Mécanismes de résistance aux antiparasitaires Mickaël Riou (PhD) Unité de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire (FACM) Nematodes Tenia s.p.p. Trypanosoma s.p.p. Plasmodium falciparum Eimeria s.p.p. Microfilaires
Mécanismes de résistance aux antiparasitairesMickaël Riou (PhD)
Unité de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire (FACM)
Nematodes
Tenia s.p.p.
Trypanosoma s.p.p.Plasmodium falciparum
Eimeria s.p.p.
Microfilaires
Objectifs pédagogiquesDifférencier les familles de parasites
Connaître les grandes familles d’antiparasitaires utilisées en médecine humaine et vétérinaire
Définir les principaux mécanismes de résistance aux antiparasitaires
Donner des exemples précis d’antiparasitaires et de leur mode d’action
SommaireI - Définitions générales
II - Grandes Familles de Parasites
III – Les traitements antiparasitaires
IV - Mécanismes de résistance aux antiparasitaires– Définition et développement de la résistance– Mécanismes spécifiques et non spécifiques
V - Exemples : – un parasite animal : Haemonchus contortus– un parasite humain : Plasmodium falciparum
VI- Conclusions
I – Définitions généralesParasitologie : L'étude morpho-biologique des parasites et des affections qu'ils
entraînent chez leurs hôtes et parfois chez leurs vecteurs, leurs hôtes. Elle correspond aussi à l’étude du diagnostic, de la prophylaxie et du traitement de ces affections.
Parasite : Etre vivant animal ou végétal qui pendant une partie ou la totalité de son existence vit aux dépens d’un autre organisme appelé hôte.
Parasitisme : Etat de spoliation des matières nutritives d’un parasite envers son hôte.
Hôte : Organisme vivant qui héberge un pathogène. Il peut être définitif (Toxoplasma gondii / félidés) ou intermédiaire (T. gondii / Homme).
Vecteur : Etre vivant qui sert d’hôte à un agent pathogène et qui est susceptible de la transmettre à un autre organisme (Anopheles pour le paludisme).
Réservoir : Organisme vivant ou niche écologique chez qui se perpétue l’agent pathogène et qui assure la survie de l’espèce.
II – Grandes familles de parasites (1)
A) Protozoaires
B) Plathelminthes
C) Némathelminthes
D) Ectoparasites
AmibiasesEntamoebahistolytica
TrichomonasesTrichomonas
vaginalis
ToxoplamoseToxoplasma
gondii
TrypanosomosesTrypanosoma
cruzi
GiardiasesGiardia
intestinalis
AProtozoaires
II – Grandes familles de parasites (2)
BabesiosesBabesia canis
LeishmaniosesLeishmania sp
CryptosporidiosesCryptosporidium
parvum
PneumocystosesPneumocystis
carinii
Paludisme
AProtozoaires
II – Grandes familles de parasites (3)
II – Grandes familles de parasites (4)
B) Plathelminthes– Cestodes
Teniases (Tenia saginata)
Echinococcoses (E. granulusus)
– TrematodesFascioloses (F. hepatica)
Schistosomiases (S. mansoni)
II – Grandes familles de parasites (5)
C) Némathelminthes– Ascaridiose (Ascaris lumbricoides)– Oxyurose (Enterobius vermicularis)– Trichocéphalose (Trichuris trichiuria)– Nécatorose (Necator americanus)– Toxocarose (Toxocara canis)– Trichinose (Trichinella spiralis)– Wuchériose (Wuchereria bancrofti)– Loase (Loa loa)– Onchocercose (Onchocerca volvulus)
– Trichonstrongles (Haemonchus contortus)
II – Grandes familles de parasites (6)
D) Ectoparasites– Poux (Pediculus humanus capitis )– Gales (Sarcoptes scabiei )– Tiques (Ixodes ricinus )– Punaises (Triatoma infestans )– Puces (Pulex irritans )– Myases– Sangsues (Limnatis nilotica )– Dermatoses
III – Traitements antiparasitaires (1)
A) Familles d’antiparasitaires
B) Médicaments en médecine vétérinaire
Les benzimidazoles
Les lactones macrocycliques
III – Traitements antiparasitaires (2)
A) Différentes familles Benzimidazoles et Pro-benzimidazolesLactones macrocycliques ImidazothiazolesTétrahydropyrimidinesAlcaloïdes naturellesOrganophosphorésSalicylanilidesSulfamides
