken en hun hoge affiniteit en
specificiteit voor hun doelwit. Ze
zijn robuust en kunnen lange tijd bewaard worden zonder hun
antigeenbindend vermogen te
verliezen (enkele weken bij 37°C, enkele maanden bij 4°C en
langer bij -20°C). Daarnaast
zijn ze niet-immunogeen o.a. door homologie met het variabele
domein van de zware keten
van het humane antilichaam [92]–[94].
Eigenschappen van Nbs kunnen aangepast worden naar wens. Zo
kunnen bijvoorbeeld
meerdere Nbs gecrosslinked worden om de specificiteit te
verhogen of de kritieke
concentratie, nodig voor het gewenste effect, te verlagen. Deze
samenvoeging gebeurt via
glycine-serine linkers van de C-terminus naar de N-terminus
[95]. Ook kunnen aanpassingen
gemaakt worden om de halfwaardetijd te veranderen. Zo kunnen Nbs
bijvoorbeeld gebonden
worden aan albumine [96].
Nbs vinden toepassingen als geneesmiddel maar kunnen ook
gebruikt worden in diagnostiek
en onderzoek. Als geneesmiddel vinden Nbs toepassingen in heel
wat verschillende takken
zoals hematologie, ademhalingsziekten, immunologie, oncologie en
botziekten. Reeds in
klinische trial is Caplacizumab (anti-vWF Nanobody), dat een
toepassing heeft in
trombotische trombocytopenische purpura (TTP) [94]. TTP is een
zeldzame bloedziekte
waarbij microthrombie gevormd worden, wat kan leiden tot
verstopping van kleine
bloedvaten en onvoldoende bloedtoevoer naar organen. De von
Willebrand factor (vWF)
speelt hierin een belangrijke rol. Deze vormt multimeren
(Ultra-Large vWF) en zal vervolgens
bloedplaatjes binden aan zijn A1-domein, wat leidt tot
bloedklontervorming. In gezonde
individuen worden deze multimeren geknipt door het enzym
ADAMTS13. Bij individuen die
leiden aan TTP is dit enzym defect. Caplacizumab bindt aan het
A1-domein waardoor
binding van bloedplaatjes en aggregaatvorming verhinderd wordt
[97]. Een toepassing van
Nbs binnen de diagnostiek is radiolabeling van een Nb voor
gebruik in positron emissie
tomografie (PET). Dit werd onderzocht voor de niet-invasieve
detectie van aderverkalking
[98]. Ook als biosensor of koppeling aan magnetische
nanopartikels zijn toepassingen
bekend [93]. Als laatste kunnen Nbs een handige tool zijn in
fundamenteel onderzoek. Zo
kunnen Nbs aangewend worden om functies van structurele eiwitten
te onderzoeken, een
techniek complementair met RNAi [99]. Zo werden recent Nbs
gebruikt om de functie van
actinebindende eiwitten te onderzoeken [78], [100]. In deze
thesis worden gekarakteriseerde
CRN Nbs aangewend om de rol van CRN in exosoomvorming te
bestuderen.
-
29
2 Materialen en methoden
2.1 Verband tussen cortactine en exosomen
2.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies
2.1.1.1 Celcultuur
MDA-MB-231 parentale humane borstkankercellen werden gebruikt.
Daarnaast werd ook
gebruikgemaakt van stabiele CRN NTA Nb2-EGFP en CRN SH3 Nb2-EGFP
MDA-MB-231
borstkankercellen. De genen, coderend voor deze EGFP-getaggeerde
Nbs, werden
binnengebracht in MDA cellen via transductie. Expressie van de
Nbs wordt geïnduceerd door
toevoeging van doxycycline (dox, Addendum Figuur 1). Alle
cellijnen werden opgegroeid in
DMEM waaraan 10% foetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicilline
en 100 µg/mL
streptomycine werd toegevoegd. De cellen werden geïncubeerd bij
37 °C en 10% CO2.
