Transfección de células eucariotas Dra. Anabel Alvarez Juliá Biología celular - 2017
Transfección de células eucariotas
Dra. Anabel Alvarez JuliáBiología celular - 2017
Transfección: Proceso por el cual un ácidonucleico foráneo ingresa en unacélula eucariota
¿Para qué transfectar?•Estudiar la regulación de la expression génica(promotores y otros elementos regulatorios)
•Estudiar mecanismos involucrados en el procesamiento del ARN, postraduccionales, etc.
•Estudiar la localización subcelular y/o el efectode la expression de una proteína sobre el fenotipo celular
•Expresión de proteínas para su purificación
•Evaluar la interacción de proteínas
•Producir organismos transgénicos
•Terapia génica
Estable Transitoria
No se transmite en la división celular.
El ADN introducido no se integra al genoma. Existe solo por un período limitado de tiempo.
El ADN se incorpora dentro del genoma.
Transmiten el ADN introducido a su progenie.
Tipos de transfección
Producción de proteínas a granescala, estudios farmacológicoslargos, terapia génica…
Efectos rápidos de la expresión degenes o sus productos o producciónde proteína a pequeña escala
¿Cuál elijo?Estable Transitoria
Es necesario seleccionar las célulasque han incorporado el ADN.
Se requiere de un método de transfección de alta eficiencia.
Se puede evaluar el efecto de la transfección a tiempos cortos
Brooks, PNAS 2007
Métodos físicos
Métodos químicosLiposomas
Fosfato de calcio
Polímeros catiónicos
Electroporación
Biobalística
Microinyección
Métodos biológicos (transducción viral)Adenovirus
Retrovirus
Lentivirus
¿Cómo transfecto?
BiobalísticaProyección de micropartículas de oro recubiertas con el ácido nucleico a alta velocidadDispositivo: Gene gunCélulas vegetales
MicroinyecciónMicroinyección del ADN al núcleoDispositivo: microagujas/micromanipuladosCélulas individuales
ElectroporaciónEl ADN pasa a través de poros temporarios en lamembrana celularDispositivo: electroporador. Da un pulso eléctrico queeleva el potencial eléctrico de la membrana celularSuspensión celular
Métodos físicos
Moléculas catiónicas:•Péptidos y sus derivados (por ejemplo, polilisina)•Polímeros sintéticos (polietilenimina o PEI) o naturales (colágeno)•Lípidos catiónicos (liposomas)
Mecanismo: forman complejos con el ADN, que se adhieren a la membranacelular mediante interacciones electrostáticas y son incorporadospor endocitosis.
Métodos químicos
Difieren en eficiencia y
citotoxicidad
Fosfato de calcio: se utiliza una solución buffer para formar un coprecipitadode ADN y fosfato de calcio sobre el cultivo celular. Este precipitado ingresa a lacélula por endocitosis
Métodos biológicos1. Producción de partículas pseudovirales en células empaquetadoras: virus
defectivos para la replicación cuyo genoma incluye al gen de interés2. Infección de células de interés con partículas virales
Ventajas:• Amplio rango de células de mamíferos con alta eficiencia de transfección• Dependiendo el tipo de virus se puede:
Restringir la infección a células en división o a células que no se dividen únicamente
Dirigir a un tipo celular específico (terapia génica) Integrar o no en el genoma
Ejemplo: lentivirus
No todas las células incorporan el ADN foráneo.
Eficiencia: porcentaje de células que incorporaron el ADN.
• Tipo celular• Viabilidad celular • Confluencia• Medio de cultivo• Tipo de molécula
transfectada• Método de transfección• Calidad y cantidad de ADN
Eficiencia de la transfección
Método A Método B
Un vector es una molécula de ADNque se utiliza como vehículo paraintroducir material genético exógenoa otra célula, donde puede replicar oser expresado.
Vectores
Los plásmidos son un tipo de vector. Son moléculas pequeñas deADN circular doble cadena. Se replican en forma independiente delcromosoma bacteriano
Plásmidos
¿Cómo ingresa el ADN a la célula?