Les antiparasitaires sont classés selon les auteursen fonction de leur mode d’action ou de leur site d’action (Prichard et al, 1980, Martin, 1997 et Martin et al 1997)
III – Traitements antiparasitaires (3)Benzimidazoles
– Mintezol ® (Thiabendazole)– Zentel ® (Albendazole)– Panacur ® (Fenbendazole)
Lactones macrocycliques– Mectizan ® (Ivermectine)– Equimectrin ® (Ivermectine)
Imidazothiazoles– Metronidazole ® (Métronidazole)– Levinol ® (Levamisol)
Tétrahydropyrimidines– Catminth ® (Pyrantel)– Combantrin ® (Pyrantel)
Nemathelminthes
CestodesProtozoaires
NemathelminthesEctoparasites (Gales)
NemathelminthesAmibiases
Trichomonose
Nemathelminthes
III – Traitements antiparasitaires (3)Alcaloïdes
– Nivaquine ® (Chloroquinine)– Surquina ® (Quinine)– Phyto Vermi+ ® (Mélange de plantes)
Organophosphorés– Scabecid ® (Lindane)– Prioderm ® (Malathion)– Diazol 50 ® (Diazinon)
Salicylanilides– Pas utiliser en médecine humaine (toxicité)– Flukiver ® (Closantel)
Sulfamides– Romet-30 ® + Antiparasitaires
(Sulfadiméthoxine/ormétoprime)– Bactrim ® (Cotrimoxazole)
Nemathelminthes
Protozoaires(essentiellement Plasmodium s.p.p)
EctoparasitesNémathelminthes
Némathelminthes
Trématodes
Protozoaires
III – Traitements antiparasitaires (4)B) Benzimidazoles (BZ)
– Thiabendazole (TBZ, 1963) : premier anthelminthique (AH) utilisé contre les strongles gastro-intestinaux (SGI)
– Effet ovicide sur les œufs non embryonnés (Varady et Cobra, 1999)
–Structure de base : Noyau benzène et noyau imidazoleSubstitutions en position 2 et 5
TBZ
2
5
Noyau benzène
Noyau imidazole
III – Traitements antiparasitaires (5)B) Benzimidazoles (suite)
– TBZ : n’est plus utilisé actuellement Peu efficace sur les stades larvaires Nombreux cas de résistance
– Nombreux autres dérivés (Albendazole, Fenbendazole…) : action sur les stades larvaires et les vers adultes
– Modes d’action (cibles intracellulaires)Fixation sur des complexes enzymatiques (succinate décarboxylase et fumarate réductase) : Privation des ressources énergétiques
Inhibition de la formation des microtubules du cytosquelette (capping) : Paralysie du vers et arrêt des divisions cellulaires
(Prichard, 1973 ; Lacey, 1988 et Martin et al , 1997)
III – Traitements antiparasitaires (6)C) Les lactones macrocycliques
– Deux groupes de lactones macrocycliquesAvermectines (ivermectine et doramectine)Milbémycines (moxidectine)
- Effet sur les stades larvaires et les vers adultes
– Modes d’action : Agoniste du récepteur à l’acide gamma amino-butyrique (GABA) ou au glutamateForte libération de ces neuromédiateursHyperpolarisation axonale ( de la perméabilité membranaire aux ions chlorures)Paralysie flasque
III – Traitements antiparasitaires (6)C) Les lactones macrocycliques suite
– Ivermectine (IVM)
– 1ère lactone macrocyclique utiliséecontre les SGI et les arthropodes(bovins)
– Utiliser dans l’hémisphère sud principalement
– Risque de toxicité élevée pour l’hôte et l’environnement
– Faiblement métabolisée et éliminée par les voies naturelles
(Tyrell et al, 2002 ; Freeman et al, 2003 et Waller, 1997)
IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (1)
A) Définition de la résistance
B) Développement de la résistance
C) Mécanismes spécifiques
D) Mécanismes non spécifiques
E) Exemple : Les strongyloses animales
– Haemonchose
IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (2)
A) Définition
L’O.M.S. a définie la résistance comme le développement de la capacité d’individus d’une population (isolat) à tolérer des doses de toxiques qui seraient naturellement mortelles pour la majorité des individus d’une population sensible de la même espèce.
