TRANSFIERA SUS MÉTODOS DE HPLC … · analisis/Control de calidad Objetivos primarios Respuesta a la fabricación– producción más rápida ... •Dimensiones de columna para

TRANSFIERA SUS

MÉTODOS DE HPLC

CONVENCIONAL A

FAST LC

Tecnologias para mejorar los

tiempos de análisis y la

productividad

Julián de la Mata

13 de Diciembre de 2012

1

Agenda

En este eSeminario hablaremos sobre:

- Pasos a seguir para convertir un método de HPLC

convencional en un método rápido.

- Aumento de la eficacia de la separación con

columnas UHPLC (superficial y totalmente porosas )

- Guía de selección de columnas para el desarrollo de métodos

rápidos

2

Pasos a seguir para convertir un método de HPLC

convencional en un método rápido.

Consideraciones acerca de la justificación de un método rápido: revalidaciones/beneficios

Consideraciones acerca de las columnas: fase estacionaria, dimensiones, tecnología de partículas

Consideraciones del método:

Cálculos de conversión de métodos

Fase móvil, pH , temperatura

Consideraciones acerca del instrumento.

Objetivos perseguibles: mantener la resolución ,evitar la dispersión de picos, anticipación de limitaciones de presión o flujo.

3

Page 4

Beneficios de la Fast LC en la calidad de los

analisis/Control de calidad

Objetivos primarios

Respuesta a la fabricación– producción más rápida

Posibilidades de expansión – analizar más productos por día

Manejar mayor carga de muestras con menos personal

Reducir costo por análisis (carga de trabajo, gastos generales)

Objetivos secundarios

Reducir consumo de disolventes (compra, desechos)

Procesar más muestras con menos instrumentos.

Page 5

¿por qué mucha gente no hace nada al respecto?

La Revalidación es vista como algo costoso y

tedioso, a pesar de los beneficios a largo plazo.

Hay un sentimiento histórico– “no funciona tan

fácilmente como decís en vuestros seminarios”

Hay quien piensa que se requiere un equipo

especialido de UHPLC para hacer cromatografía

rápida.

Y que las opciones de mejora sin una posible

degradación de la selectividad/resolución son

limitadas.

Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden

Usarse cumpliendo los Requirimientos USP

De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 4/2009

L

PACKING

BRAND NAME

MANUFACTURER

L1

L1

Octadecyl silane chemically bonded to

porous silica or ceramic micro-

particles, 1.5 to 10 µm in diameter, or a

monolithic rod

Octadecyl silane chemically bonded to

AminoQuant

AQUASIL C18

Ascentis C18

Ascentis Express C18

ASI C18

ASI microC18

Atlantis dC18

Atlantis T3

Axxi-Chrom C18, ODS

Bakerbond C18

BetaBasic 18

BetaMax Neutral

BETASIL C18

Bio-C18

BioBasic 18

Bio-Sil ODS

Bio-Sil ODS-10

Bondclone C18

BR-C18

Burdick & Jackson C18

Cadenza CD-C18

Cadenza 5CD-C18

Cadenza CL-C18

Cadenza 5CL-C18

Cadenza CW-C18

Cadenza 5CW-C18

Cadenza HS-C18

Capcell C18 AG 120

Capcell C18 SG 120, 300

Capcell C18 UG 80, 120, 300

Capcell C18 MG

Capcell C18 MGII

Capcell C18 MGIII

Capcell C18 ACR

Capcell C18 AQ

Capcell C18 IF

Chemcosorb 5-ODS-H

Chromegabond C18

Chromegabond WR-C18

Chromolith RP-18e

Clarity Oligo-RP

Clipeus C18

Cogent HPS C18

Cogent hQ C18

Cogent Simulare C18

Cogent MicroBee C18

Cogent Bidentate C18

Cogent e-Column C18

Cosmosil C18 MS-II

Cosmosil C18 AR-II

Cosmosil C18 AR-300

Cosmosil C18 PAQ

Delta-Pak C18

Agilent Technologies

Thermo Scientific

Supelco

Supelco

Analytical Sciences Inc.

Analytical Sciences Inc.

Waters Corp.

Waters Corp.

