Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau “Tumor-infiltrierende Lymphozyten beim Glioblastoma multiforme” Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Christian Beyer aus Hersbruck
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Aus der Strahlenklinik der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau
“Tumor-infiltrierende Lymphozyten beim Glioblastoma multiforme”
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Christian Beyer
aus
Hersbruck
Gedruckt mit Erlaubnis derMed izi n ischen Faku ltät der Fri edri ch -Alexander-U n iversität
Verfahren bereitgestellt. Die TMA®-Technik ermöglicht eine effiziente
immunhistochemische Untersuchung zahlreicher Patienten (Kononen et al.
1998). Aus einem Spenderblock, der das in Paraffin gegossene Tumorgewebe
enthält, wird eine repräsentative, zylinderförmige Stanze gewonnen. Diese
wird in einen „leeren“ Paraffinempfängerblock übertragen. Da der
Empfängerblock zahlreiche Stanzen aus verschiedenen Spenderblöcken
aufnehmen kann, können zahlreiche Tumorproben gleichzeitig
immunhistochemisch untersucht werden. Nachdem alle Stanzen in den
Empfängerblock übertragen sind, werden sie durch Erwärmen des Paraffins
(10 min; 43°C) im Empfängerblock fixiert (AlphaMetrix 2005). Danach können
vom Empfängerblock Leerschnitte gewonnen und anschließend gefärbt
werden (Abb. 3).
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Der Durchmesser eines Stanzzylinders beträgt 2 mm und repräsentiert nur
einen kleinen Ausschnitt des gesamten Tumors. Dementsprechend sorgfältig
muss die Lokalisation der Stanze im Spenderblock beziehungsweise im
Tumorgewebe vorab gewählt werden. In dieser Studie wurden mit Hilfe von
Hämatoxylin-Eosin (HE)-Schnitten der Spenderblöcke repräsentative
Tumorbereiche aufgesucht. Diese Bereiche wurden auf den Spenderblöcken
markiert, um dort genau definiert die Stanzen zu gewinnen. Zur Anfertigung
der TMA® diente der Manuelle Tissue Arrayer (MTA)-1 (Beecher Instruments,
Wisconsin, USA). Pro Untersuchungsfall wurden mindestens zwei Stanzen
aus der sehr zelldichten Tumorhauptmasse untersucht sowie eine weitere im
Infiltrationsbereich, wo die Tumorzellen das Normalgewebe infiltrieren. Eine
eindeutige Infiltrationszone konnte jedoch nicht für alle Tumorproben bestimmt
werden. Die Stanzen wurden fern von nekrotischen Arealen gewonnen. Pro
Patient wurden drei Stanzen angefertigt, gefärbt und ausgewertet (Abb. 4).
Abb. 3: TMA-Anfertigung mit dem Beecher MTA-1. Grafik entnommen aus der deutschsprachigen Bedienungsanleitung für den Manuellen Tissue Arrayer (MTA)-1 (AlphaMetrix Biotech GmbH).
Abb. 4: Fertiger TMA® nach anti-CD3-Färbung und ein Untersuchungsfeld in verschiedenen Vergrößerungen.
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mouse- anti-human CD8
B-Lymphozyten CD20 DAKO Cytomation,
mouse-anti-human CD20 1 : 500
Makrophagen und Mikroglia CD68 DAKO Cytomation,
mouse-anti-human CD68 1 : 200
Regulatorische T-Zellen FoxP3 Abcam, mouse anti-
human FoxP3 1 : 100
Gefäßmarker CD34 DAKO Cytomation;
mouse-anti-human CD34 1 : 200
Die Schnitte wurden mit einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert, in der
Mikrowelle thermisch vorbehandelt und mit der Biotin-Streptavidin-Komplex-
Methode entsprechend der Protokolle der Hersteller gefärbt. Bei FoxP3 kam
eine Verstärkung mit Tyramin zum Einsatz.
3.1.4. Bildanalytisch-gestützte Auswertung mit BIOMAS®
Die Auswertung der TMA erfolgte mit einem bildanalytisch-gestützten
Verfahren. Die 2 mm-Stanzen wurden in 200-facher Vergrößerung als
Serienbild mit dem Leica DM 6000 B Mikroskop (Leica, Wetzlar)
aufgenommen. Damit war die Begutachtung einer Stanze im Ganzen möglich.
Das Serienbild wurde mit der BIOMAS®-Software ausgewertet (MSAB,
Erlangen). Zunächst wurden die Vaskularisierung und die Gesamtzellzahl
erfasst. Grundlage waren die mit dem Gefäßmarker CD34 gefärbten TMA. Die
Gefäßinnenwände wurden markiert, womit BIOMAS® die Gefäßfläche jedes
einzelnen Gefäßes und die Gesamtgefäßfläche berechnete. Die durch die HE-
Färbung blau gefärbten Zellkerne wurden ebenfalls markiert und von
BIOMAS® gezählt. Zusätzlich ermittelte BIOMAS® den jeweils kürzesten
Abstand von den markierten Zellen zur Gefäßinnenwand. Die Daten zur
Vaskularisierung und Gesamtzellzahl wurden durch die ausgewertete Fläche
(Region of interest; ROI) dividiert, so dass die Ergebnisse auf
Flächeneinheiten bezogen werden konnten (Abb. 5).
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Abb. 5: Anti-CD34-Färbung zur Erfassung von Gesamtzellzahl und Vaskularisierung. Rot unterlegt sind markierte Gefäße. Die blauen Sternchen kennzeichnen Zellkerne in HE-Färbung für die Gesamtzellzahlbestimmung.
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In einem zweiten Schritt erfolgte die Auswertung der TIL. Hierzu wurden
neben den Lymphozyten wiederum die Gefäßinnenwände markiert, um den
Abstand zwischen Lymphozyt und dem nächstgelegenen Gefäß erfassen zu
können. Durch Markierung der ROI war wiederum der Bezug zu einer
Flächeneinheit möglich. Die Anzahl der TIL wurde durch die zuvor ermittelte
Gesamtzellzahl dividiert, um den relativen Anteil der TIL im Tumorgewebe
ermitteln zu können (Abb. 6).
Abb. 6: Erfassung der Lymphozytenanzahl sowie der Abstände der Lymphozyten zum jeweils nächstgelegenen Gefäß am Beispiel einer CD8+-Färbung. Rot unterlegt sind Gefäße. Die Grüne Pfeile markieren das Lot der CD8+ TIL auf das nächstgelegene Gefäß. Die orangefarbenen Pfeile zeigen den Abstand eines Lymphozyts zum nächstgelegenen Lymphozyten.