Dose léthale 50 ou DL50
Facteur de résistance FR
FR = (DL50 de l’isolat testé / DL de l’isolat de référence)
FR < 2 : isolat sensible2 < FR < 5 : isolat tolérantFR > 5 : isolat résistant (Kelly et Hall, 1979)
IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (3)
Différents types de résistance aux antiparasitaires
– Résistance simple : vis-à-vis d’un seul antiparasitaire
– Résistance de famille : + antiparasitaires d’une même famille ayant le même mode d’action
– Résistance croisée : + antiparasitaire de familles différentes ayant la même cible
– Résistance multiple : + antiparasitaires ayant des cibles différentes et appartenant à différentes familles
Réversion : retour de la valeur de la DL50 à celle d’un isolat sensible de la même espèce
– Difficile à obtenir : utilisation d’inhibiteurs des mécanismes cellulaires (vérapamil et lectines)
(Kelly et Hall, 1979 ; Kerboeuf et al, 1988 et 1999)
IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (4)
B) Développement de la résistance
Le sous dosage volontaire ou involontaire (élevages)– Estimation du poids de l’animal incorrect– Coût des produits
Pression de sélection : répétition des traitements (++++ multirésistances)
« Dose and move » (en médecine vétérinaire) Cette pratique consiste à traiter des animaux avec des antiparasitaires et à
ensuite les placer sur un pâturage sain pour empêcher les réinfestations. Pb : si parasites résistants = infestation du pâturage sain et contamination des
animaux
Individus porteurs de parasites résistants dans une population sensible
(Kelly et Hall, 1979 ; Prichard et al, 1980 ; Jackson, 1993)
IV – Mécanismes de résistance aux antiparasitaires (5)
C) Mécanismes spécifiques
– Mutations spontanées sur des allèles rares = modification de la cible de l’antiparasitaire
– Mutation ponctuelle suffit pour induire une résistance
Exemples :
– BZ : β-tubuline
– Imidazothiazoles : récepteur nicotinique à l’acétylcholine
– Avermectines : récepteur au glutamate
IV – Mécanismes de résistance aux anx antiparasitaires (6)
D) Mécanismes non spécifiques
– Ce n’est pas une mutation de cible
– Elimination des xénobiotiques (antiparasitaires, antitumoraux, antibiotiques…)
– Absorption, rejet ou séquestration de ces substances
– Détoxication cellulaire :
Phase I : biotransformation (cytochrome P450)
Phase II : conjugaison (gluthation)
Phase III excrétion : efflux (MDR = Multidrug résistance)
V – Exemples :
A) Les strongyloses animales
Strongles gastro-intestinaux appartenant à la famille des Trichostrongylidae et à la sous-famille des Haemonchinae
Parasite : Haemonchus contortus
Parasite de la caillette des petits ruminants (ovins et caprins)
Cosmopolites et grandes capacités d’adaptation
Très pathogènes, hématophages et très prolifiques
Nombreux cas de résistance multiple
H. contortus :
Décrit en 1803 par Rudolphi, puis Cobb 189810 espècesClassification (Durette-Desset et Chabaud, 1993) :
– Phylum Némathelminthes– Classe Nématodes– Sous-classe Sercernentae– Ordre Strongylida– Sous-ordre Trichostrongilina– Super-Famille Trichostrongyloidea– Famille Trichostrongylidae– Sous-Famille Haemonchinae– Genre Haemonchus– Espèce H. contortus
Anatomie : pièce buccale et une bourse caudale caractéristique en Y chez le mâleHématophage
Présentation d’Haemonchus contortus
Larves L4
Larves L1Larves L2