Axxiom

JT Baker

Thermo Scientific

Thermo Scientific

Thermo Scientific

Sepax Techonologies

Thermo Scientific

BIO-RAD Laboratories

BIO-RAD Laboratories

Phenomenex

Sepax Techonologies

B&J

Imtakt - Silvertone Sciences

Imtakt - Silvertone Sciences

Imtakt - Silvertone Sciences

Imtakt - Silvertone Sciences

Imtakt - Silvertone Sciences

Imtakt - Silvertone Sciences

Imtakt - Silvertone Sciences

Shiseido

Shiseido

Shiseido

Shiseido

Shiseido

Shiseido

Shiseido

Shiseido

Shiseido

Dychrom

ES Industries

ES Industries

Merck KgaA

Phenomenex

Higgins Analytical

MicroSolv Techn. Corp.

MicroSolv Techn. Corp.

MicroSolv Techn. Corp.

MicroSolv Techn. Corp.

MicroSolv Techn. Corp.

MicroSolv Techn. Corp.

Nacalai Tesque, Inc.

Nacalai Tesque, Inc.

Nacalai Tesque, Inc.

Nacalai Tesque, Inc.

Waters Corp.

L

Page 6

Poroshell 120

Criterios de Ajuste de Métodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Métodos de Dimensiones de Columna

Parámetro Especificaciones Máximas Comentarios/Ejemplos

Longitud de Columna 70% 250mm 75mm

150mm 50mm

Diámetro Interno de

Columna

25% (FDA ORA-LAB 5.4.5*)

USP – 25% ID Columna puede ajustarse si la

velocidad lineal es constante**

4.6 mm 3.0 mm (-35%)

4.6 mm 2.1 mm (-54%)

3.0 mm 2.1 mm (-30%)

Flow Rate 50%

Volumen de Inyección

Reducir tanto como se necesite–

debe cumplir los límites de

detección y precisión

Si cambia a una columna más

corta , haga el cambio apropiado

en el volumen de inyección

Tamaño de Partícula Reducir hasta el 50%

(no se puede aumentar)

Puede cambiar la longitud de columna y el

tamaño de partícula para mantener la misma

Rs

5um 3.5um (-30%)

5um 2.7um (-46%) *Cambiado en 2/24/09 – Para la copia oficial y actual , ir a

http://www.fda.gov/ScienceResearch/FieldScience/default.htm

** USP 30 Second Supplement Revisions, PF34(5), en proceso.

Ver “ Stimuli article” en Pharmacopeial Forum 2009; 35(6)

Page 7

Pasos generales para desarrollar un método

robusto en LC/LCMS

• Usar el tipo de cromatografía adecuado– normalmente fase

reversa (C18, polar embebida, etc…) o fases HILIC.

• Elegir las condiciones adecuadas para una separación

isocrática o en gradiente.

• Ajustar el pH para una optima retención de los analítos

• Elegir la fase ligada adecuada para obtener una separación

y resolución adecuada de los picos.

8

Consideraciones en la elección de la fase

estacionaria de su columna.

• Diferentes interacciones para compuestos polares y no

polares.

• Explotar otras interacciones con la fase ligada (e.g., pi-pi)

• El cambio de la fase móvil puede mejorar la

selectividad/resolución y reducir el tiempo de análisis

• Cuando se usan columnas Poroshell 120 la comparación

de las fases ligadas puede hacerse rápidamente!

• Con columnas de distintas fases ligadas y tecnologías de alta

velocidad el traslado de métodos es muy fácil.

Una nueva herramienta para la selección de

columnas en el desarrollo de métodos

El “Column and Sample Prep NAVIGATOR”:

http://www.agilent.com/chem/navigator

10

Ayuda en la selección de columna y en la Preparación de Muestra!

Consideraciónes en el desarrollo de métodos en LCMS

• Selección de fase móvil

• A menudo se prefieren los gradientes debido a las diferencias en las características de retención.

• Elección del tampón

• Por ejemplo un tampón volátil para LCMS (Fórmico,acético, etc)

• Dimensiones de columna para una mayor sensibilidad y velocidad

• Elija columna estrechas para una mayor sensibilidad y más cortas para análisis rápidos.

11

Page 12

¿Qué parámetros afectan a la resolución?

Opciones positivas con bajo riesgo:

• Aumentar el flujo (en condiciones isocráticas)

• Disminuir el tiempo de gradiente, aumentando el flujo proporcionalmente

• Utilizar columnas con menor tamaño de partícula (permite utilizar columnas más cortas)

• Optimizar los parámetros del detector, reducir la dispersión del sistema.

Opciones con mayor riesgo:

• Quimica de la Columna o de la fase móvil (cambios de selectividad)

• Temperatura de la columna (posibles cambios de selectividad)

Ruerde siempre– que cambios en la selectividad química son a menudo tan beneficiosos como perjudiciales. Pruebe primero las opciones positivas, luego explore las opciones con mayor riesgo. La disminución de la viscosidad de la fase móvil invariablemente mejora la eficaciá de la columna.

