Bibliothek vorbereiten | Sequenzieren | Daten analysieren Vorteile l Genaue Messung der Strangausrichtung Ermöglicht die Erkennung der Antisense-Transkription, verbessert die Transkriptnotation und erhöht die Alignment- Effizienz l Ausgezeichnete Abdeckungsqualität Ermöglicht eine genaue und umfassende Zuordnung alternativer Transkripte und Genfusionen l Geeignet für mehrere Probentypen Ermöglicht die Analyse verschiedener Proben, einschließlich Proben von geringer Qualität, formalinfixierter, in Paraffin eingebetteter Proben (FFPE) und Blutproben l Hervorragende Flexibilität Bietet eine hervorragende Flexibilität beim Versuchsdesign mit bis zu 96 eindeutigen doppelten Indizes (Unique Dual Indexes, UDIs) für ein zuverlässiges Proben-Multiplexing Einleitung Die RNA-Sequenzierung ist eine leistungsstarke Methode für die Erkennung, das Profiling und die Quantifizierung von RNA- Transkripten. Dank der Verwendung von Illumina- Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation (NGS) erfordert die RNA-Sequenzierung keine spezies- oder transkriptspezifischen Sonden, sodass die Daten nicht durch vorherige Annahmen über das Transkriptom beeinflusst werden. Daher ermöglicht die RNA-Sequenzierung hypothesenfreie Versuchsdesigns aller Spezies, einschließlich Spezies mit schlechter oder fehlender Genomnotation. Über die Messung von Genexpressionsänderungen hinaus kann die RNA-Sequenzierung für Erkennungsanwendungen, z. B. das Identifizieren alternativer Spleißereignisse, Genfusionen, die allelspezifische Expression sowie das Untersuchen seltener und neuartiger Transkripte verwendet werden. Aufgrund eines gewachsenen Verständnisses der Komplexität der Genregulation ist das Erfordernis der Erfassung zusätzlicher Daten entstanden. Stranginformationen geben an, aus welchem der beiden DNA-Stränge ein bestimmtes RNA-Transkript abgeleitet wurde. Diese Informationen erhöhen die Zuverlässigkeit der Transkriptnotation, insbesondere bei nicht humanen Proben. Das Identifizieren des Strangursprungs erhöht den Prozentsatz der sich alignierenden Reads, was die Sequenzierungskosten pro Probe senkt. Die Beibehaltung der Strangausrichtung ermöglicht auch die Identifizierung der Antisense-Expression, eines wichtigen Mediators der Genregulation. 1 Die Möglichkeit zum Erfassen der relativen Abbildung 1: TruSeq Stranded RNA – TruSeq Stranded mRNA und Total RNA ermöglichen die zuverlässige Abfrage sowohl von Standardproben als auch von Proben geringer Qualität und umfassen Workflows, die für zahlreiche Studiendesigns geeignet sind. Häufigkeit der Sense- und Antisense-Expression bietet eine Transparenz für regulatorische Interaktionen, die ohne diese Möglichkeit fehlen könnte. Während die wichtigen biologischen Rollen nicht codierender RNA (ncRNA) weiterhin anerkannt werden, bietet die Gesamt- Transkriptom-Analyse oder Gesamt-RNA-Sequenzierung ein umfassenderes Bild der Expressionsdynamik. Die durch die Reduzierung der ribosomalen RNA (rRNA) ermöglichte Gesamt-RNA- Sequenzierung eignet sich für FFPE-Proben, die potenziell kritische biologische Informationen enthalten. TruSeq Stranded RNA bietet sowohl für mRNA- als auch für Gesamt-Transkriptom-Analysen eine einzigartige Kombination von hervorragender Datenqualität. Zudem ermöglicht der Workflow die zuverlässige Abfrage sowohl von Standardproben als auch von Proben geringer Qualität. Außerdem ist er für zahlreiche