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3.1.5. Statistische Analyse
Am Ende der Auswertung der TMA® lagen pro Tumorprobe folgende
Datensätze vor:
- Gesamtzellzahl pro Tumorfläche
- Gefäßfläche in Relation zur Gesamtfläche
- Anzahl der TIL relativ zur Gesamtzellzahl
- Abstände der TIL zum nächstgelegenen Gefäß
Die aus den immunhistochemischen Untersuchungen gewonnen Daten
wurden zusammen mit den dazugehörigen klinischen Daten aus dem Erlanger
Tumorzentrum in das Statistikprogramm SPSS (SPSS Software GmbH,
München) übertragen. Die statistische Überlebenszeitanalyse erfolgte mit der
Cox-Regression und dem Kaplan-Meier-Schätzer. Endpunkt der Analyse war
der Tod der Patienten. Der Beobachtungszeitraum erstreckte sich folglich vom
Tag der neurochirurgischen Operation bis zum Tod des Patienten. Die
Abhängigkeit des Gesamtüberlebens von den verschiedenen
immunhistochemischen Charakteristika wurde mit dem Logrank-Test geprüft.
Für die Überlebenszeitanalyse wurden die Patienten anhand der
immunhistochemischen Daten jeweils in zwei Gruppen aufgeteilt.
Die Trennung erfolgte entweder am Median oder an der 66 %-Perzentile der
immunhistochemischen Datensätze. Bei annähernder Normalverteilung der
Datensätze wurde die Trennung am Median durchgeführt, dagegen wurden
die Datensätze an der 66 %-Perzentile getrennt, wenn im oberen Drittel der
Verteilung ein ausgeprägter Peak zu erkennen war. Eine Auswertung des
progressionsfreien Überlebens mit dem Endpunkt der Tumorprogression war
nicht möglich, da die klinischen Daten hierfür lückenhaft waren. Neben der
Analyse der immunhistochemischen Daten, wurde der mögliche Einfluss von
Patientenalter und Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)-Index (Oken
et al. 1982) auf das Gesamtüberleben der Patienten untersucht.
Patientenalter, Karnofsky-Index und MGMT-Promotor-Status sind die
einzigen, beim GBM etablierten prognostischen Faktoren. Da der Karnofsky-
Index vom Tumorzentrum für diese Studie nicht erfasst worden war, wurde der
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ECOG-Index ersatzweise untersucht. Daten über den MGMT-Promotor-Status
der Patienten standen nicht zur Verfügung, da dessen routinemäßige
Bestimmung erst 2008 in Erlangen eingeführt wurde.
3.2. Chemokinetischer Migrations-Assay
3.2.1. Das Prinzip der 2-dimensionalen Boyden-Chamber
Zahlreiche verschiedene Methoden zur Analyse von Zellmigration wurden
bereits etabliert (Entschladen et al. 2005). Der 2-dimensionale Filter-Assay
wurde 1962 von Boyden erstmalig beschrieben (Boyden 1962). Eine obere
Kammer wird durch einen Filter mit definierter Porengröße von einer unteren
Kammer getrennt. Um Chemotaxis und Migration an Immunzellen zu
untersuchen, werden in die obere Kammer Immunzellen und in die untere ein
Lockstoff gegeben. Die obere Kammer ist partiell in die untere Kammer
eingetaucht. Der Lockstoff kann nun über die Membran in die obere Kammer
diffundieren, die Immunzellen in die untere Kammer migrieren (Abb. 7).
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Da der Diffusionsprozess sehr schnell vonstatten geht, kann man mit der
„klassichen“ Boyden-Chamber zwar Chemokinetik jedoch nicht Chemotaxis
analysieren. Chemotaxis beschreibt die gerichtet Migration an einem
Konzentrationsgradienten, Chemokinetik hingegen die ungerichtete Migration,
die durch Chemokine gesteigert werden kann. Der rasche
Abb. 7: Prinzip der modifizierten Boyden Chamber: Nach Probengewinnung (Lymphozyten und Tumorüberstände) folgt die Migration in der Boyden Chamber. Die migrierten Lymphozyten können mit Hilfe verschiedener Meßverfahren (Mikroskopie, Multi-Assay-Reader, Flußzytometrie) detektiert werden.
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Konzentrationsausgleich wurde für das in dieser Studie verwendete 96-well
Millipore-MultiScreen®-System mit Hilfe des Farbstoffes Toluolblau
nachgewiesen. In die unteren Kammern wurde statt des Lockstoffes in Wasser
gelöstes Toluolblau gegeben. In den oberen Kammern befand sich
ungefärbtes destilliertes Wasser. Die Konzentrationen von Toluolblau in den
oberen Kammern wurden nach definierten Zeiten photometrisch bestimmt.
In die obere Kammer des Versuchsystems nach Boyden werden Lymphozyten
im Überschuss gegeben. Man geht von einer Migrationsfraktion von circa
10 % der vorgelegten Zellen aus (Entschladen 2005). Abhängig von der
Größe und der Migrationsgeschwindigkeit stimulierter und unstimulierter
Zellen muss zunächst das passende System, in erster Linie der passende
Filter beziehungsweise die passende Membran, gefunden werden. Zu
beachten sind Unterschiede im Membranmaterial, in der Membrandicke, in
Porengröße und Porendichte (NeuroProbe 2006).
Für diese Versuche kam das 96-well MultiScreen®-System von Millipore
(Millipore, Billerica, MA, USA) mit einem Porendurchmesser von 3 µm zur
Anwendung. Die relativ dünnen Millipore-Membranen eignen sich gut für die
Detektion migrierter Lymphozyten an der Membranunterseite mittels
Immunofluoreszenzfärbung- und Mikroskopie. Dickere Filter, zum Beispiel die
ThinCertTM-Membran (Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen), führen bei
der Mikroskopie zu einem stärkeren Hintergrund (Abb. 8). Die Porengröße von
3 µm wird vom Hersteller für Migrationsuntersuchungen an Lymphozyten
empfohlen, jedoch können auch 5 µm Poren bei verkürzter Migrationszeit
eingesetzt werden (Ott 2005).
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Zur Detektion der migrierten Zellen kommen üblicherweise drei Verfahren zum
Einsatz, die auch bei Etablierung der Migrations-Assays im Vorfeld dieser
Studie getestet worden waren:
1) Bildanalytische Erfassung der migrierten Lymphozyten an der
Membranunterseite nach Fixierung und DAPI- Färbung
2) Bestimmung der in die untere Kammer gewanderten Lymphozyten mittels
Flußzytometrie
3) Detektion der in die untere Kammer migrierten Lymphozyten mit Hilfe
eines Multi-Assay-Readers nach Fluoreszenzfärbung mit in vivo-
Farbstoffen
Bei der bildanalytischen Erfassung der migrierten Lymphozyten wurden die
Lymphozyten an der Membranunterseite am Ende der Migrationszeit mit 4 %
Formaldehydlösung für 15 min fixiert, mit 0,1 % Triton-X-Lösung für 10 min
permeabilisiert und mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA) gefärbt. Dazu wurden 0,3 µl DAPI in 1 ml Standard saline
citrate (SSC) / Tween (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) verdünnt. Die
Membran wurde auf einen Objektträger gelegt, mit Vectashild® (Vector
Laboratories Inc., Burlingame, CA) eingedeckt und dann als Serienbild mit
dem Leica DM 6000 B Mikroskop (Leica, Wetzlar) aufgenommen. Die mit dem
Abb. 8: ThinCert®- (links) und MultiScreen®- (rechts) Membran bei Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop.