Page 13

Cómo las dimensiones de la columna, el flujo y el tamaño

de partícula influyen en la resolución y la velocidad

Dimension

Columna

Tamaño

partícula

Eficiencia

teórica,N

Flujo

(ml/min)

Bar* Eficiencia

estimada,N

Veloc.

neta

Cambio

neto en

Resol.

4.6x250mm 5um 20,000 1.0 73 18,300 -- --

4.6x250mm 5um 20000 2.5 183 9,300 2.5x -29%

4.6x150mm 3.5um 17,100 1.0 90 15,000 1.6x -9%

4.6x150mm 3.5um 17,100 2.5 224 13,200 4x -15%

4.6x100mm 1.8um 22,200 1 226 17,700 2.5x -2%

4.6x100mm 1.8um 22,200 2.0 452 17,500 5x -2%

* Presión en bares, fase móbil acetonitrilo/agua 60/40 v/v,

25oC temperatura de operación

Nota: Eficacia estimada para un pico con k’ o k* = 4, dispersión=20ul

LC Calculator –Web Version

14

https://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Columns-Sample-

Preparation/LC-LC-MS-Columns/Pages/lccalcweb.aspx

LC Calculator Home Get the Mobile App Get the Desktop App How do I use this app?

Dimensiones de la columna

Elección de solvente y

porcentaje de composición

Temperatura

Flujo

Porosidad

Page 15

Cálculos simples para la conversión de métodos

Muchos usuarios quieren y necesitan trasladar métodos LC

antíguos a métodos nuevos con columnas de tecnología avanzada.

Muchos usuarios quieren convertir métodos LC-UV a métodos LC-

MS predominantemente en modo ESI.

Las Columnas con menores diametros son apropiadas para

trabajar a flujos menores sin reducir la velocidad lineal ni la

velocidad del análisis.

Convertir estos métodos no es siempre tan fácil como parece.

Los fabricantes de cromatografía pueden guiar a los usuarios a

encontrar una solución eficaz bajo condiciones óptimas de

operación.

Page 16

Conversión del flujo

Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las

dimensiones de columna, el flujo y el tiempo.

1. Modificación del flujo, para columnas de diferentes diametros

ml/minmm

mmml/min 21.0

4.6

2.11.0 i.e.

2

2 col.

2

column1

column21 col. Flujo

.Diam

Diam.Flujo

Page 17

Conversión de tiempo Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las

dimensiones de columna, el flujo y el tiempo.

2. Segmento de gradiente o modificación del tiempo de análisis*

.15250

150.25 i.e. min

mm

mmmin

*asume un flujo proporcional para las columnas 1 y 2, según Equación 1

2 col.

columna1

columna21 col.

L

LongitudTiempo

ongitudTiempo

Page 18

Pendiente del gradiente vs. Tiempo y flujo Efectos k* (“K asterisco”) de la pendiente del gradiente – el parámetro en gradiente equivalente al factor de capacidad k’ (“K prima”) en las separaciones isocráticas

Aumentando k’ o k* generalmente aumenta la resolución. Esto puede hacerse disminuyendo la fuerza del solvente o disminuyebdo la pendiente del gradiente, respectivamente

3. Tiempo/ pendiente del gradiente

columna volumenes10

20%)-(100% 8% i.e.

# volumenes de columna= (Flujo x Tiempo Gradiente) / volumen columna

Volumen columna Zorbax = 3.14 x r2 x L x 0.6 (r y L en cm)

columna de Volumenes #

%Inicial)-(%Final gradiente del Pendiente %

Page 19

Conversión del volumen de inyección

Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las dimensiones de columna, el flujo y el tiempo.

4. Modificación del Volumen de Inyección

2 col.

columna1

columna21 col. ..V

Volumen

VolumenVol.iny Inyol

2 col.

columna1

columna21 col. 4

2.0

4.020 i.e. μl

ml

mlμl

Volumen columna Zorbax = 3.14 x r2 x L x 0.6 (r y L en cm)

Page 20

Restricciones del sistema: dispersión de picos,

limitaciones de flujo y presión

La reducción del volumen de columna aumenta el efecto negativo del sistema en el ensanchamiento de picos.(recom. utilizar capilares 0.12mm y celda de pequeño volumen)

El aumento del flujo puede afectar al rendimiento del desgasificador y la estabilidad de la presión – comprobar especificaciones y precauciones con el fabricante.