2.1.1.2 Antilichamen
Voor Western blot werd gebruikgemaakt van de volgende primaire
antilichamen: konijn
monoklonaal anti-CD63 (1:1000, ab134045, Abcam), konijn
polyklonaal anti-golgin 245
(1:1000, sc-102565, Santa Cruz), muis monoklonaal
anti-cytochroom C (1:1000, ab13575,
Abcam), konijn polyklonaal anti-calnexine (1:1000, sc-11397,
Santa Cruz) en konijn
polyklonaal anti-PMP70 (1:1000, ab85550, Abcam). Als secundaire
antilichamen werden
horseradish peroxidase-linked anti-muis en anti-konijn van GE
Healthcare aan een
verdunning van 1:2000 gebruikt. Alle verdunningen gebeurden in
5% melkoplossing (5%
mager melkpoeder in Tris buffered saline met 1% Tween20,
afgekort TBS-T).
2.1.1.3 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie
Ter voorbereiding werd een grote hoeveelheid cellen opgegroeid.
Hiervoor werden vijf T175
celcultuurflessen per conditie aangelegd.
- Dag 1: Exosomen afkomstig van FBS werden weggewassen. Hiervoor
werden de T175
celcultuurflessen driemaal gewassen met serumvrij medium (DMEM
met 100 U/mL
penicilline en 100 µg/mL streptomycine). Vervolgens werd 10 mL
serumvrij medium
toegevoegd aan elke cultuurfles. Twee condities werden
meegenomen. Enerzijds bleven
vijf T175 celcultuurflessen onbehandeld (- dox). Anderzijds werd
er aan vijf andere
doxycycline toegevoegd aan een verdunning van 1:4000 (+ dox). De
cellen werden
daarna gedurende 24 h geïncubeerd bij 37 °C en 10% CO2.
- Dag 2: Na 24 h werd het medium, dat de exosomen bevat,
afgenomen en verzameld per
conditie (- dox, + dox). Vers serumvrij medium (- dox of + dox)
werd toegevoegd. Het
afgenomen medium werd gecentrifugeerd gedurende 4 min aan 800
rpm ter verwijdering
van cellen en debris. Daarna werd het medium achtereenvolgens
gefilterd doorheen een
0,45 µm en 0,22 µm filtermembraan, ter verwijdering van grotere
vesikels en het overige
debris.
- Dag 3: Na 48 h werd het medium met de exosomen een tweede maal
afgenomen waarna
dezelfde centrifugatie en tweevoudige filtratie werd uitgevoerd.
Na het medium
afgenomen te hebben, werden de cellen getrypsiniseerd en geteld
met een Bürker
telkamer. De exosomen werden na filtratie opgeconcentreerd
waarvoor de Amicon Ultra-
15 Centrifugal Filter Unit (Millipore) met een nominaal
moleculair gewicht limiet van
10 kDa gebruikt werd. Het gefilterde medium werd gediafiltreerd
(4000 x g bij 4 °C) tot een
volume kleiner dan 500 µL bekomen werd. Deze opgeconcentreerde
exosomen werden
-
30
vervolgens geladen op een discontinue iodixanolgradiënt. Deze
gradiënt bestond uit 3 mL
40% iodixanoloplossing, 3 mL 20% iodixanoloplossing, 3 mL 10%
iodixanoloplossing en
2,5 mL 5% iodixanoloplossing aangebracht in een 12 mL
polyallomeer tube (Beckman
Coulter). Deze oplossingen werden bekomen door het mengen van
een iodixanol working
solution met een homogenization buffer (0,25 M sucrose, 1 mM
EDTA, 10 mM Tris-HCL
pH 7,4). De working solution bestond uit een working buffer
(0,25 M sucrose, 6 mM,
EDTA, 60 mM Tris-HCl pH 7,4) en een stockoplossing OptiPrep (60%
(w/v) iodixanol
oplossing). Na het laden van de exosomen op de gradiënt werd dit
gecentrifugeerd
gedurende 18 h aan 100 000 x g bij 4 °C (SW41Ti rotor, Beckman
Coulter).
- Dag 4: Fracties van 1 mL werden afgenomen en opgelost in 10 mL
phosphate buffered
saline (PBS, zonder Ca2+ en Mg2+) in een 12 mL polyallomeer tube
(Beckman Coulter). De
fracties werden daarna gedurende 3 h gecentrifugeerd aan 100 000
x g bij 4 °C (SW41Ti
rotor, Beckman Coulter). De verkregen pellet werd
geresuspendeerd in 50 µL PBS en
uitverdeeld over drie volumes, meer bepaald 5 µL, 20 µL en 25
µL. Dit werd bewaard
bij - 80 °C.