Environnement : Phase externe(facteurs : température et humidité)
Hôte : Phase interne
Prolificité
Ponte
Larves infestantes L3
Mâles et Femelles
Oeufs
Cycle biologique d ’H.contortus
Ingestion Elimination dans les fécès
Animaux infestés : individus jeunes, individus âgés et immunodéprimés
Effet variable selon le taux d’infestation
Dégradation de l’état général : – Perte de poids– Laine de mauvaise qualité– Diarrhées – Anémie
Trois syndromes d’Haemonchose (Chermette, 1982) : – Haemonchose suraiguë (infestation massive)– Haemonchose aiguë (jeunes animaux ou mères au moment de la parturition)– Haemonchose chronique ( plus courante)
Pouvoir pathogène d’Haemonchus contortus
Mort de l’animal
Répartition mondiale d’Haemonchus contortus
Peu Haemonchoses
Très important dans l’hémisphère sud(50 %)
Episodique et ponctuelle15 %
La résistance chez H. contortus
Phénomènes de résistance impliquent :
(1) Mécanismes spécifiques : inhibition de la polymérisation de la β-tubuline par les benzimidazoles
(2) Mécanismes non spécifiques : en autres la "Multi-Drug Resistance" (MDR)
Mécanismes spécifiques chez H. contortus
Exemple : Mutation de la β-tubuline dans la résistance aux BZ
– La mutation la plus connue et étudié en médecine vétérinaire
– 2 isotypes de β-tubuline chez H. contortus : Isotype 1 : gènes répartis sur 6 allèlesIsotype 2 : gènes répartis sur 12 allèles
– Une seule mutation du gène β-tubuline 1WT (phénylalanine / phénylalanine)Mutation 200 (tyrosine en phénylalanine) ++++++++Mutation 167 (tyrosine en phénylalanine)
– Pas de mutation du gène β-tubuline 2 mais une délétion totale du gène
(Jackson, 1993 ; Beeck et al, 1994 ; Kwa et al, 1994 ; Sylvestre et Cabaret, 2002)
Mécanismes non spécifiques chez H. contortus
Exemple : Multidrug résistance aux BZ
– P-glycoprotéines ou P-gp
ABC transporteursUbiquistesDeux parties symétriques (duplication d’un gène ancestral en deux séquences homologues dont 43 % d’homologiePM de 170 kDa soit 1300 aa et une partie glucidique de 30 KDa12 domaines transmembranaires (TM)2 domaines ATPasiques (NBD)Deux sites hydrophiles en Cter et NterDeux sites de fixation R (Rhodamine 123) et H (Hoetsch 33342)Glycosylation sur la 1ère boucle extracallulaire
(Borst et al., 1993 ; Feller et al., 1995 ; Sharom, 1997 ; Shapiro et Ling, 1998 ; Di Pietro et al., 2002 et Gottesman et al., 2002)
12 domaines transmembranaires 2 domaines de fixation à l’ATP ("nucleotide binding domains" ou NBD). Glycosylation
La P-glycoprotéine : P-gp
Domainestransmembranaires
1 32 54 7 86 12
NBD1
11109
NH2
COOH
NBD2
Mécanismes non spécifiques chez H. contortus
Classification des MDR correspondant aux P-gp
– Chez l’hommeGènes homologues : MDR1 et MDR3MDR1 : MDR1a et MDR1b76 % d’homologie entre MDR1 et MDR3
– Chez la sourisGènes homologues : mdr1, mdr2 et mdr3
– Chez les nématodes14 isoformes de P-gp connues, mais la classification n’est pas claire
(Sangster, 1994 ; Sharom, 1997 ; Garrigues, 2002 ; Di Pietro et al., 2002 et Gottesman et al., 2002)
MDR1 = Résistance
MDR3 = Transport de lipides
Identification des P-gp pour le stade œuf
broyattotal
d’oeufs
170 kDa
114 kDa
85 kDa
Westernblot
(C219)
170 kDa
114 kDa
la bande à 170 kDa est une P-gpla bande à 114 kDa :
soit une P-gp dégradée soit un autre transporteur ABC
Kerboeuf et al, 2003
Œuf d’H. contortus
Blastomères