El aumento de flujo, junto con la disminución en el tamaño de partícula , producirá un aumento significativo de presión – este efecto debe ser calculado antes de usar las condiciones de operación para asegurar unos valores aceptables

Consejo: Una mayor Temperatura puede mejorar la

velocidad y la resolución

La alta temperatura es un parametro a considerar en la optimización de métodos de Fast LC.

•Proporciona una transferencia de masa más rápida:

– Mejora la Eficiencia ( resolución)

– Disminuye el tiempo de analisis– separaciones más rápidas sin pérdida en resolución.

•Disminuye la viscosidad de la fase móvil

– Baja la presión – permite flujos mayores, separaciones más rápidas, mayor eficiencia

•Pueden cambiar la selectividad– optimizar la resolución

•No es necesario llegar al límite-los valores medios tambien proporcionan beneficios

Viscosidad de los solventes Presión del sistema con MeOH/Agua

Porcentaje de

MeOH (%)

Presión (bar)

0 142

10 169

20 203

30 229

40 249

50 252

60 240

70 216

80 184

90 145

100 98

Columna de 4.6 x 50mm y partículas de 1.8um a 1 ml/min,30oC

0

50

100

150

200

250

0 50 100

pressure

per cent age of MeOH

Pr essure cur ve

•Use P de 4.6 x 50mm como punto de partida

•Multiplique P por Lcol2 / Lcol1

•Si P es menor que la P Max del Instrumento

puede usar esa longitud

Viscosidad de los solventes Presión del sistema con ACN/Agua

Porcentaje de ACN

(%)

Presión (bar)

0 142

10 154

20 159

30 156

40 150

50 135

60 120

70 104

80 88

90 70

100 59

Columna de 4.6 x 50mm y partículas de 1.8um a 1 ml/min,30oC

Syst em pr essur e wi t h t he change of

per cent age of ACN

0

50

100

150

0 50 100

Per cent age of ACN

Pressure

•Use P de 4.6 x 50mm como punto de partida

•Multiplique P por Lcol2 / Lcol1

•Si P es menor que la P Max del Instrumento

puede usar esa longitud

El Cambio en la Retención por el pH para

compuestos Ionizables es clave en el desarrollo de

métodos

• Los analitos no cargados tienen mejor retención en fase

reversa (i.e. acidos a bajo pH y bases a alto pH)

• Los Silanoles de la silica ionizan a pH medio,

incrementando la retención de los analitos básicos (i.e

posibles interacciones de intercambio iónico)

• Elija el pH de la fase móvil para optimizar la retención y la

selectividad durante el desarrollo de métodos.

• Las columnas Poroshell 120 EC-C18 pueden usarse en

un amplio rango de pH.

El Cambio en la retención con el pH para compuestos

ionizables depende del tipo de compuesto

Fase Movil: 45% MeOH, 55% 20 mM Tampón fosfato

Más retención para los analitos no cargados (i.e. acidos a bajo pH y bases a alto pH)

0

2

4

6

8

10

12

pH 2.5 pH 6.5 pH 8 pH 11.5

Acetylsalicylic acid (pka 3.5)

Pyridine (pKa 5.2)

Codeine (pKa 8)

Procainamide (pKa 9.2)

Amphetamine (pKa 9.9)

Caffeine (pKa 14)

Rete

nti

on

Tim

e

Conversión del

volumen de inyección

Recomendación de

parámetros del

Detector

Conversión de método

gradiente e isocrático

(auto-detección)

Consejo: Method Translator facilita los cambios Truco: Deje que el Method Translator haga los cálculos Modo básico para una Fácil Transferencia de un Método Convencional a Fast LC

Método Original Nuevo Método

Detailed Output Detailed Input

Agilent Method Translator – Modo avanzado Información más detallada, pero aún fácil de usar

Aumento de la eficacia de la

separación con columnas UHPLC

(superficial y totalmente porosas )

28

¿Es fácil la transferencia de métodos?

¿Cuales son los crietérios de ajuste de métodos de la USP y la FDA?

• Las columnas Poroshell 120 superficialmente porosas pueden usarse cumpliendo

los requerimientos de la USP para el traslado de métodos sin necesidad de

revalidar.

