Transferencia de material genético Aislamiento de plásmidos.

Transferencia de material genético

Aislamiento de plásmidos

Conformaciones de un plásmido

• Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez.

• Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas

• DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado.• Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy

empacado• Superenrollado desnaturalizado. Parecido al

anterior pero un poco menos empacado

Superenrollamiento del DNA plasmídico

Factores que afectan la estructura del DNA

• Calor• pH• Concentración de iones

Temperatura de fusión: Tm

• Temperatura a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.

Método de purificación

G= Glucosa (evitar stress)T=Tris (Amortiguador)E= EDTA (Quelante de Mg)

• Determinación de concentración de DNA

Pureza del DNA• Determinación de pureza

A260/A280

• Relación de 1.9-2.0 alta pureza

Determinación de contaminantes de DNA

Absorbancia a 230 contaminación por fenol o urea

Enzimas de restricción Tipo IUna sola enzima que posee 3 subunidades reconoce el sitio de ADN Esta enzima metila y restringe. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

Tipo IIEnzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos.

Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.

Pueden generar dos tipos de cortes

Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda)

Mapa de restricción

A PCR-amplified DNA fragment has been digested with three different restriction endonucleases (EcoRI, Bgl II, & MboI), singly (lanes 1-3) and in pairwise combination (lanes 4-6). Comparison with a molecular weight standard (lane 7) allows a determination of the sizes of the fragments in the digests, which in turn permit an inference of the order and distances among restriction sites in the DNA fragment