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Fluoreszenzfarbstoff DAPI gefärbten Lymphozyten wurden mit dem
Gefäßfläche prozentual an Gesamtfläche in % mit Mittelwert, Median und Standardabweichung Tumor Infiltrationszone 6,26E-02 4,92E-02 ± 4,25E-02
4,75E-02 2,98E-02 ± 5,02E-02
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Starke interindividuelle Schwankungen ließen sich auch in der Anzahl der
MIB1+-Zellen sowie in der Vaskularisierung von Tumorhauptbereich und
Infiltrationszone beobachten. Im Mittel waren im Tumorhauptbereich 9,18 %
und in der Infiltrationszone 3,91 % aller Zellen positiv für den
Proliferationsmarker MIB1. 6,26 % der Gesamtfläche des
Tumorhauptbereiches waren durch Gefäß- und Gefäßmalformationen besetzt.
Im Infiltrationsbereich betrug die Gefäßfläche bemessen an der Gesamtfläche
3,91 % (Tab. 5).
Bei der Begutachtung der mittels Immunhistochemie gefärbten Tumorschnitte
fiel auf, dass die TIL vermehrt um die Gefäße lokalisiert waren. Diese
Beobachtung war bereits vielfach in der Literatur beschrieben und dort als
„perivascular cuffs“ oder perivaskuläre Infiltrate bezeichnet worden. Zur
genaueren Quantifizierung der perivaskularen Infiltrate wurden mittels
Computer-gestützter Bildanalyse der jeweils kürzeste Abstand eines TIL zum
nächst gelegenen Gefäß ermittelt (Tab. 6).
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Aus diesen Abständen ließ sich für jeden Patienten eine Verteilung der TIL in
Abhängigkeit vom Abstand zum Gefäß bilden und graphisch darstellen (Abb.
17). Eine mittlere, standardisierte Verteilung über alle Patienten zeigte, dass
die CD3+, die CD8+ und die CD20+-Lymphozyten vermehrt in einem Bereich
von bis zu 30 µm um das Gefäß lokalisiert waren (Abb. 18).
Tab. 6: Abstände „Zelle zu Gefäß“ in µm in Abhängigkeit vom Zelltyp
Anteil der Zellen in Abhängigkeit vom Abstand zum Gefäß (µm)
Zelltyp Mittelwert, Median und Standardabweichung in µm
0 bis 30 30 bis 60
60 bis 90
> 90
Alle Zellen
48,87 35,28 ± 20,635
0,426 0,397 ± 0,231
0,308 0,322 ± 0,108
0,139 0,145 ± 0,093
0,127 0,040 ± 0,176
MIB1 29,74 26,70 ± 10,03
0,591 0,573 ± 0,183
0,324 0,333 ± 0,145
0,071 0,050 ± 0,070
0,015 0,000 ± 0,037
CD68 28,23 22,86 ± 8,68
0,646 0,639 ± 0,202
0,262 0,270 ± 0,135
0,067 0,043 ± 0,078
0,025 0,000 ± 0,056
CD3 24,86 18,10 ± 19,21
0,712 0,750 ± 0,252
0,219 0,174 ± 0,224
0,049 0,000 ± 0,119
0,020 0,000 ± 0,057
CD8 21,99 16,37 ± 9,11
0,749 0,758 ± 0,209
0,190 0,158 ± 0,170
0,048 0,000 ± 0,095
0,013 0,000 ± 0,072
CD20 23,17 15,55 ± 31,17
0,733 0,852 ± 0,320
0,252 0,143 ± 0,309
0,014 0,000 ± 0,087
0,001 0,000 ± 0,007
FoxP3 25,66 18,65 ± 18,93
0,713 0,750 ± 0,280
0,206 0,178 ± 0,228
0,065 0,000 ± 0,151
0,016 0,000 ± 0,067
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Abb. 18: Relative Verteilung der Zellen in Abhängigkeit des Abstandes zum jeweils nächsten Gefäß in µm.
Abb. 17: Relative Verteilung der CD8+-Lymphozyten in Abhängigkeit des Abstandes (in µm) zum jeweils nächsten Gefäß für die Ermittlung des Cutoff-Wertes.
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Mehr als 70 % der dieser TIL Subpopulationen befanden sich innerhalb der
30 µm-Zone um das nächstliegende Gefäß. Als Referenz diente eine für alle
im Tumor befindlichen Zellen ermittelte Verteilung. Die mittlere
Gesamtzellverteilung konnte näherungsweise als eine Verteilung der
Tumorzellen betrachtet werden, da die Tumorzellen mit Abstand den größten
Anteil aller Zellen im GBM ausmachten. Danach lagen nur 42,6 % der
Tumorzellen innerhalb der 30 µm-Zone des nächst gelegenen Gefäßes.
Die CD68+ Mikroglia/Makrophagen, von denen bekannt ist, dass sie sich in
einer genau definierten räumlichen Distanz zueinander im Hirngewebe
anordnen, zeigten eine geringere Affinität zu den nächstliegenden Gefäßen
als die Lymphozyten. 64,6 % der gegen CD68 gefärbten Zellen war innerhalb
der ersten 30 µm vom Gefäß lokalisiert. Schließlich befanden sich die MIB-1+
Zellen ebenfalls vermehrt in der Nähe des nächstliegenden Gefäßes. Dabei
blieb unklar, ob diese Beobachtung als Confounding-Effekt gewertet werden
sollte, da aktivierte Immunzellen ebenfalls vermehrt den Proliferationsmarker
MIB1 exprimieren. Tumorzellen in unmittelbarer Nähe zu den Gefäßen
könnten aber auch eine erhöhte MIB1-Expression vorweisen, da sie in
Gefäßnähe eine bessere Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und
endokrine Botenstoffen vorfinden (Tab. 5).