Ejemplo de transferencia de un método USP a Poroshell 120 – paso por

paso.Ajuste de parámetros para optimizar la separación

• Volumen de inyección,

• gradiente

• flujo,

• Velocidad de adquisición de datos

• Volumen extra columna

29

Separación inicial de 10 sulfamidas en 30 minutos

Columna 4.6 x 250 mm, 5-um

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm

G1315B , celda de flujo de 2 ul , 0.1s 30C

Par Crítico

Rs=1.21

Presión = 110 bar

Vamos a convertir esta separación a Poroshell 120 EC-C18. El objetivo será acelerar la

separación y no perder resolución del par críticio.

Tiempo %B

0 8

30 33

33 33

34 8

1 ml/min 254 nm 5 ul inyección

A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua

B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN

Eclipse Plus C18, 4.6 x 250mm, 5um

Escalado del volumen de Inyección y del gradiente de una

columna de 250 mm,5um a una Poroshell de 100 mm, 2.7um

min 2 4 6 8 10 12

3.6

33

4.2

18

4

.35

6

4.6

91

5.6

13

5.9

81

6

.06

4

7.4

60

8.2

70

10

.40

0

Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm

G1315B , celda de flujo de 2 ul , 0.1s 30C

Presión = 172 bar

Separacion de 10 sulfamidas en una Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 100 mm, 2.7-um en

12 minutos usando un gradiente de ácido fórmico/acetonitrilo.

(100/250 x30 min) = 12 min

(5 ul a 2 ul)

Tiempo %B

0 8

10 33

11 33

12 8

1 ml/min 254 nm 2 ul injection

A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua

B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN

Poroshell120 EC-C18

4.6 x 100mm, 2.7um

Rs=1.23

Aumentamos el flujo de 1 mL/min a 1.5, y luego a 2 mL/min

para optimizar por el menor tamaño de partícula

min 2 4 6 8

2.4

30

2.8

26

2

.92

1

3.1

45

3.7

74

4.0

17

4

.07

5

5.0

02

5.5

39

6.9

74

min 2 4 6

1.8

21

2.1

21

2

.19

2

2.3

58

2.8

33

3.0

10

3

.05

5

3.7

39

4.1

35

5.2

19

Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm

G1315B , celda de flujo de 2 ul , 0.1s 30C

Escalando del gradiente para un aumento de flujo de 1.0 mL/min a 1.5 mL/min y a 2.0 mL/min, resulta

en una separación de 6 minutos en la Poroshell 120 EC-C18 column. La resolución no cambia.

Time %B

0 8

6.7 33

7.4 33

1.5 ml/min

254 nm

2 ul inyección

A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua

B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN

Poroshell 120 EC-C18

4.6 x 100mm, 2.7um

Time %B

0 8

5 33

5.5 33

2.0 ml/min

254 nm

2 ul inyección

A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua

B 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN

Rs=1.22

Rs=1.21

Gradiente rápidamente optimizado para la mejor

selectividad en la Poroshell 120 EC-C18

min 0 2 4 6 8 10

mAU

0

20

40

60

80

100

3.7

06

4.3

71

4.5

12

4.8

77

5.9

29

6.3

75

6.4

72

8.0

38

8.9

82

11.5

32

min 0 2 4 6 8 10

mAU

0

20

40

60

80

100

2.4

75

2.9

23

3.0

21

3.2

63

3.9

77

4.2

66

4.3

34

5.3

68

5.9

90

7.7

05

min 0 2 4 6 8 10

mAU

0

20

40

60

80

1.8

56

2.1

94

2.2

68

2.4

48

2.9

89

3.2

02

3.2

54

4.0

23

4.4

80

5.7

76

min 0 2 4 6 8 10

mAU

0

20

40

60

2.3

57

3.2

52 3

.352

3.7

23

5.5

45

6.5

17

6.8

35

8.4

79

9.1

34 1

0.5

16

min 0 2 4 6 8 10

mAU

0

20

40

60

0.6

36

1.7

59

2.2

53 2

.369

2.6

69

3.9

74

4.5

21

4.6

32

5.5

11

5.9

74 7

.078

La resolución se mejora optimizando la separación del gradiente.

Rs=1.23

Rs=1.22

Rs=1.21

Rs=2.2

Rs=1.9

Mejora de la resolución y la velocidad con Poroshell Traslado de método de una columna Eclipse Plus C-18 4.6 x 250 mm 5 um a una

Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

9.7

12

11.1

16

11.5

96

12.6

74

15.2

48

16.1

51

16.4

35

20.6

87

23.0

76

29.2

90

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

50

100

150

200

250

1.7

19

2.1

89

2.3

11

2.6

06

3.8

67

4.4

37 4.5

58

5.4

50

5.9

20

7.0

37

Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)

Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho)

Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor)

Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)

No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada

de 2 micras en ambas columnas.