Studiendesigns geeignet (Abbildung 1). Effektive ribosomale Reduzierung TruSeq Stranded RNA (Tabelle 1) kombiniert bewährte Chemie zur ribosomalen Reduzierung und Bibliotheksvorbereitungs-Chemie in einem einzigen, optimierten Protokoll. Anders als PolyA-basierte Abfangmethoden, entfernen Ribo-Zero™-Kits rRNA mithilfe biotinylierter Proben, die rRNA-Spezies selektiv binden. Das Sonden- rRNA-Hybrid wird von magnetischen Beads abgefangen und mittels Pulldown entfernt, sodass die gewünschte rRNA-bereinigte RNA in der Lösung verbleibt. Dieser Prozess minimiert die ribosomale Kontamination und maximiert den Prozentsatz an eindeutig zugeordneten Reads, wobei sowohl mRNA- als auch ein breites Spektrum an ncRNA-Spezies von Interesse abgedeckt werden, darunter lange intergenische nicht codierende RNA (lincRNA), kleine nukleäre RNA (snRNA), kleine nukleoläre RNA (snoRNA) und sonstige RNA-Spezies. 2 TruSeq ™ Stranded mRNA und Total RNA Erhalten Sie eine deutliche und umfassende Ansicht des Transkriptoms mit einer optimierten, kostengünstigen und skalierbaren Lösung für mRNA- oder Gesamt-Transkriptom-Analysen. Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
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TruSeq Stranded mRNA und Total RNA - illumina.com · universellerhumanerReferenz-RNA(UHR)genaueInformationen zumStrangursprungliefern,beträgtmitTruSeqStrandedmRNA ≥ 99...
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Bibl io thek vorberei ten | Sequenzieren | Daten analysieren
Vorteilel Genaue Messung der Strangausrichtung
Ermöglicht die Erkennung derAntisense-Transkription,
verbessert die Transkriptnotation und erhöht die Alignment-
Effizienz
l Ausgezeichnete AbdeckungsqualitätErmöglicht eine genaue und umfassende Zuordnung
alternativer Transkripte undGenfusionen
l Geeignet für mehrere ProbentypenErmöglicht die Analyse verschiedenerProben, einschließlich
Proben von geringerQualität, formalinfixierter, in Paraffin
eingebetteter Proben (FFPE) undBlutproben
l Hervorragende FlexibilitätBietet eine hervorragende Flexibilität beim Versuchsdesign mit
bis zu 96 eindeutigen doppelten Indizes (Unique Dual Indexes,
UDIs) für ein zuverlässiges Proben-Multiplexing
Einleitung
Die RNA-Sequenzierung ist eine leistungsstarke Methode für dieErkennung, das Profiling und die Quantifizierung von RNA-Transkripten. Dank der Verwendung von Illumina-Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation (NGS)erfordert die RNA-Sequenzierung keine spezies- odertranskriptspezifischen Sonden, sodass die Daten nicht durchvorherige Annahmen über das Transkriptom beeinflusst werden.Daher ermöglicht die RNA-Sequenzierung hypothesenfreieVersuchsdesigns aller Spezies, einschließlich Speziesmit schlechteroder fehlenderGenomnotation. Über die Messung vonGenexpressionsänderungen hinaus kann die RNA-Sequenzierungfür Erkennungsanwendungen, z. B. das Identifizieren alternativerSpleißereignisse, Genfusionen, die allelspezifische Expression sowiedas Untersuchen seltener und neuartiger Transkripte verwendetwerden.
Aufgrund eines gewachsenen Verständnisses der Komplexität der
Genregulation ist das Erfordernis der Erfassung zusätzlicher Daten
entstanden. Stranginformationen geben an, aus welchem der beiden
DNA-Stränge ein bestimmtes RNA-Transkript abgeleitet wurde.
Diese Informationen erhöhen die Zuverlässigkeit der
Transkriptnotation, insbesondere bei nicht humanen Proben.