In der graphischen Aufarbeitung der mittleren, standardisierten Verteilungen
von TIL und Tumorzellen (Abb. 18) zeigte sich ein Schnittpunkt zwischen der
Verteilungslinie der TIL (bunt) und der Gesamt-/Tumorzellen (schwarz) bei
etwa 30 µm Abstand zum Gefäß. Innerhalb der ersten 30 µm war der
standardisierte Anteil der TIL größer, außerhalb der 30 µm-Zone waren
vermehrt Tumorzellen lokalisiert. Diese Beziehung zeigte sich auch, wenn
anstatt der mittleren Gesamtverteilungen von TIL und Gesamt-/Tumorzellen,
die patientenspezifischen, standardisierten Verteilungen, zum Beispiel für die
CD8+ Lymphozyten, auftragen wurden (Abb. 17). Die perivaskuläre 30 µm-
Zone erwies sich somit als geeigneter Parameter, um die Verteilungen der
verschiedenen Lymphozytensubpopulationen zu vergleichen sowie
interindividuelle Unterschiede in den TIL-Verteilungen zu charakterisieren und
55
hinsichtlich ihrer prognostischen Bedeutung für das Patientenüberleben zu
untersuchen.
4.1.3. Prognostische Bedeutung der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten
Zur Überlebenszeitanalyse mit Hilfe der Cox-Regression sowie des Kaplan-
Meier-Schätzers wurden die Patienten anhand der immunhistochemischen
Daten gruppiert. Die Aufteilung in zwei Gruppen erfolgte bei der Untersuchung
des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von Gesamt-/Tumorzellzahl, MIB1+-
Zellzahl und Gefäßfläche jeweils am Median. Bei der Analyse der Ergebnisse
aus den Abstandsmessungen erfolgte die Trennung ebenfalls am Median. Die
verschiedenen Datensätze waren dabei näherungsweise normalverteilt
(Abb. 19).
Mittelwert 2902 Median 2777 Standardabweichung 1507
Gesamtzellen pro mm² im Tumorhauptbereich
66 %-Perzentile 3553 Abb. 19: Anzahl der Gesamtzellen pro mm² Tumorfläche im Tumorhauptbereich (Histogramm).
56
Bei der Analyse des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von der Anzahl der
TIL erfolgte die Trennung des Patientenkollektivs hingegen an der 66 %-
Perzentile. Der Grund dafür waren Peaks im oberen Drittel der TIL-
Verteilungen (Abb. 20). Zudem schien die Trennung an der 66 %-Perzentile
besser geeignet, das Langzeitüberleben in Abhängigkeit von der Anzahl der
TIL zu untersuchen. Die kleine Gruppe der Langzeitüberleber könnte, so die
Vorstellung, durch eine 1/3- zu 2/3-Trennung des Patientenkollektivs besser
erfasst werden. Die Überlebenszeitanalyse in Abhängigkeit der
immunhistochemischen Charakteristika erfolgte nur für den
Tumorhauptbereich. Der Tumorinfiltrationsbereich wurde nicht ausgewertet,
da er nicht für alle Tumorproben eindeutig definiert werden konnte.
Die Cox-Regressions-Analyse des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit der
verschiedenen immunistochemischen Variablen, ließ lediglich auf eine
Mittelwert 34,7 Median 16,6 Standardabweichung 42,4
CD8+-Lymphozyten pro mm² im Tumorhauptbereich
66 %-Perzentile 27,6 Abb. 20: Anzahl der CD8+-Lymphozyten pro mm² Tumorfläche im Tumorhauptbereich (Histogramm).
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prognostische Bedeutung der CD68+ Mikroglia/Makrophagen schließen. Mit
einem Hazard Ratio von 0,49 bei einem 95 %-Konfidenzintervall von 0,25 bis
0,95 erwiesen sich die CD68+ als prognostisch günstig. Eine vermehrte
Infiltration mit CD68+-Zellen ging mit einem längeren Überleben der Patienten
einher, was in der Kaplan-Meier-Überlebenskurve veranschaulicht wurde
(Tab. 7).
Die prognostische Bedeutung der CD68+ Mikroglia/Makrophagen bestätigte
sich bei Anwendung des Logrank-Tests (Abb. 21). Bei der Cox-Regression
deutete sich eine prognostische Bedeutung der CD3+-TIL sowie der relativen
Gefäßfläche im Tumor an, ohne dass eine Signifikanz mit 5 %-
Signifikanzniveau abgeleitet werden konnte.
Tab. 7: Hazard Ratio und 95 %-Konfidenzintervall aus der Cox-Regressions-Analyse von Gesamtüberleben in Abhängigkeit der TIL.
95 %-Konfidenzintervall Zelltyp Hazard
Ratio Unteres Oberes
Gruppiert nach
MIB-1 1,01 0,58 1,78 Median
CD3 0,54 0,29 1,02 66 %-Perzentile
CD8 0,65 0,35 1,22 66 %-Perzentile
CD20 0,64 0,34 1,21 66 %-Perzentile
CD68 0,49 0,25 0,95 66 %-Perzentile
FoxP3 0,62 0,34 1,16 66 %-Perzentile
Gesamt 1,35 0,80 2,29 Median
Gefäße 0,58 0,34 1,00 Median
58
In der Überlebenszeitanalyse mit Kaplan-Meier-Schätzer und Logrank-Test
hatte die Tumorzelldichte für das Gesamtüberleben der Patienten eine
prognostische Bedeutung. Eine Tumorzelldichte von größer als
2794 Zellen/mm² war ein prognostisch negativer Faktor für das
Gesamtüberleben, wenn auch, bei einem p-Wert von 0,048, von schwacher
Signifikanz (Abb. 22). Dennoch scheint es plausible, dass eine hohe Zelldichte
ein hochmalignes Geschehen mit hoher Wachstums- und
Ausbreitungstendenz repräsentieren könnte.
Abb. 21: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der CD68+-Zellen bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
59
Eine erhöhte Tumorvaskularisierung ging mit einer verbesserten Prognose der
Patienten einher. Patienten mit einer Gefäßfläche von mehr als 4,9 % der
Gesamtfläche überlebten signifikant länger (p = 0,049) im Vergleich mit
Patienten mit geringerer Tumorvaskularisierung (Abb. 23). Über mögliche
Ursachen lässt sich nur spekulieren. Dabei könnte eine erhöhte
Sauerstoffversorgung eine entscheidende Rolle spielen, da eine ausreichende
Tumoroxygenierung eine Voraussetzung für eine wirkungsvolle Therapie mit
ionisierender Strahlung und Antineoplastika ist.
Tumorhypoxie, hervorgerufen durch eine verringerte Sauerstoffversorgung
des Tumors, könnte dagegen die Proliferation von Tumorzellen stimulieren.
Beispielsweise stimuliert HIF-1α, der zentrale Mediator der zellulären Antwort
auf Hypoxie, Zellproliferation- und Überleben (Vaupel et al. 2007). Eine
geringe Tumorvaskularisierung würde eine verminderte Sauerstoffversorgung
Abb. 22: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von der Zelldichte im Tumorhauptbereich pro mm² Tumorfläche.