325 bar

110 bar

Sulfadiazina,

Sulfatiazol

Sulfapiridina

Sulfamerazina,

Sulfametazina,

Sulfametazol,

Sulfametoxipiridazina,

Sulfacloropiridazina

Sulfametoxazol,

Sulfadimetoxina

Tiempo %B

0 8

33 33

34 33

Columna: Eclipse Plus C18

4.6 x 250mm, 5um

Flujo: 1 mL/min

Fase Móvil:

A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua

B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN

Tiempo %B

0 8

12 33

13.2 33

Columna: 4.6 x 100mm

Poroshell 120 EC-C18,

2.7um

Flujo: 1.85 mL/min

Page 34

Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell

120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

9.7

12

11.1

16

11.5

96

12.6

74

15.2

48

16.1

51

16.4

35

20.6

87

23.0

76

29.2

90

110 bar

5

mAU

0

50

100

150

200

250

1.7

19

2.1

89

2.3

11

2.6

06

3.8

67

4.4

37 4.5

58

5.4

50

5.9

20

7.0

37

325 bar

min

Ver condiciones en diapositiva anterior

Page 35

Mejor Resolución ,

linea base!!

Rs=1.21

Rs=1.9

Optimización de los parámetros del instrumento

para el uso de columnas de pequeño volumen

Los parámetros críticos del instrumento incluyen:

Velocidad de adquisición de datos

Tamaño de la celda de flujo

Tubos capilares

Volumen de mezcla (parte del volumen de

retraso del gradiente)

Volumen de retraso del gradiente (dwell volume)

Isocrático y

Gradiente

Gradiente solo

Optimización de resultados con columnas sub-2um

- Comparación de la velocidad de adquisición de datos

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Velocidad de adquisicion de datos = 2 seg

Velocidad de adquisicion de datos = 0.1 sec

Platos #3 Platos #4

3478 4384

Platos #3 Platos #4

6613 6138

Columna: ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 4.6 x 30 mm, 1.8 µm Fase Mobil: 60% Metanol: 40 agua Flujo: 1mL/min

Temperatura: RT Detección: UV 254 nm Muestra: QC Test 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cl-Nitrobenzeno 4. Tolueno

Contribución del Instrumento HPLC al rendimiento en Isocrático y en Gradiente

ECV = volumen de muestra+ volumen tubos de conexión + volumen conectores+ volumen celda del detector Dwell Volume = volumen desde la formación del gradiente a

la cabeza de la columna.

Extra Column

Volume (ECV) {

Dwell

Volume

Fase

móvil

Detector

Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent

Poroshell 120 Evaluacion de N para la Poroshell 120 150 mm × 4.6 mm column

39

Muestra:Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene

Column: Agilent Poroshell 120 SB-C18 150 mm × 4.6

mm, 2.7 μm

Fase Movil: Agua: ACN = 30:70

Flujo: 1.5 mL/min

Volumen de Inyección: 1 μL

Temperatura columna: 50 °C

Detector: DAD 254 nm/10, Ref 360/100 nm, 20 Hz,

celda estandar

Pressure: 200 bar

Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent

Poroshell 120 100.000 platos en menos de 5 min usando 3 columnas en serie

40

Muestra: Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene

Columna: Tres columnas Agilent Poroshell 120 SB-

C18, 150 mm × 4.6 mm, 2.7 μm

Fase Movil: Water: ACN = 20:80

Flujo: 1, 1.5, 1.8 mL/min

Volumen de inyección: 1 μL

Temperatura columna: 60 °C

Detector: DAD 254 nm/10, Ref 360/100 nm, 20 Hz,

celda estandard

Video para la transferencia de métodos con

Poroshell 120 en la web de Agilent

41

https://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Columns-Sample-Preparation/LC-LC-MS-

Columns/Analytical-HPLC-UHPLC/Poroshell-120/Pages/poroshell120video.aspx

UHPLC – ¿Porqué usar columnas diferentes?

Los instrumentos UHPLC incluyen una variedad de opciones de alta presión además de las diseñadas para Alta productividad y Cromatografía Rápida.

Estos instrumentos operan a presiones superiores a los 400 bar/6000 psi.

El objetivo es tener columnas de pequeño tamaño de particula <2-3um para obtener una mejor eficacia, resolución y productividad en estos instrumentos.