Los vectores de clonado son pequeñas moléculas de ADN,con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de lacélula hospedadora y en general, producen un gran numerode copias.
Los vectores de expresión poseen toda la información necesaria para expresar el gen.
¿Clonar o expresar?
Origen de replicación (ori)
Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción (MCS –Multiple cloning site)
Marcadores que permitan su reconocimiento (resistencias a antibióticos)
Entonces, para clonar necesito:
Además del origen de replicación, marcador de selección y MCS, necesito:
Promotor
Sitio de terminación de la transcripción
Sitio de unión a ribosomas
Plus: tags a proteínas fluorescentes o detectables por anticuerpos
¿Y si quiero expresar el gen?
Marcador de selección para eucariotas (transfección estable)
Ya tenemos el gen de interés en nuestro vector… ¿y ahora?
Línea celular
Cultivo primario Células, tejidos u órganos tomados directamentedel organismo y cultivados en un medio artificial.
Cultivo celular que tiene capacidad demultiplicarse indefinidamente
Cultivo celular
Adheridas: Disgregación química, mecánica o enzimática
Suspensión: Dilución
Confluencia – pasajes celulares
Establecimiento de una línea celular
Debe aportar todos los requerimientos para el crecimiento de las células
Buffer: Mantenimiento del pH, bicarbonato, HEPES
Base: Glucosa (fuente de C), aminoácidos (fuente de N), cofactores enzimáticos, vitaminas, sales
Suero: Estímulos proliferativos y adhesivos. Ejemplos: Transferrina, albúmina, factores de crecimiento, etc.
Antibiótico: Prevención de contaminación. Ejemplos: Penicilina, estreptomicina, gentamicina
Suplementos
Medio de cultivo
pH: 7.2 -7.5Osmolaridad: 280 -320mOsmol/kg
CO2: 5 -7 %Temperatura: 37 °C (mamíferos)
Esterilidad → Técnica asép ca
Condiciones físico-químicasMedio de cultivo
Técnica aséptica
Guardapolvo Limpiar el área antes de empezar a trabajar
Corrientes de aire estéril. Esperar 5 minutos antes de comenzar a trabajarMedios esterilizados (filtración), material autoclavado
Esterilizar la cabina con luz UV antes de usarGuantes
Cabinas de seguridad biológicas Mechero
-Cabello recogido-Guardapolvo
Limpiar la mesada de trabajo con alcohol 70%
Verificar el material de trabajo
Saber qué hay que hacer = Leer la guía
Descartar el material,Verificar mecheros,Limpiar la mesada,Dejar las pipetas en su máxima graduación
Antes de entrar
Antes de empezar
Al finalizar
Reglas de trabajo en el laboratorio
Desarrollo del TPMaterialesTubos eppendorfs estérilesTips estérilesMicropipetas
SolucionesPEI 87kOpti-MEMADN plasmídico-GFPPBS estérilMedio de cultivo completo (DMEM con 5% Suero fetal bovino, antibiótico)
TP de transfección
N-cadherina-GFP 850 ng/µlβ3-integrina-GFP 490 ng/µlα Actinina-GFP 370 ng/µlPTP1B-D181A-GFP 560ng/µlPaxilina-GFP 610 ng/µlTubulina-GFP 580 ng/µl
1. Sembrar las células en una placa multipocillos a una densidad celular adecuada 24 hs antes de la transfección
2. Preparar la mezcla de transfección usando los reactivos a temperatura ambiente en tubos de 1,5 ml estériles de la siguiente manera:-1 µg de DNA/pocillo -2 µl de PEI 87k /pocillo -100 µl/pocillo de Opti-MEMIncubar durante 10 minutos a temperatura ambiente
3. Lavar cada pocillo de células con PBS estéril 2 veces4. Agregar 200 µl de Opti-MEM a cada uno5. Agregar la mezcla de transfección a cada pocillo
6. Incubar 2 a 4 hs en estufaCambiar el medio de las células por medio fresco completo a 37 °C