2.1.1.4 Western blot
Om te weten in welke fracties, verkregen na de OptiPrep
densiteitsgradiënt ultracentrifugatie,
exosomen aanwezig waren, werd aan de 5 µL fracties 1,5 µL 5x
sample buffer (5% SDS,
20% glycerol, 0,2% broomfenolblauw, 5% -mercapto-ethanol, 65 mM
Tris-HCl) toegevoegd.
De fracties werden geladen op een 10% polyacrylamidegel. Ook
werd er 60 µg ruw extract
(gelyseerde parentale MDA cellen) waaraan 5x sample buffer werd
toegevoegd, geladen.
Vervolgens werd SDS-PAGE (40 mA) uitgevoerd waarbij
gebruikgemaakt werd van een Tris-
glycine running buffer. Na scheiding werden de eiwitten
getransfereerd naar een
nitrocellulosemembraan. Het blotten werd gedurende 3 h aan 45 V
of overnacht aan 25 V
uitgevoerd. Dan werden de membranen gedurende 1 h geblokkeerd in
5% melkoplossing
waarna overnacht geïncubeerd werd met het primair antilichaam
(anti-CD63) op een rotor bij
4 °C. Incubatie met het secundaire antilichaam gebeurde
gedurende 1 h op een rotor bij
kamertemperatuur nadat de membranen eerst gewassen werden met
TBS-T (3 x 4 min). Na
de incubatie werd opnieuw een wasstap met TBS-T (3 x 4 min)
uitgevoerd en werden de
membranen ontwikkeld. Hiervoor werden de membranen gedurende 1
min geïncubeerd met
een oplossing van 50% peroxide solution (detection reagent 1,
Thermo Scientific) en 50%
luminol enhancer solution (detection reagent 2, Thermo
Scientific). De detectiereagentia
reageren met behulp van het horseradish peroxidase gelinkt aan
het secundaire antilichaam
en geven daarbij licht vrij. Dit lichtsignaal werd vastgelegd op
een chemiluminescentie
detectiefilm (Amersham Hyperfilm ECL).
Voor het nagaan van de zuiverheid van de exosoombevattende
fracties, werden alle 25 µL
fracties van één OptiPrep densiteitsgradiënt
ultracentrifugatie-reeks onderworpen aan
badsonicatie gedurende 1 h voorafgaand aan SDS-PAGE. Aan de
fracties werd 7 µL 5x
sample buffer toegevoegd. Ook hier werd ruw extract meegenomen.
Voor het blotten werd
het programma van 3 h (45 V) gebruikt. Het
nitrocellulosemembraan werd geknipt ter hoogte
van 25 kDa alvorens te incuberen met de primaire antilichamen.
Incubatie van de bovenste
helft (>25 kDa) gebeurde met anti-golgin 245 en incubatie van
de onderste helft (
-
31
2.1.1.5 Exosoomkwantificatie via nanoparticle tracking
analysis
Aan de hand van een Western blot werd bepaald in welke fracties
exosomen aanwezig
waren. In deze fracties werd het aantal exosomen bepaald via
nanoparticle tracking analysis
(NTA). NTA werd uitgevoerd gebruikmakend van de NanoSight
LM10-HS met een violet
(405 nm) lasersysteem. De exosoomfracties werden verdund in PBS
opdat de concentratie
binnen het lineaire gebied van de standaardcurve zou vallen (3 x
108 – 1 x 109 partikels/mL).
Per staal werden drie video’s van 30 s opgenomen waarbij de
temperatuur telkens
bijgehouden werd. De video’s werden vervolgens geanalyseerd
(concentratie partikels per ml
en grootte) met de NTA software. Uit de concentratie partikels
per ml kon dan het aantal
exosomen per cel berekend worden.
2.1.1.6 Statistische analyse
Voor elke cellijn werden drie herhalingen uitgevoerd.
Normaliteit werd nagegaan met de
Kolmogorov-