Esto nos da la flexibilidad de operar por encima de los 400 bar en muchas aplicaciones – bien para obtener velocidad o bien para mejorar la resolución con columnas largas de 1.8um

El nuevo Agilent 1290 Infinity puede operar hasta 1200 bar.

Esto requiere columnas diseñadas para poder trabajar hasta los 1200 bar – las nuevas columnas RRHD!

Separaciones por debajo de1 Minuto con Columnas

RRHD

ZORBAX RRHD SB-C18, 2.1 x 100mm, 1.8 µm

H2O (0.05% Acido Fórmico) / 2-98% Acetonitrilo

T = 80°C

Inj Vol = 0.5 µl

WL = 210 nm

DR = 80 Hz

F = 2 ml/min

P = 1085 bar

10 Compound Pharma Test Mix

1.0min

Elige la Longitud de la columna según el Tiempo de Análisis y la Rs

Page 44

RRHD 1.8um 1200 bar

Fase Móvil: 40:60 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 mL/min, Temp: ambiente, Columnas: RRHD SB-C18, 2.1 mm ID, Longitudes

abajo Picos: 1: uracilo, 2 acetofenona, 3 propiofenona, 4 butirofenone, 5 valerofenona, 6 hexanofenona

Rs3,2: 5.64

N6 : 10,700

Presión: 350 bar

Solvente: 1,25mL

Rs3,2: 11.98

N6 : 34,100

Presión :750 bar

Solvente: 2,5mL

Rs3,2: 9.02

N6 : 21,100

Presión : 566 bar

Solvente: 1,75mL

50 mm

100 mm

150 mm

min 0 1 2 3 4

min 0 1 2 3 4

min 0 1 2 3 4

0

La columna RRHD de 150mm es una buena elección para alcanzar alta

resolución con el 1290 Infinity LC.

Aumento de eficacia y Resolución con longitudes

largas 150 + 100 mm = 250 mm 1.8um @ 1100 bar

Page 45

α3,2: 1.20

Rs3,2: 8.76

N6 : 50,200 Pw2: 0.018 min

Pw6: 0.037 min

α3,2: 1.19

Rs3,2: 6.42

N6 : 31,400 Pw2: 0.016 min

Pw6: 0.029 min

150 mm (P:582 bar)

150 +100 mm (P:1095 bar) 1. Uracilo

2. Acetofenona

3. Propiofenona

4. Butirofenona

5. Valerofenona

6. Hexanofenona

Fase Móvil:25:75 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 mL/min, temperatura ambiente,

Columnas ZORBAX RRHD SB-C18, 1.8um

Alta Rs en 3.5 minutos, 250mm, 1.8um a 1100 bar

La Resolución es buena con la columna de 150mm, pero con una columna más

larga la resolución es mejor

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

50

100

150

200

250

300

min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

50

100

150

200

250

300

¿Dónde cae este ejemplo en el Rango del 1290 Infinity?

Page 46

Esta app. cae en el “Power Range” (0,5ml/min-1.095 bar)

Guía de selección de columnas

para el desarrollo de métodos

rápidos

47

Nuevas tecnologías de columna para el desarrollo

de métodos

Columnas para análisis de alta resolución y alta velocidad

• Columnas Sub-2 µm totalmente porosas para operación a ultra altas presiones

• Columnas superficialmente porosas Sub-3 µm

Considerations when developing methods on new column technologies

• Tamaños de particula < 2 μm, presiones típicas 600-1200

• Tamaños de partícula < 3um, limite de presión 600 bares

Comparando Eficiencia y Presión con Diferentes

Tipos de Columnas

Tamaño de partícula/Tipo

Presión Eficiencia LC Compatibilidad

5µm Totalmente Porosa

40 bar 5,000 Todos los

instrumentos hasta 400 bar

3.5µm Totalmente Porosa

80 bar 7,800 Todos los

instrumentos hasta 400 bar

2.7µm

Poroshell 120 150 bar 12,000

Todos LCs/UHPLCs (hasta 600 bar)

1.8µm Totalmente Porosa

250 bar 12,500 Todos

LCs/UHPLCs (hasta to 1200 bar)

Columnas: 4.6 x 50mm, Fase Movil: 60% ACN:40% Agua Flujo: 2 mL/min

50

1.7um

0.5um

0.5um

Las Columnas Poroshell 120 tienen:

• 80-90% de eficicacia de las sub 2um

• A presiones un ~40-50% más bajas

• Con un tamaño de partícula de 2.7um

• Con una frita de entrada de 2um

• Con el doble de resolución de una

columna de 3.5um

• Con un límite de presión de 600 bar

• La partícula tiene un núcleo sólido

(1.7um) y una cubierta exterior porosa

de 0.5um como zona de difusión

Columnas Superficialmente Porosas Poroshell 120

para HPLC y UHPLC:

Beneficios de la tecnologia de las columnas

Poroshell 120

• Permite aumentar la velocidad de separación (reducción del tiempo de análisis)

• Uso con cualquier instrumento (HPLC o UHPLC)

• Reducción de los costos de solventes y de desecho

• Poroshell 120

• Escalabilidad

• Facilidad de transferencia dé métodos

• Mayor transferencia de masa debido a la menor difusión.