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des Gewebes bedingen, was in den Tumorzellen Proliferations- und
Überlebenssignale aktiviert. Dies wiederum könnte das Tumorwachstum
beschleunigen und die Prognose der Patienten letztendlich verschlechtern.
Beide Hypothesen ließen sich mit den Ergebnissen aus den
immunhistochemischen Untersuchungen jedoch nicht belegen. Die
immunhistochemische Markierung der Gefäße mit CD34 sowie die
bildmorphologischen Kriterien ermöglichten keine eindeutige Unterscheidung
zwischen funktionellen Gefäßen und Gefäßmalformationen.
Gefäßmalformationen, die Ausdruck der dysregulierten Angiogenese und
Vaskulogenese im GBM sind, tragen schließlich kaum zu einer ausreichenden
Blutversorgung des Tumorgewebes bei.
Abb. 23: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von der Gefäßfläche bezogen auf die Tumorgesamtfläche.
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Die Marker MIB-1, CD3, CD8 und CD20 erwiesen sich nicht als prognostische
bedeutende Faktoren für das Überleben der Patienten. Lediglich bei den CD3+
T-Lymphozyten war eine vermehrte Infiltration tendenziell mit einen
verlängerten Überleben verbunden (Abb. 24). Die mögliche prognostische
Bedeutung der FoxP3+ TIL war die Hauptfragestellung der
immunhistochemischen Untersuchungen am Erlanger Patientenkollektiv. In
anderen Tumorerkrankungen war den immunsupprimierenden FoxP3+ TIL
eine prognostisch negative Bedeutung, im Sinne einer
Überlebenszeitverkürzung zugeschrieben worden. Man nahm an, dass
Tumorzellen die FoxP3+-TIL gezielt anlocken und sich damit ein Immunprivileg
verschaffen könnten (Zitvogel 2006).
Zuletzt war in einigen Tumorentitäten auch die Expression von FoxP3+ durch
die Tumorzellen selbst beschrieben worden (Ebert 2008; Hinz 2007; Zuo
2007). Bei den Untersuchungen des Erlanger Patientenkollektivs zeigten die
mit FoxP3 gefärbten Zellen ausschließlich histomorphologische Kriterien von
Lymphozyten. Die mit FoxP3 gefärbten Zellkerne waren klein, dicht und rund.
Der Zytoplasmasaum der FoxP3 gefärbten Zellen war sehr schmal. Insgesamt
waren die FoxP3 gefärbten Zellen deutlich kleiner als die Tumorzellen. Damit
zeigte sich im Erlanger Patientenkollektiv mit den oben beschriebenen
immunhistochemischen Methoden keine Expression von FoxP3 in den
Tumorzellen, sondern nur in den Treg.
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Die Anzahl der FoxP3+ Treg war, wie oben beschrieben, sehr gering und betrug
im Tumorhauptbereich 0,19 % aller Zellen und 7,04 % aller CD3+-T-
Lymphozyten. Diese Resultate entsprachen den Angaben aus der Literatur (El
Andaloussi and Lesniak 2006b). Im Gegensatz zu vorangegangenen Studien
(El Andaloussi 2006a; Fecci 2006) bestätigte sich die negativ prognostische
Bedeutung der Treg im Erlanger Patientenkollektiv jedoch nicht (Abb. 25). In
der Kaplan-Meier-Analyse des Erlanger Kollektivs zeigten Patienten mit
erhöhter Infiltration durch Treg ein verlängertes Überleben. Der Unterschied zu
den Patienten mit weniger Treg im Tumorhauptbereich war mit p = 0,130
jedoch nicht signifikant.
Abb. 24: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der MIB-1+-Zellen (links oben), CD20+ Lymphozyten (links unten), CD3+ Lymphozyten (rechts oben) und CD8+ Lymphozyten (rechts unten) jeweils bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
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Um die Bedeutung möglicher Interaktionen der TIL für das Gesamtüberleben
der Patienten zu untersuchen, wurden Verhältnisse verschiedener TIL
Subpopulationen zueinander bestimmt. Dabei fiel besonders die
prognostische Bedeutung des Quotienten aus Treg zu CD68+
Mikroglia/Makrophagen auf. Ein großer FoxP3/CD68-Quotient war mit einem
signifikanten (p = 0,037) Überlebensvorteil assoziiert (Abb. 26). Somit war das
Überleben der Patienten bei hoher Treg-Anzahl und/oder niedriger Anzahl der
Mikroglia/Makrophagen verlängert. Dieses Resultat war erstaunlich, da die
hohe Anzahl von Mikroglia/Makrophagen unabhängig von der Anzahl der Treg
prognostisch günstig war. Eine Erklärung für diesen Widerspruch ließ sich aus
den vorliegenden Ergebnissen nicht schließen. Im Gegensatz zum
FoxP3/CD68-Quotienten hatten die Verhältnisse von CD3+ T-Lymphozyten zu
Abb. 25: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der FoxP3+-Lymphozyten bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
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CD68+ Mikroglia/Makrophagen sowie der Anteil der Treg im CD3+ T-
Zellkompartiment keine prognostische Bedeutung (Abb. 26).
Abb. 26: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von den Verhältnissen der FoxP3+ zu CD68+ Zellen (Mitte oben), der FoxP3+ zu CD3+-Lymphozyten (links unten) und der CD3+ zu CD68+ Zellen (rechts unten) jeweils im Tumorhauptbereich.
65
Die Lokalisation der Treg im Tumorhauptbereich war ebenfalls ohne
prognostische Relevanz. Das Überleben wurde in Abhängigkeit von der
Häufigkeit der Treg innerhalb der 30 µm-Zone um das nächstgelegene Gefäß
getestet. Patienten, wo sich mehr als 73 % aller Tumor-infiltrierenden Treg
innerhalb der 30 µm-Zone befanden, zeigten nahezu das gleiche
Gesamtüberleben wie Patienten, bei denen kleiner oder gleich 73 % aller
FoxP3+-Zellen innerhalb der 30 µm-Zone lokalisiert waren (Abb. 27).
Das Überleben der Patienten war außerdem unabhängig von der Lokalisation
der MIB1+ Zellen, der CD3+ T-Lymphozyten, der CD20+ B-Lymphozyten sowie
Abb. 27: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom Abstand der FoxP3+ Lymphozyten zum Gefäß.