Das Identifizieren des Strangursprungs erhöht den Prozentsatz der
sich alignierenden Reads, was die Sequenzierungskosten pro Probe
senkt. Die Beibehaltung der Strangausrichtung ermöglicht auch die
Identifizierung der Antisense-Expression, eines wichtigen Mediators
derGenregulation.1Die Möglichkeit zum Erfassen der relativen
Abbildung 1: TruSeqStrandedRNA – TruSeqStrandedmRNA und Total RNAermöglichen die zuverlässige Abfrage sowohl von Standardproben als auch vonProben geringer Qualität und umfassen Workflows, die für zahlreicheStudiendesigns geeignet sind.
Häufigkeit der Sense- und Antisense-Expression bietet eineTransparenz für regulatorische Interaktionen, die ohne dieseMöglichkeit fehlen könnte.
Während die wichtigen biologischen Rollen nicht codierender RNA(ncRNA) weiterhin anerkannt werden, bietet die Gesamt-Transkriptom-Analyse oderGesamt-RNA-Sequenzierung einumfassenderes Bild der Expressionsdynamik. Die durch dieReduzierung der ribosomalen RNA (rRNA) ermöglichte Gesamt-RNA-Sequenzierung eignet sich für FFPE-Proben, die potenziell kritischebiologische Informationen enthalten. TruSeq Stranded RNA bietetsowohl fürmRNA- als auch für Gesamt-Transkriptom-Analysen eineeinzigartige Kombination von hervorragender Datenqualität. Zudemermöglicht derWorkflow die zuverlässige Abfrage sowohl vonStandardproben als auch von Proben geringerQualität. Außerdem ister für zahlreiche Studiendesigns geeignet (Abbildung 1).
Effektive ribosomale Reduzierung
TruSeq Stranded RNA (Tabelle 1) kombiniert bewährte Chemie zur
ribosomalen Reduzierung und Bibliotheksvorbereitungs-Chemie in
einem einzigen, optimierten Protokoll. Anders als PolyA-basierte
biotinylierter Proben, die rRNA-Spezies selektiv binden. Das Sonden-
rRNA-Hybrid wird von magnetischen Beads abgefangen undmittels
Pulldown entfernt, sodass die gewünschte rRNA-bereinigte RNA in
der Lösung verbleibt. Dieser Prozessminimiert die ribosomale
Kontamination undmaximiert den Prozentsatz an eindeutig
zugeordneten Reads, wobei sowohl mRNA- als auch ein breites
Spektrum an ncRNA-Spezies von Interesse abgedeckt werden,
darunter lange intergenische nicht codierende RNA (lincRNA),
kleine nukleäre RNA (snRNA), kleine nukleoläre RNA (snoRNA) und
sonstige RNA-Spezies.2
TruSeq™ Stranded mRNA und Total RNAErhalten Sie eine deutliche und umfassende Ansicht des Transkriptoms mit einer optimierten,kostengünstigen und skalierbaren Lösung für mRNA- oder Gesamt-Transkriptom-Analysen.
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
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Tabelle 1: Anvisierte RNA-Spezies für die Reduzierung
Anvisierte RNA-Spezies Bibliotheksvorbereitung
• Zytoplasmatische rRNATruSeqStranded Total RNA with Ribo-
Zero Human/Mouse/Rat
• Zytoplasmatische rRNA• Mitochondriale rRNA
TruSeqStranded Total RNA with Ribo-
Zero Gold• Zytoplasmatische rRNA• Mitochondriale rRNA• Globin-mRNA
TruSeqStranded Total RNA with Ribo-
Zero Globin
Hochwertige Stranginformationen
TruSeq Stranded RNA-Chemie bietet eine hervorragendeDatenqualität. Die Strangmessung oder der Prozentsatz an eindeutigzugeordneten Reads, die basierend auf gut charakterisierteruniverseller humaner Referenz-RNA (UHR) genaue Informationenzum Strangursprung liefern, beträgt mit TruSeq StrandedmRNA≥ 99 %undmit TruSeq Stranded Total RNA ≥ 98 %. Diese äußerstgenauen Informationen dienen zur Steigerung des Prozentsatzesan eindeutigen Reads, die sich in der Assemblierung schlechtannotierter Transkriptome alignieren, und bieten die erforderlicheSensitivität für die Erkennung der Antisense-Expression.Die einheitliche, präzise Messung der RNA-Häufigkeit spiegelt sich ineiner hohen Reproduzierbarkeit zwischen technischen Replikatenwider (Abbildung 2, R2 = 0,9783).