Bi-couche phospholipidiqueCouche chitineuse
Couche vitelline
Espace embryonnaire
1
1 Coque = 300-400 nm
Structure d’une membrane
Membranes plasmiques
Phospholipides
Protéines transmembranaires
Cholestérol
7-10 nm
Présence de P-gp actives dans différentes zones de la coque des œufs
Localisation des P-gp dans les œufs
Contrôle isotypique
Int
Ext
UIC2
Coque (x21000)
Int
Ext Bi-couche phospholipidique
Couche chitineuseCouche vitelline
Microscopie électroniqueMarquage immunogold
Riou et al, 2005
Activité des P-gp dans les œufs
Mesure du nombre de P-gp actives grâce à un anticorps monoclonal anti-Pgp humaine (UIC2 anti-MDR1)
Substrat de pompe : R123
IS IRKerboeuf et al, 2003
DL50 faible DL50 forte
Modulation de l’activité des P-gp dans les œufs (1)
vsddfndModulation chimique de l’activité
des P-gp par le vérapamil sur l’efflux de TBZ
- Inhibition chimique
- Fixation de l’inhibiteur sur la P-gp
- Blocage de l’efflux au TBZ
Augmentation de la sensibilité au TBZ
Kerboeuf et al, 1999
Modulation de l’activité des P-gpdans les œufs (2)
Modulation chimique de l’activité des P-gp par les lectines (Lens culinaris
lectin)
- Fixation de l’inhibiteur sur la partie glycosylée de la protéine
- Blocage de l’efflux au TBZ
Augmentation de la sensibilité au TBZ
La partie glycosylée de la P-gp est indispensable à la fonctionnalité de la
protéine
IR
Kerboeuf et al, 2002
Modulation de l’activité des P-gpdans les œufs (3)
Modulation biologique de l’activité des P-gp
par le cholestérol
- changement de l’environnement membranaire (fluidité)
- Activation ou blocage des pompes
- Augmentation ou Diminution de l’efflux TBZ
La teneur en cholestérol de la membrane est primordiale pour le bon fonctionnement des pompes de type P-gp
Riou et al, 2003 IS
IR
2
AP
?Membrane
plasmique*
Milieu
intracellulaire
Milieu
extracellulaire
ATP ADP + Pi
3
5
Entrée des anthelminthiques
Etat de repos des P-gp
Elimination des anthelminthiques
Schéma hypothétique du fonctionnementdes P-gp chez les nématodes
1 Diffusion passive 3 Activation des P-gp 5 Retour à un état initial
2 Influx actif lié aux P-gp 4 Efflux actif lié aux P-gp
NBDs
?
NBDs NBDs
?AP
AP ?
1AP
?
?
AP AP
AP
AP
4
V – Exemples suite:B) Le paludisme : parasitose humaine
Le paludisme ( du latin paludis ou marais), appelé aussi malaria
Découverte en 1880 en Algérie par Charles Louis Alphonse Laveran, prix Nobel de médecine 1907
Homme et Chimpanzés
Parasitose due à un protozoaire (Plasmodium) transmis par la piqûre de la femelle l’anophèle
Infection des hématies et des cellules hépatiques
Fièvres intermittentes
Cycle biologique de Plasmodium s.p.p.
Homme
Erythrocytopathie parasitaire :
• accès fébriles violents et rythmés • destruction massive d'hématies (directe et indirecte) = anémie hémolytique et réaction du SRH (splénomégalie progressive)•biligénie pigmentaire, d'où subictère (et hépatomégalie de reprise•détérioration de l'état général
Paludismes récurrents
Pouvoir pathogène des Plasmodium
Répartition mondiale
♦ Prévalence élevée de la chloriquino-résistance ou multi-résistance♦ Chloriquino-résistance présente♦ Pas de Plasmodium falciparum ou de chloriquino-résistance♦ Pas de paludisme
2007
Chloroquine (Nivaquine*) 600 mg (2 comprimés à 0,30 g) par jour les 2 premiers jours, puis 300 mg (1 comprimé à 0,30 g) par jour les 3 jours suivants.