66
der CD68+ Mikroglia/Makrophagen (Abb. 28). Das Versuchsvorgehen war
dabei stets gleich. Untersucht wurde die Häufigkeit der verschiedenen
Zelltypen innerhalb der 30 µm-Zone zum nächstgelegenen Gefäß. Die
Gruppierung der Patienten erfolgte jeweils am Median der
Häufigkeitsverteilung und die statistische Testung erfolgte mittels Logrank-
Test. Die teils deutlichen Unterschiede in der Lokalisation der TIL, die weiter
oben beschrieben sind, hatten allesamt keine prognostische Bedeutung für
das Gesamtüberleben im Erlanger Patientenkollektiv.
Abb. 28: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom Abstand der MIB1+-Zellen (links oben), der CD20+ B-Lymphozyten (links unten), der CD3+ T-Lymphozyten (rechts oben) und der CD68+ Mikroglia/Makrophagen (rechts unten) zum Gefäß.
67
4.2. Ergebnisse aus Chemotaxis-Untersuchungen
4.2.1. Konzentrationsausgleich in der Boyden-Chamber
Der Konzentrationsausgleich zwischen oberer und unterer Kammer erfolgte
nach Zugabe von Phenolrot in die untere Kammer sehr rasch. Nach circa 30
bis 40 min erreichte die Konzentration in der oberen Kammer ein konstantes
Plateau, der Konzentrationsausgleich war damit abgeschlossen. Zwar kann
man davon ausgehen, dass die kleinen Phenolrot-Moleküle (Molekulargewicht
= 354,38 g/mol) rascher diffundieren als Chemokine (Molekulargewicht = 8000
bis 14000 g/mol), dennoch dürfte sich auch bei den Chemokinen rasch ein
Konzentrationsausgleich eingestellt haben (Entschladen 2005) (Abb. 29).
4.2.2. Charakterisierung der Primärzelllinien
GFAP ist ein hochspezifischer, zytoplasamatischer Marker für astrogliale
Zellen. Nach längerer in vitro-Kultivierung kann die GFAP-Produktion
vermindert sein, was sich an den LN18 und A172 Zelllinien zeigte. Die selbst
etablierten Primärzelllinien zeigten im Immunostaining allesamt eine
ausgeprägte Anfärbung mit dem anti-GFAP-Antikörper. Im Gegensatz zu den
Abb. 29: Diffusion von Phenolrot durch MultiScreen®-Membran mit 3 µm-Porendurchmesser in Abhängigkeit von der Diffusionszeit in Minuten.
68
LN18 und A172 Zellinien, war die GFAP-Färbung innerhalb der einzelnen
Primärzelllinien sehr polymorph (Abb. 30).
Die Primärkulturen beinhalteten wahrscheinlich verschiedene Tumorzellklone
und nicht-tumoröse Zellen astroglialen Ursprungs. Zur Produktion der
Tumorüberstände war der polymorphe Charakter der Primärzelllinien als
positiv anzusehen. Die Primärzellinien waren dem komplexen Tumormilieu
ähnlicher als die monoklonalen A172 und LN18 Glioblastomzelllinien. In
früheren Untersuchungen von Wagner nahmen die IL-10-Spiegel während der
Abb. 30: Doppelfärbung von Glial fibrillary acid protein (GFAP; grün) und DAPI-Färbung (Kern; blau) bei primären und sekundären Glioblastoma multiforme-Zellkulturen (primär: KD, BS, BT, RA und RE2; sekundär: A172 und LN18).
69
Etablierung und weiteren Kultivierung von Glioblastomzellkulturen stark ab.
Vermutlich führte die Abnahme der CD68+ Mikroglia und Makrophagen, die als
Hauptproduzenten für IL-10 im GBM-Tumormilieu identifiziert werden konnten,
zum Abfall der IL-10-Spiegel nach Etablierung und Kultivierung der (Wagner et
al. 1999).
Das Wachstum der Primärkulturen wurde beim Passagieren
lichtmikroskopisch beobachtet. In den Primärkulturen fanden sich häufig
übereinander wachsende Zellen und ausgeprägte Zellklumpen, was als
Zeichen unkontrollierten Wachstums bewertet wurde (Abb. 31). Im Gegensatz
dazu würden nicht-neoplastische Zellen, zum Beispiel Hautfibroblasten,
Wachstum und Teilung durch Kontaktinhibition einschränken, nachdem der
Flaschenboden vollständig bedeckt ist.
70
Abb. 31: Primärkultur BRA: verschiedene Bereiche in Zellkulturflasche.
71
4.2.3. Calcein zur Detektion migrierter Zellen
Calcein und Höchst 33342 sind Fluoreszenzfarbstoffe für in vitro- und in vivo-
Migrationsuntersuchungen an Lymphozyten. Während Höchst 33342 ähnlich
wie DAPI an Adenosin-Thymidin-reiche Regionen der DNS bindet, verbleibt
Calcein nach Bindung an Proteine im Zytoplasma der Lymphozyten (Parish
1999). Calcein erwies für diese Untersuchungen als geeigneter. Die
Differenzen zwischen den Messpunkten waren bei beiden Farbstoffen ähnlich,
der Hintergrund nach Calceinfärbung und Messung mit dem HTS 7000 Multi-
Assay-Reader jedoch geringer (Abb. 32).
Verschiedene Studien hatten belegt, dass Calcein auch in hohen
Konzentrationen keinen Einfluss auf zelluläre Funktionen ausübt (Parish
1999). In einer in vivo-Studie wurde jedoch gezeigt, dass eine bestimmte
Lymphozytensubpopulation besonders viel Calcein aufnehme und dass bei
dieser Subpopulation das homing über die high endothelial venules
eingeschränkt ist (Weston et al. 1992). In einer weiteren Veröffentlichung war
zudem beschrieben worden, dass die Migration von Monozyten durch Calcein
gehemmt werden kann (Czepluch et al. 2007). In dieser Studie waren die
Monozyten für 30 min mit 8,03 µM Calcein-Lösung inkubiert worden.
Abb. 32: Detektion der Lymphozyten mittels Multi-Assay-Reader nach Calcein- oder H33342-Färbung.
72
In den eigenen Untersuchungen übte Calcein jedoch keinen Einfluss auf die
Migration von Lymphozyten aus. Die Lymphozyten wurden 45 min mit 0,5 µM
Calcein gefärbt, das überschüssige Calcein, das noch nicht in die Zellen
aufgenommen worden war, mit 1xPBS ausgewaschen und die Zellen nach
Zentrifugation in RPMI-Medium plus 0,2 % BSA für die Migration
resuspendiert (Abb. 32-35).
Abb. 33: Detektion der Lymphozyten mittels Multi-Assay-Reader nach Calcein- Färbung mit und ohne Auswaschen des überschüssigen Calceins.