TruSeq Total RNA für Proben von geringerQualität
TruSeq Stranded RNA ermöglicht die zuverlässige und effizienteAbfrage von FFPE- und anderen RNA-Proben von geringerQualität.Es besteht transkriptübergreifend eine hohe und gleichmäßigeAbdeckung bei frisch gefrorenen (FF-) und FFPE-Proben, die mitTruSeq Stranded Total RNA vorbereitet wurden (Abbildung 3).Der optimierte Ribo-Zero-Workflow zum Entfernen von rRNA bieteteine praktikable, in hohemMaße skalierbare Lösung für eineeffiziente Gesamt-Transkriptom-Analyse von Proben, die in der Regelschwierig zu analysieren sind.
RNA-Analyse von Blutproben
TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Globin ermöglicht dieeffiziente, zuverlässige Abfrage von aus Blutproben isoliertercodierender und nicht codierender RNA. Ein optimierter,automatisierbarerWorkflow wendet die Ribo-Zero-Chemie an, um ineinem einzigen, schnellen Vorgang gleichzeitig Globin-mRNA sowiezytoplasmatische undmitochondriale rRNA zu entfernen (Tabelle 1).DieserWorkflow kombiniert das Entfernen von Globin-mRNA, dasEntfernen von rRNA und die Bibliotheksvorbereitung, um dieSequenzierungsergebnisse zu optimieren. Er verkürzt zudem dieAssay-Gesamtdauer, macht zusätzliche Entfernungschemieüberflüssig und senkt die Kosten pro Probe.
Abbildung 2: Hohe Übereinstimmung zwischen technischen Replikaten:Technische Replikate von FFPE-Gewebe weisen eine hohe Übereinstimmung auf,was auf eine stabile Leistung bei der Bibliotheksvorbereitung hindeutet. Bei denAchsen handelt es sich um die log2-FPKM-Genexpression (Fragments perKilobase Million). Der R²-Wert wird abgebildet.
Abbildung 3: Gleichmäßige Abdeckung über Transkripte hinweg: TruSeqStranded Total RNA bietet eine hervorragende Abdeckung über die wichtigsten1.000 exprimierten Transkripte hinweg bei FF-Tumorgewebe (oben) und FFPE-Tumorgewebe (unten) sowie passendem normalem Brustgewebe mit > 98 %alignierten Strang-Reads.
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
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Differenzialexpression von nicht codierender RNA
Das Beibehalten der Stranginformationen von RNA-Transkripten istaus vielen Gründen wichtig, einschließlich der Erkennung differenziellexprimierter Transkripte. Die RNA-Sequenzierungsanalyse vonBrusttumor- und normalem Gewebe wurde zwischen TruSeqStranded Total RNA Kit mit Ribo-Zero und einer PolyA-basiertenStandardmethode für die Bibliotheksvorbereitung verglichen. Sowohlbei den mit TruSeq Stranded Total RNA als auch bei den mit PolyAvorbereiteten Bibliotheken wird die Differenzialexpression von ATP5Hzwischen Tumor- und normalen Proben erkannt. Mit TruSeqStranded Total RNA wird die Differenzialexpression in umgekehrterAusrichtung an der Position des Pseudogen-Transkripts AC087651.1jedoch auch in der erwarteten, entgegengesetztenStrangausrichtung erkannt (Abbildung 4). TruSeq Stranded TotalRNA ermöglicht zudem die zuverlässige Erkennung derDifferenzialexpression zwischen Tumor- und normalem Gewebe übermehrere Arten von ncRNA hinweg, darunter lincRNA, snRNA,snoRNA und sonstige RNA-Spezies (misc RNA) (Abbildung 5).