• Fases similares a las columnas ZORBAX totalmente porosas.

Mejoras en la transferencia de masas del analíto

gracias a una menor Difusión

Totalmente Porosa

Superficialmente Porosa

• Particulas totalmente porosas • Difusión a través de toda la partícula

• Poroshell 120

• Difusión solo en la capa porosa

• Resultados:

• Menor término C

• Mayor eficiencia

• Y

• Mayores flujos con

• Mínimo impacto en la eficiencia

CBAh /Ecuación van Deemter

Fases estacionarias de las columnas Poroshell 120

Poroshell 120 EC-C18 and C8

• Robustas C18 y C8 desactivadas para las mejores formas de pico a pH 2-9

Poroshell 120 Stablebond C18 and C8

• Química robusta para pH<2

Poroshell 120 Phenyl-Hexyl

• Misma selectividad que las ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl

• Excelente elección para interacciones pi-pi.

• Selectividad alternativa a EC-C18 o SB-C18

• Selectividad similar a columnas fenil, difenil, u otras columnas fenil-hexil

Poroshell 120 SB-Aq

• Fase de ligado propietario que es una

excelente elección para analitos

polares.

Poroshell 120 Bonus-RP

• Su grupo polar embebido proporciona

una selectividad única para

compuestos polares

Poroshell 120 EC-CN

• Química CN desactivada con caracter

flexible para fase reversa y normal

Poroshell 120 HILIC

• Sílica HILIC para uso en Cromatografía

de Interacción Hidrofílica de moléculas

polares.

Agilent tiene 3 tipos de columnas para UHPLC

Hay 3 tipos de columnas UHPLC – la elección depende de las necesidades

Columnas RRHT – columnas 1.8um para LC rápida hasta 600 bar

• Designadas para su uso con el Agilent 1200RRLC

• Compatible con algunos UHPLC’s con límites de presión hasta 800 bar

Columnas RRHD – columnas1.8um hasta1200 bar

• Designadas para uso con el nuevo gilent 1290 Infinity LC

• Para trabajos hasta1200 bar

• Totalmente UHPLC compatible

Poroshell 120 columns

• Límite the presión de 600 bar para uso con HPLC/UHPLC

• Excellent ajuste para LC’s de 400 bar con resultados tipo UHPLC

Page 54

Guías de Selección de Columnas Agilent UHPLC

Análisis

Rápido

Alta Rs

(N)

400 bar LC “Compatible”

1000+ bar

UHPLC “Compatible”

Escalabilidad

de Partícula

1.8, 3.5um

etc.

ID’s

4.6, 3.0

& 2.1

mm

Muestras

sucias?

Poroshell

120, 600

bar X only 2.7um

frita

2um

RRHT,

600 bar

<50mm

RRHD,

1200 bar X X

(3.0 &

2.1)

Page 55

Page 56

Conclusiones

Las conversiones de métodos son una oportunidad para aumentar la

productividad en el laboratorio.

Con los cálculos adecuados se obtienen mejoras en la resolución y

en la selectividad.

Para el uso de columnas más pequeñas con menores tamaños de

partícula puede requerirse la optimización del sistema

cromatográfico.

La presión operativa puede verse incrementada– asegúrese de que

su sistema tiene la capacidad adecuada para operar a las presiones

necesarias en el rango de flujos de los métodos optimizados.

Las columnas Poroshell 120 superficialmente porosas están

diseñadas para trabajar en los rangos de presiones de los equipos

convencionales

Guía de Columna y Desarrollo de Métodos

57

Solicite la Guía de

Columnas y Desarrollo de

Métodos:

Una guía de 162 páginas con

recomendaciones de columnas y

pasos en el desarrollo de métodos.

Número de Publicación 5990-7595EN

Soporte Técnico Agilent

Teléfono de Atención al Cliente:

901 11 68 90

email: [email protected]

www.agilent.com/chem