73
4.2.4. Einfluss der Migrationszeit auf die Migration
Die Migrationszeit sollte so gewählt werden, dass die Unterschiede zwischen
stimulierten und unstimulierten Lymphozyten möglichst gut zur Darstellung
kamen. Bei Verwendung der Millipore MultiScreen®-Membranen mit 3 µm
Porendurchmesser erwies sich für die Migration eine Zeitspanne von 3 h als
günstig. Bereits nach 5 min waren erste Lymphozyten an der
Abb. 34: Ermittlung einer möglichst niedrigen Calcein-Konzentration (in µM).
Abb. 35: Einfluss von Calcein auf die Migration.
74
Membranunterseite mittels Immunofluoreszenzfärbung und -mikroskopie
detektierbar. Mit dem Multi-Assay-Reader-Verfahren zeigten sich nach
spätestens 1 h deutliche Unterschiede im chemokinetischen Verhalten der
Lymphozyten. Bei längeren Migrationszeiten fielen die Unterschiede meistens
deutlicher aus. Bei Verwendung der Millipore MultiScreen®-Membranen mit
5 µm Porendurchmesser, wanderten die Lymphozyten schneller in das untere
Well (Abb. 36-38).
Abb. 36: Detektion von Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) an der Membranunterseite.
Abb. 37: Einfluss der Migrationszeit auf den Migrationsindex.
75
4.2.5. Einfluss des Kulturmediums auf die Migration
Fötales, bovines Serum (FBS) enthält zahlreiche Wachstums- und
Botenstoffe. Es kann als einfacher und sicherer Lockstoff zur Etablierung von
Migrationsassays eingesetzt werden. Zur Etablierung der Migrationsversuche
wurde DMEM mit 10 % FBS als Lockstoff eingesetzt. Serumfreies DMEM und
1xPBS mit jeweils 0,2 % BSA dienten als Negativkontrollen (Abb. 39).
Abb. 38: Verwendung von Millipore MultiScreen Membranen mit 3 µm und 5 µm Porendurchmesser im Vergleich. Migration von Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) mit Migrationszeiten von 2 und 4 h.
76
Aufgrund der chemotaktischen Wirkung von FBS wurde bei der Gewinnung
der Tumorüberstände aus den GBM-Zelllinien DMEM mit 2 % FBS zur
Kultivierung eingesetzt. Damit sollte den Zellen ausreichend
Wachstumsfaktoren zur Verfügung gestellt werden, aber gleichzeitig ein zu
großer Einfluss des FBS auf die späteren Migrationsversuche vermieden
werden. In den Migrationsversuchen diente frisches DMEM mit 2 % FBS als
Kontrolle.
Eine interessante Beobachtung war schließlich, dass die Zeit, die die
Lymphozyten im Medium verbrachten, erheblichen Einfluss auf die Migration
hatte. In einem Vergleichsversuch wurden in einem Ansatz Lymphozyten nach
Isolation, Waschen und Zugabe frischen Mediums zum Zeitpunkt 0, 2 und 4 h
in die 96-well Platte aufgetragen und die Migration zum Zeitpunkt 6 h
gestoppt. Die Lymphozyten waren damit 2, 4 beziehungsweise 6 h gewandert.
Das Medium aller Lymphozyten wurde einmalig zum Zeitpunkt 0 h
ausgetauscht. Die Ergebnisse fielen überraschend aus. Die meisten
Lymphozyten waren nicht nach 6-stündiger Migration, sondern nach 2 h
Migrationszeit gewandert. Die Wiederholung des Versuchs bestätigte dieses
Ergebnis (Abb. 40).
0
5000
10000
15000
20000
25000
PB
S+0
,2%
BS
A
RP
MI+
0,2%
BS
A
RP
MI+
10%
FBS
PB
S+0
,2%
BS
A
RP
MI+
0,2%
BS
A
RP
MI+
10%
FBS
PB
S+0
,2%
BS
A
RP
MI+
0,2%
BS
A
RP
MI+
10%
FBS
PBMC CD8+ CD4+
Lym
phoz
yten
pro
wel
l (15
0 µl
)
Abb. 39: RPMI plus 10 % FBS als Chemoattractant.
77
Im zweiten Ansatz betrugen die Migrationszeiten ebenfalls 2, 4 und 6 h.
Jedoch wurden alle Lymphozyten nach Waschen, Zentrifugation und
Resuspension in frischem Medium zum Zeitpunkt 0 h ausgesät und die
Migration entsprechend nach 2, 4 und 6 h gestoppt. Wie erwartet wanderten
bei 6 h Migrationszeit die meisten Lymphozyten, bei 2 h am wenigsten (Abb.
41).
Abb. 40: 2, 4, 6-stündige Migration von Lymphozyten mit Auftragen nach 0, 2 und 4 h und gemeinsamen Stopp nach 6 h.
78
Auf den ersten Blick scheinen beide Versuche identisch. Die unterschiedlichen
Ergebnisse sind vermutlich auf folgenden, entscheidenden Unterschied
zurückzuführen: die Lymphozyten aus dem ersten Ansatz, die zu den späteren
Zeitpunkten ausgesät wurden, verblieben für 2 h beziehungsweise 4 h im
Medium und sezernierten Boten- und Wachstumstoffe. Das Medium wurde
unmittelbar vor dem Aussäen nicht mehr ausgetauscht, die Lymphozyten
wurden in dem konditionierten Medium aufgetragen. Dadurch wurde das
Migrationsverhalten nachhaltig beeinflusst. Für die darauf folgenden
Versuchen war es deshalb umso wichtiger, alle Lymphozyten unmittelbar vor
dem Auftragen auf die 96-wells (Zeitpunkt: 0 h) durch einen zusätzlichen
Waschvorgang und Zugabe von frischen Medium in die gleiche
Ausgangsposition zu bringen, zumal das Isolieren der verschiedenen
Lymphozytensubpopulationen unterschiedlich lange dauerte und die
Lymphozyten bis zum Versuchsbeginn unterschiedlich lange in ihrem Medium
verweilten.
Abb. 41: 2, 4, 6-stündige Migration von Lymphozyten mit gemeinsamen Auftragen und Stopp nach 2, 4 und 6 h.
79
4.2.6. Migration auf A172- und LN18-Überstände
Unabhängig von der Behandlungsmodalität (Tumor unbehandelt, 2 Gy, TMZ,
2 Gy + TMZ), zeigten PBMC und CD8+ Lymphozyten auf Überstände der
beiden etablierten Zelllinien A172 und LN18 eine verstärkte Migration
(Abb. 42).