Abbildung 4: Differenzialexpression von ncRNA-Transkripten: ATP5H-ExpressionausChromosom 17wird in Brusttumor- ggü. normalem Gewebe differenziellexprimiert. Die Verwendung von zwei verschiedenen Bibliotheksvorbereitungs-methoden (RZ: Ribo-Zero für Gesamt-RNA oder PolyA: PolyA-basierte mRNA)zeigt die Differenzialexpression in Tumor- gegenüber normalem Gewebe beibeiden Vorbereitungsmethoden (blau). Nur TruSeqStranded Total RNA with Ribo-Zero zeigt jedoch die Differenzialexpression an der Position einesPseudogens (rot,AC087651.1), für dasReadswie erwartet in der entgegengesetzten Ausrichtungerkannt werden. Diese Stranginformationen wären bei einer standardmäßigenmRNA-Vorbereitung verloren gegangen.
Abbildung 5: Erkennung der ncRNA-Expression: Mit TruSeqStranded Total RNAkann die Differenzialexpression über mehrere ncRNA-Spezies hinweg, darunterlange intergenische nicht codierende RNA (lincRNA), kleine nukleäre RNA(snRNA), kleine nukleoläre RNA (snoRNA) und sonstige RNA (misc RNA),zwischen Tumor- und normalem Gewebe erkannt werden (vier Replikate proProbe, Falscherkennungsrate (FDR) = 0,05).
Die Indizeswerden füreine innovative Lösung zumProben-Multiplexing ineinemeinfachen Verfahren zu den cDNA-Fragmenten derProbehinzugefügt. Füreine bessere Betriebseffizienz können bis zu 96vorgefüllte, eindeutig indizierte Proben gepoolt undzusammen in eineeinzige Fließzellen-Lane auf einerbeliebigen Illumina-Sequenzierung-splattformsequenziertwerden.Nach derSequenzierungwerden dieIndizesverwendet, umdie Daten zu demultiplexieren undReadsdenrichtigen Proben imPool zuzuweisen.
TruSeq Stranded RNA kann eine Strategie mit einfachem Index odereine Strategie mit doppeltem Index verwenden, die eine eindeutigeKombination aus zwei Indizes zum Demultiplexieren nutzt.Die Adaptermit eindeutigem doppeltem Index (Unique Dual Index,UDI) wurden im Rahmen der Zusammenarbeit von IntegratedDNA Technologies, Inc. (IDT) und Illumina entwickelt (separaterhältlich) und verwenden zum Demultiplexieren eindeutige Paarevon Indizes. Die neu eingeführten UDIs (24 und 96) bieten einegrößere Plexität, die die präzise Zuordnung von Reads und deneffizienten Einsatz von Fließzellen ermöglicht. Die Verwendung vonUDI-Kombinationen ist eine bewährte Methode, mit der sichsicherstellen lässt, dass Readsmit falschen Indizes dieVariantenbestimmung nicht beeinflussen.
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
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Zusammenfassung
TruSeq StrandedmRNA und Total RNA bieten eine deutliche undumfassende Ansicht des Transkriptoms und ermöglichen einegenaue Messung der Strangausrichtung, eine einheitlicheAbdeckung und eine äußerst zuverlässige Erkennung von Merkmalenwie alternativen Transkripten, Genfusionen und der allelspezifischenExpression. TruSeq Stranded Total RNA vereint alle Vorteile derTruSeq RNA-Bibliotheksvorbereitung mit Ribo-Zero-Chemie zurribosomalen Reduzierung und bietet somit eine zuverlässige und inhohemMaße skalierbare Lösung zur Vorbereitung sequenzierfähigerBibliotheken für die Gesamt-Transkriptomanalyse, die mit einerVielzahl an Proben kompatibel ist, darunter nicht humane und FFPE-Proben.
Quellen1. Nagai K, Kohno K, Chiba M, et al. Differential expression profiles of sense and
antisense transcripts between HCV-associated hepatocellular carcinoma
and corresponding noncancerous liver tissue. Int J Oncol. 2012(40):1813-20.