Primaquine* 15 mg (3 comprimés à 0,5 mg) par jour pendant 15 jours, soit du 6e au 20e jour inclus.
Les ACT (Artemisinin-based combination therapy : combinaisons à base d'artémisinine).
Traitements : (chimioresistance) :– La méfloquine comme le LARIAM® (Roche, 250 mg)– L’atovaquone-proguanil comme le MALARONE® (250 mg. atovaquone + 100 mg. proguanil chlorhydrate)
Traitements des Plasmodium
Mécanismes non spécifiques chez Plasmodium
Exemple : Pfmdr1 (Plasmodium falciparum multi-drugresistance)
– Pfmdr 1 (ou PfCRT)
ABC TransporteursParasiteChromosome 5PM de 162 kDa soit 1426 aa12 domaines transmembranaires (TM)2 domaines ATPasiques (NBD)Efflux des quinines et d’autres antimalariensAssociation avec les MDR cellulairesEfflux de la vacuole digestiveRésistance du à une mutation ponctuelle en positon Tyr 184 to Phe 184; Ser 1034 to Cys 1034; Asn 1042 to Asp 1042; and Asp 1246 to Tyr 1246
(codon 86)
Mécanismes non spécifiques chez Plasmodium
Modification du gène Pfmdr1 chez deux clones de P. falciparum
(Reed M.B. et al, 2000 dans letter to Nature)
2 allèles (7G8) de Pfmdr1 connus pour induire la résistance aux chloroquines
-Utilisation de vecteurs plasmidiques
- Deux isolats : 2 sauvages résistants et 4 mutants de Pfmdr1
Mécanismes non spécifiques chez Plasmodium
Effet des mutations du gène Pfmdr1 sur la croissance de P. falciparum
(Reed M.B. et al, 2000 dans letter to Nature)
- 5 antimalariens testés
Mécanismes non spécifiques chez Plasmodium
Effet des mutations du gène Pfmdr1 sur l’acculmulation des antimalariens chez P. falciparum
(Reed M.B. et al, 2000 dans letter to Nature)
Accumulation doublée chez 7G8-mdrD10/c1 et 7G8-mdrD10/c2 et corrélée à une double diminution de la IC50 de la chloroquine.
Pas de changement dans l'accumulation de la chloroquine chez les 2 D10-mdr7G8 / 1 ou D10-mdr7G8 / 3.
Changement de phénotype de résistance est traduite par une augmentation de l'accumulation de la méfloquine à la fois pour les D10-mdr7G8 / 1 et D10-mdr 7G8/3relative àD10-mdrD10
Conclusion :
Les mutations de certains aa de Pfmdr1 jouent un rôle important dans la résistance aux antimalariens
Pfmdr1 est un cible pour les traitements antimalariens
Il n’agit pas seul pour conférer la résistance
V – ConclusionsLa résistance aux antiparasitaires
Problème de santé humaine et animale
Toutes des espèces de parasites
Dans les élevages : pertes économiques importantes
Deux types de mécanismes : spécifiques et non spécifiques(combinaison des deux)
Peu ou pas de production de nouveaux antiparasitaires
Recherche de molécules naturelles pour lutter contre ces parasites
Rappels des objectifs pédagogiques
Connaître les familles de parasites
Connaître les grandes familles d’antiparasitaires utilisées en médecine humaine et vétérinaire
Définir les principaux mécanismes de résistance aux antiparasitaires
Donner des exemples précis d’antiparasitaires et leur mode d’action
Liens utileshttp://coursdeparasitologie.ifrance.com
w3.rennes.inra.fr/.../nematodes/nematodes.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed (rechercher les articles scientifiques)
www.pasteur.mg/cyclepaludisme.html
kentsimmons.uwinnipeg.ca/16cm05/1116/16comeco.html
http://www.google.fr (images)
http://fr.wikipedia.org/wiki/Accueil