Die Migration der Treg wurde dagegen nur durch Überstände der LN18-
Tumorzellen verstärkt. CD4+ sowie CD4+CD25- Lymphozyten wurden weder
durch die Tumorüberstände von A172 noch durch die Überstände von LN18
angelockt. Die Migration der CD4+ sowie der CD4+CD25- Lymphozyten auf die
Tumorüberstände war im Vergleich zur Migration auf das Kontrollmedium
sogar vermindert. Es konnte kein konstanter, von den Tumorzelllinien
unabhängiger Einfluss einzelner Behandlungsmodalitäten auf die
chemotaktische Wirkung der Tumorüberstände festgestellt werden. Die
Abb. 42: Migration von Spenderlymphozyten (PBMC) auf verschiedene Kontrollen und Tumorüberstände.
80
Migration der verschiedenen Lymphozytensubpopulationen wurde im Mittel
allenfalls durch Überstände aus der Kombinationsbehandlung von 2 Gy + TMZ
verstärkt aktiviert.
Dabei könnte die Kombinationsbehandlung von 2 Gy + TMZ die höchsten
Apoptose- und Nekroseraten in den Tumorzelllinien hervorgerufen haben. Die
daraus resultierende Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren
könnte wiederum die verstärkte Migration besonders der CD8+ Lymphozyten
verursacht haben. Die Migration der CD8+ Lymphozyten war um die Faktoren
1,4 (A172) beziehungsweise 2,1 (LN18) nach Kombinationsbehandlung der
Tumorzellen mit 2 Gy plus TMZ im Vergleich zur Wanderung auf das
Kontrollmedium verstärkt.
4.2.7. Migration auf Primärüberstände
Die Migration auf die verschiedenen Überstände aus den Primärkulturen war
sehr unterschiedlich. Ein eindeutiges Muster war nur schwer auszumachen.
Bei genauer Betrachtung der Ergebnisse, insbesondere der Migration bei
Verwendung der Tumorüberstände von KD- und BS-Primärkulturen, schien
die Migration abhängig von der Behandlungsform der Tumorzellen, aber
unabhängig von der verwendeten Lymphozytensubpopulation (PBMC, CD8+
und Treg). Die lymphozytäre Migration auf die unbehandelten und die mit 2 Gy
plus TMZ kombiniert behandelten Überstände von KD und BS war erhöht.
Eine Behandlung mit entweder 2 Gy oder TMZ steigerte die Migrationsrate im
Vergleich zur Kontrolle mit Medium jedoch nicht (Abb. 43, 44).
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8. Danksagung
Mein Dank gilt allen, die mich bei meiner wissenschaftlichen Arbeit unterstützt und zu
ihrem Gelingen beigetragen haben.
Zunächst möchte ich mich bei meinen Betreuern Dr. L. Distel und Prof. Dr. G. G.
Grabenbauer bedanken, die diese Arbeit initiiert und stetig mit neuen Ideen
bereichert haben. Besonders gerne denke ich an die gemeinsamen
wissenschaftlichen Diskussionen zurück.
Zu großen Dank bin ich den Herren PD Dr. O. Ganslandt und PD Dr. R. Voll
verpflichtet, meinen Betreuern seitens des Interdisziplinären Zentrums für Klinische
Forschung (IZKF) Erlangen. Das IZKF Erlangen bot mir zudem finanzielle und
wissenschaftliche Unterstützung bei der Durchführung meines Projektes.
Die Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern der Neurochirurgischen Klinik
und des Neuropathologischen Institutes des Universitätsklinikums Erlangen war stets
hervorragend. Besonderer Dank gilt Herrn Dr. R. Coras aus der Neuropathologie und
ein weiteres Mal Herrn PD Dr. O. Ganslandt, meinem Ansprecherpartner in der
Neurochirurgie.
Zuletzt danke ich Herrn Prof. Dr. R. Fietkau, Direktor der Strahlenklinik des
Universitätsklinikums Erlangen, der die finanziellen und wissenschaftlichen
Rahmenbedingungen zur Durchführung dieser Arbeit in der Strahlenbiologie
10/2009 - 12/2009 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung nach ÄAppO 2002
08/2008 - 06/2009 Praktisches Jahr mit folgenden Tertialen: Strahlentherapie (Universitätsklinikum Erlangen) Chirurgie (Universitätsklinikum Erlangen) Rheumatologie (Duke University, North Carolina)
10/2005 - 07/2008 Klinischer Ausbildungsabschnitt an der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
10/2003 - 09/2005 Vorklinischer Ausbildungsabschnitt an der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Abschluss mit dem Ersten Abschnitt der Ärztlichen Prüfung nach ÄAppO 2002
Note: 1,0
09/1994 - 06/2003 Gymnasium Eschenbach
Abiturnote: 1,0
FORSCHUNG
seit 08/2008 „Tumor-infiltrierende Lymphozyten beim Glioblastoma multiforme“
Promotionsarbeit bei Prof. Grabenbauer und Dr. Distel im Rahmen des D4-Projekts des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF), Erlangen
seit 07/2009 Murine Fibrose-Modelle in der Sklerodermie
Forschungsarbeit in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Distler, Medizinische Klinik 3 des Universitätsklinikums Erlangen
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AUSZEICHNUNGEN
06/2003 Buchpreis der Deutschen Physikalischen Gesellschaft
06/2003 Appolinaire-Preis der Robert Bosch Stiftung
06/2003 Vorschlag für die Stiftung Maximilianeum
09/2007 Aufnahme in das Erlanger Leonardo-Kolleg (Exzellenz-Initiative der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg)
02/2008 Aufnahme in die Studienstiftung des Deutschen Volkes
08/2008 Doktorandenstipendium des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF) Erlangens
REVIEWTÄTIGKEITEN
Associate Member of Faculty 1000 Medicine, Section: Etiology, Pathogenesis and Animal Models of Rheumatic Disease
Arthritis Research and Therapy
KONGRESSBEITRÄGE
„CD4+CD25+, regulatorische T-Lymphozyten werden in vitro im Vergleich zu peripheren mononukleären Zellen durch Glioblastoma-Tumorzellen nicht selektiv angelockt.“ Postervortrag auf der Jahrestagung der Deutschen und Österreichischen Gesellschaft für Radioonkologie (DEGRO und ÖGRO), Wien 2008
„Lokalisation Tumor-infiltrierender Lymphozyten im Glioblastoma multiforme.“ Poster am Doktorandenworkshop des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung, Erlangen 2008
PUBLIKATIONEN
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Beyer C, Abraham D, Distler JH, Distler O. The pathogenesis of systemic sclerosis. In: Distler O, editor. Scleroderma - modern aspects of pathogenesis, diagnosis and therapy. Bremen: UNI-MED Verlag AG; 2009.
Distler JH, Beyer C, Schett G, Luscher TF, Gay S, Distler O. Endothelial progenitor cells: Novel players in the pathogenesis of rheumatic diseases. Arthritis Rheum 2009;60(11):3168-3179.
Beyer C, Pisetsky DS. Microparticles in rheumatologic diseases. Nature Reviews Rheumatology 2009;in press.